Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

Shikun Hou; Nathaly M. Arce Soto; Elizabeth J. Glover

doi:10.3791/67486

Artykuł metodologiczny

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 listopada 2024

Shikun Hou¹ , Nathaly M. Arce Soto¹ , Elizabeth J. Glover¹

¹Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje standardowy paradygmat picia w domowej klatce z przerywanym dostępem do dwóch butelek do modelowania spożycia alkoholu u szczurów. Ponadto zawiera instrukcje krok po kroku, aby rozszerzyć standardowy protokół o system wykrywania lizawek DIY, który umożliwia analizę mikrostrukturalną zachowań związanych z piciem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Picie w domowej klatce z dwoma butelkami jest jednym z najczęściej używanych paradygmatów do badania konsumpcji etanolu u gryzoni. W najprostszej formie zwierzęta mają zapewniony dostęp do dwóch butelek do picia, z których jedna zawiera zwykłą wodę z kranu, a druga etanol, przy czym dzienne spożycie mierzy się zmianą masy butelki w ciągu 24 godzin. W związku z tym takie podejście nie wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Chociaż taka łatwość wdrożenia jest prawdopodobnie największym czynnikiem przyczyniającym się do jej powszechnego przyjęcia przez przedklinicznych badaczy alkoholu, rozdzielczość danych dotyczących picia uzyskanych przy użyciu tego podejścia jest ograniczona przez liczbę pomiarów wagi butelki przez badacza (np. raz dziennie). Jednak chęć zbadania wzorców picia w kontekście ogólnego spożycia, interwencji farmakologicznych i manipulacji neuronalnych skłoniła do opracowania domowych systemów wykrywania lizania w klatkach, które mogą pozyskiwać dane na poziomie poszczególnych lizań. Chociaż wiele z tych systemów zostało opracowanych niedawno, system open source, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device), zyskał znaczną uwagę w tej dziedzinie ze względu na swoją przystępność cenową i łatwość obsługi. Chociaż ekscytujący, system ten został zaprojektowany do użytku u myszy. W tym miejscu dokonujemy przeglądu odpowiednich procedur dotyczących standardowego i wyposażonego w likometr picia w klatce domowej z dwiema butelkami. Wprowadzamy również metody dostosowania systemu LIQ HD do szczurów, w tym modyfikacje sprzętowe w celu dostosowania do większych rozmiarów klatki oraz przeprojektowany uchwyt na butelkę wydrukowany w 3D, kompatybilny ze standardowymi, gotowymi butelkami do picia. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą badać codzienne wzorce picia, a także poziomy spożycia u wielu szczurów równolegle, zwiększając w ten sposób rozdzielczość uzyskanych danych przy minimalnych inwestycjach w dodatkowe zasoby. Metody te zapewniają naukowcom elastyczność w korzystaniu zarówno ze standardowych butelek, jak i aparatury wyposażonej w lizometr do badania mechanizmów neurobiologicznych leżących u podstaw picia alkoholu, w zależności od ich precyzyjnych potrzeb eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż umiarkowane spożywanie alkoholu historycznie wiązało się z umiarkowanymi korzyściami zdrowotnymi, ostatnie kompleksowe badania na dużą skalę wykazały, że żadna ilość spożywanego alkoholu nie jest bezpieczna¹^,². W rzeczywistości spożywanie alkoholu jest siódmym najczęstszym czynnikiem ryzyka śmierci i niepełnosprawności na świecie¹, a osoby, które piją nawet niewielkie ilości alkoholu, mają zwiększone ryzyko zachorowania na nowotwory, choroby zakaźne i urazy¹^,³. W Stanach Zjednoczonych liczba zgonów spowodowanych spożyciem alkoholu wzrosła o prawie 30% w latach 2016-2021⁴. Co ważne, ryzyko śmierci i niepełnosprawności wzrasta monotonicznie wraz ze wzrostem konsumpcji¹.

Chociaż badania na ludziach dostarczyły cennych informacji na temat neurobiologii używania i nadużywania alkoholu, eksperymentalna kontrola zapewniana przez modele zwierzęce jest kluczowa dla dogłębnego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zachowań związanych z piciem i ryzykiem intensywnego picia. Modele te są również cennymi narzędziami do opracowywania metod leczenia mających na celu ograniczenie niekontrolowanego zużycia. Picie w klatce domowej z dwoma butelkami jest jednym z najczęściej stosowanych paradygmatów przedklinicznych do badania spożycia alkoholu przez gryzonie. Wynika to w dużej mierze z łatwości wdrożenia, ponieważ pozwala na pomiar całkowitego dobrowolnego spożycia alkoholu i preferencji bez konieczności korzystania ze specjalistycznego sprzętu badawczego lub skomplikowanych analiz. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą zbierać pomiary w żądanych odstępach czasu (np. godzinach, dniach, tygodniach), obliczając zmianę wagi butelki od początku do końca sesji picia. Odmiany tej podstawowej metody były stosowane przez wielu w tej dziedzinie, aby ułatwić niskie, umiarkowane lub upijające się poziomy spożycia alkoholu zarówno w krótkich, jak i długich okresach czasu. Na przykład, ciągłe i przerywane procedury wyboru dwóch butelek zostały zastosowane w celu ułatwienia niskiego i umiarkowanego poziomu spożycia alkoholu, odpowiednio, zarówno u myszy⁵, jak i rats⁶^,⁷^,⁸. Te same paradygmaty mogą sprzyjać wysokiemu poziomowi spożycia w odmianach preferujących alkohol⁷^,⁹. Alternatywnie, wykazano, że adaptacja tej metody, która ogranicza dostęp do alkoholu do 2-4 godzin dziennie, rozpoczynając około 3 godziny po rozpoczęciu ciemnego cyklu, powoduje upijanie się u myszy (tj. Picie w ciemności)¹⁰^,¹¹. Dodatkowe warianty tych metod zostały wykorzystane w połączeniu z metodami, które ułatwiają uzależnienie od alkoholu (tj. przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu) w celu zbadania eskalacji dobrowolnego picia alkoholu podczas odstawienia¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹.

Chociaż powszechnie przyjęty przez tę dziedzinę, standardowe podejście do mierzenia spożycia alkoholu na podstawie zmiany wagi butelki jest ograniczone w rozdzielczości do całkowitego spożycia na sesję picia. W związku z tym podejście to nie jest w stanie uchwycić wzorców picia, o których wiadomo, że wpływają zarówno na ryzyko, jak i nasilenie zaburzeń związanych z używaniem alkoholu (AUD)²⁰^,²¹^,²². Rzeczywiście, średnie spożycie przez daną osobę w czasie może być konsekwencją kilku epizodów intensywnego picia lub wielu epizodów picia, z których każdy wiąże się ze stosunkowo niskim spożyciem, a niuanse te pozostają niewykryte, gdy konsumpcja jest mierzona jako całkowite spożycie na sesję picia. Co ważne, znacznie więcej epizodów picia związanych z dużymi napadami picia (tj. przełykaniem) obserwuje się u osób z AUD w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej²³, a dane dotyczące naczelnych sugerują, że osoby, które ustaliły wzorzec spożywania alkoholu, który obejmuje duże napady picia na wczesnym etapie ich historii picia, są narażone na znaczne ryzyko wystąpienia AUD²². Co więcej, epizody picia, które obejmują duże okresy konsumpcji, znacznie zwiększają ryzyko zachorowalności i śmiertelności niezależnie od diagnozy AUD²¹. Ogólnie rzecz biorąc, dane te doprowadziły do wzrostu zainteresowania badaniem wzorców picia oprócz poziomów całkowitego spożycia w modelach przedklinicznych i skłoniły do opracowania szeregu systemów o różnym stopniu złożoności, które są w stanie rejestrować dane dotyczące picia na poziomie poszczególnych lizawek.

Jednym z pierwszych było opracowanie systemu dwóch butelek wyposażonego w wykrywanie lizania wiązką fotowolną, przeznaczonego do stosowania u myszy²⁴. System ten został następnie zaadaptowany przez oddzielną grupę do użytku u szczurów²⁵. Od tamtej pory wariacje na ten temat zostały wykorzystane do opracowania podobnych systemów zawartych w niestandardowych pomieszczeniach dla gryzoni²⁶, które pozwalają na wykrywanie lizania poszczególnych zwierząt trzymanych społecznie²⁷^,²⁸, i które rejestrują zarówno zachowania związane z karmieniem, jak i piciem²⁹. Wśród nich, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ zyskał znaczną uwagę dzięki zaoferowaniu systemu do użytku w myszach, który jest równoległy do łatwości implementacji i przystępności cenowej systemu opracowanego przez Godnyuck et al.²⁴. System ten wykorzystuje wykrywanie pojemnościowe do bezpośredniego wykrywania kontaktu między językiem a przewodzącą metalową rurką łykającą, w przeciwieństwie do środków pośrednich, takich jak podejście sipper lub interakcja, które są zapewniane za pomocą systemu wykrywania wiązki światła. Autorzy dostarczają danych pokazujących, że ich pojemnościowy system wykrywania zapewnia znacznie większą precyzję i czułość w wykrywaniu lizawek, tworząc silniejsze korelacje między liczbą lizawek a zmianą masy butelki niż detekcja fotowiązką. Autorzy demonstrują ponadto możliwość wykorzystania tego systemu w połączeniu z paradygmatem picia w klatce domowej z ciągłym dostępem do dwóch butelek w celu uchwycenia pomiarów mikrostruktury picia alkoholu oprócz pomiarów całkowitego dziennego spożycia³⁰.

Tutaj opisujemy procedury picia alkoholu w domowej klatce z dwoma butelkami przy użyciu standardowego podejścia, jak również metody umożliwiające wykrywanie lizawki (Rysunek 1). Wprowadzamy również metody budowania i wdrażania LIQ HDR - adaptacji LIQ HD³⁰ do użytku u szczurów, która obejmuje modyfikacje sprzętowe w celu dostosowania do większych rozmiarów klatek oraz przeprojektowany uchwyt na butelki wydrukowany w 3D, kompatybilny ze standardowymi butelkami dostępnymi z półki. Metody te zapewniają naukowcom elastyczność w stosowaniu podejścia standardowego lub wyposażonego w lizometr, w zależności od ich zasobów eksperymentalnych i potrzeb w zakresie gromadzenia danych.

