Artykuł metodologiczny

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 listopada 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje standardowy paradygmat picia w domowej klatce z przerywanym dostępem do dwóch butelek do modelowania spożycia alkoholu u szczurów. Ponadto zawiera instrukcje krok po kroku, aby rozszerzyć standardowy protokół o system wykrywania lizawek DIY, który umożliwia analizę mikrostrukturalną zachowań związanych z piciem.

Streszczenie

Picie w domowej klatce z dwoma butelkami jest jednym z najczęściej używanych paradygmatów do badania konsumpcji etanolu u gryzoni. W najprostszej formie zwierzęta mają zapewniony dostęp do dwóch butelek do picia, z których jedna zawiera zwykłą wodę z kranu, a druga etanol, przy czym dzienne spożycie mierzy się zmianą masy butelki w ciągu 24 godzin. W związku z tym takie podejście nie wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Chociaż taka łatwość wdrożenia jest prawdopodobnie największym czynnikiem przyczyniającym się do jej powszechnego przyjęcia przez przedklinicznych badaczy alkoholu, rozdzielczość danych dotyczących picia uzyskanych przy użyciu tego podejścia jest ograniczona przez liczbę pomiarów wagi butelki przez badacza (np. raz dziennie). Jednak chęć zbadania wzorców picia w kontekście ogólnego spożycia, interwencji farmakologicznych i manipulacji neuronalnych skłoniła do opracowania domowych systemów wykrywania lizania w klatkach, które mogą pozyskiwać dane na poziomie poszczególnych lizań. Chociaż wiele z tych systemów zostało opracowanych niedawno, system open source, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device), zyskał znaczną uwagę w tej dziedzinie ze względu na swoją przystępność cenową i łatwość obsługi. Chociaż ekscytujący, system ten został zaprojektowany do użytku u myszy. W tym miejscu dokonujemy przeglądu odpowiednich procedur dotyczących standardowego i wyposażonego w likometr picia w klatce domowej z dwiema butelkami. Wprowadzamy również metody dostosowania systemu LIQ HD do szczurów, w tym modyfikacje sprzętowe w celu dostosowania do większych rozmiarów klatki oraz przeprojektowany uchwyt na butelkę wydrukowany w 3D, kompatybilny ze standardowymi, gotowymi butelkami do picia. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą badać codzienne wzorce picia, a także poziomy spożycia u wielu szczurów równolegle, zwiększając w ten sposób rozdzielczość uzyskanych danych przy minimalnych inwestycjach w dodatkowe zasoby. Metody te zapewniają naukowcom elastyczność w korzystaniu zarówno ze standardowych butelek, jak i aparatury wyposażonej w lizometr do badania mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw picia alkoholu, w zależności od ich precyzyjnych potrzeb eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Chociaż umiarkowane spożywanie alkoholu historycznie wiązało się z umiarkowanymi korzyściami zdrowotnymi, ostatnie kompleksowe badania na dużą skalę wykazały, że żadna ilość spożywanego alkoholu nie jest bezpieczna1,2. W rzeczywistości spożywanie alkoholu jest siódmym najczęstszym czynnikiem ryzyka śmierci i niepełnosprawności na świecie1, a osoby, które piją nawet niewielkie ilości alkoholu, mają zwiększone ryzyko zachorowania na nowotwory, choroby zakaźne i urazy1,3. W Stanach Zjednoczonych liczba zgonów spowodowanych spożyciem alkoholu wzrosła o prawie 30% w latach 2016-20214. Co ważne, ryzyko śmierci i niepełnosprawności wzrasta monotonicznie wraz ze wzrostem konsumpcji1.

Chociaż badania na ludziach dostarczyły cennych informacji na temat neurobiologii używania i nadużywania alkoholu, eksperymentalna kontrola zapewniana przez modele zwierzęce jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zachowań związanych z piciem i ryzykiem intensywnego picia. Modele te są również cennymi narzędziami do opracowywania metod leczenia mających na celu ograniczenie niekontrolowanego zużycia. Picie w klatce domowej z dwoma butelkami jest jednym z najczęściej stosowanych paradygmatów przedklinicznych do badania spożycia alkoholu przez gryzonie. Wynika to w dużej mierze z łatwości wdrożenia, ponieważ pozwala na pomiar całkowitego dobrowolnego spożycia alkoholu i preferencji bez konieczności korzystania ze specjalistycznego sprzętu badawczego lub skomplikowanych analiz. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą zbierać pomiary w żądanych odstępach czasu (np. godzinach, dniach, tygodniach), obliczając zmianę wagi butelki od początku do końca sesji picia. Odmiany tej podstawowej metody były stosowane przez wielu w tej dziedzinie, aby ułatwić niskie, umiarkowane lub upijające się poziomy spożycia alkoholu zarówno w krótkich, jak i długich okresach czasu. Na przykład, ciągłe i przerywane procedury wyboru dwóch butelek zostały zastosowane w celu ułatwienia niskiego i umiarkowanego poziomu spożycia alkoholu, odpowiednio, zarówno u myszy5, jak i rats6,7,8. Te same paradygmaty mogą sprzyjać wysokiemu poziomowi spożycia w odmianach preferujących alkohol7,9. Alternatywnie, wykazano, że adaptacja tej metody, która ogranicza dostęp do alkoholu do 2-4 godzin dziennie, rozpoczynając około 3 godziny po rozpoczęciu ciemnego cyklu, powoduje upijanie się u myszy (tj. Picie w ciemności)10,11. Dodatkowe warianty tych metod zostały wykorzystane w połączeniu z metodami, które ułatwiają uzależnienie od alkoholu (tj. przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu) w celu zbadania eskalacji dobrowolnego picia alkoholu podczas odstawienia12,13,14,15,16,17,18,19.

Chociaż powszechnie przyjęty przez tę dziedzinę, standardowe podejście do mierzenia spożycia alkoholu na podstawie zmiany wagi butelki jest ograniczone w rozdzielczości do całkowitego spożycia na sesję picia. W związku z tym podejście to nie jest w stanie uchwycić wzorców picia, o których wiadomo, że wpływają zarówno na ryzyko, jak i nasilenie zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (AUD)20,21,22. Rzeczywiście, średnie spożycie przez daną osobę w czasie może być konsekwencją kilku epizodów intensywnego picia lub wielu epizodów picia, z których każdy wiąże się ze stosunkowo niskim spożyciem, a niuanse te pozostają niewykryte, gdy konsumpcja jest mierzona jako całkowite spożycie na sesję picia. Co ważne, znacznie więcej epizodów picia związanych z dużymi napadami picia (tj. przełykaniem) obserwuje się u osób z AUD w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej23, a dane dotyczące naczelnych sugerują, że osoby, które ustaliły wzorzec spożywania alkoholu, który obejmuje duże napady picia na wczesnym etapie ich historii picia, są narażone na znaczne ryzyko wystąpienia AUD22. Co więcej, epizody picia, które obejmują duże okresy konsumpcji, znacznie zwiększają ryzyko zachorowalności i śmiertelności niezależnie od diagnozy AUD21. Ogólnie rzecz biorąc, dane te doprowadziły do wzrostu zainteresowania badaniem wzorców picia oprócz poziomów całkowitego spożycia w modelach przedklinicznych i skłoniły do opracowania szeregu systemów o różnym stopniu złożoności, które są w stanie rejestrować dane dotyczące picia na poziomie poszczególnych lizawek.

Jednym z pierwszych było opracowanie systemu dwóch butelek wyposażonego w wykrywanie lizania wiązką fotowolną, przeznaczonego do stosowania u myszy24. System ten został następnie zaadaptowany przez oddzielną grupę do użytku u szczurów25. Od tamtej pory wariacje na ten temat zostały wykorzystane do opracowania podobnych systemów zawartych w niestandardowych pomieszczeniach dla gryzoni26, które pozwalają na wykrywanie lizania poszczególnych zwierząt trzymanych społecznie27,28, i które rejestrują zarówno zachowania związane z karmieniem, jak i piciem29. Wśród nich, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30 zyskał znaczną uwagę dzięki zaoferowaniu systemu do użytku w myszach, który jest równoległy do łatwości implementacji i przystępności cenowej systemu opracowanego przez Godnyuck et al.24. System ten wykorzystuje wykrywanie pojemnościowe do bezpośredniego wykrywania kontaktu między językiem a przewodzącą metalową rurką łykającą, w przeciwieństwie do środków pośrednich, takich jak podejście sipper lub interakcja, które są zapewniane za pomocą systemu wykrywania wiązki światła. Autorzy dostarczają danych pokazujących, że ich pojemnościowy system wykrywania zapewnia znacznie większą precyzję i czułość w wykrywaniu lizawek, tworząc silniejsze korelacje między liczbą lizawek a zmianą masy butelki niż detekcja fotowiązką. Autorzy demonstrują ponadto możliwość wykorzystania tego systemu w połączeniu z paradygmatem picia w klatce domowej z ciągłym dostępem do dwóch butelek w celu uchwycenia pomiarów mikrostruktury picia alkoholu oprócz pomiarów całkowitego dziennego spożycia30.

Tutaj opisujemy procedury picia alkoholu w domowej klatce z dwoma butelkami przy użyciu standardowego podejścia, jak również metody umożliwiające wykrywanie lizawki (Rysunek 1). Wprowadzamy również metody budowania i wdrażania LIQ HDR - adaptacji LIQ HD30 do użytku u szczurów, która obejmuje modyfikacje sprzętowe w celu dostosowania do większych rozmiarów klatek oraz przeprojektowany uchwyt na butelki wydrukowany w 3D, kompatybilny ze standardowymi butelkami dostępnymi z półki. Metody te zapewniają naukowcom elastyczność w stosowaniu podejścia standardowego lub wyposażonego w lizometr, w zależności od ich zasobów eksperymentalnych i potrzeb w zakresie gromadzenia danych.

Poniżej znajduje się opis potrzebnych materiałów i instrukcje krok po kroku dotyczące rejestrowania picia w klatce domowej przy użyciu procedury picia z przerywanym dostępem do dwóch butelek, zaadaptowanej z Simms et al.7. W tej procedurze szczury mają zapewniony 24-godzinny dostęp do dwóch butelek do picia 7 dni w tygodniu. W poniedziałki, środy i piątki (MWF) szczury otrzymują jedną butelkę zawierającą wodę (H2O) i drugą butelkę zawierającą etanol (EtOH). Butelki te są usuwane we wtorki, czwartki i soboty (TRS) i zastępowane dwiema butelkami wody. Szczury piją z tych samych dwóch butelek wody w soboty i niedziele. Należy pamiętać, że w razie potrzeby metody te można łatwo dostosować do alternatywnych harmonogramów dostępu do etanolu (np. ciągły, objadanie się itp.). Dla podejść standardowych i wyposażonych w lizometr podano osobne instrukcje.