Poniżej znajduje się opis potrzebnych materiałów i instrukcje krok po kroku dotyczące rejestrowania picia w klatce domowej przy użyciu procedury picia z przerywanym dostępem do dwóch butelek, zaadaptowanej z Simms et al.⁷. W tej procedurze szczury mają zapewniony 24-godzinny dostęp do dwóch butelek do picia 7 dni w tygodniu. W poniedziałki, środy i piątki (MWF) szczury otrzymują jedną butelkę zawierającą wodę (_H2O) i drugą butelkę zawierającą etanol (EtOH). Butelki te są usuwane we wtorki, czwartki i soboty (TRS) i zastępowane dwiema butelkami wody. Szczury piją z tych samych dwóch butelek wody w soboty i niedziele. Należy pamiętać, że w razie potrzeby metody te można łatwo dostosować do alternatywnych harmonogramów dostępu do etanolu (np. ciągły, objadanie się itp.). Dla podejść standardowych i wyposażonych w lizometr podano osobne instrukcje.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie reprezentatywne dane zostały zebrane przy użyciu osobnych dorosłych szczurów Long-Evans za zgodą University of Illinois Chicago Institutional Animal Care and Use Committee i zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Pojedyncza obudowa jest wymagana w celu dokładnego monitorowania zużycia płynów przez każdego pacjenta. Dorosłe samce (n = 38) i samice (n = 22) szczury Long-Evans miały P50-80 po przybyciu i pozwolono im zaaklimatyzować się w wiwarium przez tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Szczury miały dostęp ad libitum do standardowej karmy (Teklad 7912, Envigo) i wody, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowanie przed eksperymentem

Oznacz butelki do picia jako_H2Olub EtOH. Następnie oznaczyć etykietą z niepowtarzalnym identyfikatorem dla każdego szczura jedną butelkę_H2Oi jedną butelkę EtOH dla MWF oraz dwie butelki_H2Odla TRS.
UWAGA: Opcjonalnie użyj taśmy w innym kolorze do identyfikacji butelek_H2Oi EtOH, aby uniknąć potencjalnych błędów podczas wymiany butelki.
Napełnij butelki H_2Owodą pitną 1 dzień przed datą rozpoczęcia eksperymentu. Przygotuj roztwór EtOH, łącząc 190 proof EtOH z wodą pitną (20% v/v) na 1 dzień przed datą rozpoczęcia eksperymentu.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zastosowany EtOH nie był denaturowany, ponieważ denaturowany EtOH jest trujący.
Przygotuj pustą klatkę na tej samej półce, co szczury biorące udział w eksperymencie. Ta klatka zostanie użyta do obliczenia wycieku.
Wyposaż klatki w system LIQ HDR, jeśli używasz (patrz krok 3, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6 i Rysunek uzupełniający 1).
Należy określić dokładną porę dnia na zmianę butelki przed rozpoczęciem badania. Butelki należy wymieniać codziennie o tej samej porze w celu uzyskania dokładnego pomiaru spożycia w ciągu 24 godzin.
UWAGA: Poprzednie badania wykazały, że gryzonie wykazują największy stopień konsumpcji wcześnie po rozpoczęciu ciemnego cyklu¹⁰^,³¹. Dlatego, aby uchwycić spożycie w tym wysoce aktywnym okresie (patrz krok 2.3.1 w celu uchwycenia picia podobnego do upijania się), zaleca się, aby zmiana butelki nastąpiła 30-60 minut po wyłączeniu światła. Używaj czerwonych lamp podczas zmiany butelki, aby umożliwić wizualizację bez zakłócania cyklu światło-ciemność.

2. Codzienne procedury i konserwacja

Pierwszego dnia eksperymentu wykonaj następujące czynności.
1. Wyjmij standardowe butelki z wodą z klatek.
2. Opcjonalnie: Szczury często przepychają górną część klatki, gdy szukają pożywienia, co może spowodować rozlanie, którego nie można skorygować za pomocą pustej klatki na wycieki. Użycie kubków na żywność wewnątrz klatki może złagodzić ten problem. Jeśli używasz, wyjmij teraz jedzenie z górnej części klatki, dodaj kubek na jedzenie do klatki i napełnij go karwą. Upewnij się, że powierzchnia podłogi przydzielona szczurowi nadal spełnia wytyczne instytucjonalne oparte na wielkości klatki dla szczurów i wielkości kubka na karmę.
3. Należy wskazać personelowi opiekuńczemu i hodowlanemu, w stosownych przypadkach, że personel badawczy zapewni żywność i wodę na czas trwania eksperymentu.
4. Zmiany w klatce mogą zakłócać gromadzenie danych. Wykonuj zmiany klatki w połączeniu z uzyskaniem pomiarów masy ciała. Naukowcy, którzy zdecydują się na takie rozwiązanie, powinni odpowiednio poinformować o tym swój personel opiekuńczy i hodowlany.
W kolejnych dniach postępuj zgodnie z procedurami opisanymi poniżej.
UWAGA: Pamiętaj, że każdy ruch klatek i butelek może spowodować rozlanie. Dlatego ważne jest, aby zachować delikatność ruchów i stosować te same metody zakładania i wyjmowania butelek z klatki na rozlewanie, jakie stosuje się w przypadku klatek dla szczurów.
1. Wejdź do pokoju przed czasem wymiany butelki, zapewniając wystarczająco dużo czasu na wykonanie poniższych kroków, i umieść nowe butelki na klatkach o odpowiedniej godzinie rozpoczęcia sesji.
2. Zdejmij pokrywki filtrów z klatek. Jeśli jest to MWF, przejdź do kroku 2.2.3. Jeśli TRS, przejdź do kroku 2.2.4.
3. W poniedziałki, środy i piątki zdejmuj butelki TRS z górnych części klatek. Zważyć butelki MWF (jedną EtOH i jedną_H2O). Zapisz masę początkową butelki na dzisiejszą sesję picia. W razie potrzeby zapewnij dodatkowe jedzenie na górze klatki lub kubkach na żywność. O wyznaczonej godzinie rozpoczęcia sesji umieść butelki na górze klatki każdego szczura taśmą skierowaną do góry, aby szczury nie gryzły etykiety butelki.
  UWAGA: Zazwyczaj zużycie wody nie jest rejestrowane ani raportowane dla TRS, ale badacze mogą opcjonalnie zebrać te dane, uzyskując wagę na butelkach i poza nimi, jak opisano poniżej w kroku 2.2.3 i kroku 2.2.4, jeśli jest to pożądane. Strona butelki EtOH powinna być zmieniana po każdej sesji picia, aby uniknąć rozwoju potencjalnej preferencji bocznej, która może nieumyślnie zniekształcić dane dotyczące spożycia.
  1. Opcjonalnie: Poprzednie prace wykazały, że wiele szczurów wykazuje skłonności do picia podobne do upijania się na początku sesji picia⁸^,³²^,³³. Większość badaczy wychwytujących upijanie się w tym czasie zgłasza spożycie w ciągu pierwszych 30-60 minut sesji picia. Aby uzyskać dane dotyczące spożycia podczas tego potencjalnego epizodu objadania się, wykonaj czynności opisane poniżej.
  2. Ustaw minutnik po nałożeniu butelek na ostatnią klatkę. Pozostaw pomieszczenie w spokoju w wyznaczonym czasie.
  3. Wejdź ponownie do pomieszczenia, gdy włączy się timer. Wyjmij butelki EtOH i_H2Oi zapisz wagę butelek. Umieść butelki EtOH i H_2Oz powrotem w klatkach.
    UWAGA: Ten krok nie jest wymagany do rejestrowania epizodów objadania się podczas korzystania z systemu wyposażonego w wykrywanie lizania.
4. We wtorki, czwartki i soboty należy wyjmować butelki MWF z klatek o wyznaczonej godzinie zakończenia sesji, odpowiadającej 24 godziny po godzinie rozpoczęcia. Zważ każdą butelkę i zapisz wagę końcową butelki dla sesji picia MWF. Uzyskaj i zapisz masę ciała każdego szczura. W razie potrzeby zapewnij dodatkowe jedzenie na górze klatki lub kubkach na żywność. Umieść butelki TRS H₂O na górze klatki każdego szczura taśmą skierowaną do góry, aby szczury nie gryzły etykiety butelki.
5. Włóż pokrywy filtrów do klatek i opuść pomieszczenie dla zwierząt.
  UWAGA: Opcjonalnie przykryj łyki butelek EtOH, aby zapobiec parowaniu. Jeśli zmiany w klatkach są wykonywane przez personel badawczy, należy przeznaczyć 1 dzień w tygodniu podczas dyżurów TRS na wykonanie tego zadania. Umieść każdego szczura w czystej klatce po uzyskaniu masy ciała.
Myj butelki i płyny odświeżające regularnie, co tydzień lub co dwa tygodnie, zgodnie z procedurami dotyczącymi pielęgnacji i hodowli zwierząt. Zadbaj o to, aby wykonywać te obowiązki w sposób, który nie przerywa sesji picia. Na przykład butelki TRS_{H 2}O można myć i ponownie napełniać po wyjęciu na MWF. Podobnie, butelki MWF_H2Oi EtOH można myć i ponownie napełniać po wyjęciu na TRS.

3. Wykrywanie lizawki podczas eksperymentów z wyborem dwóch butelek

UWAGA: Badacze zainteresowani gromadzeniem danych o piciu w wysokiej rozdzielczości mogą zmodyfikować powyższą procedurę, dodając do butelek funkcje wykrywania lizaw. LIQ HD³⁰ to tani system do samodzielnego montażu (DIY), który pozwala na tego typu zbieranie danych u myszy. Przedstawione poniżej procedury opisują modyfikacje niezbędne do adaptacji LIQ HD do stosowania u szczurów (określanych jako LIQ HDR). Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać listę wszystkich sprzedawanych na rynku i niestandardowych części drukowanych w 3D niezbędnych do skonstruowania jednego systemu wykrywania lizawek, który może przechwytywać dane dotyczące wyboru dwóch butelek dla maksymalnie 18 szczurów. Pliki .stl do druku 3D oraz instrukcje można znaleźć na stronie internetowej autora (www.ejgloverlab.com/3dprints).