Protokół

Wszystkie reprezentatywne dane zostały zebrane z wykorzystaniem dorosłych szczurów szczepu Long-Evans, przebywających w pojedynczych klatkach, za zgodą Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Illinois w Chicago oraz zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania. Pojedyncze klatki są niezbędne do dokładnego monitorowania spożycia płynów przez każdego osobnika. Dorosłe samce (n = 38) i samice (n = 2) szczurów Long-Evans w momencie przybycia miały wiek P50-80 i przed rozpoczęciem eksperymentu poddano je tygodniowej aklimatyzacji w wivarium. Szczury miały dostęp ad libitum do standardowej karmy (Teklad 7912, Envigo) i wody, chyba że wskazano inaczej.

1. Przygotowanie przed eksperymentem

  1. Oznaczyć butelki do picia jako H2O lub EtOH. Następnie, używając unikalnego identyfikatora dla każdego szczura, oznaczyć jedną butelkę H2O i jedną butelkę EtOH dla grupy MWF oraz dwie butelki H2O dla grupy TRS.
    UWAGA: Opcjonalnie można użyć taśm w różnych kolorach do odróżnienia butelek z H2O i EtOH, aby pomóc uniknąć potencjalnych błędów podczas wymiany butelek.
  2. Napełnić butelki H2O wodą pitną na 1 dzień przed datą rozpoczęcia eksperymentu. Przygotować roztwór EtOH, łącząc EtOH o stężeniu 190 proof z wodą pitną (20% v/v) na 1 dzień przed datą rozpoczęcia eksperymentu.
    OSTROŻNIE: Krytyczne jest użycie EtOH niedenaturowanego, ponieważ EtOH denaturowany jest trujący.
  3. Przygotować pustą klatkę na tej samej półce, na której znajdują się szczury uczestniczące w eksperymencie. Ta klatka będzie służyć do obliczenia strat wynikających z rozlania cieczy.
  4. Wyposażyć klatki w system LIQ HDR, jeśli jest on stosowany (patrz krok 3, Rycina 2, Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5, Rycina 6 oraz Rycina uzupełniająca 1).
  5. Przed rozpoczęciem badania ustalić dokładną godzinę wymiany butelek. Butelki powinny być wymieniane o tej samej porze każdego dnia, aby uzyskać dokładny pomiar spożycia w ciągu 24 h.
    UWAGA: Poprzednie badania wykazały, że gryzonie wykazują największy stopień spożycia wczesnym etapie cyklu ciemnego10,31. Dlatego, aby zarejestrować spożycie podczas tego okresu wysokiej aktywności (patrz krok 2.3.1 w celu rejestracji picia typu binge), zaleca się, aby wymiana butelek odbywała się 30-60 min po zgaszeniu świateł. Podczas wymiany butelek należy używać czerwonych lamp, aby umożliwić obserwację bez zakłócania cyklu światło-ciemność.

2. Procedury i konserwacja codzienna

  1. W pierwszym dniu eksperymentu należy wykonać następujące czynności:
    1. Usunąć standardowe butelki z wodą z klatek.
    2. Opcjonalnie: Szczury często potrącają górną część klatki podczas poszukiwania pożywienia, co może spowodować rozlanie płynów, którego nie wyeliminuje pusta klatka kontrolna do rozlewania. Zastosowanie miseczek z pokarmem wewnątrz klatki może zniwelować ten problem. W przypadku ich zastosowania należy teraz usunąć pokarm z górnej części klatki, umieścić wewnątrz klatki miseczkę i wypełnić ją paszą. Należy upewnić się, że powierzchnia podłogi dostępna dla szczura nadal spełnia instytucjonalne wytyczne, biorąc pod uwagę rozmiar klatki oraz miseczki z pokarmem.
    3. Poinformować personel opiekuńczy i hodowlany (jeśli dotyczy), że personel badawczy będzie zapewniał pokarm i wodę przez cały czas trwania eksperymentu.
    4. Zmiana klatek może zakłócać zbieranie danych. Zmianę klatek należy przeprowadzać równocześnie z pomiarem masy ciała. Badacze decydujący się na takie rozwiązanie powinni odpowiednio powiadomić personel opiekuńczy i hodowlany.
  2. W kolejnych dniach należy postępować zgodnie z poniższymi procedurami.
    UWAGA: Pamiętaj, że każdy ruch klatek i butelek może spowodować rozlanie płynów. Dlatego ważne jest, aby poruszać nimi delikatnie i stosować te same metody nakładania i zdejmowania butelek z klatki kontrolnej, co w przypadku klatek ze szczurami.
    1. Wejść do pomieszczenia przed czasem wymiany butelek, upewniając się, że jest wystarczająco dużo czasu na wykonanie poniższych kroków, a następnie umieścić nowe butelki na klatkach w odpowiednim czasie rozpoczęcia sesji.
    2. Zdjąć filtry z górnych części klatek. W dniach MWF przejść do kroku 2.2.3. W dniach TRS przejść do kroku 2.2.4.
    3. W poniedziałki, środy i piątki (MWF) usunąć butelki TRS z górnych części klatek. Zważyć butelki MWF (jedną z EtOH i jedną z H2O). Zapisać masę początkową butelki dla dzisiejszej sesji picia. W razie potrzeby dostarczyć dodatkowy pokarm na górną część klatki lub do miseczek. W wyznaczonym czasie rozpoczęcia sesji umieścić butelki na górnej części klatki każdego szczura taśmą skierowaną do góry, aby szczury nie przegryzały etykiet butelek.
      UWAGA: Zazwyczaj spożycie wody w dniach TRS nie jest zapisywane ani raportowane, ale badacze mogą opcjonalnie zbierać te dane, mierząc masę butelek przed i po sesji, jak opisano poniżej w kroku 2.2.3 i 2.2.4. Strona, po której znajduje się butelka z EtOH, powinna być zamieniana po każdej sesji picia, aby uniknąć wykształcenia potencjalnej preferencji strony, co mogłoby nieumyślnie zaburzyć dane dotyczące spożycia.
      1. Opcjonalnie: Poprzednie prace wykazały, że wiele szczurów wykazuje picie epizodyczne (typu binge) na początku sesji picia8,32,3. Większość badaczy rejestrujących picie epizodyczne w tym czasie raportuje spożycie w ciągu pierwszych 30–60 min sesji picia. Aby uzyskać dane o spożyciu podczas tego potencjalnego epizodu, należy wykonać poniższe kroki.
      2. Ustawić timer po umieszczeniu butelek w ostatniej klatce. Pozostawić pomieszczenie w spokoju podczas odliczania czasu.
      3. Powrócić do pomieszczenia po sygnale timera. Zdjąć butelki z EtOH i H2O i zapisać ich masę. Ponownie umieścić butelki z EtOH i H2O w klatkach.
        UWAGA: Krok ten nie jest wymagany do rejestracji epizodów picia epizodycznego w przypadku stosowania systemu wyposażonego w detekcję lizania.
    4. W wtorki, czwartki i soboty (TRS) usunąć butelki MWF z klatek w wyznaczonym czasie zakończenia sesji, odpowiadającym 24 h po czasie rozpoczęcia. Zważyć każdą butelkę i zapisać masę końcową butelki dla sesji picia MWF. Zmierzyć i zapisać masę ciała każdego szczura. W razie potrzeby dostarczyć dodatkowy pokarm na górną część klatki lub do miseczek. Umieścić butelki TRS z H2O na górnej części klatki każdego szczura taśmą skierowaną do góry, aby szczury nie przegryzały etykiet butelek.
    5. Ponownie założyć filtry na klatki i opuścić pomieszczenie z zwierzętami.
      UWAGA: Opcjonalnie można zakryć pijaki butelek EtOH, aby zapobiec parowaniu. Jeśli zmiana klatek jest wykonywana przez personel badawczy, należy wyznaczyć 1 dzień w tygodniu podczas obowiązków TRS na wykonanie tego zadania. Po pomiarze masy ciała umieścić każdego szczura w czystej klatce.
  3. Myć butelki i odnawiać płyny w regularnych odstępach tygodniowych lub dwutygodniowych, zgodnie z instytucjonalnymi procedurami opieki i hodowli zwierząt. Należy zadbać o to, aby czynności te były wykonywane w sposób, który nie przerywa sesji picia. Na przykład butelki TRS z H2O można myć i napełniać po ich usunięciu w dniach MWF. Podobnie butelki MWF z H2O i EtOH można myć i napełniać po ich usunięciu w dniach TRS.

3. Detekcja lizania podczas eksperymentów z wyborem między dwiema butelkami

UWAGA: Badacze zainteresowani pozyskaniem danych o piciu o wysokiej rozdzielczości mogą zmodyfikować powytą procedurę, dodając do butelek funkcję detekcji lizania. LIQ HD30 jest niskokosztowym systemem do samodzielnego wykonania (DIY), który umożliwia ten rodzaj gromadzenia danych u myszy. Poniższe procedury opisują modyfikacje niezbędne do przystosowania systemu LIQ HD do zastosowania u szczurów ( ownego jako LIQ HDR). Patrz Tabela materiałów zawierająca listę wszystkich części dostępnych w sprzedaży oraz wykonanych na zamówienie przy użyciu druku 3D, niezbędnych do skonstruowania jednego systemu detekcji lizania, który umożliwia zbieranie danych dotyczących wyboru między dwiema butelkami dla maksymalnie 18 szczurów. Pliki .stl do druku 3D oraz instrukcje znajdują się na stronie internetowej autora (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. Konfiguracja jednostek czujników pojemnościowych
    UWAGA: Każdy system LIQ HDR składa się z trzech jednostek czujników pojemnościowych, które wspólnie rejestrują dane o lizaniu z 36 butelek równolegle, co odpowiada 18 szczurom utrzymywanym pojedynczo. Każda jednostka czujnika składa się z jednej płytki rozdzielczej komunikacji różnicowej I2C i jednej płytki czujnika pojemnościowego z 12 klawiszami, która łączy się z likometrami z sześciu oddzielnych klatek za pomocą sześciu par 2-pinowych kabli oznaczonych kolorami dla każdego likometru (Rycina 2A).
    1. Przygotować materiały niezbędne do zbudowania wszystkich trzech jednostek czujników pojemnościowych, zgodnie z Rycina 2B, wraz z wymaganymi narzędziami lutowniczymi.
    2. Aby rozpocząć budowę jednostki czujnika A, pokryć 2-pinowy kabel złączem żeńskim czerwoną rurką termokurczliwą o długości 7 cali, włożyć jego czerwony i czarny koniec przewodu do pinów #0 i #1 na płytce czujnika (Rycina 2C-1) i przylutować (Rycina 2C-2). Należy upewnić się, że kabel znajduje się z przodu płytki czujnika, jak pokazano, aby móc ustawić klatki w kolejności numerycznej od lewej do prawej w iwarium, unikając nakładania się kabli i potencjalnego zakłócenia rejestracji (patrz krok 3.6 i Rycina 6).
    3. Pokryć pięć kolejnych kabli rurkami termokurczliwymi o wyraźnie różnych kolorach i przylutować do pinów #2-1, jak pokazano (Rycina 2C-3). Należy upewnić się, że wszystkie czerwone przewody są przylutowane do pinów o numerach parzystych, które połączą się ze wszystkimi butelkami po lewej stronie, a wszystkie czarne przewody są przylutowane do pinów o numerach nieparzystych, które połączą się ze wszystkimi butelkami po prawej stronie.
    4. Aby zabezpieczyć połączenia, pokryć miejsca lutowania klejem na gorąco z każdej strony (Rycina 2C-4). Oznaczyć złącza w kolejności numerycznej, przypisując unikalny identyfikator do każdego likometru (Rycina 2C-4).
    5. Aby zmontować jednostkę czujnika A, połączyć płytkę czujnika A z punktem końcowym (EndPoint) rozdzielacza komunikacji za pomocą 4-pinowego kabla o długości 50 mm, a punkt końcowy połączyć z wyjściem 3,3 V konwertera poziomów z 5 V na 3 V za pomocą 4-pinowego kabla o długości 100 mm (Rycina 2D-1). Chociaż zarówno płytka czujnika, jak i płytka rozdzielacza komunikacji mają dwa identyczne złącza 4-pinowe, nadal ważne jest upewnienie się, że okablowanie jest dokładnie takie, jak pokazano (Rycina 2D-1 i Rycina 2F), aby móc wykorzystać wydrukowane w 3D obudowy czujników i sugerowaną konfigurację iwarium (patrz krok 3.6 i Rycina 6). Umieścić jednostkę czujnika A wewnątrz wydrukowanej w 3D obudowy (Rycina 2D-2). Ostrożnie zamknąć górną pokrywę, dbając o to, aby nie przygnieść kabla konwertera poziomów (Rycina 2D-3).
    6. Zmodyfikować adresy I2C płytek czujników B i C, przylutowując przewód zworowy z pinu ADDR do pinu 3Vo lub SDA, zgodnie z oznaczeniem (Rycina 2E).
    7. Przylutować sześć kolorowo oznaczonych kabli ze złączami żeńskimi do płytek czujników B i C w tej samej kolejności, w której zrobiono to dla płytki A. Oznaczyć każde złącze odpowiadającym numerem identyfikacyjnym likometru. Połączyć płytkę B z punktem środkowym (MidPoint) rozdzielacza komunikacji, a płytkę C z punktem końcowym (EndPoint) za pomocą 4-pinowych kabli o długości 50 mm (Rycina 2F).
    8. Umieścić jednostki czujników B i C w ich odpowiednich obudowach wydrukowanych w 3D. Połączyć szeregowo wszystkie trzy jednostki czujników za pomocą kabli Ethernet, aby zakończyć konfigurację czujników (Rycina 2G).
  2. Konfiguracja interfejsu mikrokontrolera
    UWAGA: Interfejs mikrokontrolera LIQ HDR (Rycina uzupełniająca 1A) jest taki sam, jak opisano dla LIQ HD30, z bardzo niewielkimi modyfikacjami. Procedury opisane poniżej stanowią ogólny przegląd kroków niezbędnych do skonfigurowania interfejsu z modyfikacjami opisanymi w krokach 3.2.6 i 3.2.8. W celu uzyskania bardziej szczegółowych instrukcji krok po kroku badaczy odsyła się do oryginalnego protokołu oraz samouczka wideo udostępnionego na stronie GitHub autora30.
    1. Przygotować materiały i narzędzia lutownicze niezbędne do zbudowania interfejsu mikrokontrolera (Rycina uzupełniająca 1B). Na tylnej stronie tarczy dotykowej (Rycina uzupełniająca 1C-1) utworzyć zworę lutowniczą pomiędzy polami lutowniczymi podświetlenia tylnego (Rycina uzupełniająca 1C-2).
    2. Na tylnej stronie tarczy rejestracji danych przerwać ścieżkę pola zwory pinu CS (Rycina uzupełniająca 1D-1). Na przedniej stronie rejestratora danych przylutować krótki przewód zworowy z pinu CS do pinu #7 (Rycina uzupełniająca 1D-2).
    3. Aby zainstalować złącza stosowe tarczy, najpierw nałożyć je na tył tarczy dotykowej (Rycina uzupełniająca 1E-1). Nałożyć rejestrator danych na tarczę dotykową, ustabilizować za pomocą taśmy i przylutować wszystkie piny złączy do rejestratora danych (Rycina uzupełniająca 1E-2). Następnie zdjąć tarczę dotykową.
    4. Nałożyć pozostałe złącze 2 x 3 na mikrokontroler (Rycina uzupełniająca 1F-1), a następnie nałożyć rejestrator danych na mikrokontroler przed przylutowaniem pinów złącza na miejscu (Rycina uzupełniająca 1F-2).
    5. Włożyć baterię guzikową do rejestratora danych (Rycina uzupełniająca 1G-1). Nałożyć tarczę dotykową na rejestrator danych (Rycina uzupełniająca 1G-1). Włożyć kartę microSD wraz z adapterem do rejestratora danych (Rycina uzupełniająca 1G-2).
    6. Aby wykonać dodatkowy przewód uziemiający, odciąć jedno złącze męskie z przewodu zworowego i zdjąć izolację z końca na długość ok. 1/4 cala (Rycina uzupełniająca 1H-1). Przylutować odcinek odizolowanego przewodu z rdzeniem jednowłóknistym do przewodu zworowego i pokryć miejsce lutowania rurką termokurczliwą (Rycina uzupełniająca 1H-2).
    7. Podłączyć 4-pinowe przewody zworowe i dodatkowy przewód uziemiający do mikrokontrolera (Czarny - GND, Czerwony - 5V, Żółty - pin #21, Niebieski - pin #20, Rycina uzupełniająca 1I-1). Zabezpieczyć połączenia klejem na gorąco (Rycina uzupełniająca 1I-2). Opcjonalnie owinąć przewody zworowe rurką termokurczliwą (Rycina uzupełniająca 1I-2).
    8. Umieścić w pełni zmontowany interfejs mikrokontrolera w obudowie wydrukowanej w 3D, przeciągając 4-pinowe przewody zworowe i przewód uziemiający przez otwór na górze (Rycina uzupełniająca 1J).
    9. Postępować zgodnie z oryginalnym protokołem w celu instalacji oprogramowania interfejsu mikrokontrolera30.
  3. Budowa likometrów LIQ HDR
    UWAGA: Niestandardowy wydruk 3D utrzymujący butelki jest przeznaczony do użytku ze standardową butelką do picia dla gryzoni z rurką ssącą o średnicy 8 mm (patrz Tabela materiałów, Rycina 3A). Ten uchwyt butelki można łatwo przystosować do użytku z podobnymi butelkami i rurkami ssącymi przy niewielkich modyfikacjach lub bez nich.
    1. Przygotować materiały, wydruki 3D i narzędzia lutownicze niezbędne do zbudowania jednego likometru, jak pokazano na Rycina 3B. Należy pamiętać, że każdy system LIQ HDR pomieści maksymalnie 18 likometrów dla 36 butelek.
    2. Aby przedłużyć kabel ze złączem męskim, zdjąć izolację z obu jego końców na długość ok. 1/4 cala, a także z czarnego i czerwonego przewodu przedłużającego (Rycina 3C-1).
    3. Przylutować przewody przedłużające do kabla ze złączem (Rycina 3C-2) i pokryć miejsca lutowania rurką termokurczliwą (Rycina 3C-3). Pokryć kabel ze złączem męskim rurką termokurczliwą dopasowaną kolorystycznie do odpowiadającego mu kabla ze złączem żeńskim w jednostce czujnika (Rycina 3C-4).
    4. Aby zachować spójność z okablowaniem płytki czujnika (Rycina 2), przeciągnąć czerwony i czarny przewód odpowiednio przez lewy i prawy wewnętrzny kanał kablowy uchwytu butelki (Rycina 3D-1).
    5. Przylutować każdy przewód do samego końca przewodzącej taśmy miedzianej o długości 1 ¾ cala (Rycina 3D-2) i złożyć taśmy miedziane na pół (Rycina 3D-3).
    6. Odlepić taśmę miedzianą i za pomocą pęsety ostrożnie wprowadzić ją do wnętrza uchwytu rurki ssącej (Rycina 3E-1) przed mocnym przyklejeniem jej do wewnętrznych ścianek uchwytu rurki ssącej (Rycina 3E-2). Należy upewnić się, że strona lutowana taśmy miedzianej jest przyklejona do ścianki bliższej linii środkowej uchwytu butelki, zgodnie z oznaczeniem (Rycina 3E-2). Przecisnąć rurkę ssącą przez uchwyt, aby mocno docisnąć taśmę do ścianki i przygotować uchwyt.
    7. Aby wzmocnić stronę lutowaną taśmy miedzianej, która nie jest tak dobrze przywierająca i ma tendencję do odklejania się, nałożyć kroplę kleju na gorąco na miejsce lutowania (Rycina 3E-3). Rozsmarować klej tak, aby pokrył zarówno taśmę miedzianą, jak i przylegający odsłonięty fragment wydruku 3D (Rycina 3E-4).
    8. Przeciągnąć kabel przez wewnętrzny kanał osłony kabla (Rycina 3F). Należy wybrać odpowiednią osłonę kabla (skierowaną w lewo lub w prawo) dla każdego likometru, aby móc zastosować sugerowaną konfigurację iwarium (patrz krok 3.6 i Rycina 6). UWAGA: Likometry 5-6, 1-12 i 17-18, które w obecnej konfiguracji są przedstawione za pomocą niebieskich lub fioletowych kabli, wymagają osłony kabla skierowanej w lewo (Rycina 4D-1), natomiast wszystkie pozostałe likometry wymagają osłony kabla skierowanej w prawo (Rycina 4D-2).
    9. Aby zainstalować klips kablowy, najpierw umieścić jeden przewód w rowku jednej połowy klipsa kablowego (Rycina 3G-1), następnie nałożyć drugą połowę na drugi przewód, a następnie ciasno zamknąć obie połowy za pomocą nakrętki (Rycina 3G-2).
    10. Oznaczyć złącze męskie odpowiadającym numerem identyfikacyjnym likometru (Rycina 3H). Powtarzać te kroki, aż wszystkie 18 likometrów zostanie zbudowanych.
  4. Instalacja likometrów LIQ HDR
    UWAGA: System LIQ HDR jest przeznaczony do instalacji na standardowej klatce typu shoebox dla szczurów z metalowym drutowym wierzchem (Rycina 4A-1).
    1. Zidentyfikować dwie pary prętów z odległością od środka do środka ok. 75 mm na drutowym wierzchu klatki, aby pomieścić uchwyt butelki. Użyć szczypiec, aby lekko rozsunąć metalowe pręty wokół otworów na rurkę ssącą. Zaizolować te pręty taśmą izolacyjną, aby zapobiec kontaktowi metal-metal między rurkami ssącymi a wierzchem klatki (Rycina 4A-2).
      UWAGA: Chociaż taśma izolacyjna jest niedostępna dla szczurów i dlatego nie jest narażona na przegryzienie, zalecamy jej usunięcie po zakończeniu badania i nieużywanie jej ponownie między badaniami.
    2. Zainstalować likometr i panel z akrylu laserowego o grubości 1/8 cala na wierzchu klatki za pomocą dwóch zestawów śrub M5 i nakrętek (Rycina 4B). Upewnić się, że otwory na rurki ssące w likometrze i panelu akrylowym są wyrównane oraz że rurki ssące nie stykają się z żadną częścią wierzchu klatki.
    3. Zamocować klips kablowy do najbardziej zewnętrznego pręta (o średnicy ok. 4 mm) drutowego wierzchu klatki (Rycina 4C). W razie potrzeby wyregulować klips kablowy, aby upewnić się, że wierzch klatki ściśle przylega do dna klatki, a kabel nie jest naciągany ani zginany pod zbyt dużym napięciem. Upewnić się, że dla każdego likometru zastosowano właściwą osłonę kabla (Rycina 4D i patrz krok 3.8.8).
    4. Wyregulować rurki ssące w razie potrzeby tak, aby z zakrętki wystawało tylko ok. 2 cm rurki (Rycina 4E-1). Aby zainstalować butelki, wsunąć rurkę ssącą przez uchwyt rurki ssącej w uchwycie butelki, aż do oporu (Rycina 4E-2). Tylko sam czubek rurki ssącej powinien wystawać poza panel akrylowy (Rycina 4E-3). Jest to kluczowe, aby żadna inna część rurki ssącej nie była odsłonięta, aby uniknąć fałszywie dodatnich wyników lizania wynikających z zachowań niepokarmowych, takich jak dotykanie lub zabawa rurką ssącą przez szczura. Górny filtr powinien ściśle przylegać do drutowego wierzchu klatki i klipsa kablowego, nie przeszkadzając w samym kablu (Rycina 4F).
      UWAGA: Do całkowitego zamknięcia rurek ssących o większej długości w eksperymentach wymagających głębszego wprowadzenia rurek do klatki (np. przy pomiarze picia u młodych szczurów, które mogą mieć trudności z dosięgnięciem krótkiej rurki) można użyć grubszego panelu akrylowego lub stosu kilku paneli o grubości 1/8 cala.
  5. Instalacja i stosowanie blokad rurek ssących
    ​UWAGA: Blokada rurki ssącej (Rycina 5A) jest zaprojektowana tak, aby ograniczyć dostęp szczura do rurki ssącej podczas wymiany butelek i zapewnić dokładną kalibrację likometru na początku każdej sesji picia.
    1. Przygotować części wydrukowane w 3D oraz śrubę M5, nakrętkę i podkładkę do jednej blokady rurki ssącej, jak pokazano na Rycina 5B.
    2. Wsunąć zębatkę SIPPER_Gear do podstawy SIPPER_Base (Rycina 5C-1). Upewnić się, że SIPPER_Gear jest zorientowana dokładnie tak, jak pokazano na wstawce z renderingiem 3D. Wsunąć śrubę wielozwojową SIPPER_Worm do otworu na górze SIPPER_Base. Obracać śrubę zgodnie z ruchem wskazówek zegara podczas wsuwania, aż głowica zrówna się z podstawą (Rycina 5C-2).
    3. Przykręcić nakrętkę SIPPER_Nut do końca śruby wielozwojowej od spodu podstawy (Rycina 5C-3). Użyć pęsety, aby dokręcić nakrętkę, obracając tarczę śruby wielozwojowej. Wsunąć okrągłe, wąskie szyjki blokad SIPPER_Blockers do szczelin zębatki (Rycina 5C-4).
    4. Zainstalować zmontowaną blokadę rurki ssącej na wierzchu klatki za pomocą zestawu śrub M5 (Rycina 5D). Upewnić się, że obie blokady rurek ssących są wyrównane z otworami na rurki.
    5. Aby zablokować dostęp do rurek ssących, obrócić tarczę śruby wielozwojowej zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby obniżyć blokady, aż całkowicie zakryją otwory na rurki ssące (Rycina 5E).
    6. Aby umożliwić dostęp do rurek ssących, obrócić tarczę przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż blokady znajdą się w pozycji pionowej, prostopadle do wierzchu klatki (Rycina 5F-1). Ręcznie pociągnąć w górę każde ramię blokady, aż głowice znajdą się tuż poniżej drutowego wierzchu klatki. Obrócić blokady o 90°, tak aby głowice były równoległe do metalowych prętów na wierzchu klatki, a ramiona zostały zablokowane na miejscu (Rycina 5F-2). Kontynuować obracanie tarczy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż obie blokady zostaną podniesione powyżej wierzchu klatki (Rycina 5F-3) i rurki ssące będą w pełni dostępne (Rycina 5F-4).
  6. Używanie systemu LIQ HDR w iwarium
    UWAGA: Poniższa konfiguracja iwarium jest zoptymalizowana do rejestracji wyboru między dwiema butelkami przy użyciu jednego interfejsu mikrokontrolera podłączonego do 18 standardowych klatek typu shoebox dla szczurów. Wszystkie komponenty elektroniczne, w tym interfejs mikrokontrolera, jednostki czujników i różne kable, są przymocowane do ściennych metalowych drutowych regałów, na których znajdują się klatki (Rycina 6A). Mogą być wymagane pewne modyfikacje, aby dostosować system do konkretnych pomieszczeń dla zwierząt i potrzeb użytkownika.
    1. Zamontować każdą jednostkę czujnika do regałów w iwarium za pomocą niestandardowej śruby montażowej wydrukowanej w 3D (Rycina 6B). Upewnić się, że każda jednostka czujnika jest zamontowana bezpośrednio pod klatką z żółtym likometrem, aby uniknąć niepotrzebnego napięcia kabla (Rycina 6A).
    2. Rozmieścić i zabezpieczyć każdy kabel ze złączem żeńskim, upewniając się, że nie nakładają się one na siebie i nie zginają nadmiernie przy końcach lutowanych, co mogłoby skutkować słabym wykrywaniem lizania (Rycina 6B). W przypadku użycia regałów z metalowych prętów można to łatwo osiągnąć, przywiązując kable z łącznikami opaskami zaciskowymi do oddzielnych prętów na półce, jak przedstawiono.
    3. Zamontować interfejs mikrokontrolera obok jednostki czujnika A za pomocą tej samej śruby montażowej wydrukowanej w 3D i podłączyć jego 4-pinowe złącze do portu wejściowego 5 V konwertera poziomów z 5 V na 3 V podłączonego do jednostki czujnika A (Rycina 6C).
    4. Użyć taśmy izolacyjnej, aby przymocować dodatkowy przewód uziemiający do źródła uziemienia, np. metalowych regałów (Rycina 6D).
    5. Rozmieścić każdą klatkę na podstawie koloru i identyfikatora zainstalowanego likometru zgodnie z przedstawieniem na Rycina 6A, aby zminimalizować nakładanie się i napięcie kabli.
    6. Bezpiecznie połączyć wszystkie męskie kable złączy likometrów z dopasowanymi żeńskimi kablami złączy czujników (Rycina 6E). Podłączyć zasilacz, aby uruchomić interfejs mikrokontrolera (Rycina 6F).
    7. Na głównej stronie interfejsu graficznego użytkownika (GUI) (Rycina 6G) dotknąć Symbolu Ustawień, aby otworzyć stronę ustawień. Użytkownicy mogą zmienić czas włączania (ON) i wyłączania (OFF) świateł zgodnie z harmonogramem iwarium, aby zapewnić automatyczne ściemnienie wyświetlacza interfejsu po rozpoczęciu cyklu ciemności (Rycina 6H-1).
    8. Dotknąć Edytuj ustawienia czujnika (Rycina 6H-1), aby ustawić Próg Dotyku (Touch Threshold) na 8 i Próg Zwolnienia (Release Threshold) na 2, co w naszej opinii zapewnia najbardziej spójne wykrywanie lizania u szczurów przy obecnej konfiguracji (Rycina 6H-2). Należy jednak pamiętać, że użytkownicy mogą potrzebować eksperymentować z różnymi ustawieniami w przypadku wprowadzenia jakichkolwiek modyfikacji w obecnym systemie.
    9. Odznaczyć opcję Autokalibracja, jeśli dane są zbierane tylko przez okres 24 h lub krócej (Rycina 6H-2).