Konfiguracja czujników pojemnościowych
UWAGA: Każdy system LIQ HDR składa się z trzech pojemnościowych jednostek czujników, które razem przechwytują dane o lizaniu z 36 butelek równolegle, co odpowiada 18 szczurom trzymanym w jednym pomieszczeniu. Każda jednostka czujnika składa się z jednej płytki wyprowadzającej komunikację różnicową I²C i jednej 12-klawiszowej płytki czujnika pojemnościowego, która połączy się z lichometrami z sześciu oddzielnych klatek za pomocą sześciu par 2-pinowych oznaczonych kolorami dla każdego lichometru (Rysunek 2A).
1. Zbierz materiały potrzebne do zbudowania wszystkich trzech pojemnościowych modułów sensorycznych, jak pokazano na rysunku Rysunek 2B, wraz z wymaganymi narzędziami lutowniczymi.
2. Aby rozpocząć budowę modułu czujnika A, przykryj 2-pinowy ze złączem żeńskim czerwoną rurką termokurczliwą o długości 7 cali, włóż jego czerwono-czarne końcówki przewodu do pinów #0 i #1 na płytce czujnika ( Rysunek 2C-1) i na miejscu ( Rysunek 2C-2). Upewnij się, że znajduje się z przodu płytki czujnika, jak pokazano, aby ułożyć klatki w kolejności numerycznej od lewej do prawej w wiwarium bez nachodzenia i potencjalnego zakłócania nagrywania (patrz krok 3.6 i Rysunek 6).
3. Przykryj pięć kolejnych rurkami termokurczliwymi w wyraźnym kolorze i do pinu #2-11, jak pokazano (Rysunek 2C-3). Upewnij się, że wszystkie czerwone przewody są przylutowane do parzystych pinów, które połączą się ze wszystkimi butelkami po lewej stronie, a wszystkie czarne przewody są przylutowane do nieparzystych pinów, które połączą się ze wszystkimi butelkami po prawej stronie.
4. Przykryj połączenia lutowane gorącym klejem ze wszystkich stron dla ochrony (Rysunek 2C-4). Oznacz złącza w kolejności numerycznej, podając unikalny identyfikator dla każdego likometru ( Rysunek 2C-4).
5. Aby zmontować moduł czujnika A, podłącz płytkę czujnika A do punktu końcowego wyjścia komunikacyjnego za pomocą 4-pinowego 50 mm i podłącz punkt końcowy do wyjścia 3,3 V dźwigni dźwigni zmiany biegów 5 V do 3 V za pomocą 4-pinowego 100 mm (Rysunek 2D-1). Chociaż zarówno płytka czujnika, jak i płytka rozdzielająca komunikację mają dwa identyczne 4-pinowe złącza, nadal ważne jest, aby upewnić się, że okablowanie jest dokładnie takie, jak pokazano ( Rysunek 2D-1 i Rysunek 2F) w celu korzystania z wydrukowanych w 3D obudów czujników i sugerowanej konfiguracji wiwarium (patrz krok 3.6 i Rysunek 6). Jednostka czujnika domu A wewnątrz wydrukowanej w 3D obudowy ( Rysunek 2D-2). Delikatnie zamknij górną część, uważając, aby nie zgnieść linki zmiany poziomu (Rysunek 2D-3).
6. Zmodyfikuj adresy I²C płyt czujników B i C, przylutowując przewód połączeniowy z pinu ADDR do pinu 3Vo lub SDA, jak pokazano ( Rysunek 2E).
7. sześć oznaczonych kolorami żeńskich połączeniowych do płytek czujników B i C, używając tej samej kolejności, co dla płytki A. Oznacz każde złącze odpowiednim numerem identyfikacyjnym likometru. Podłącz płytę B do punktu środkowego rozdzielacza komunikacyjnego, a C do punktu końcowego za pomocą 4-pinowych 50 mm (Rysunek 2F).
8. Domowe moduły czujników B i C w odpowiednich obudowach wydrukowanych w 3D. Połącz łańcuchowo wszystkie trzy moduły czujników za pomocą Ethernet, aby zakończyć konfigurację czujnika ( Rysunek 2G).
Konfiguracja interfejsu mikrokontrolera
UWAGA: Interfejs mikrokontrolera LIQ HDR (rysunek uzupełniający 1A) jest taki sam, jak opisany dla LIQ HD³⁰ z bardzo niewielkimi modyfikacjami. Przedstawione poniżej procedury zawierają ogólny przegląd kroków niezbędnych do skonfigurowania interfejsu z modyfikacjami opisanymi w krokach 3.2.6 i 3.2.8. Badacze są odsyłani do oryginalnego protokołu i samouczka wideo zamieszczonego na stronie autora GitHub, aby uzyskać bardziej szczegółowe instrukcje krok po kroku³⁰.
1. Zbierz materiały i narzędzia lutownicze potrzebne do zbudowania interfejsu mikrokontrolera (rysunek uzupełniający 1B). Z tyłu osłony dotykowej (rysunek uzupełniający 1C-1) utwórz zworkę lutowniczą w poprzek pól lutowniczych z tyłu lite (rysunek uzupełniający 1C-2).
2. Z tyłu osłony rejestrującej dane odetnij ścieżkę podkładki zworki styku CS (Rysunek uzupełniający 1D-1). Z przodu rejestratora danych krótki przewód połączeniowy od pinu CS do pinu #7 (rysunek uzupełniający 1D-2).
3. Aby zainstalować nagłówki do układania w stos osłony, najpierw ułóż je z tyłu osłony ekranu dotykowego (Rysunek uzupełniający 1E-1). Ułóż rejestrator danych na ekranie dotykowym, użyj taśmy do stabilizacji i wszystkie piny nagłówka do rejestratora danych (rysunek uzupełniający 1E-2). Następnie zdejmij ekran dotykowy.
4. Ułóż pozostałe złącze header 2 x 3 na mikrokontrolerze (rysunek uzupełniający 1F-1), a następnie ułóż rejestrator danych na mikrokontrolerze przed przylutowaniem pinów nagłówka na miejscu (rysunek uzupełniający 1F-2).
5. Włóż baterię pastylkową do rejestratora danych (rysunek uzupełniający 1G-1). Umieść ekran dotykowy w jednym rzędzie z rejestratorem danych (rysunek uzupełniający 1G-1). Włóż kartę microSD wraz z adapterem do rejestratora danych (Rysunek uzupełniający 1G-2).
6. Aby wykonać dodatkowy przewód uziemiający, odetnij jedno złącze męskie od przewodu połączeniowego i zdejmij koniec na ~1/4 cala (rysunek uzupełniający 1H-1). pasmo odizolowanego drutu z rdzeniem stałym do przewodu połączeniowego i przykryj złącze lutowane rurką termokurczliwą (rysunek uzupełniający 1H-2).
7. Podłącz 4-pinowe przewody połączeniowe i dodatkowy przewód uziemiający do mikrokontrolera (- GND, czerwony - 5V, żółty - pin #21, niebieski - pin #20, rysunek uzupełniający 1I-1). Zabezpiecz połączenia gorącym klejem (rysunek uzupełniający 1I-2). Opcjonalnie owiń przewody połączeniowe rurką termokurczliwą (Rysunek uzupełniający 1I-2).
8. Umieść w pełni zmontowany interfejs mikrokontrolera w obudowie wydrukowanej w 3D, z 4-pinowymi przewodami połączeniowymi i przewodem uziemiającym przewleczonym przez otwór u góry (rysunek uzupełniający 1J).
9. Postępuj zgodnie z oryginalnym protokołem instalacji oprogramowania interfejsu mikrokontrolera³⁰.
Budowa likometrów LIQ HDR
UWAGA: Niestandardowy wydruk 3D, który trzyma butelki, jest przeznaczony do użytku ze standardową butelką do picia gryzoni o średnicy rurki do symfla 8 mm (patrz Tabela materiałów, Rysunek 3A). Ten uchwyt na butelkę można łatwo przystosować do użytku z podobnymi butelkami i rurkami do spijania z niewielkimi modyfikacjami lub bez nich.
1. Zbierz materiały, wydruki 3D i narzędzia lutownicze potrzebne do zbudowania jednego lichometru, jak pokazano na Rysunek 3B. Należy pamiętać, że każdy system LIQ HDR mieści maksymalnie 18 likometrów na 36 butelek.
2. Aby przedłużyć męski połączeniowy, zdejmij izolację z obu jego końców do długości ~1/4 cala, a także przedłużacz z czarnym i czerwonym przewodem (Rysunek 3C-1).
3. przedłużacze do połączeniowego (Rysunek 3C-2) i przykryj połączenia lutowane rurką termokurczliwą (Rysunek 3C-3). Przykryj męski połączeniowy rurką termokurczliwą, która jest kolorystycznie dopasowana do odpowiedniego żeńskiego połączeniowego na module czujnika (Rysunek 3C-4).
4. Aby zachować spójność z okablowaniem płytki czujnika (Rysunek 2), przeciągnij czerwony i przewód odpowiednio przez lewy i prawy wewnętrzny kanał kablowy uchwytu na butelkę (Rysunek 3D-1).
5. każdy drut do samego końca przewodzącej taśmy miedzianej 1 3/4 cala ( Rysunek 3D-2) i złóż miedziane taśmy na pół ( Rysunek 3D-3).
6. Odklej miedzianą taśmę i użyj kleszczy, aby ostrożnie manewrować nią wewnątrz wspornika łyka (Rysunek 3E-1) przed mocnym przyklejeniem jej do wewnętrznych ścianek wspornika łyżki ( Rysunek 3E-2). Upewnij się, że strona lutownicza taśmy miedzianej jest przyklejona do ściany bliżej linii środkowej uchwytu na butelkę, jak pokazano (Rysunek 3E-2). Przepchnij rurkę rozsączającą przez wspornik, aby mocno docisnąć taśmę do ściany i zagruntować wspornik.
7. Aby wzmocnić lutowaną stronę taśmy miedzianej, która nie jest tak przyczepna i ma tendencję do odklejania się, nałóż odrobinę gorącego kleju na złącze lutowane (Rysunek 3E-3). Rozsmaruj klej, aby pokryć zarówno taśmę miedzianą, jak i przylegającą odsłoniętą część wydruku 3D (Rysunek 3E-4).
8. Przeciągnij przez wewnętrzny kanał osłony (Rysunek 3F). Upewnij się, że wybrałeś odpowiednią osłonę (skierowaną w lewo lub w prawo) dla każdego likometru, aby skorzystać z sugerowanej konfiguracji wiwarium (patrz krok 3.6 i Rysunek 6)."UWAGA: Lickometry 5-6, 11-12 i 17-18, które są przedstawione na niebieskich lub fioletowych w obecnej konfiguracji, wymagają osłony skierowanej w lewo (Rysunek 4D-1), podczas gdy wszystkie inne likometry wymagają prawostronnego zabezpieczenia (Rysunek 4D-2).
9. Aby zainstalować zacisk kablowy, najpierw zamontuj jeden przewód w rowku jednej połowy zacisku kablowego ( Rysunek 3G-1), następnie zamontuj drugą połowę na drugim przewodzie, a następnie szczelnie zamknij obie połówki nakrętką (Rysunek 3G-2).
10. Oznacz złącze męskie odpowiednim numerem identyfikacyjnym likometru ( Rysunek 3H). Powtarzaj te kroki, aż wszystkie 18 likometrów zostanie zbudowanych.
Instalowanie likometrów LIQ HDR
UWAGA: LIQ HDR jest przeznaczony do montażu na standardowej klatce dla szczurów w pudełku po butach z metalowym drucianym wierzchem (Rysunek 4A-1).
1. Zidentyfikuj dwie pary prętów z odległością od środka do środka wynoszącą ~75 mm na górze drucianej klatki, aby pomieścić uchwyt na butelkę. Użyj szczypiec, aby lekko otworzyć metalowe pręty wokół otworów na łyżki. Zaizoluj te pręty taśmą izolacyjną, aby zapobiec kontaktowi metalu z metalem między łyżkami a górną częścią klatki (Rysunek 4A-2).
  UWAGA: Chociaż taśma izolacyjna nie jest dostępna dla szczurów, a zatem nie jest podatna na żucie, zalecamy wyrzucenie jej po zakończeniu badania i nieużywanie jej ponownie między badaniami.
2. Zamontuj lickometr i laserowy panel akrylowy o grubości 1/8 cala na górze klatki za pomocą dwóch zestawów i nakrętek M5 (Rysunek 4B). Upewnij się, że otwory na łyk w lizometrze i panelu akrylowym są wyrównane i że sipery nie stykają się z żadną częścią górnej części klatki.
3. Przymocuj zacisk kablowy do najbardziej zewnętrznego pręta (~ 4 mm średnicy) górnej części klatki drucianej (Rysunek 4C). W razie potrzeby wyreguluj zacisk kablowy, aby upewnić się, że górna część klatki ściśle przylega do dna klatki i że nie jest ciągnięty ani zginany pod zbyt dużym napięciem. Upewnij się, że dla każdego likometru używana jest właściwa osłona (Rysunek 4D i patrz krok 3.8.8).
4. W razie potrzeby wyreguluj rurki sipper tak, aby tylko ~2 cm sipper wystawało z nasadki (Rysunek 4E-1). Aby zainstalować butelki, włóż rurkę siku przez wspornik łyka uchwytu na butelkę, aż się zatrzyma (Rysunek 4E-2). Tylko sama końcówka rurki sipper powinna wystawać poza panel akrylowy (Rysunek 4E-3). Bardzo ważne jest, aby żadna inna część rurki sipper nie była odsłonięta, aby uniknąć fałszywie dodatnich liźnięć spowodowanych zachowaniami niekonsumpcyjnymi, takimi jak dotykanie lub zabawa rurką sipper przez szczura. Górna część filtra powinna być w stanie ściśle spoczywać na górnej części klatki drucianej i zacisku kablowym, nie naruszając samego (Rysunek 4F).
  UWAGA: Grubszy panel akrylowy lub stos wielu paneli 1/8 cala może być użyty do całkowitego zamknięcia rurek łykowych o większej długości do eksperymentów, które wymagają, aby rurki łykowe sięgały głębiej w klatkę, na przykład podczas pomiaru picia u młodych szczurów, które mogą mieć problemy z dotarciem do krótkiego łyka.
Instalowanie i używanie blokerów sipper
UWAGA: Bloker łyków (Rysunek 5A) został zaprojektowany w celu ograniczenia dostępu szczura do łyka podczas zmiany butelki i zapewnienia dokładnej kalibracji lizkometru na początku każdej sesji picia.
1. Zbierz wydrukowane w 3D części oraz, nakrętkę i podkładkę M5 dla jednego blokera łyków, jak pokazano na Rysunek 5B.
2. Włóż SIPPER_Gear do SIPPER_Base (Rysunek 5C-1). Upewnij się, że SIPPER_Gear jest zorientowany dokładnie tak, jak pokazano na wstawce renderowania 3D. Włóż SIPPER_Worm do otworu w górnej części SIPPER_Base. Obróć ślimak zgodnie z ruchem wskazówek zegara podczas wkładania, aż zrówna się z podstawą (Rysunek 5C-2).
3. Przykręć SIPPER_Nut do końca robaka od spodu podstawy (Rysunek 5C-3). Użyj kleszczyków, aby dokręcić nakrętkę podczas obracania pokrętła ślimakowego. Włóż okrągłe, wąskie szyjki SIPPER_Blockers w szczeliny koła zębatego (Rysunek 5C-4).
4. Zamontuj zmontowaną blokadę łyżkową na górze klatki za pomocą zestawu M5 (Rysunek 5D). Upewnij się, że oba blokery łyków są wyrównane z otworami łyka.
5. Aby zablokować dostęp do sipperów, obróć pokrętło ślimakowe zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby opuścić blokery, aż całkowicie zakryją otwory sipper (Rysunek 5E).
6. Aby zapewnić dostęp do łyków, przekręć pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż blokery znajdą się w pozycji pionowej prostopadłej do górnej części klatki (Rysunek 5F-1). Ręcznie pociągnij do góry każde ramię blokujące, aż głowice znajdą się tuż poniżej górnej części drucianej klatki. Obróć blokery o 90° tak, aby głowice były równoległe do metalowych prętów na górze klatki, a ramiona były zablokowane na miejscu (Rysunek 5F-2). Obracaj pokrętłem w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż oba blokery zostaną podniesione ponad górną część klatki ( Rysunek 5F-3), a łyki będą w pełni dostępne ( Rysunek 5F-4).
Korzystanie z systemu LIQ HDR w wiwarium
UWAGA: Poniższa konfiguracja wiwarium jest zoptymalizowana pod kątem wychwytywania picia z dwóch butelek za pomocą jednego interfejsu mikrokontrolera podłączonego do 18 standardowych klatek dla szczurów w pudełku po butach. Wszystkie elementy elektroniczne, w tym interfejs mikrokontrolera, moduły czujników i różne, są przymocowane do zamontowanych na ścianie półek z drutu metalowego, które utrzymują klatki (Rysunek 6A). Mogą być wymagane pewne modyfikacje w celu dostosowania do obiektów dla zwierząt i potrzeb użytkowników.
1. Zamontuj każdy moduł czujnika na półkach wiwarium za pomocą niestandardowej montażowej wydrukowanej w 3D (Rysunek 6B). Upewnij się, że każdy moduł czujnika jest zamontowany bezpośrednio pod klatką za pomocą żółtego likometru, aby uniknąć niepotrzebnego naprężenia (Rysunek 6A).
2. Ułóż i zabezpiecz każdy złącza żeńskiego, upewniając się, że nie zachodzą na siebie ani nie zginają się nadmiernie na końcach lutowanych, co może skutkować słabym wykrywaniem lizania (Rysunek 6B). Jeśli używane są półki na pręty metalowe, można to łatwo osiągnąć, wiążąc połączeniowe z oddzielnymi prętami na półce, jak pokazano.
3. Zamontuj interfejs mikrokontrolera obok modułu czujnika A za pomocą tej samej wydrukowanej w 3D montażowej i podłącz jego 4-pinowe złącze do portu wejściowego 5 V przesuwnika poziomu 5 V do 3 V podłączonego do modułu czujnika A (Rysunek 6C).
4. Użyj taśmy elektrycznej, aby przymocować dodatkowy przewód uziemiający do źródła uziemienia, takiego jak metalowa półka ( Rysunek 6D).
5. Ułóż każdą klatkę w oparciu o kolor i identyfikator zainstalowanego likometru zgodnie z Rysunek 6A, aby zminimalizować nakładanie się i naprężenia.
6. Bezpiecznie podłącz wszystkie złącza męskiego likometru do pasujących żeńskich połączeniowych czujnika (Rysunek 6E). Podłącz zasilacz, aby włączyć interfejs mikrokontrolera (Rysunek 6F).
7. Na głównej stronie GUI (graficzny interfejs użytkownika) (Rysunek 6G) dotknij symbolu ustawień, aby otworzyć stronę Ustawienia. Użytkownicy mogą zmieniać czas włączania i wyłączania świateł w oparciu o harmonogram wiwarium, aby zapewnić, że wyświetlacz interfejsu automatycznie przyciemnia się, gdy rozpocznie się cykl ciemności (Rysunek 6H-1).
8. Stuknij Edytuj ustawienia czujnika (Rysunek 6H-1), aby dostosować próg dotyku do 8 i próg zwolnienia do 2, co według nas umożliwia najbardziej spójne wykrywanie lizania dla szczurów przy użyciu bieżącej konfiguracji ( Rysunek 6H-2). Należy jednak pamiętać, że użytkownicy mogą być zmuszeni do eksperymentowania z różnymi ustawieniami, jeśli zostaną wprowadzone jakiekolwiek modyfikacje w bieżącym systemie.
9. Usuń zaznaczenie opcji Automatyczna kalibracja, jeśli dane są zbierane tylko w ciągu 24 godzin lub krócej (Rysunek 6H-2).