4. Codzienne procedury dla badania wyboru między dwiema butelkami z wodą w klatce domowej z wykorzystaniem detekcji lizania

  1. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w punkcie 2 dla standardowych procedur dwubutelkowego wyboru, z następującymi modyfikacjami.
  2. W poniedziałki, środy i piątki, przed zamontowaniem butelek MWF, użyj blokad pipetek, aby zakryć otwory pipetek we wszystkich klatkach (patrz krok 3.5.5 i Rycina 5E).
  3. Przed rozpoczęciem rejestracji wybierz odpowiednią Stronę Eksperymentalną (Experimental Side) na głównej stronie interfejsu GUI, która będzie stroną butelki z EtOH w danym dniu (Rycina 6G).
  4. Po zainstalowaniu wszystkich butelek MWF dotknij przycisku START! na stronie głównej (Rycina 6G), aby rozpocząć kalibrację czujników; w tym czasie zaleca się odsunąć od systemu i upewnić się, że szczury nie liżą pipetek (Rycina 6I-1). Kalibracja trwa kilka sekund, po czym system przechodzi do głównej strony rejestracji, wyświetlającej skumulowaną liczbę liznięć dla każdej butelki dla każdego likometru (Rycina 6I-2).
  5. Podnieś wszystkie blokady pipetek powyżej górnej części klatki, aby umożliwić dostęp do pipetek (patrz krok 3.5.6 i Rycina 5F), a następnie ostrożnie przywróć wszystkie górne części filtrów zgodnie z opisem (patrz krok 3.4.4 i Rycina 4F).
  6. Dotknij przycisku Refresh, aby zaktualizować liczbę liznięć na ekranie, ponieważ nie są one aktualizowane w czasie rzeczywistym automatycznie (Rycina 6I-2).
  7. We wtorki, czwartki i soboty dotknij przycisku Save & Quit, aby zatrzymać rejestrację i powrócić do strony głównej (Rycina 6I-2) przed usunięciem butelek MWF.
  8. Aby wyjąć kartę SD w celu przesłania danych, dotknij przycisku Eject SD przed odłączeniem karty SD (Rycina 6G). Włóż kartę SD do dowolnego komputera i skopiuj plik danych .csv nazwany według daty podania butelki na ten komputer (Rycina 6K). Aby ponownie zamontować kartę SD do następnej rejestracji, włóż kartę do interfejsu i dotknij przycisku Mount SD (Rycina 6J).
    UWAGA: Zalecamy codzienne tworzenie kopii zapasowych plików danych.
  9. Zaleca się ograniczenie pomiarów masy ciała do jednego razu w tygodniu, jeśli jest to zgodne z modelem zwierzęcym i protokołem wykorzystania zwierząt, oraz wykonywanie tego zadania w dniu wyznaczonym na wymianę klatki, aby zminimalizować niepotrzebne zakłócenia pracy likometrów i czujników. Odłącz wszystkie męskie kable likometrów od odpowiadających im żeńskich kabli czujników przed przesunięciem klatek. Po zważeniu każdego szczura przenieś go do czystej klatki. Przenieś likometr na nową górną część klatki i w razie potrzeby ponownie podłącz każdy likometr do odpowiedniego czujnika.
  10. W przypadku eksperymentów badających wpływ interwencji (np. iniekcji leku) na pobór EtOH i mikrostrukturę picia, zaplanuj takie interwencje przed rozpoczęciem sesji picia, whenever possible. W sytuacjach, gdy nie jest to możliwe, badacze mogą przerwać detekcję liznięć, dotykając przycisku Pause (Rycina 6I-2) i wznowić przechwytywanie danych, dotykając przycisku Resume po zakończeniu interwencji. Sugerujemy ważenie butelek podczas każdej przerwy w sesji picia, aby uchwycić zmiany w poborze EtOH przed i po interwencji, a także uwzględnić ewentualny wyciek, który może wystąpić podczas zdejmowania górnej części klatki w celu uzyskania dostępu do zwierzęcia.
  11. Po zakończeniu badania wszystkie komponenty w klatce powinny zostać dokładnie zdezynfekowane przed użyciem z nowymi zwierzętami, aby ograniczyć przenoszenie zanieczyszczeń między zwierzętami. Zalecamy delikatne spryskiwanie i przecieranie likometru 70% roztworem EtOH, dbając o to, aby nie uszkodzić wewnętrznych komponentów elektrycznych. Blokadę pipetek i panel akrylowy można myć w ciepłej wodzie z mydłem.

5. Analiza danych

  1. Przed oceną miar zależnych należy skorygować dane dotyczące spożycia o rozlanie, które nieuchronnie występuje podczas codziennej wymiany butelek. W tym celu oblicz średnią zmianę masy butelek z EtOH i H2O w klatkach kontrolnych (spillage cage) w trakcie całego okresu badania.
  2. Wyklucz wszelkie wartości przekraczające dwa odchylenia standardowe od średniej dla każdej butelki. Po usunięciu tych wartości odstających, odejmij obliczone średnie od zmian masy butelek z EtOH i H2O uzyskanych z klatek zawierających zwierzęta. Dzięki odjęciu tej wartości badacze mogą mieć pewność, że średnia strata wynikająca z rozlania danego roztworu nie jest uwzględniana w pomiarach spożycia. Odjęcie średniej ilości rozlanego płynu może w niektórych przypadkach prowadzić do uzyskania wartości ujemnej dla niektórych zwierząt. Takie wartości należy zamienić na zero i interpretować jako brak spożycia danego roztworu.
  3. Głównymi miarami zależnymi w eksperymentach z wyborem spożycia z dwóch butelek są spożycie EtOH (g/kg) oraz preferencja (%). Oblicz spożycie na podstawie zmiany masy butelki z EtOH (g) i znormalizuj do masy ciała (kg), wykonując następujące kroki:
    1. Przelicz zmianę masy butelki (g) na zmianę objętości (mL), korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-1
      Gęstość czystego etanolu wynosi 0.789 g/mL. Zatem gęstość wkładu 20% EtOH wynosi 0.1578 g/mL. H2O ma gęstość 1 g/mL, zatem gęstość wkładu 80% H2O = 0.80 g/mL. W konsekwencji każdy 1 mL roztworu 20% EtOH (v/v) składa się z 0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 g/mL. Zatem ostateczne równanie przy zastosowaniu stężenia 20% (v/v) EtOH to:
      figure-protocol-2
    2. Oblicz dawkę spożytego etanolu, korzystając z poniższego równania. Aby obliczyć ilość spożytego etanolu w stosunku do masy ciała zwierzęcia, użyj masy ciała uzyskanej w tym samym tygodniu, co dane o spożyciu.
      figure-protocol-3
    3. Oblicz preferencję, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-4
  4. Podobnie jak jego odpowiednik dla myszy30, system LIQ HDR rejestruje szereg zmiennych mikrostruktury picia, w tym czas trwania lizania, liczbę serii, czas trwania serii, liczbę liznięć w serii oraz czas trwania liznięć w serii (Rysunek 6K). Seria picia definiowana jest jako ciąg liznięć, który rozpoczyna się od co najmniej 3 liznięć wykonanych w czasie krótszym niż 1 s i kończy po upływie 3 s bez kolejnych liznięć. Pomiary te mogą być następnie wykorzystane do obliczenia średniego czasu trwania pojedynczego liznięcia, średniego czasu trwania pojedynczej serii, średniej liczby liznięć na serię, średniej częstotliwości lizania, szacowanego odstępu między liznięciami oraz szacowanego odstępu między seriami.
    UWAGA: Interfejs mikrokontrolera dostarcza te dane mikrostrukturalne z rozdzielczością 1-minutową w pliku .csv (Rysunek 6K). Badacze mogą korzystać z aplikacji analitycznej dostarczonej w oryginalnym protokole LIQ HD30 lub z preferowanej platformy do post-processingu, aby gromadzić i podsumowywać dane zgodnie z potrzebami badawczymi. Dane mikrostrukturalne są zazwyczaj sumowane w całym 24-godzinnym okresie, aby porównać średnie różnice na poziomie makro, lub w przedziałach od 30 min do 1 h, aby zbadać zmienność wzorców picia w cyklu światło-ciemność.

Wyniki

Standardowe dane dotyczące spożycia EtOH w domowej klatce w modelu przerywanego wyboru między dwiema butelkami
Stosując standardową procedurę (Rysunek 7A), badacze mogą zarejestrować spożycie z 24 h (Rycina 7B-D) oraz picie w typie napadowym, jeśli masy butelek są zbierane krótko po rozpoczęciu sesji picia (Ryciny 7E-F). Obliczając spożycie etanolu w stosunku do spożycia wody, badacze mogą również uzyskać dane dotyczące preferencji we wszystkich mierzonych punktach czasowych (Rysunki 7D,F). Jak pokazano w Rycina 7Cszczury często wykazują okres wzrostu spożycia etanolu w ciągu pierwszych kilku dni dostępu do dwóch butelek z wyborem. Następuje po nim plateau, podczas którego spożycie pozostaje względnie stabilne. Choć zjawisko to jest konsekwentnie obserwowane u samców szczurów7,32,33,34,35,36ten wzorzec nie zawsze jest obserwowany u samic. Zamiast tego niektóre badania wykazują stabilne poziomy spożycia etanolu przez cały okres badania u szczurów samic37,38Ponadto niektóre badania sugerują, że spożycie etanolu może ulec dalszemu zwiększeniu przy dłuższym okresie dostępu.36,39Dzienne spożycie może się znacznie różnić w zależności od osobnika. Jednakże średnie dzienne spożycie zostało dobrze scharakteryzowane dla szczepów najczęściej stosowanych w badaniach nad alkoholem i może służyć jako punkt odniesienia do oceny sukcesu przy analizie danych grupowych.7,8,33,34,35,39.

Jak pokazano na Rysunku 7E, wiele szczurów spożywa znaczną część swojej dziennej dawki etanolu krótko po rozpoczęciu sesji picia8,3. Taki wzorzec spożycia etanolu, przypominający picie impulsywne (binge-like), jest często związany z wyraźną preferencją etanolu nad wodą (Rysunek 7F). Badacze nie powinni być jednak zaskoczeni, jeśli preferencja w ciągu 24 h nie przekroczy 50%. Dotyczy to szczególnie szczurów z linii niewymieszanych lub linii niepreferujących alkoholu, a także badań ograniczonych do stosunkowo krótkich okresów dostępu do wyboru między dwiema butelkami7,32,3,35,37.

Walidacja systemu LIQ HDR dla mikrostruktury analizy wyboru między dwiema butelkami
Dodanie systemu LIQ HDR do standardowego paradygmatu wyboru między dwiema butelkami u szczurów pozwala badaczom na dokładne i precyzyjne przewidywanie spożycia na podstawie zarejestrowanych danych o piciu. Potwierdza to obecność silnej i istotnej korelacji między skumulowaną liczbą wykrytych polizań a zmianą masy butelek zarówno dla EtOH (R2 = 0,789, F(1,113) = 398,1, p < 0,001), jak i butelki z H2O (R2 = 0,7910, F(1,17) = 42,9, p < 0,01) w okresie 24 h (Rycina 8A). Obowiązuje to również w dniach, w których szczury otrzymały dwie butelki zawierające H2O (R2 = 0,875, F(1,18) = 1484, p < 0,001; Rycina 8B).

LIQ HDR umożliwia również precyzyjną analizę wzorców picia z wysoką rozdzielczością czasową, której nie zapewnia standardowy paradygmat wyboru między dwiema butelkami. Stosując to podejście, badacze mają możliwość badania różnic we wzorcach picia pomiędzy różnymi roztworami, w obrębie cyklu świetlnego, między płciami, grupami lekowymi i nie tylko. Dla przykładu, pogrupowanie średniej liczby polizań w interwały 30-minutowe pozwala na łatwą analizę średnich 24-godzinnych wzorców picia. Zgodnie z oczekiwaniami, analiza ta wykazuje znacznie wyższe spożycie zarówno EtOH, jak i H2O podczas cyklu ciemnego, kiedy szczury są aktywne, niż w cyklu świetlnym, kiedy szczury zazwyczaj śpią (Rysunek 8C). Stosując podobne podejście, badacze mogą badać różnice grupowe we wzorcach picia. Na przykład mikrostrukturę picia można porównać między samcami a samicami szczurów, badając średnią liczbę polizań EtOH (Rysunek 8D) lub wody (Rysunek 8E) w okresie 24 h. Aby zbadać zjawisko front-loadingu i/lub picia epizodycznego (binge-like drinking), badacze mogą zwiększyć rozdzielczość analizy, koncentrując się na piciu występującym krótko po rozpoczęciu sesji, stosując mniejsze okno grupowania danych. Pozwala to badaczom na analizę okresów picia epizodycznego bez konieczności wielokrotnego ważenia butelek w ciągu 24 h. Jak pokazano na Rysunku 8C (wstawka), analiza ta ujawnia, że większość picia odnotowana przy wadze butelki zmierzonej 30 min po rozpoczęciu sesji ma miejsce w ciągu pierwszych 5 min, a nie w całym 30-minutowym okresie. Dane tego typu mogą pomóc w identyfikacji optymalnych momentów pobierania próbek krwi w celu pomiaru stężenia etanolu we krwi (BEC). Rzeczywiście, podobny wzorzec front-loadingu zaobserwowano w osobnym dniu picia, podczas którego wysokorozdzielcze wzorce picia rejestrowano w okresie tak krótkim jak 15 min (Rysunek 8F). Średnia liczba polizań zarejestrowana podczas tej sesji wiarygodnie przewidywała zmianę wagi butelki (EtOH: R2 = 0.6316, F(1,10) = 17.15, p = 0.020; H2O: R2 = 0.8601, F(1,10) = 61.47, p < 0.001; Rysunek 8G). Co więcej, wartości BEC pobrane z próbek krwi 15 min po rozpoczęciu sesji dobrze korelowały z wykrytą liczbą polizań (R2 = 0.4327, F(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Rysunek 8H), nawet przy stosunkowo niskich poziomach spożycia EtOH.