4. Codzienne procedury picia w domu z dwóch butelek za pomocą wykrywania lizawki

Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w kroku 2 dla standardowych procedur wyboru dwóch butelek z następującymi modyfikacjami.
W poniedziałki, środy i piątki, przed założeniem butelek MWF, użyj blokerów do zakrycia otworów na łyki we wszystkich klatkach (patrz krok 3.5.5 i Rysunek 5E).
Przed nagraniem wybierz właściwą stronę eksperymentalną na głównej stronie GUI, która będzie stroną butelki EtOH na ten dzień (Rysunek 6G).
Po zainstalowaniu wszystkich butelek MWF dotknij START! na stronie głównej (Rysunek 6G), aby rozpocząć kalibrację czujników, podczas której zaleca się użytkownikom odejście od systemu i upewnienie się, że szczury nie liżą łyków (Rysunek 6I-1). Kalibracja trwa kilka sekund, po czym system przechodzi na główną stronę nagrywania, pokazując skumulowane liczby lizawek na każdej butelce dla każdego likometru (Rysunek 6I-2).
Podnieś wszystkie blokery łyżków powyżej górnej części klatki, aby umożliwić dostęp do nich (patrz krok 3.5.6 i Rysunek 5F), a następnie delikatnie przywróć wszystkie górne części filtrów zgodnie z opisem (patrz krok 3.4.4 i Rysunek 4F).
Stuknij Odśwież, aby zaktualizować liczby lizania na ekranie, które same nie będą aktualizowane w czasie rzeczywistym (Rysunek 6I-2).
We wtorki, czwartki i soboty dotknij Zapisz i zakończ, aby zatrzymać nagrywanie i powrócić do strony głównej (Rysunek 6I-2) przed wyjęciem butelek MWF.
Aby wyjąć kartę SD w celu przesłania danych, dotknij Wysuń kartę SD przed odłączeniem karty SD (Rysunek 6G). Włóż kartę SD do dowolnego komputera i skopiuj/wklej plik danych .csv nazwany na cześć daty butelki ON do tego komputera (Rysunek 6K). Aby ponownie zamontować kartę SD do następnego nagrania, włóż kartę do interfejsu i dotknij Zamontuj SD (Rysunek 6J).
UWAGA: Zalecamy codzienne tworzenie kopii zapasowych plików danych.
Zaleca się ograniczenie pomiarów masy ciała do jednego razu w tygodniu, jeśli jest to zgodne z modelem zwierzęcym i protokołem wykorzystania zwierząt oraz wykonanie tego zadania w dniu wyznaczonym na zmianę klatki, aby zminimalizować niepotrzebne zakłócenia w pracy lizometrów i czujników. Odłącz wszystkie męskie lizkometru od pasujących żeńskich czujnika przed przeniesieniem klatek. Po zważeniu każdego szczura umieść go z powrotem w czystej klatce. Przenieś lizometr do nowego górnego miejsca klatki i w razie potrzeby ponownie podłącz każdy lizometr do odpowiedniego czujnika.
W przypadku eksperymentów testujących wpływ interwencji (np. wstrzyknięcia leku) na spożycie EtOH i mikrostrukturę picia, należy zaplanować takie interwencje przed rozpoczęciem sesji picia, jeśli to możliwe. W sytuacjach, gdy nie jest to możliwe, badacze mogą przerwać wykrywanie lizania, dotykając przycisku Pauza (Rysunek 6I-2) i wznowić przechwytywanie danych, dotykając przycisku Wznów po zakończeniu interwencji. Sugerujemy zbieranie odważników butelek podczas każdej przerwy w sesji picia, aby uchwycić zmiany w spożyciu EtOH przed i po interwencji, a także uwzględnić rozlanie, które może wystąpić podczas zdejmowania górnej części klatki w celu uzyskania dostępu do zwierzęcia.
Pod koniec badania wszystkie elementy znajdujące się w klatce powinny zostać dokładnie zdezynfekowane przed użyciem u nowych zwierząt, aby ograniczyć przenoszenie zanieczyszczeń między zwierzętami. Zalecamy delikatne spryskanie i przetarcie lizometru 70% roztworem EtOH, uważając, aby nie zakłócić działania wewnętrznych elementów elektrycznych. Bloker łyka i panel akrylowy można myć ciepłą wodą z mydłem.