System LIQ HDR rejestruje różne parametry mikrostruktury picia, które są wykrywane i obliczane w czasie rzeczywistym podczas sesji picia, a następnie zapisywane w 1-minutowych przedziałach, podobnie jak w przypadku detekcji lizania (Ryc. 6K). Parametry te zostały krótko opisane w kroku 5.4 oraz zdefiniowane wcześniej30. Badacze mogą przeprowadzać szczegółowe analizy zmian w indywidualnej mikrostrukturze picia i badać, w jaki sposób i w jakim stopniu wzorce picia wpływają na różnice w całkowitym spożyciu. Dla przykładu stwierdzono, że choć samce i samice szczurów wykazywały podobną liczbę liznięć, serii picia oraz długość serii (Ryc. 9A-C) podczas picia wody, wiązało się to z większym całkowitym spożyciem (g/kg) u samic niż u samców (test t; t=2.82, df=10, p=0.0163; Ryc. 9D). Jest to oczekiwane ze względu na dymorfizm płciowy w masie ciała, co ułatwia osiągnięcie wyższych poziomów spożycia w stosunku do masy ciała u samic niż u samców przy tej samej liczbie liznięć. Uderzające jest to, że stoi to w sprzeczności z porównaniem różnic płciowych w wzorcach mikrostruktury dla EtOH, które wykazało podobną mikrostrukturę picia powiązaną z podobnymi poziomami spożycia EtOH (Ryc. 9E-H). Dane te sugerują, że podczas gdy objętość jednego liznięcia wody jest podobna między płciami, samice szczurów mają mniejszą objętość liznięcia EtOH w porównaniu do samców. Wspólnie te dane mikrostrukturalne wspierają tezę, że samce i samice szczurów prawdopodobnie różnią się strategiami dobrowolnego picia w zależności od rodzaju spożywanego płynu w warunkach klatki domowej. W poprzednich pracach zgłaszano również różnice płciowe w strategiach picia zależne od rodzaju płynu40,41, choć różnice zaobserwowane w tych badaniach nie ograniczały się tylko do spożycia wody. Długość historii picia może odgrywać rolę w różnicach zaobserwowanych między badaniami, ponieważ picie z wyboru z dwóch butelek było ograniczone do 5 tygodni w obecnym zbiorze danych, podczas gdy w poprzednich pracach przekraczało ono 12 tygodni40,41.

figure-results-1
Rysunek 1Picie w klatce domowej z wyborem między dwiema butelkami. (A) Badacze mogą mierzyć dobrowolne spożycie i preferencję etanolu w klatce domowej (w stosunku do wody), stosując standardową metodę polegającą na obliczaniu ilości spożycia na podstawie zmiany masy butelek. (B) Dzięki zastosowaniu LIQ HDR – niskokosztowego, samodzielnie konstruowanego systemu detekcji lizania w klatce domowej, zaprojektowanego dla szczurów – badacze mogą uzyskać takie same pomiary, jak w standardowej procedurze wyboru między dwiema butelkami, jednocześnie rejestrując mikrostrukturę picia o wysokiej rozdzielczości przez cały okres pomiaru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

figure-results-2
Rysunek 2: Konstrukcja jednostek czujników pojemnościowych. (A) Elementy elektroniczne i schemat połączeń. (B) Materiały do konstrukcji trzech jednostek czujników pojemnościowych wymaganych do budowy jednego systemu LIQ HDR. (C) Przylutuj kable z 2-pinowymi złączami żeńskimi dla klatek #1-6 do pinów #0-1 płytki A i zabezpiecz połączenia lutownicze klejem na gorąco. Oznacz kable kolorami za pomocą kolorowych rurek termokurczliwych i przypisz każdemu unikalny numer identyfikacyjny likometru. (D) Podłącz płytkę A oraz konwerter poziomów napięć z 5V na 3V do punktu końcowego (EndPoint) komunikacji różnicowej I2C za pomocą kabli 4-pinowych (1), a następnie umieść płytkę A i moduł komunikacyjny w obudowie wydrukowanej w technologii 3D (2-3). (E) Zmień adresy I2C płytek B i C, przylutowując przewód połączeniowy z pinu ADDR odpowiednio do pinów 3Vo oraz SDA. (F) Przylutuj kable z 2-pinowymi złączami żeńskimi do płytek czujników B i C, oznacz je odpowiednimi identyfikatorami likometrów i podłącz płytkę B do punktu pośredniego (MidPoint) komunikacji, a płytkę C do punktu końcowego (EndPoint) za pomocą kabli 4-pinowych. (G) Umieść jednostki czujników B i C w ich odpowiednich obudowach wydrukowanych w 3D i połącz szeregowo wszystkie trzy jednostki za pomocą kabli Ethernet. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Budowa lizmometru LIQ HDR. (A) Render 3D komponentów wewnątrz klatki. (B) Materiały do przygotowania jednego lizmometru dwubutelkowego. Należy pamiętać, że jeden system LIQ HDR pomieści 18 lizmometrów dwubutelkowych. (C) Przedłużenie długości kabla z męskim złączem 2-pinowym za pomocą pary czarnych i czerwonych przewodów oraz oznaczenie kolorystyczne rurkami termokurczliwymi. (D) Przeciągnięcie czarnych i czerwonych przewodów przez otwory lewy (L) i prawy (R) w uchwycie butelki (1) oraz przylutowanie końców do taśm miedzianych (2-3). (E) Przyklejenie taśm miedzianych do wewnętrznych ścianek uchwytów ssawki (1-2) i wzmocnienie ich klejem na gorąco (3-4). (F) Przeciągnięcie kabla przez osłonę kabla. (G) Montaż klipsa do kabla. (H) Oznaczenie złącza odpowiadającym numerem identyfikacyjnym lizmometru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Instalacja likometru. (A) Użyj taśmy izolacyjnej, aby odizolować metalowe pręty wokół otworów pipety na metalnej górze klatki. (B) Zamontuj likometr i panel akrylowy do góry klatki za pomocą dwóch zestawów śrub i nakrętek M5. (C) Przymocuj klips do kabla do zewnętrznego pręta drutowej góry klatki. (D) Upewnij się, że dla każdej klatki użyto odpowiedniego ochronnika kabla (lewy L lub prawy R). (E) Upewnij się, że wystają tylko ~2 cm pipet z butelek (1), tak aby po umieszczeniu butelek na klatce (2) jedynie same końcówki pipet wystawały poza panel akrylowy i były dostępne dla szczurów. (F) Górna część filtra powinna pasować na klips do kabla, nie przeszkadzając samemu kablowi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Instalacja i użycie blokady poidełek. (A) Rendering 3D blokady poidełek. (B) Dedykowane części wydrukowane w 3D dla jednej blokady poidełek. (C) Montaż części wydrukowanych w 3D. (D) Instalacja zmontowanej blokady poidełek na górze klatki za pomocą śruby M5 + nakrętki + podkładki. (E) Obrót tarczy zgodnie z ruchem wskazówek zegara w celu zablokowania dostępu do poidełek. (F) Obrót tarczy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w celu usunięcia blokad z poidełek (1), uniesienia blokad i obrócenia ich o 90° (2), a następnie dalszy obrót tarczy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż blokady znajdą się nad górną częścią klatki (3-4). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Konfiguracja wiwarium i obsługa interfejsu GUI. (A) Zalecana konfiguracja wiwarium i schemat okablowania. (B) Zamontuj każdą jednostkę czujnika na regale, a następnie ułóż i przymocuj kable czujników do regału. (C) Zamontuj interfejs mikrokontrolera na regale i podłącz jego 4-pinowy zworkowy łącznik do konwertera poziomów napięcia z 5V na 3V podłączonego do jednostki czujnika A. (D) Zabezpiecz dodatkowy przewód uziemiający taśmą izolacyjną. (E) Podłącz kable czujników do odpowiednich kabli lickometru. (F) Podłącz zasilacz, aby uruchomić interfejs mikrokontrolera. (G) Strona główna interfejsu GUI. (H) Stuknij Settings, aby dostosować czas włączania/wyłączania świateł do harmonogramu oświetlenia wiwarium (1), oraz stuknij Sensor Settings, aby dostosować progi dotknięcia i zwolnienia dla szczurów (2). (I) Aby zarejestrować dane, wybierz stronę z butelką EtOH na stronie głównej, stuknij START!, aby skalibrować czujniki (1) i rozpocząć rejestrację (2). Stuknij Refresh, aby zaktualizować liczbę liznięć wyświetlaną na ekranie, oraz stuknij Save & Quit, aby zatrzymać rejestrację. (J) Stuknij Eject SD na stronie głównej, aby wysunąć kartę SD i przesłać dane. Stuknij Mount SD po włożeniu karty SD. (K) Zrzut ekranu  reprezentatywnego pliku z surowymi danymi, ilustrujący sposób zapisywania danych mikrostrukturalnych w 1 min bin przez interfejs mikrokontrolera. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywne dane dotyczące spożycia płynów w teście wyboru między dwiema butelkami, zarejestrowane zgodnie ze standardową procedurą. W paradygmacie okresowego dostępu do dwóch butelek z płynami w klatce domowej, (A) szczury otrzymują 20% (v/v) roztwór EtOH (pomarańczowy) oraz H2O (niebieski) w poniedziałki, środy i piątki (MWF), a dwie butelki zawierające H2O we wtorki, czwartki i weekendy. (B) Pomiary dziennego spożycia płynów wykazują, że podczas gdy szczury utrzymują stosunkowo stały poziom całkowitego spożycia płynów (mL) przez cały okres badania, (C) zwierzęta często wykazują wzrost spożycia EtOH w ciągu pierwszych kilku sesji picia, po których poziom spożycia osiąga plateau. (D) Ten wzorzec wzrostu i utrzymywania się poziomu spożycia jest analogicznie odzwierciedlony w preferencji EtOH. Badacze mogą również zarejestrować spożycie EtOH o charakterze napadowym (E), jeśli wagi butelek zostaną zmierzone po pierwszych 30-60 min od rozpoczęcia sesji. (F) Jest to często powiązane z wysoką preferencją EtOH nad H2O. Zacieniowane słupki błędu reprezentują ± SEM (n = 32 dla samców i n = 16 dla samic). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: System LIQ HDR precyzyjnie rejestruje spożycie w wysokiej rozdzielczości czasowej. Precyzja i dokładność systemu LIQ HDR są potwierdzone, częściowo, przez obecność istotnej dodatniej korelacji między liczbą liznięć a zmianą masy butelki w dniach, gdy szczury otrzymują (A) H2O i EtOH, a także w (B) dniach, gdy obie butelki zawierają H2O. (C) Różnice w wzorcach picia między H2O (niebieski) a EtOH (pomarańczowy) w ciągu 24-godzinnego okresu picia można łatwo ocenić poprzez pogrupowanie średniej liczby liznięć w interwały 30-minutowe. Wstawka odpowiada średniej liczbie liznięć w 5-minutowych przedziałach podczas pierwszych 30 min dostępu do butelki (wyróżnione na szaro), w czasie których szczury często wykazują istotne zachowanie typu front-loading. Różnice międzygrupowe we wzorcach picia można również badać stosując podobne podejście, co zilustrowano mikrostrukturą liznięć dla (D) EtOH i (E) H2O przedstawioną dla samców i samic szczurów w okresie 24 h. (F) Wzorce picia można również oceniać w wysokiej rozdzielczości czasowej w krótszym okresie testowym, (G) podczas którego LIQ HDR nadal dokładnie śledzi spożycie i (H) przewiduje stężenie etanolu we krwi (BEC) nawet przy stosunkowo niskich poziomach spożycia EtOH. Zacieniowane słupki błędów reprezentują ± SEM (n = 6 dla każdej płci). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Reprezentatywne dane dotyczące mikrostruktury picia. LIQ HDR umożliwia rejestrowanie parametrów mikrostruktury picia, w tym (A) liczby liznięć, (B) liczby epizodów picia oraz (C) długości epizodu, a ponad to (D) pomiar całkowitego spożycia wody na podstawie zmiany wagi butelki. (E-H) Podobne pomiary można uzyskać dla etanolu. Porównania tych parametrów między grupami pozwalają zidentyfikować odmienne wzorce picia, co widać w niniejszym przykładzie, wykazującym różnice między płciami w strategiach picia w zależności od spożywanego roztworu. Linia ciągła oznacza medianę, a linie przerywane kwartyle (n = 6 dla każdej płci); nieparzysty test t; *p < 0.05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Budowa interfejsu mikrokontrolera. (A) Schemat połączeń i części elektronicznych. (B) Materiały do budowy interfejsu mikrokontrolera wymagane dla jednego systemu LIQ HDR. (C) Na tylnej stronie tarczy dotykowej pojemnościowej należy dodać zworkę lutowniczą pomiędzy polami lutowniczymi podświetlenia. (D) Na tylnej stronie tarczy rejestratora danych należy przeciąć ścieżkę pola zworki dla pinu CS (1). Przylutować przewód zworki od pinu CS do pinu nr 7 (2). (E) Przylutować piny głowicowe do rejestratora danych, używając tarczy dotykowej jako podstawy. (F) Nałożyć pozostałą głowicę 2x4 na mikrokontroler (1), nałożyć rejestrator danych na mikrokontroler i przylutować głowicę na miejscu (2). (G) Włożyć baterię pastylkową do rejestratora danych (1), nałożyć ekran dotykowy na rejestrator danych i włożyć kartę SD do rejestratora danych (2). (H) Aby wykonać dodatkowy przewód uziemiający, należy odciąć jeden konektor męski od przewodu zworki i przylutować koniec do odizolowanego drutu jednościowego. (I) Podłączyć 4-pinowe przewody zworki oraz dodatkowy przewód uziemiający do mikrokontrolera (1) i zabezpieczyć klejem na gorąco (2). (J) Umieścić interfejs mikrokontrolera w niestandardowej obudowie wydrukowanej w technologii 3D. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecny protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przechwytywania danych dotyczących picia etanolu przy użyciu procedury klatki domowej z przerywanym dostępem do dwóch butelek. Metoda ta może być wdrożona ze względną łatwością i przy niewielkich lub zerowych kosztach lub potrzebie specjalistycznego sprzętu badawczego. Korzystając z przedstawionych tutaj procedur do konstruowania i wdrażania LIQ HDR - systemu wykrywania lizawek do stosowania u szczurów - naukowcy mogą rejestrować dane o mikrostrukturze picia o wysokiej rozdzielczości, oprócz standardowych pomiarów spożycia i preferencji.

Harmonogram przerywanego dostępu opisany w obecnym protokole jest szeroko stosowaną procedurą w dużej mierze dlatego, że jest dobrze znany z tego, że powoduje wyższe poziomy spożycia etanolu niż wiele alternatywnych harmonogramów dostępu do etanolu. Rzeczywiście, wcześniejsze badania wykazały, że szczury z dostępem w trybie przerywanym mają wyższe średnie dzienne spożycie etanolu niż szczury z ciągłym dostępem przez 24 godzinyna dobę 6,7. Niemniej jednak pożądane mogą być różne harmonogramy dostępu do etanolu w zależności od pytania badawczego lub innych parametrów projektu eksperymentalnego. Naukowcy mogą bardzo łatwo zmodyfikować obecny protokół, aby dostosować go do różnych harmonogramów (np. ciągły dostęp, picie w ciemności itp.), po prostu zmieniając czas i dni włączania i wyłączania butelki.

Chociaż picie z dwóch butelek jest stosunkowo prostym do wdrożenia paradygmatem, mogą pojawić się problemy, które mogą zagrozić gromadzeniu danych. Dlatego tak ważne jest, aby eksperymentatorzy codziennie sprawdzali dane, aby szybko zidentyfikować potencjalne problemy. W szczególności badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na bardzo duże lub bardzo małe zmiany w wadze butelek, które mogą wskazywać odpowiednio na nieszczelny lub zatkany łyk. Wczesne wychwycenie oznak tych problemów może zapobiec wykluczeniu z analizy wszystkich danych z danego tematu. Rzeczywiście, jeśli badacze zauważą drastyczne zmiany (lub brak zmian) w wadze butelki w ciągu 24 godzin, prosta zmiana na nową butelkę może pomóc w potwierdzeniu, czy dana butelka powinna zostać wycofana z obiegu. Z tych powodów dobrze jest mieć pod ręką dodatkowe butelki i popijaki. Należy jednak zauważyć, że niektóre szczury naturalnie wykazują bardzo niski poziom picia etanolu, np. 35. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku szczurów niektórych szczepów, patrz8 w celu przeglądu. Dlatego naukowcy nie powinni być zaniepokojeni, jeśli niewielka populacja zwierząt w danym eksperymencie ma niskie spożycie etanolu lub nie ma go wcale. Podobnie, niektóre zwierzęta mają skłonność do zabawy łykiem/butelką w sposób, który może sprzyjać rozlaniu. Chociaż rzadko, powtarzające się przypadki dużych zmian masy butelki, które nie są związane ze spożyciem, mogą wymagać usunięcia określonego zwierzęcia z eksperymentu.

Nasz szczegółowy protokół krok po kroku pokazuje łatwość wdrożenia i użytkowania systemu LIQ HDR dla szczurów. Badacze bez wcześniejszej wiedzy lub umiejętności w zakresie elektroniki mikrokontrolerów i programowania mogą łatwo dostosować ten system do swoich potrzeb eksperymentalnych z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami. Nasze reprezentatywne dane dodatkowo wskazują na jego udane zastosowanie w badaniach nad piciem w klatkach dla szczurów w domach i jego potężną zdolność do uchwycenia wielu pomiarów mikrostruktury picia w wysokiej rozdzielczości czasowej. LIQ HDR zawiera kilka modyfikacji konstrukcyjnych w stosunku do swojego poprzednikamyszy 30. Zostało to zrobione nie tylko ze względu na konieczność udanej adaptacji do stosowania u szczurów, ale także w celu poprawy funkcjonalności i doświadczenia użytkownika. Elementy w klatce, w tym wydrukowany w 3D uchwyt na butelkę, blokada łyków i elementy elektroniczne, są przenoszone na górę klatki w celu ochrony przed żuciem, co może skutkować częstą i znaczną utratą danych oraz rotacją sprzętu. Dodanie wycinanego laserowo panelu akrylowego dodatkowo pomaga zapobiegać zniszczeniu tych wrażliwych elementów. Poza panelem akrylowym, który jest wykonany z tego samego materiału, co standardowa klatka dla szczurów w pudełku po butach, wszystkie inne elementy LIQ HDR są niedostępne dla zwierzęcia z wnętrza klatki lub dostępne tylko na krótką chwilę podczas zmiany butelki. Taka konstrukcja ogranicza możliwość zniszczenia elementów urządzenia i ryzyko dla zwierzęcia w wyniku spożycia produktów nieżywnościowych. W przeciwieństwie do stosunkowo pracochłonnych butelek na zamówienie używanych w projekcie LIQ HD, wydrukowany w 3D UCHWYT NA BUTELKĘ LIQ HDR został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z dostępnymi na rynku butelkami do picia dla gryzoni. Butelki są instalowane na górze klatki i są dostępne dla szczurów w taki sam sposób, jak butelki do picia są stosowane podczas standardowej pielęgnacji i hodowli. Dodanie blokerów sipper jest prostym, ale skutecznym rozwiązaniem, które poprawia niezawodność systemu i zapobiega utracie cennych danych, które w przypadku braku blokera mogą wynikać z picia, które ma miejsce przed zainicjowaniem przechwytywania danych na interfejsie Arduino lub błędnych pomiarów lizania, które występują, gdy szczury wchodzą w interakcję z łykami podczas codziennej kalibracji. Podczas gdy znacznie większe klatki dla szczurów wymagają zwiększenia rozmiaru oryginalnego projektu sprzętu, użycie znacznie dłuższych kabli może negatywnie wpłynąć na czułość i dokładność wykrywania pojemnościowego z powodu zakłóceń, a także na integralność komunikacjiI2Cmiędzy łańcuchowymi płytkami czujników a interfejsem Arduino. Obejście tego problemu polega na zastosowaniu systemu komunikacji różnicowej I2C w celu uzyskania ultradalekiego zasięgu, prawie bezstratnej transmisji sygnału za pośrednictwem kabli Ethernet. Materiały użyte do produkcji komponentów w klatce pozwalają na łatwe czyszczenie i dezynfekcję między użyciami. Linkometr można spryskać i przetrzeć 70% roztworem EtOH, przy czym należy zachować ostrożność, aby elementy elektryczne, takie jak przewodząca taśma miedziana, pozostały nienaruszone. Sprzęt nieelektryczny, który ma bezpośredni kontakt ze zwierzęciem, taki jak bloker łyka i panel akrylowy, można dokładnie umyć ciepłą wodą z mydłem.