5. Analiza danych

Przed oceną środków zależnych należy skorygować dane dotyczące spożycia dla wycieków, które nieuchronnie występują w wyniku codziennej wymiany butelek. W tym celu należy uśrednić zmianę masy butelek EtOH i_H2Ona klatce rozlewowej w ciągu całego okresu badania.
Wykluczyć wszelkie wartości większe niż dwa odchylenia standardowe od średniej dla każdej butelki. Po wykluczeniu tych wartości odstających należy odjąć obliczone średnie od zmian masy EtOH i_H2Obutelki uzyskanej z butelek na klatkach zawierających zwierzęta. Odejmując tę kwotę, badacze mogą mieć pewność, że średnia strata wynikająca z rozlania danego roztworu nie jest brana pod uwagę w pomiarach zużycia. Odjęcie średniej ilości rozlanego płynu może w niektórych przypadkach skutkować ujemną wartością dla niektórych zwierząt. Przelicz je na zero i zinterpretuj jako brak jakiegokolwiek spożycia dla tego roztworu.
Głównymi miarami zależnymi w eksperymentach z piciem z dwiema butelkami są spożycie EtOH (g/kg) i preferencje (%). Oblicz spożycie na podstawie zmiany masy butelki EtOH (g) i znormalizuj do masy ciała (kg), wykonując następujące czynności.
1. Przelicz zmianę masy butelki (g) na zmianę objętości (ml), używając następującego równania:
  
  Gęstość czystego etanolu wynosi 0,789 g/ml. Dlatego gęstość 20% EtOH wynosi 0,1578 g / ml. H₂O waży 1 g/ml. Dlatego gęstość przyczyniająca się 80% H₂O = 0,80 g / ml. W związku z tym każdy ml 20% roztworu EtOH (v/v) składa się z 0,1578 (EtOH) + 0,80 (_H2O) = 0,9578 g/ml. Dlatego końcowe równanie przy użyciu 20% (v/v) stężenia EtOH to:
2. Oblicz dawkę zużytego etanolu, korzystając z poniższego równania. Do obliczenia spożytego etanolu w przeliczeniu na masę ciała zwierzęcia należy wykorzystać masę ciała uzyskaną w tym samym tygodniu, co dane dotyczące spożycia.
3. Oblicz preferencję, korzystając z następującego równania:
Podobnie jak jego mysi odpowiednik³⁰, LIQ HDR rejestruje różne zmienne mikrostruktury picia, w tym czas trwania lizania, numer ataku, czas trwania walki, numer lizania i czas trwania lizania (Rysunek 6K). Atak picia definiuje się jako serię liźnięć, która rozpoczyna się od co najmniej 3 liźnięć wykonanych w czasie krótszym niż 1 sekunda i kończy się po upływie 3 sekund bez dodatkowych liźnięć. Miary te można następnie wykorzystać do obliczenia średniego czasu trwania indywidualnego lizania, średniego czasu trwania indywidualnego ataku, średniej liczby liźnięć na walkę, średniej częstotliwości liźnięcia, szacowanego interwału między liźnięciami i szacowanego interwału między walkami.
UWAGA: Interfejs mikrokontrolera dostarcza te dane mikrostruktury w rozdzielczości 1 minuty w pliku .csv (Rysunek 6K). Badacze mogą korzystać z aplikacji analitycznej dostarczonej z oryginalnym protokołem LIQ HD³⁰ lub preferowaną platformą przetwarzania końcowego, aby zestawiać i podsumowywać dane zgodnie z potrzebami badawczymi. Dane mikrostrukturalne są zazwyczaj sumowane w ciągu całego okresu 24 godzin w celu porównania uśrednionych różnic na poziomie makro lub w przedziale od 30 minut do 1 godziny w celu zbadania zmian wzorców picia w cyklu jasnym i ciemnym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowa, przerywana, domowa klatka z dwoma butelkami, dane dotyczące picia EtOH
Korzystając ze standardowej procedury (Rysunek 7A), badacze mogą uchwycić 24-godzinne spożycie (Rysunki 7B-D), a także picie przypominające upijanie się, jeśli waga butelki zostanie zebrana wkrótce po rozpoczęciu sesji picia (Ryc. 7E-F). Obliczając spożycie etanolu w stosunku do spożycia wody, naukowcy mogą również uzyskać dane o preferencjach we wszystkich mierzonych punktach czasowych (Rysunki 7D,F). Jak pokazano w Rysunek 7C, szczury często wykazują okres eskalacji spożycia etanolu w ciągu pierwszych kilku dni dostępu do dwóch butelek. Po tym następuje plateau, podczas którego spożycie pozostaje stosunkowo stabilne. Chociaż konsekwentnie obserwowane u samców szczurów⁷^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶, ten wzorzec nie zawsze występuje u samic. Zamiast tego niektóre badania donoszą o stabilnym poziomie spożycia etanolu przez cały okres badania u samic szczurów³⁷^,³⁸. Ponadto niektóre badania sugerują, że spożycie etanolu może dalej eskalować wraz z dłuższymi okresami dostępu³⁶^,³⁹. Dzienne spożycie może się znacznie różnić u poszczególnych osób. Jednak średnie dzienne spożycie zostało dobrze scharakteryzowane dla szczepów najczęściej stosowanych w badaniach nad alkoholem i może być wykorzystane jako punkt odniesienia dla sukcesu, gdy patrzy się na zgrupowane dane⁷^,⁸^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁹.

Jak pokazano w Rysunek 7E, wiele szczurów spożywa znaczną część swojego dziennego spożycia etanolu wkrótce po rozpoczęciu sesji picia⁸^,³³. Ten przypominający napady wzorzec przyjmowania etanolu jest często związany ze znaczną preferencją dla etanolu w stosunku do wody (Rysunek 7F). Badacze nie powinni być jednak zaskoczeni, jeśli preferencja 24 h nie przekroczy 50%. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku niekrewniaczych lub alkoholowych szczepów gryzoni i badań ograniczonych do stosunkowo krótkich okresów wyboru dwóch butelek Class<="xref">7^,³²^,³³^,³⁵^,³⁷.

Walidacja LIQ HDR dla analizy mikrostruktury picia z dwóch butelek
Dodanie systemu LIQ HDR do standardowego paradygmatu wyboru dwóch butelek dla szczurów pozwala naukowcom na dokładne i precyzyjne przewidywanie spożycia na podstawie zebranych danych o piciu. Potwierdza to istnienie silnej i istotnej korelacji między skumulowaną liczbą wykrytych lizawek a zmianą masy butelek zarówno dla EtOH (R² = 0,7789, F_(1,113) = 398,1, p < 0,0001), jak i butelki H₂O (R² = 0,7910, F_(1,117) = 442,9, p < 0,0001) w okresie 24 godzin (Rysunek 8A). Dotyczy to również dni, w których szczury otrzymały dwie butelki zawierające_H2O(R² = 0,8875, F_(1,188) = 1484, p < 0,0001; Rysunek 8B).

LIQ HDR umożliwia również precyzyjną analizę wzorców picia w wysokiej rozdzielczości czasowej, której nie zapewnia standardowy paradygmat wyboru dwóch butelek. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mają możliwość zbadania różnic we wzorcach picia między różnymi roztworami, w całym cyklu świetlnym, między płciami, grupami leków i nie tylko. Aby to zilustrować, zaliczenie średnich lizawek do 30-minutowych interwałów pozwala na łatwą analizę średnich wzorców picia w ciągu 24 godzin. Zgodnie z oczekiwaniami, analiza ta ujawnia znacznie wyższe spożycie zarówno EtOH, jak i_H2Opodczas cyklu ciemnego, kiedy szczury nie śpią, niż w cyklu światła, kiedy szczury zazwyczaj śpią (Rysunek 8C). Stosując podobne podejście, naukowcy mogą badać różnice grupowe we wzorcach picia. Na przykład mikrostrukturę picia można porównać między samcami i samicami szczurów, badając średnią liczbę lizań dla EtOH (Rysunek 8D) lub wody (Rysunek 8E) w okresie 24 godzin. Aby zbadać picie typu front-loading i/lub picie podobne do upijania się, badacze mogą zwiększyć rozdzielczość swojej analizy, aby skupić się na piciu występującym wkrótce po rozpoczęciu sesji, korzystając z mniejszego okna w celu podsumowania danych. Dzięki temu naukowcy mogą badać okresy upijania się bez konieczności zbierania wielu odważników butelek w ciągu 24 godzin. Jak pokazano w Rysunek 8C (wstawka), ta analiza pokazuje, że większość picia uchwyconego przez wagę butelki uzyskaną 30 minut po rozpoczęciu sesji ma miejsce w ciągu pierwszych 5 minut, a nie przez cały okres 30 minut. Dane takie jak te mogą pomóc w identyfikacji optymalnych punktów czasowych do pobierania próbek krwi w celu pomiaru stężenia etanolu we krwi (BEC). Rzeczywiście, podobny wzorzec wstępnego ładowania zaobserwowano w oddzielnym dniu picia, podczas którego wzorce picia w wysokiej rozdzielczości zostały uchwycone w okresie tak krótkim, jak 15 minut (Rysunek 8F). Średnie liźnięcia zarejestrowane podczas tej sesji wiarygodnie przewidywały zmianę masy butelki (EtOH: R² = 0,6316, F_(1,10) = 17,15, p = 0,0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Rysunek 8G). Co więcej, BEC pobrane z próbek krwi uzyskanych 15 minut po rozpoczęciu sesji dobrze korelowały z liczbą wykrytych lizań (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; Rysunek 8H) nawet przy stosunkowo niskich poziomach spożycia EtOH.