Niezawodność i skuteczność każdego systemu wykrywania lizawek wymaga odpowiedniej konstrukcji i instalacji, a także szeroko zakrojonych testów, starannego monitorowania błędów i skutecznego rozwiązywania problemów. Wszystkie elementy do majsterkowania muszą być wykonane i zmontowane z wprawą i starannością. Jest to szczególnie ważne w przypadku etapów związanych z, które mogą wymagać praktyki dla początkujących. Niezależnie od tego, przed użyciem w rzeczywistych eksperymentach wymagane jest szeroko zakrojone testowanie wszystkich likometrów. Jeśli system musi zostać zmodyfikowany w celu dostosowania do indywidualnych potrzeb eksperymentalnych, ustawienia czujnika (np. progi dotyku i zwolnienia) mogą wymagać dalszego dostrojenia w celu dokładnego wykrywania lizania. Dla początkujących użytkowników sugerujemy przetestowanie systemu w krótkim, pilotażowym badaniu na małej próbie przy użyciu wysoce smacznego roztworu, który spowoduje wysoki poziom picia. Wykrywanie lizawki można zweryfikować w czasie rzeczywistym, dokonując wizualnej kontroli płytki czujnika, ponieważ dioda LED za każdym razem, gdy zarejestrowane jest lizawki. Silne, znaczące i stałe korelacje między liczbą lizawek a zmianą wagi butelki powinny być wykorzystywane jako punkt odniesienia dla prawidłowej konfiguracji sprzętu i oprogramowania. Nawet po sfinalizowaniu konfiguracji zalecamy rozpoczęcie nagrywania dla danego eksperymentu w dniu, w którym szczury otrzymują dwie butelki zawierające wodę, w celu rozwiązania problemów ze sprzętem, które mogą być widoczne na początku eksperymentu. Korzystne może być również przetestowanie funkcji likometru w dniu wodnym w związku ze zmianą klatki, ponieważ wymaga to odłączenia likometrów i ponownego podłączenia do czujnika. Losowa awaria pojedynczego lizometru lub czujnika, która skutkowałaby bardzo oczywistymi danymi odstającymi (np. brak lub wykryto niewiele lizawek pomimo znacznej zmiany masy butelki) konsekwentnie dla tego samego lizometru, wskazuje na wadliwy komponent (elementy). Zalecamy wcześniejsze przygotowanie dodatkowych komponentów do każdego elementu systemu likometru, aby umożliwić łatwą wymianę w razie potrzeby. Wreszcie, nie można przecenić znaczenia upewnienia się, że kable czujników nie zachodzą na siebie ani nie zginają się nadmiernie. Może to skutkować losowymi przypadkami słabego wykrywania lizania, widocznym przez nieracjonalnie niską liczbę lizania dla danej zmiany wagi butelki lub bardzo długi czas lizania (blisko 60 000 ms dla 1-minutowego pojemnika) obejmujący minuty lub godziny. Niemniej jednak niewielkie straty danych są nieuniknione w badaniach, w których dane zbiera się w ciągu 24 godzin dla wielu zwierząt przez wiele dni przy użyciu podejścia standardowego lub wyposażonego w lizometr. Badacze mogą wykluczyć błędne dane dotyczące rzadkich sesji picia, gdy waga butelki i/lub lizanie wyraźnie nie odzwierciedlają spożycia (np. zatkanie łyka, błąd kalibracji itp.). W takich przypadkach średnia wartość dla danej miary (np. spożycia (g/kg), lizania itp.) w okresie badania dla tego konkretnego podmiotu może zostać zastąpiona brakującą wartością podczas analizy danych. ANOVA z efektami mieszanymi może być również używana jako alternatywa w celu uzupełnienia brakujących punktów danych.

Jedną z zalet paradygmatu picia z wyboru dwóch butelek jest dobrowolny aspekt przyjmowania etanolu. Zapewnia to doskonałą trafność twarzy, szczególnie w świetle wyników pokazujących, że alkohol podawany przez eksperymentatora może mieć znacząco różny wpływ na funkcjonowanie mózgu i zachowanie w porównaniu z dobrowolnie podawanym alkoholem42. Co więcej, dobrowolny charakter paradygmatu pozwala naukowcom uchwycić indywidualne różnice w spożyciu, podobne do zmienności preferencji alkoholowych i wzorców picia obserwowanych u ludzi. Te indywidualne różnice mogą stanowić potężną okazję dla badaczy do skorelowania konsumpcji (spożycia i/lub wzorców) z wielkością obserwowanych efektów patologicznych.

Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia paradygmatu picia w klatce domowej z dwiema butelkami. Na przykład, chociaż indywidualna zmienność spożycia etanolu może być korzystna dla niektórych eksperymentów, może być wadą w innych eksperymentach, w których pożądany może być stały poziom odurzenia lub narażenia na etanol. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku eksperymentów badających konsekwencje uzależnienia i odstawienia od przewlekłego narażenia na etanol. Co ważne, picie z dwóch butelek nie jest charakteryzowane jako model uzależnienia - nawet u szczurów z dostępem do etanolu przez dłuższy czas. Tak więc, przy braku objawów towarzyszących odstawieniu, badacze powinni zachować ostrożność w interpretacji konsekwencji długotrwałego spożywania etanolu jako skutków uzależnienia i/lub odstawienia. Rzeczywiście, jest możliwe, jeśli nie prawdopodobne, że szczury pijące stosunkowo duże ilości etanolu podczas procedury wyboru dwóch butelek wykazują objawy odstawienia, ale szczury pijące mniejsze całkowite ilości w danym okresie 24 godzin nie wykazują podobnych objawów uzależnienia. Wzorce picia mogą również odgrywać ważną rolę w tych rozważaniach, ponieważ dwa zwierzęta pijące tę samą ilość w ciągu 24 godzin mogą doświadczać bardzo różnych poziomów zatrucia (tj. BEC) w zależności od wzorca spożycia etanolu22. Podkreśla to użyteczność LIQ HDR w procedurze wyboru dwóch butelek, ponieważ może łatwo zidentyfikować szczury, które spożywają daną dawkę etanolu w szybkim tempie (tj. łyk) w porównaniu z tymi, które spożywają tę samą dawkę w znacznie wolniejszym tempie (tj. łyk). Chociaż jest to potencjalnie niepożądane w badaniach oceniających skutki kontrolowanej dawki etanolu, wykrywanie zmian we wzorcach picia (np. zmniejszone epizody objadania się) po określonej interwencji eksperymentalnej ma znaczącą wartość translacyjną, biorąc pod uwagę podejście do redukcji szkód, które jest coraz częściej stosowane w klinice. Wreszcie, nie jest wymagany wysiłek, aby zwierzęta uzyskały dostęp do etanolu w paradygmatach picia w klatkach domowych, w tym w opisanym tutaj. Dlatego użyteczność tego paradygmatu ogranicza się do analizy samego picia, podczas gdy metody instrumentalne są preferowane w przypadkach, gdy badacze są zainteresowani badaniem poszukiwania alkoholu - co jest ważną cechą AUD.

Podsumowując, opisany tutaj protokół dostarcza naukowcom wszystkich informacji i zasobów niezbędnych do pomiaru spożycia etanolu przez szczury w klatce domowej. Przedstawiamy opcje podejść o stosunkowo niskiej i wysokiej rozdzielczości, zapewniając badaczom elastyczność w wyborze metody, która jest najbardziej odpowiednia dla ich potrzeb badawczych.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Josephowi Pitockowi i dr Katie Przybysz za pomoc techniczną podczas rozwoju LIQ HDR. Dziękujemy również Nicholasowi Petersenowi i dr Marie Doyle za wiele pomocnych rozmów podczas tworzenia LIQ HDR. Prace te były wspierane przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism przy National Institutes of Health (P50 AA022538 i R01 AA029130 do EJG).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dostępne na rynku komponentyIlość
12-klawiszowy pojemnościowy czujnik dotykowy (MPR121)Adafruit19823
2-pinowa para (raster JST XH 2,5 mm)Adafruit487218
4-pinowa zworka do płytki stykowej (Qwiic)SparkFunPRT-179121
4-pinowy (100mm Qwiic)SparkFunPRT-172591
4-pinowy (50mm Qwiic)SparkFunPRT-172603
przesuwnik poziomu 5V-na-3VAdafruit56371
Pojemnościowa osłona dotykowa (2,8 cala)Adafruit19471
Miedziana taśma przewodząca (1/4 cala)DigiKey4393-CFT-1/4-ND
1 Dane Osłona rejestracyjnaAdafruit11411
Zestaw do różnicowej komunikacji I2C (QwiicBus)SparkFunKIT-172501
Taśma izolacyjnaDigiKey3M156004-ND1
Rurka termokurczliwa (3/16 cala różne kolory)Opaski kablowe i więcejHS357-S106
Zestaw rurek termokurczliwych (4 cale)Jameco20959631
Litowa bateria pastylkowa (3V 12.5mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5 płaska podkładkaGrainger54FN661
M5 nakrętka sześciokątnaGrainger6CA721
śruba maszynowa M5 (12mm)Grainger6GU881
M5 śruba maszynowa (25mm)Grainger  6GU912
męski/męski przewód połączeniowyAdafruit19571
płytka mikrokontrolera (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND
1 filament PETG (2,85 mm srebrny)MatterHackersM-DDH-UZR2
2 filament PLA (2,85 mm)MatterHackersM-SEW-RUAW2
filament PLA (2,85 mm srebrny)MatterHackersM-66P-6CLE1
Zasilacz (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
karta pamięci SD/microSD (8GB)Adafruit12941
Nagłówki do układania w stosy Adafruit851
Drut z rdzeniem stałym (22AWG czerwony)Adafruit2881
Przewód linkowy (22AWG)Adafruit29761
Drut linkowy (22AWG czerwony)Adafruit30681
rurka sipper z nakrętką skręcaną z kulkąAlternatywny projektTCCN8.5-ST2.5SB38
Butelka na wodę (8 uncji)Alternatywny projektWB8FS38
niestandardowe komponenty drukowane w 3D< / mocny>Ilość
spód obudowy Arduino wydrukowany w 3DNie dotyczyARDUINO_Bottom.stl1
Górna część obudowy Arduino z nadrukiem 3DNie dotyczyARDUINO_Top.stl1
Klips kablowy drukowany w 3D LNie dotyczyCLIP_L.stl18
Nakrętka z klipsem kablowymwNie dotyczy CLIP_Nut.stl18
Klips kablowy drukowany w 3D RdotyczyCLIP_R.stl18
Uchwyt na butelkę z drukowanym w 3D likometremNie dotyczyLICKOMETER_Bottle Holder.stl19
Drukowana w 3D osłona liktometru LNie dotyczyLICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
Drukowana w 3D osłona likometru RNie dotyczyLICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
Drukowane w 3D litery likometruNie dotyczyLICKOMETER_Letters.stl19
Śruba montażowa drukowana w 3DNieŚruba mocująca.stl4
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D A dółNieSENSOR_A_Bottom.stl1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D A góraNieSENSOR_A_Top.stl1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D B dółNieSENSOR_B_Bottom.stl1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D B góraNieSENSOR_B_Top.stl1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D C dółNie dotyczySENSOR_C_Bottom.stl1
Wydrukowana w 3D obudowa czujnika C topN/ASENSOR_B_Top.stl1
Wydrukowane w 3D litery obudowyczujnika N/ASENSOR_Letters.stl1
Drukowana w 3D blokada sipperNd.SIPPER_Blocker.stl36
Wydrukowana w 3D podstawa blokująca sipperNie dotyczySIPPER_Base.stl18
Wydrukowana w 3D przekładnia blokująca sipperNie dotyczySIPPER_Gear.stl18
Nakrętka blokująca sipper z nadrukiem 3DN/ASIPPER_Nut.stl18
Drukowana w 3D śruba blokująca sipperNd.SIPPER_Worm.stl18
Wycinany laserowo panel akrylowy LizkometrN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
wydrukowana 3D Nie dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy

Bibliografia

  1. GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
  2. Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
  3. GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
  4. Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
  5. Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
  6. Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
  7. Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
  8. Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
  9. Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
  10. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  11. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  12. Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
  13. Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
  14. Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
  15. Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
  16. Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
  17. Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
  18. Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  19. Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
  20. Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
  21. Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
  22. Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
  23. Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
  24. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  25. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
  26. Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
  27. Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
  28. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
  29. Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
  30. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  31. Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
  32. Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
  33. Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
  34. Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
  35. Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
  36. Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
  37. Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
  38. Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
  39. Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
  40. De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
  41. Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
  42. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spo ycie alkoholu u gryzonimikrostruktura piciasystem lickometruprzyjmowanie etanolu przez szczurywzorce piciast enie etanolu we krwipicie epizodyczne binge like drinking
Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.