LIQ HDR rejestruje różne pomiary mikrostruktury picia, które są wykrywane i obliczane w czasie rzeczywistym podczas sesji picia i zapisywane w 1-minutowych pojemnikach, podobnie jak wykrywanie lizania (Rysunek 6K). Środki te zostały pokrótce opisane w kroku 5.4 i zdefiniowane wcześniej³⁰. Naukowcy mogą przeprowadzać szczegółowe analizy zmian w indywidualnej mikrostrukturze picia oraz badać, w jaki sposób i w jakim stopniu wzorce picia przyczyniają się do różnic w ogólnym spożyciu. Aby to zilustrować, odkryliśmy, że chociaż samce i samice szczurów wykazywały podobną liczbę lizań, napadów picia i długości napadów (Rysunek 9A-C) podczas picia wody, wiązało się to z większym ogólnym spożyciem (g / kg) u samic niż u samców (test t; t = 2,882, df = 10, p = 0,0163; Rysunek 9D). Jest to oczekiwane, biorąc pod uwagę dymorfizm płciowy w masie ciała, który ułatwia wyższy poziom spożycia masy ciała u samic niż samców przy równoważnej liczbie lizań. Uderzające jest to, że kontrastuje to z porównaniem różnic płci we wzorcach mikrostruktury dla EtOH, które ujawniło podobną mikrostrukturę picia związaną z podobnymi poziomami spożycia EtOH (Ryc. 9E-H). Dane te sugerują, że podczas gdy objętość lizania wody jest podobna u obu płci, w porównaniu z samcami, samice szczurów mają mniejszą objętość lizania dla EtOH. Łącznie te dane mikrostrukturalne wspierają tezę, że samce i samice szczurów prawdopodobnie różnią się pod względem dobrowolnych strategii picia w zależności od rodzaju płynu spożywanego w klatce domowej. Wcześniejsze prace wykazały również różnice płci w strategiach picia, które zależą od rodzaju płynów⁴⁰^,⁴¹, chociaż różnice zaobserwowane w tych badaniach nie ograniczały się tylko do spożycia wody. Długość historii picia może odgrywać rolę w różnicach zaobserwowanych między badaniami, ponieważ picie z dwóch butelek było ograniczone do 5 tygodni w obecnym zestawie danych, podczas gdy przekraczało 12 tygodni w poprzednim worku⁴⁰^,⁴¹.

figure-results-1
Rysunek 1: Wybór dwóch butelek w klatce domowej. (A) Naukowcy mogą mierzyć dobrowolne spożycie etanolu w klatce domowej i preferencje (w stosunku do wody) przy użyciu standardowego podejścia, które oblicza spożycie na podstawie zmiany wagi butelki. (B) Korzystając z LIQ HDR, taniego systemu wykrywania lizania w klatkach domowych typu "zrób to sam", przeznaczonego dla szczurów, naukowcy mogą uzyskać te same pomiary, co w standardowej procedurze wyboru dwóch butelek, jednocześnie rejestrując mikrostrukturę picia w wysokiej rozdzielczości podczas całego okresu nagrywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konstruowanie pojemnościowych modułów sensorycznych. (A) Części elektroniczne i schemat połączeń. (B) Materiały do budowy trzech pojemnościowych modułów sensorycznych wymaganych do budowy jednego systemu LIQ HDR. (C) 2-pinowe ze złączem żeńskim do klatek #1-6 do płytki pinu A #0-11 i zabezpiecz połączenia lutowane gorącym klejem. Oznacz kolorami z kolorowymi rurkami termokurczliwymi i oznacz każdy z nich unikalnym numerem identyfikacyjnym likometru. (D) Podłącz płytę A i przesuwnik poziomu 5 V do 3 V do punktu końcowego wyjścia komunikacyjnego różnicowego I²C za pomocą 4-pinowych (1) oraz płyty głównej A i breakoutu komunikacyjnego w obudowie wydrukowanej w 3D (2-3). (E) Zmień adresy I²C płyt B i C poprzez przylutowanie przewodu połączeniowego z pinu ADDR do pinów 3Vo i SDA, odpowiednio. (F) 2-pinowe ze złączem żeńskim do płytek czujników B i C, oznacz odpowiednimi identyfikatorami likometru i podłącz płytę B do węzła komunikacyjnego MidPoint i płytkę C do punktu końcowego za pomocą 4-pinowych. (G) Umieść moduły czujników B i C w odpowiednich obudowach wydrukowanych w 3D i połącz łańcuchowo wszystkie trzy jednostki za pomocą Ethernet. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Zbuduj likometr LIQ HDR. (A) Renderowanie 3D komponentów w klatce. (B) Materiały do ustawienia jednego dwubutelkowego lizometru. Należy pamiętać, że jeden system LIQ HDR mieści 18 dwubutelkowych likometrów. (C) Wydłuż długość 2-pinowego ze złączem męskim za pomocą pary czarnych i czerwonych przewodów oraz kodu kolorystycznego za pomocą rurki termokurczliwej. (D) Przeciągnij i czerwony przewód przez lewy (L) i prawy (R) otwór w uchwycie butelki (1) i końce do taśm miedzianych (2-3). (E) Przyklej taśmy miedziane do wewnętrznych ścianek wsporników sipper (1-2) i wzmocnij je gorącym klejem (3-4). (F) Przeciągnij przez osłonę. (G) Zamontuj zacisk kablowy. (H) Oznacz złącze pasującym numerem identyfikacyjnym likometru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Instalacja Lickometer. (A) Użyj taśmy izolacyjnej, aby zaizolować metalowe pręty wokół otworów na łyżki na metalowej górze klatki. (B) Zamontuj likometr i panel akrylowy na górze klatki za pomocą dwóch zestawów i nakrętek M5. (C) Przymocuj zacisk kablowy do najbardziej zewnętrznego pręta górnej części klatki drucianej. (D) Upewnij się, że używasz odpowiedniej osłony (lewa L lub prawa R) dla każdej klatki. (E) Upewnij się, że odsłonięte są tylko ~2 cm łyków butelek (1), tak aby po umieszczeniu butelek na klatce (2) tylko same końcówki łyków wystają poza panel akrylowy i są dostępne dla szczurów. (F) Górna część filtra powinna pasować do zacisku kablowego, nie naruszając samego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Instalacja i użytkowanie blokady sipper. (A) Renderowanie 3D blokera sippera. (B) Niestandardowe części drukowane w 3D dla jednego blokera sipper. (C) Zmontuj części wydrukowane w 3D. (D) Zamontuj zmontowaną blokadę łyżki na górze klatki za pomocą M5 + nakrętki + podkładki. (E) Obróć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować dostęp do sipperów. (F) Obróć pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby usunąć blokady z łyżków (1), podnieś blokady i obróć o 90° (2), a następnie kontynuuj obracanie pokrętła w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż blokery znajdą się nad górną częścią klatki (3-4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Konfiguracja wiwarium i obsługa GUI. (A) Zalecana konfiguracja wiwarium i schemat połączeń. (B) Zamontuj każdy moduł czujnika na półkach oraz ułóż i ustabilizuj czujnika do półek. (C) Zamontuj interfejs mikrokontrolera do półek i podłącz jego 4-pinową zworkę do przesuwnika poziomu 5 V do 3 V podłączonego do modułu czujnika A. (D) Zabezpiecz dodatkowy przewód uziemiający taśmą elektryczną. (E) Podłącz czujnika do odpowiednich likometru. (F) Podłącz zasilacz, aby włączyć interfejs mikrokontrolera. (G) Strona g≥єdowa interfejsu GUI. (H) Dotknij Ustawienia, aby dostosować czas włączania/wyłączania świateł do harmonogramu oświetlenia wiwarium (1) i dotknij Ustawienia czujnika, aby dostosować progi dotyku i zwalniania dla szczurów (2). (I) Aby zapisać dane, wybierz stronę butelki EtOH na stronie głównej, dotknij START! aby skalibrować czujniki (1) i rozpocząć nagrywanie (2). Stuknij Odśwież, aby zaktualizować liczbę liźnięcia wyświetlaną na ekranie, a następnie stuknij Zapisz i zakończ, aby zatrzymać nagrywanie. (J) Stuknij Wysuń SD na stronie głównej, aby wyjąć kartę SD i przesłać dane. Stuknij Zamontuj SD po włożeniu karty SD. (K) Zrzut ekranu reprezentatywnego pliku danych surowych ilustrujący, w jaki sposób dane mikrostruktury są zapisywane w 1-minutowym pojemniku przez interfejs mikrokontrolera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywne dane dotyczące wyboru dwóch butelek przy użyciu standardowej procedury. W paradygmacie picia EtOH z dwubutelkową klatką domową z przerywanym dostępem, szczury (A) otrzymują 20% (v/v) roztworu EtOH (pomarańczowy) i_H2O(niebieski) w poniedziałki, środy i piątki (MWF) oraz dwie butelki zawierające_H2Owe wtorki, czwartki i weekendy. (B) Pomiary dziennego spożycia płynów ujawniają, że podczas gdy szczury utrzymują stosunkowo stały poziom całkowitego spożycia płynów (ml) przez cały okres badania, (C) szczury często wykazują eskalację spożycia EtOH w ciągu pierwszych kilku sesji picia, po czym poziomy spożycia ustabilizują się. (D) Ten wzorzec eskalacji i utrzymania jest podobnie odzwierciedlony w preferencji dla EtOH. Naukowcy mogą również uchwycić spożycie EtOH (E) w stylu napadu objadania się, jeśli waga butelki zostanie zebrana po pierwszych 30-60 minutach rozpoczęcia sesji. (F) Jest to często związane z wysoką preferencją dla EtOH w stosunku do H₂O. Zacienione słupki błędów reprezentują ± SEM (n = 32 dla mężczyzn i n = 16 dla kobiet). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: LIQ HDR dokładnie rejestruje zużycie energii w wysokiej rozdzielczości czasowej. Precyzja i dokładność systemu LIQ HDR jest częściowo potwierdzona przez obecność istotnej dodatniej korelacji między liczbą lizań a zmianą masy butelki w dniach, w których szczury otrzymują (A) _H2Oi EtOH, a także (B) dniach, w których obie butelki zawierają_H2O. (C) Różnice we wzorcach picia między_H2O (niebieski) i EtOH (pomarańczowy) w ciągu 24-godzinnego okresu picia można łatwo ocenić, dzieląc średnie liźnięcia na 30-minutowe odstępy. Wstawka odpowiada przeciętnemu lizaniu w 5-minutowych pojemnikach w ciągu pierwszych 30 minut dostępu do butelki (zaznaczone na szaro), w którym to czasie szczury często wykazują znaczne zachowanie związane z ładowaniem od przodu. Różnice między grupami we wzorcach picia można również badać przy użyciu podobnego podejścia, czego przykładem jest mikrostruktura lizawki dla (D) EtOH i (E) _H2Oprzedstawiona dla samców i samic szczurów w okresie 24 godzin. (F) Wzorce picia można również ocenić w wysokiej rozdzielczości czasowej w krótszym okresie testowym, (G), podczas którego LIQ HDR nadal dokładnie śledzi spożycie i (H) przewiduje stężenie etanolu we krwi (BEC) nawet przy stosunkowo niskich poziomach spożycia EtOH. Zacienione słupki błędów reprezentują ± SEM (n = 6 dla każdej płci). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Reprezentatywne dane dotyczące mikrostruktury picia. LIQ HDR umożliwia uchwycenie pomiarów mikrostruktury picia, w tym (A) liczbę lizań, (B) liczbę napadów picia i (C) długość serii, a także (D) pomiar całkowitego spożycia wody przez zmianę wagi butelki. (E-H) Podobne środki można uzyskać w przypadku etanolu. Porównania między grupami tych miar mogą zidentyfikować wyraźne wzorce picia, jak ma to miejsce w obecnym przykładzie, który ujawnia różnice płci w strategiach picia w oparciu o spożyty roztwór. Linia ciągła oznacza medianę, a linie przerywane oznaczają kwartyle (n = 6 dla każdej płci); niesparowany test t; *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Konfiguracja interfejsu mikrokontrolera. (A) Części elektroniczne i schemat połączeń. (B) Materiały do budowy interfejsu mikrokontrolera wymaganego dla jednego systemu LIQ HDR. (C) Z tyłu pojemnościowej osłony dotykowej dodaj zworkę lutowniczą na tylnych polach lutowniczych. (D) Z tyłu osłony rejestrującej dane odciąć ślad zworki styku CS (1). przewód połączeniowy od pinu CS do pinu #7 (2). (E) piny nagłówka do rejestratora danych, używając osłony dotykowej jako podstawy. (F) Ułóż pozostałe złącze header 2x4 do mikrokontrolera (1), ułóż rejestrator danych na mikrokontrolerze i nagłówek na miejsce (2). (G) Włóż baterię pastylkową do rejestratora danych (1), ułóż ekran dotykowy na rejestratorze danych i włóż kartę SD do rejestratora danych (2). (H) Aby wykonać dodatkowy przewód uziemiający, odetnij jedno złącze męskie od przewodu połączeniowego i koniec do odizolowanego przewodu z rdzeniem stałym. (I) Podłącz 4-pinowe przewody połączeniowe i dodatkowy przewód uziemiający do mikrokontrolera (1) i zabezpiecz gorącym klejem (2). (J) Umieść interfejs mikrokontrolera w niestandardowej obudowie wydrukowanej w 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przechwytywania danych dotyczących picia etanolu przy użyciu procedury klatki domowej z przerywanym dostępem do dwóch butelek. Metoda ta może być wdrożona ze względną łatwością i przy niewielkich lub zerowych kosztach lub potrzebie specjalistycznego sprzętu badawczego. Korzystając z przedstawionych tutaj procedur do konstruowania i wdrażania LIQ HDR - systemu wykrywania lizawek do stosowania u szczurów - naukowcy mogą rejestrować dane o mikrostrukturze picia o wysokiej rozdzielczości, oprócz standardowych pomiarów spożycia i preferencji.

Harmonogram przerywanego dostępu opisany w obecnym protokole jest szeroko stosowaną procedurą w dużej mierze dlatego, że jest dobrze znany z tego, że powoduje wyższe poziomy spożycia etanolu niż wiele alternatywnych harmonogramów dostępu do etanolu. Rzeczywiście, wcześniejsze badania wykazały, że szczury z dostępem w trybie przerywanym mają wyższe średnie dzienne spożycie etanolu niż szczury z ciągłym dostępem przez 24 godziny^{na dobę} ^6,7. Niemniej jednak pożądane mogą być różne harmonogramy dostępu do etanolu w zależności od pytania badawczego lub innych parametrów projektu eksperymentalnego. Naukowcy mogą bardzo łatwo zmodyfikować obecny protokół, aby dostosować go do różnych harmonogramów (np. ciągły dostęp, picie w ciemności itp.), po prostu zmieniając czas i dni włączania i wyłączania butelki.

Chociaż picie z dwóch butelek jest stosunkowo prostym do wdrożenia paradygmatem, mogą pojawić się problemy, które mogą zagrozić gromadzeniu danych. Dlatego tak ważne jest, aby eksperymentatorzy codziennie sprawdzali dane, aby szybko zidentyfikować potencjalne problemy. W szczególności badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na bardzo duże lub bardzo małe zmiany w wadze butelek, które mogą wskazywać odpowiednio na nieszczelny lub zatkany łyk. Wczesne wychwycenie oznak tych problemów może zapobiec wykluczeniu z analizy wszystkich danych z danego tematu. Rzeczywiście, jeśli badacze zauważą drastyczne zmiany (lub brak zmian) w wadze butelki w ciągu 24 godzin, prosta zmiana na nową butelkę może pomóc w potwierdzeniu, czy dana butelka powinna zostać wycofana z obiegu. Z tych powodów dobrze jest mieć pod ręką dodatkowe butelki i popijaki. Należy jednak zauważyć, że niektóre szczury naturalnie wykazują bardzo niski poziom picia etanolu, np. ³⁵. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku szczurów niektórych szczepów, patrz⁸ w celu przeglądu. Dlatego naukowcy nie powinni być zaniepokojeni, jeśli niewielka populacja zwierząt w danym eksperymencie ma niskie spożycie etanolu lub nie ma go wcale. Podobnie, niektóre zwierzęta mają skłonność do zabawy łykiem/butelką w sposób, który może sprzyjać rozlaniu. Chociaż rzadko, powtarzające się przypadki dużych zmian masy butelki, które nie są związane ze spożyciem, mogą wymagać usunięcia określonego zwierzęcia z eksperymentu.

Nasz szczegółowy protokół krok po kroku pokazuje łatwość wdrożenia i użytkowania systemu LIQ HDR dla szczurów. Badacze bez wcześniejszej wiedzy lub umiejętności w zakresie elektroniki mikrokontrolerów i programowania mogą łatwo dostosować ten system do swoich potrzeb eksperymentalnych z niewielkimi lub żadnymi modyfikacjami. Nasze reprezentatywne dane dodatkowo wskazują na jego udane zastosowanie w badaniach nad piciem w klatkach dla szczurów w domach i jego potężną zdolność do uchwycenia wielu pomiarów mikrostruktury picia w wysokiej rozdzielczości czasowej. LIQ HDR zawiera kilka modyfikacji konstrukcyjnych w stosunku do swojego poprzednika^{myszy 30}. Zostało to zrobione nie tylko ze względu na konieczność udanej adaptacji do stosowania u szczurów, ale także w celu poprawy funkcjonalności i doświadczenia użytkownika. Elementy w klatce, w tym wydrukowany w 3D uchwyt na butelkę, blokada łyków i elementy elektroniczne, są przenoszone na górę klatki w celu ochrony przed żuciem, co może skutkować częstą i znaczną utratą danych oraz rotacją sprzętu. Dodanie wycinanego laserowo panelu akrylowego dodatkowo pomaga zapobiegać zniszczeniu tych wrażliwych elementów. Poza panelem akrylowym, który jest wykonany z tego samego materiału, co standardowa klatka dla szczurów w pudełku po butach, wszystkie inne elementy LIQ HDR są niedostępne dla zwierzęcia z wnętrza klatki lub dostępne tylko na krótką chwilę podczas zmiany butelki. Taka konstrukcja ogranicza możliwość zniszczenia elementów urządzenia i ryzyko dla zwierzęcia w wyniku spożycia produktów nieżywnościowych. W przeciwieństwie do stosunkowo pracochłonnych butelek na zamówienie używanych w projekcie LIQ HD, wydrukowany w 3D UCHWYT NA BUTELKĘ LIQ HDR został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z dostępnymi na rynku butelkami do picia dla gryzoni. Butelki są instalowane na górze klatki i są dostępne dla szczurów w taki sam sposób, jak butelki do picia są stosowane podczas standardowej pielęgnacji i hodowli. Dodanie blokerów sipper jest prostym, ale skutecznym rozwiązaniem, które poprawia niezawodność systemu i zapobiega utracie cennych danych, które w przypadku braku blokera mogą wynikać z picia, które ma miejsce przed zainicjowaniem przechwytywania danych na interfejsie Arduino lub błędnych pomiarów lizania, które występują, gdy szczury wchodzą w interakcję z łykami podczas codziennej kalibracji. Podczas gdy znacznie większe klatki dla szczurów wymagają zwiększenia rozmiaru oryginalnego projektu sprzętu, użycie znacznie dłuższych kabli może negatywnie wpłynąć na czułość i dokładność wykrywania pojemnościowego z powodu zakłóceń, a także na integralność komunikacji^I2Cmiędzy łańcuchowymi płytkami czujników a interfejsem Arduino. Obejście tego problemu polega na zastosowaniu systemu komunikacji różnicowej I²C w celu uzyskania ultradalekiego zasięgu, prawie bezstratnej transmisji sygnału za pośrednictwem kabli Ethernet. Materiały użyte do produkcji komponentów w klatce pozwalają na łatwe czyszczenie i dezynfekcję między użyciami. Linkometr można spryskać i przetrzeć 70% roztworem EtOH, przy czym należy zachować ostrożność, aby elementy elektryczne, takie jak przewodząca taśma miedziana, pozostały nienaruszone. Sprzęt nieelektryczny, który ma bezpośredni kontakt ze zwierzęciem, taki jak bloker łyka i panel akrylowy, można dokładnie umyć ciepłą wodą z mydłem.

Niezawodność i skuteczność każdego systemu wykrywania lizawek wymaga odpowiedniej konstrukcji i instalacji, a także szeroko zakrojonych testów, starannego monitorowania błędów i skutecznego rozwiązywania problemów. Wszystkie elementy do majsterkowania muszą być wykonane i zmontowane z wprawą i starannością. Jest to szczególnie ważne w przypadku etapów związanych z, które mogą wymagać praktyki dla początkujących. Niezależnie od tego, przed użyciem w rzeczywistych eksperymentach wymagane jest szeroko zakrojone testowanie wszystkich likometrów. Jeśli system musi zostać zmodyfikowany w celu dostosowania do indywidualnych potrzeb eksperymentalnych, ustawienia czujnika (np. progi dotyku i zwolnienia) mogą wymagać dalszego dostrojenia w celu dokładnego wykrywania lizania. Dla początkujących użytkowników sugerujemy przetestowanie systemu w krótkim, pilotażowym badaniu na małej próbie przy użyciu wysoce smacznego roztworu, który spowoduje wysoki poziom picia. Wykrywanie lizawki można zweryfikować w czasie rzeczywistym, dokonując wizualnej kontroli płytki czujnika, ponieważ dioda LED za każdym razem, gdy zarejestrowane jest lizawki. Silne, znaczące i stałe korelacje między liczbą lizawek a zmianą wagi butelki powinny być wykorzystywane jako punkt odniesienia dla prawidłowej konfiguracji sprzętu i oprogramowania. Nawet po sfinalizowaniu konfiguracji zalecamy rozpoczęcie nagrywania dla danego eksperymentu w dniu, w którym szczury otrzymują dwie butelki zawierające wodę, w celu rozwiązania problemów ze sprzętem, które mogą być widoczne na początku eksperymentu. Korzystne może być również przetestowanie funkcji likometru w dniu wodnym w związku ze zmianą klatki, ponieważ wymaga to odłączenia likometrów i ponownego podłączenia do czujnika. Losowa awaria pojedynczego lizometru lub czujnika, która skutkowałaby bardzo oczywistymi danymi odstającymi (np. brak lub wykryto niewiele lizawek pomimo znacznej zmiany masy butelki) konsekwentnie dla tego samego lizometru, wskazuje na wadliwy komponent (elementy). Zalecamy wcześniejsze przygotowanie dodatkowych komponentów do każdego elementu systemu likometru, aby umożliwić łatwą wymianę w razie potrzeby. Wreszcie, nie można przecenić znaczenia upewnienia się, że kable czujników nie zachodzą na siebie ani nie zginają się nadmiernie. Może to skutkować losowymi przypadkami słabego wykrywania lizania, widocznym przez nieracjonalnie niską liczbę lizania dla danej zmiany wagi butelki lub bardzo długi czas lizania (blisko 60 000 ms dla 1-minutowego pojemnika) obejmujący minuty lub godziny. Niemniej jednak niewielkie straty danych są nieuniknione w badaniach, w których dane zbiera się w ciągu 24 godzin dla wielu zwierząt przez wiele dni przy użyciu podejścia standardowego lub wyposażonego w lizometr. Badacze mogą wykluczyć błędne dane dotyczące rzadkich sesji picia, gdy waga butelki i/lub lizanie wyraźnie nie odzwierciedlają spożycia (np. zatkanie łyka, błąd kalibracji itp.). W takich przypadkach średnia wartość dla danej miary (np. spożycia (g/kg), lizania itp.) w okresie badania dla tego konkretnego podmiotu może zostać zastąpiona brakującą wartością podczas analizy danych. ANOVA z efektami mieszanymi może być również używana jako alternatywa w celu uzupełnienia brakujących punktów danych.

Jedną z zalet paradygmatu picia z wyboru dwóch butelek jest dobrowolny aspekt przyjmowania etanolu. Zapewnia to doskonałą trafność twarzy, szczególnie w świetle wyników pokazujących, że alkohol podawany przez eksperymentatora może mieć znacząco różny wpływ na funkcjonowanie mózgu i zachowanie w porównaniu z dobrowolnie podawanym alkoholem⁴². Co więcej, dobrowolny charakter paradygmatu pozwala naukowcom uchwycić indywidualne różnice w spożyciu, podobne do zmienności preferencji alkoholowych i wzorców picia obserwowanych u ludzi. Te indywidualne różnice mogą stanowić potężną okazję dla badaczy do skorelowania konsumpcji (spożycia i/lub wzorców) z wielkością obserwowanych efektów patologicznych.

Niemniej jednak należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia paradygmatu picia w klatce domowej z dwiema butelkami. Na przykład, chociaż indywidualna zmienność spożycia etanolu może być korzystna dla niektórych eksperymentów, może być wadą w innych eksperymentach, w których pożądany może być stały poziom odurzenia lub narażenia na etanol. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku eksperymentów badających konsekwencje uzależnienia i odstawienia od przewlekłego narażenia na etanol. Co ważne, picie z dwóch butelek nie jest charakteryzowane jako model uzależnienia - nawet u szczurów z dostępem do etanolu przez dłuższy czas. Tak więc, przy braku objawów towarzyszących odstawieniu, badacze powinni zachować ostrożność w interpretacji konsekwencji długotrwałego spożywania etanolu jako skutków uzależnienia i/lub odstawienia. Rzeczywiście, jest możliwe, jeśli nie prawdopodobne, że szczury pijące stosunkowo duże ilości etanolu podczas procedury wyboru dwóch butelek wykazują objawy odstawienia, ale szczury pijące mniejsze całkowite ilości w danym okresie 24 godzin nie wykazują podobnych objawów uzależnienia. Wzorce picia mogą również odgrywać ważną rolę w tych rozważaniach, ponieważ dwa zwierzęta pijące tę samą ilość w ciągu 24 godzin mogą doświadczać bardzo różnych poziomów zatrucia (tj. BEC) w zależności od wzorca spożycia etanolu²². Podkreśla to użyteczność LIQ HDR w procedurze wyboru dwóch butelek, ponieważ może łatwo zidentyfikować szczury, które spożywają daną dawkę etanolu w szybkim tempie (tj. łyk) w porównaniu z tymi, które spożywają tę samą dawkę w znacznie wolniejszym tempie (tj. łyk). Chociaż jest to potencjalnie niepożądane w badaniach oceniających skutki kontrolowanej dawki etanolu, wykrywanie zmian we wzorcach picia (np. zmniejszone epizody objadania się) po określonej interwencji eksperymentalnej ma znaczącą wartość translacyjną, biorąc pod uwagę podejście do redukcji szkód, które jest coraz częściej stosowane w klinice. Wreszcie, nie jest wymagany wysiłek, aby zwierzęta uzyskały dostęp do etanolu w paradygmatach picia w klatkach domowych, w tym w opisanym tutaj. Dlatego użyteczność tego paradygmatu ogranicza się do analizy samego picia, podczas gdy metody instrumentalne są preferowane w przypadkach, gdy badacze są zainteresowani badaniem poszukiwania alkoholu - co jest ważną cechą AUD.

Podsumowując, opisany tutaj protokół dostarcza naukowcom wszystkich informacji i zasobów niezbędnych do pomiaru spożycia etanolu przez szczury w klatce domowej. Przedstawiamy opcje podejść o stosunkowo niskiej i wysokiej rozdzielczości, zapewniając badaczom elastyczność w wyborze metody, która jest najbardziej odpowiednia dla ich potrzeb badawczych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Josephowi Pitockowi i dr Katie Przybysz za pomoc techniczną podczas rozwoju LIQ HDR. Dziękujemy również Nicholasowi Petersenowi i dr Marie Doyle za wiele pomocnych rozmów podczas tworzenia LIQ HDR. Prace te były wspierane przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism przy National Institutes of Health (P50 AA022538 i R01 AA029130 do EJG).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dostępne na rynku komponenty			Ilość
12-klawiszowy pojemnościowy czujnik dotykowy (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-pinowa para (raster JST XH 2,5 mm)	Adafruit	4872	18
4-pinowa zworka do płytki stykowej (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
4-pinowy (100mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
4-pinowy (50mm Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
przesuwnik poziomu 5V-na-3V	Adafruit	5637	1
Pojemnościowa osłona dotykowa (2,8 cala)	Adafruit	1947	1
Miedziana taśma przewodząca (1/4 cala)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND
1 Dane Osłona rejestracyjna	Adafruit	1141	1
Zestaw do różnicowej komunikacji I2C (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Taśma izolacyjna	DigiKey	3M156004-ND	1
Rurka termokurczliwa (3/16 cala różne kolory)	Opaski kablowe i więcej	HS357-S10	6
Zestaw rurek termokurczliwych (4 cale)	Jameco	2095963	1
Litowa bateria pastylkowa (3V 12.5mm)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
M5 płaska podkładka	Grainger	54FN66	1
M5 nakrętka sześciokątna	Grainger	6CA72	1
śruba maszynowa M5 (12mm)	Grainger	6GU88	1
M5 śruba maszynowa (25mm)	Grainger	6GU91	2
męski/męski przewód połączeniowy	Adafruit	1957	1
płytka mikrokontrolera (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND
1 filament PETG (2,85 mm srebrny)	MatterHackers	M-DDH-UZR2
2 filament PLA (2,85 mm)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
filament PLA (2,85 mm srebrny)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Zasilacz (DC 9V 1A)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
karta pamięci SD/microSD (8GB)	Adafruit	1294	1
Nagłówki do układania w stosy Adafruit		85	1
Drut z rdzeniem stałym (22AWG czerwony)	Adafruit	288	1
Przewód linkowy (22AWG)	Adafruit	2976	1
Drut linkowy (22AWG czerwony)	Adafruit	3068	1
rurka sipper z nakrętką skręcaną z kulką	Alternatywny projekt	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Butelka na wodę (8 uncji)	Alternatywny projekt	WB8FS	38
niestandardowe komponenty drukowane w 3D< / mocny>			Ilość
spód obudowy Arduino wydrukowany w 3D	Nie dotyczy	ARDUINO_Bottom.stl	1
Górna część obudowy Arduino z nadrukiem 3D	Nie dotyczy	ARDUINO_Top.stl	1
Klips kablowy drukowany w 3D L	Nie dotyczy	CLIP_L.stl	18
Nakrętka z klipsem kablowym	w	Nie dotyczy CLIP_Nut.stl	18
Klips kablowy drukowany w 3D R	dotyczy	CLIP_R.stl	18
Uchwyt na butelkę z drukowanym w 3D likometrem	Nie dotyczy	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Drukowana w 3D osłona liktometru L	Nie dotyczy	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Drukowana w 3D osłona likometru R	Nie dotyczy	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
Drukowane w 3D litery likometru	Nie dotyczy	LICKOMETER_Letters.stl	19
Śruba montażowa drukowana w 3D	Nie	Śruba mocująca.stl	4
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D A dół	Nie	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D A góra	Nie	SENSOR_A_Top.stl	1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D B dół	Nie	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D B góra	Nie	SENSOR_B_Top.stl	1
Obudowa czujnika wydrukowana w 3D C dół	Nie dotyczy	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Wydrukowana w 3D obudowa czujnika C top	N/A	SENSOR_B_Top.stl	1
Wydrukowane w 3D litery obudowy	czujnika N/A	SENSOR_Letters.stl	1
Drukowana w 3D blokada sipper	Nd.	SIPPER_Blocker.stl	36
Wydrukowana w 3D podstawa blokująca sipper	Nie dotyczy	SIPPER_Base.stl	18
Wydrukowana w 3D przekładnia blokująca sipper	Nie dotyczy	SIPPER_Gear.stl	18
Nakrętka blokująca sipper z nadrukiem 3D	N/A	SIPPER_Nut.stl	18
Drukowana w 3D śruba blokująca sipper	Nd.	SIPPER_Worm.stl	18
Wycinany laserowo panel akrylowy Lizkometr	N/A	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

wydrukowana 3D Nie dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spo ycie alkoholu u gryzoni mikrostruktura picia system lickometru przyjmowanie etanolu przez szczury wzorce picia st enie etanolu we krwi picie epizodyczne binge like drinking

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły