Artykuł metodologiczny

Organotypowe systemy modelowania tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro

DOI:

10.3791/67487

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje zastosowanie organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy nabłonek jamy ustnej narażony na działanie mikroorganizmów związanych z biofilmami (płytką nazębną) w kontekście zdrowia jamy ustnej w porównaniu z chorobą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekapitulacja interfejsu gospodarz-patogen na barierze nabłonkowej lub śluzówkowej in vitro pozostaje wyzwaniem dla biologów zajmujących się infekcjami. Podczas gdy monowarstwy nabłonka 2D hodowane we własnym zakresie nie są wiernie odwzorowane w warunkach in vivo, dostępne na rynku modele tkanek są często pomijane ze względu na ich koszt i praktyczność. Jednak przy starannym planowaniu takie modele zapewniają powtarzalne platformy dla szerokiej gamy różnych zastosowań. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu modeli nabłonkowych, które można wykorzystać do wielu różnych celów eksperymentalnych w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen w różnych niszach ekologicznych, takich jak jama ustna, skóra i błona śluzowa pochwy. Od prostych komórek planktonowych po złożone współhodowle biofilmu, modele nabłonkowe są wykorzystywane do oceny przylegania i inwazji drobnoustrojów oraz do oceny odpowiedzi gospodarza na poziomie transkrypcji i/lub białka, z możliwością bardziej szczegółowego profilowania przy użyciu różnych podejść omicznych. Co więcej, te systemy biologiczne mogą być wykorzystywane jako dokładniejsze stanowiska testowe do oceny konwencjonalnej i nowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej w złożonym mikrośrodowisku gospodarz-patogen in vitro. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły dokumentują, w jaki sposób modele są traktowane po przybyciu i przygotowywane w laboratorium do stymulacji wspólnej hodowli ze społecznościami biofilmu. Metody szczegółowo opisują, w jaki sposób wyniki eksperymentów są uzyskiwane z systemów modelowych, w tym przetwarzanie tkanki, konfiguracja kohodowli i generowanie danych. Eksperymenty te obejmują ekspresję genów gospodarza poprzez jedno- i multipleksowe analizy qPCR oraz wykrywanie białek zapalnych za pomocą testów ELISA. Podsumowując, modele nabłonkowe stanowią użyteczne systemy in vitro do przedklinicznych badań badawczych nad prostymi lub złożonymi interakcjami gospodarz-patogen.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy modeli in vitro dostarczają doskonałych warunków do badania interakcji gospodarz-patogen. Te systemy organotypowe mają na celu podsumowanie mikrośrodowiska różnych nisz ekologicznych podatnych na perturbacje mikrobiologiczne. Opublikowano szereg artykułów naukowych, w których wykorzystano modele tkanek EpiSkin (dawniej SkinEthic) do oceny interakcji gospodarz-patogen w jamie ustnej1,2,3,4,5, bariera skórna6,7,8,9,10,11, oraz błona śluzowa pochwy5,12,13, między innymi14,15. W przeciwieństwie do "dwuwymiarowej" lub "dwuwymiarowej" hodowli komórkowej, która opiera się na wykorzystaniu monowarstw nabłonkowych linii komórkowych narażonych na działanie mikroorganizmów, te dostępne na rynku modele składają się z wielu warstw zróżnicowanych komórek hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz. Chociaż systemy hodowli 2D są tańsze i często uważane za bardziej powtarzalne, są podatne na uszkodzenia komórek, gdy są hodowane z mikroorganizmami, które nie zawsze dokładnie reprezentują bariery nabłonkowe lub błony śluzowej in vivo16,17.

Ostatnie dowody pokazują, że techniki hodowli "trójwymiarowej" lub "3D" stają się coraz bardziej popularne w różnych dyscyplinach naukowych, w tym w naukach o raku, badaniach nad komórkami macierzystymi i odkrywaniu leków16,18. W kontekście biologii zakażeń modele tkanek 3D mogą być wykorzystywane do badań nad interakcjami gospodarz-bakteria, grzyb lub mieszany gatunek na granicy faz nabłonka lub bariery śluzówkowej w kontrolowanym mikrośrodowisku in vitro. Modele te mają wiele zalet w porównaniu z systemami hodowli 2D, pozwalając na ocenę kolonizacji tkanek i/lub inwazji organizmów chorobotwórczych lub złożonych zbiorowisk biofilmu17 oraz ocenę odpowiedzi gospodarza na poziomie wieloskładnikowym dla różnych biomarkerów, gdzie modele 2D są czasami ograniczone przez ich profile transkrypcyjne lub proteomiczne16,17,18. Ostatecznie, przedkliniczne zastosowania takich systemów 3D są ogromne, dostarczając ważnych danych eksploracyjnych, które można wykorzystać w modelach in vivo lub badaniach klinicznych.

W kontekście zdrowia i chorób jamy ustnej, zrozumienie szlaków zapalnych zaangażowanych na powierzchni błony śluzowej jamy ustnej jest ważne dla klinicystów, ponieważ może to ukierunkować metody leczenia. Wcześniejsze badania wykazały, że biofilmy "związane ze zdrowiem" mogą wywoływać minimalne reakcje zapalne3,19,20,21. Może to wynikać z mniejszego obciążenia biologicznego mikrobiologicznego związanego ze zdrowiem jamy ustnej lub ze względu na skład biofilmu ze Streptococcus spp. powszechnie uważanym za immunomodulatory22,23. Z drugiej strony, biofilmy składające się z mikroorganizmów związanych z chorobą, takich jak Fusobacterium nucleatum i Porphyromonas gingivalis, mają charakter prozapalny3,20,24,25,26,27. Przegląd przeprowadzony przez Mountcastle i in. w 2020 r. opisał wszystkie istotne modele kokultur, które istniały w tym czasie dla mikrośrodowiska jamy ustnej17. Chociaż takich modeli organotypowych jest mnóstwo, a kilka z nich zostało wyprodukowanych od28,29, nadal istnieje wiele trudnych przeszkód związanych z tworzeniem takich modeli 3D. Aby wymienić tylko kilka, modele te wymagają znacznej optymalizacji, a ich produkcja jest wysoce pracochłonna i zasobożerna; Odtwarzalność może być również bardzo zmienna, chyba że jest dokładnie kontrolowana16,17. Dostępne na rynku modele pozwalają obejść te problemy, zapewniając platformy do badania interakcji gospodarz-patogen w jamie ustnej i w innych niszach ekologicznych w ludzkim ciele.

Podsumowując, obecny protokół ma na celu nakreślenie zastosowania modeli tkanek organotypowych do badania interakcji gospodarz-patogen in vitro w kontekście zdrowia i chorób jamy ustnej. W szczególności opisany system modelowy wykorzystuje wielowarstwowy, dostępny na rynku nabłonek jamy ustnej wystawiony na działanie zdefiniowanej społeczności biofilmu reprezentatywnego dla choroby zapalnej jamy ustnej, zapalenia dziąseł.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół obejmuje przygotowanie wielogatunkowego biofilmu reprezentatywnego dla zapalenia dziąseł, zawierającego w sumie 7 gatunków (spp.)7,30. Trzy Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) i Streptococcus oralis (NTCC 11427) są włączone w celu naśladowania zdrowia jamy ustnej, działając jako początkowe kolonizatory błonki ślinowej. Następnie dodano cztery mikroorganizmy beztlenowe związane z przejściem od zdrowia jamy ustnej do choroby: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) i dwa podgatunki Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) i Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). Wszystkie związane z tym czynności są przeprowadzane aseptycznie przy płomieniu lub w komorze bezpieczeństwa klasy II. Wszystkie pożywki i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) stosowane w preparatach mikrobiologicznych są sterylizowane w autoklawie przed użyciem, a sterylność jest oceniana w regularnych odstępach czasu podczas protokołu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zbiorowisk mikroorganizmów do kokultury

UWAGA: Ten protokół przedstawia generowanie wielogatunkowego biofilmu reprezentatywnego dla konsorcjów związanego z zapaleniem tkanki dziąseł, znanym również jako zapalenie dziąseł. Taki model został wykorzystany do oceny odpowiedzi gospodarza w zakresie zdrowia i choroby jamy ustnej, jak opisano wcześniej3.

  1. Ożywić wszystkie trzy gatunki Streptococcus na płytkach agaru z krwią (baza Columbia Blood Agar zawierająca 5% sterylnej, zdefibrynowanej krwi końskiej) z zamrożonych zapasów porowatych kulek (uzyskanych w handlu) zawierających mikroorganizmy przechowywane w temperaturze -80°C. Osiąga się to za pomocą pętli zaszczepiającej i techniki smugowo-płytkowej.
    1. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , a następnie wyizolować 3-4 kolonie do rozmnażania w 10 ml pożywki z bulionu sojowego z tryptonem. Wywary hodowlane przez 16-18 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. W przypadku patogenów pośrednich ożywić V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum i F. nucleatum subspp. vincentii beztlenowo na podłożu Fastidious Anaaerobic Agar zawierającym 5% sterylnej defibrynowanej krwi końskiej przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, przed hodowlą w bulionie Schaedlera przez dodatkowe 24-48 godzin w tych samych warunkach.
  3. Po wzroście, zawiesiny komórek osadu przez wirowanie przez 5 minut, w temperaturze 20 °C przy 3000 x g, a następnie przemyć granulki w 10 ml sterylnego PBS (pH 7,2-7,6). Zawiesiny komórek osadu ponownie przez wirowanie przez 5 minut, w temperaturze 20 °C przy 3000 x g, a następnie powtórzyć etapy mycia po raz drugi. Ponownie zawiesić umyte komórki w 10 ml sterylnego PBS w celu standaryzacji.
  4. Standaryzować wszystkie trzy Streptococcus spp. indywidualnie za pomocą spektrofotometru przy długości fali 550 nm. Wartości absorbancji 0,50 (dopuszczalny zakres od 0,45 do 0,55) wskazują na liczbę komórek ~1 x 108 komórek/ml, jak wcześniej określono przy użyciu techniki liczenia komórek Milesa i Misry31. Aby osiągnąć ten odczyt absorbancji, należy dodatkowo rozcieńczyć 10 ml przemytych zawiesin komórek w sterylnym PBS.
  5. Po standaryzacji rozcieńczyć wszystkie Streptococcus spp. 1:10 do 1 x 107 komórek/ml w mieszaninie 1:1 bulionu Todda Hewitta (THB) i pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej przez pipetowanie do 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z mikromiareczkowym pojemnikiem, zawierającej krążek hydroksyapatytu o średnicy 13 mm. Pozostawić biofilmy do dojrzewania na 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
    UWAGA: Biofilmy wielogatunkowe mogą być hodowane na różnych podłożach istotnych dla jamy ustnej, takich jak szkliwo, zębina 32 i powierzchnie protez z poli(metakrylanu metylu)33,34. W tych modelach można również zastosować alternatywne podłoża, takie jak sztuczna lub syntetyczna ślina, chociaż należy dokładnie rozważyć w zależności od zastosowanych konsorcjów mikroorganizmów: badania wykazały, że wybór pożywki wzrostowej ma ważne implikacje dla wzrostu biofilmu w społeczności mieszanej35,36.
  6. Następnego dnia standaryzuj cztery mikroorganizmy beztlenowe w sposób podobny do powyższego (kroki 1.2-1.4). Zawiesiny komórek osadu, przemyć dwukrotnie, a następnie standaryzować V. dispar do 0,50 absorbancji (zakres od 0,45-0,55), a trzy pozostałe mikroorganizmy do 0,20 absorbancji (zakres od 0,18-0,22). Po standaryzacji należy dodatkowo rozcieńczyć wszystkie zawiesiny w stosunku 1:10 do 1 x 107 komórek/ml w mieszaninie THB i RPMI w proporcji 1:1.
  7. Ostrożnie usunąć nieprzylegające komórki i zużyte podłoża i wyrzucić je z biofilmów Streptococcus za pomocą pipetowania. Zastąp studzienki na płytce do mikromiareczkowania 500 μl standaryzowanych zawiesin 1 x 107 komórek/ml czterech beztlenowców. Hodowla biofilmów przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C.
  8. Po 24 godzinach usunąć nieprzylegające komórki i zużyte pożywki z 7-gatunkowych biofilmów i zastąpić 500 μl sterylnej mieszaniny 1:1 pożywki THB: RPMI. Biofilmy pozostawia się do dojrzewania beztlenowego w temperaturze 37 °C przez 4 dni, przy czym pożywki są codziennie usuwane i uzupełniane (w sumie cztery zmiany pożywki).
  9. W 7 dniu wielogatunkowy biofilm jest w pełni dojrzały i gotowy do dalszych eksperymentów. Przemyć biofilmy dwukrotnie 500 μl sterylnego PBS do stosowania w kokulturze.
    UWAGA: Biofilmy mogą być profilowane przy użyciu szeregu metodologii biologicznych, takich jak qPCR (do oceny składu) i profilowanie mikroskopowe za pomocą mikroskopii konfokalnej lub elektronowej, jak opisano wcześniej3.

2. Postępowanie z tkankami organotypowymi i konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Opisana poniżej konfiguracja eksperymentalna obejmuje tkankę ludzkiego nabłonka jamy ustnej (HOE) składającą się z komórek TR146 hodowanych na obojętnym filtrze membranowym z poliwęglanu. Istnieją inne modele, w tym modele naskórka, pęcherza moczowego, przełyku, rogówki, dziąseł i nabłonka pochwy. Wszystkie modele są obsługiwane i przygotowywane w sposób podobny do opisanego poniżej w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen.

  1. Po przybyciu na miejsce rozpakuj i przenieś chusteczki i pożywki HOE do szafy bezpieczeństwa klasy II. Dodać łącznie 1 ml pożywki konserwacyjnej dostarczonej z tkanką do płytek 12-dołkowych.
  2. Usuń wkładki poliwęglanowe zawierające HOE za pomocą sterylnej pęsety z płytek 24-dołkowych i agaru odżywczego używanych do transportu i przenieś je na płytki 12-dołkowe zawierające pożywkę, upewniając się, że pod tkanką nie pozostały pęcherzyki powietrza. Upewnij się, że nadmiar agaru przymocowany do boków lub spodu wkładek został ostrożnie usunięty za pomocą dodatkowej pęsety lub bibuły.
  3. Inkubować modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed przygotowaniem doświadczalnym w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych po wysyłce. Warto zauważyć, że dostępne są dodatkowe podłoża do konserwacji lub pożywki wzrostowe w celu dłuższej konserwacji lub dalszego dojrzewania modeli tkankowych.
  4. Można teraz przeprowadzać eksperymenty z kokulturą. Dla podanego tutaj przykładu, usuń 7-gatunkowe biofilmy utworzone jak powyżej (kroki 1.1-1.9) z ich substratów za pomocą sonikacji. Aby to osiągnąć, należy usunąć krążki kwasu hialuronowego zawierające biofilmy z dna płytek 24-dołkowych za pomocą igły 19 G i pęsety, a następnie przenieść biżux zawierający 1 ml sterylnego PBS firmy Dulbecco. Sonikować przy 35 kHz przez 10 minut w sonikacyjnej łaźni wodnej.
  5. Ostrożnie usunąć wkładki zawierające modele tkanek za pomocą pęsety z nocnej aklimatyzacji i dodać 100 μl zawiesiny sonikacji biofilmu bezpośrednio do tkanki za pomocą pipetowania. Do celów porównawczych należy używać niestymulowanych tkanek kontrolnych. W przypadku tych kontrolnych wkładek tkankowych dodać 100 μl sterylnego PBS Dulbecco bez zawiesiny biofilmu.
    UWAGA: Komórki planktonowe, zużyte supernatanty biofilmu zawierające rozproszone komórki lub całe biofilmy mogą być wykorzystane do modelu kokultury zamiast sonicate'a biofilmu. Różne zastosowania tych modeli gospodarz-patogen wykorzystujących różne stymulanty mikrobiologiczne są schematyczne w Rysunek 1, jak udokumentowano gdzie indziej3,5,6,8,13,37,38.
  6. Po dodaniu przenieś wkładki na inną 12-dołkową płytkę zawierającą 1 ml świeżej pożywki konserwacyjnej, ponownie upewniając się, że pod wkładkami nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować płytki zawierające modele tkanek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed przetworzeniem tkanek do dalszych zastosowań.
    UWAGA: Dostawcy tkanek mogą dostarczyć dodatkowe podłoża w celu wsparcia ciągłej hodowli tkanki po ekspozycji na sonikowane agregaty lub biofilmy. W tym celu opublikowano kilka wcześniejszych modeli badających przedłużoną inokulację biofilmu tkankowego21,28,39. Aby osiągnąć podobne wyniki przy użyciu obecnego modelu organotypowego, należy poddać sonikę (jak wyżej, krok 2.6) i pozostawić mikroorganizmy do przyczepienia się na 24 godziny. Odrzucić pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną i kontynuować hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz przez wymagany przebieg doświadczenia w czasie.

3. Przetwarzanie tkanek dla wyników eksperymentalnych

UWAGA: Po wspólnej hodowli, modele tkankowe są przetwarzane na wyniki eksperymentalne. Poniższe kroki dokumentują, w jaki sposób RNA jest ekstrahowane z tkanki w celu profilowania transkrypcji oraz jak zużyte pożywki tkankowe są wykorzystywane do wykrywania białek. Tkanka może być również utrwalona w formalinie, paraformaldehydzie lub podobnym utrwalaczu do oceny histologicznej, jak opisano wcześniej3,6.

  1. Najpierw przygotuj 350 μl buforu do lizy RLT w 2,0 ml zakręcanych probówkach O-Ring zawierających 1% β-merkaptoetanolu i ~100 μl ekwiwalentu 0,5 mm szklanych kulek przemytych kwasem.
  2. Usuń wkładki zawierające tkankę z podłoża za pomocą pęsety i wyrzuć pozostałą zawiesinę mikrobiologiczną z wkładki. Następnie przytrzymaj, odwrócony, na wysokości oczu, dla ułatwienia. Za pomocą igły 19 G ostrożnie przeciąć tkankę i błonę od spodu wkładki i przenieść do buforu RLT.
    1. Homogenizować tkankę w czasie 30 s za pomocą laboratoryjnego homogenizatora bijakowego, a następnie wyekstrahować RNA z lizatu zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Wyekstrahowany RNA służy do syntezy cDNA w celu profilowania ekspresji genów cytokin i chemokiny jako markerów stanu zapalnego za pomocą ilościowego PCR (qPCR) lub sekwencjonowania RNA. qPCR uzyskuje się za pomocą macierzy multipleksowych, takich jak matryca profilująca RT2 PCR zawierająca dołki z gotowymi starterami dla określonych genów lub odczynnik na bazie zielonej SYBR z zaprojektowanymi przez siebie sekwencjami starterów i wolnymi od nukleaz ddH2O3.
  3. Zbierz pozostałe zużyte pożywki tkankowe (~850-900 μl) do analiz proteomicznych przy użyciu metodologii nisko- i wysokoprzepustowych, takich jak ELISA, multipleksowe testy immunologiczne lub multipleksowa analiza biomarkerów białkowych7.
  4. Korzystając ze zużytych pożywek tkankowych, oceń szereg markerów związanych ze stanem zapalnym na poziomie białka. Zużyte pożywki mogą być bezpośrednio wykorzystane do powyższych metodologii (krok 3.3) lub przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C. W przypadku takich analiz należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania pożywki.
    UWAGA: Pożywka może wymagać rozcieńczenia w stosunku 1:10 w zależności od stymulatora tkankowego w celu dokładnego profilowania proteomicznego za pomocą testów ELISA.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym eksperymencie, HOE został wystawiony na działanie 7-gatunkowego sonikatu biofilmu zawierającego przedstawiciela organizmu przejścia od zdrowia jamy ustnej do zapalenia dziąseł (znanego jako zapalenie dziąseł). Choroba ta powstaje w wyniku zapalenia tkanki nabłonka dziąseł lub jamy ustnej spowodowanego zaburzeniami mikrobiologicznymi spowodowanymi gromadzeniem się płytki nazębnej na powierzchni zęba. Po stymulacji tkanki i zużyte pożywki są wykorzystywane do analiz transkrypcyjnych i proteomicznych, jak omówiono powyżej. W tym eksperymencie ekspresję genu panelu biomarkerów stanu zapalnego wykryto w tkance po stymulacji sonicate biofilmu (Ryc. 2). Osiągnięto to dzięki zastosowaniu niestandardowej matrycy profilującej RT2 PCR zawierającej 16 różnych genów, a ekspresję genów wykazano jako zmianę fałdowania w stosunku do niestymulowanej tkanki po normalizacji do genu porządkowego GAPDH. Stymulacja mikrobiologiczna zwiększyła ekspresję wszystkich genów z wyjątkiem CXCL5, przy czym różnice statystyczne zaobserwowano dla NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B i TLR4 (Figura 2A). Największą zmianę krotności zaobserwowano w przypadku CCL2, CXCL1 i CSF3, ze wzrostami odpowiednio o 16,9, 10,3 i 15,1 (Rysunek 2B).

Zużyte pożywki HOE zostały wykorzystane do analiz proteomicznych w celu wykrycia białek wytwarzanych i uwalnianych przez tkankę po stymulacji. Jest to przydatne do określenia, czy ekspresja genów koreluje z produkcją białek. W tym celu oceniono ekspresję genu IL8 i uwalnianie białka IL-8 w tkance kontrolnej i tkance stymulowanej biofilmem (Ryc. 3). Ekspresję genów oceniano za pomocą qPCR opartego na SYBR-green ze starterami dla IL8 i GAPDH, jak opisano wcześniej3. Ekspresja mRNA IL8 w HOE wzrosła 8,67-krotnie po stymulacji sonikatem biofilmu (Figura 3A). Na poziomie białka poziomy IL-8 określono ilościowo za pomocą zestawu IL-8 ELISA. Stężenie IL-8 w zużytych pożywkach wzrosło z ~ 1,005 ng / ml w tkance kontrolnej do ~ 4,245 ng / ml w tkance stymulowanej biofilmem (Figura 3B).

figure-results-1
Rysunek 1: Różne zastosowania dla modeli współhodowli tkanek organotypowych. Standaryzowane zawiesiny mikroorganizmów są bezpośrednio nakładane na tkankę w celu zbadania interakcji między gatunkiem a gospodarzem (A). Są one często używane do oceny kolonizacji drobnoustrojów w krótkim czasie (np. <24 godziny). Złożone biofilmy są sonikowane w celu zbadania wpływu rozproszonych komórek lub agregatów biofilmu na tkanki (B). Jest to ważne, ponieważ wcześniej wykazano, że takie komórki mają unikalne fenotypy w porównaniu z odpowiednikami planktonicznymi lub biofilmowymi; w tym celu nienaruszone biofilmy mogą być bezpośrednio dodawane do tkanki za pomocą dodatkowych mniejszych wkładek, aby stworzyć sąsiadującą ekspozycję z gospodarzem (C). Na koniec komórki planktoniczne są dodawane do tkanki w odpowiednich pożywkach hodowlanych w celu oceny kolonizacji mikrobiologicznej, tworzenia biofilmu i dynamiki wzrostu tkanki (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ekspresja genów w tkance HOE po stymulacji dźwiękiem 7-gatunkowego biofilmu. Zmiana ekspresji mRNA w sumie 15 genów zapalnych znormalizowanych do genu porządkowego, GAPDH, w tkance HOE w kontrolnych, niestymulowanych próbkach i wystawionych na 100 μL 7-gatunkowego sonikatu biofilmu (A). Trzy geny (CCL2, CXCL1, CSF3) o najwyższych zmianach w ekspresji mRNA pokazano w (B). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą parametrycznego niesparowanego testu T, w którym istotne zmiany przedstawiono odpowiednio jako *p <0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Dane zostały wykreślone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspresja genu IL8 i poziomy białka IL-8 wytwarzane przez tkankę HOE. Zmiana fałdowania ekspresji mRNA IL8 w tkance HOE, określona za pomocą qPCR (A) na bazie SYBR (A) i poziomów białka IL-8 określonych ilościowo z zużytych pożywek tkankowych przy użyciu metodologii ELISA (B). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu parametrycznego niesparowanego testu T, w którym istotne zmiany przedstawiono odpowiednio jako *p <0,05 i ****p < 0,0001. Dane zostały wykreślone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania statystycznego i graficznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano metodologie tworzenia złożonego, wielogatunkowego modelu biofilmu reprezentatywnego dla zapalenia dziąseł do jednoczesnej hodowli z tkanką HOE w celu oceny odpowiedzi gospodarza na stymulację mikrobiologiczną. Protokół ten może być zaadaptowany do wykorzystania w badaniu interakcji gospodarz-patogen między komórkami planktonowymi, biofilmami jedno-, dwu- lub mieszanymi lub komórkami rozproszonymi biofilmem z tkanką nabłonkową z różnych nisz ekologicznych w ludzkim ciele. Wykorzystanie modeli tkankowych do badania interakcji gospodarz-patogen stanowi ważny postęp w porównaniu z poprzednimi systemami kohodowli, które są ograniczone do monowarstw 2D, które nie zawsze naprawdę oddają sytuację in vivo, w której tkanka nabłonkowa zawiera wiele warstw komórkowych 16,17,18. Co więcej, istnieje wiele wyzwań związanych z hodowlą in vitro wielowarstwowych modeli tkankowych, z wykorzystaniem wielu linii komórkowych i/lub wzrostem warstw komórkowych na granicy faz powietrze-ciecz podatnych na zanieczyszczenie. Jak pokazano w poprzednichpublikacjach, dostępne na rynku tkanki stanowią powtarzalną platformę z modelami o niezmiennie wysokiej jakości, które są porównywalne między kontrpróbami i partiami.

W sekcji "przygotowanie zbiorowisk drobnoustrojów do wspólnej hodowli" wybrano włączenie tych mikroorganizmów do modelu 7-gatunkowego zapalenia dziąseł na podstawie powszechnie zidentyfikowanych komensalów i patogenów związanych z przejściem od zdrowia jamy ustnej do choroby. Podobnie jak w przypadku wszystkich złożonych systemów modelowania biofilmu in vitro, włączenie mikroorganizmów jest kierowane badaniami mikrobiomu odnoszącymi się do konkretnej zdrowej lub chorej niszy ekologicznej. W tym celu my i inni poinformowaliśmy o zastosowaniu modelu biofilmu związanego ze zdrowiem jamy ustnej zawierającego mikroorganizmy komensalne (np. Streptococcus i Rothia spp.)3,40,41. Co więcej, do tych modeli można dodać dodatkowe patogeny, aby stworzyć biofilmy związane z innymi chorobami. Na przykład, trzy mikroorganizmy można dodać do opisanych tutaj 7 gatunków, aby stworzyć model choroby związany z zapaleniem przyzębia3, podczas gdy patogen grzybiczy Candida albicans można dodać w celu zwiększenia polidrobnoustrojowości, a także dodać warstwę złożoności międzykrólestwa33. Rzeczywiście, promowanie interakcji grzyb-bakteria może mieć ogromne implikacje dla różnych wyników eksperymentów z wykorzystaniem takich modeli biofilmu in vitro w porównaniu z biofilmami zawierającymi wyłącznie bakterie42. Ostatecznie zdecydowanie zaleca się dokładne rozważenie tego procesu podczas tworzenia nowego modelu wielogatunkowego biofilmu do takich badań. Podczas gdy włączone mikroorganizmy powinny być łatwe do zidentyfikowania na podstawie obszernych poszukiwań w literaturze, w przypadku większości nisz i/lub chorób mogą one nie integrować się dobrze ze złożonym modelem in vitro z różnych powodów. Poniżej przedstawiono kilka innych potencjalnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę:

Dynamika tworzenia biofilmu
Tworzenie biofilmu in vivo często wiąże się z wczesną, pośrednią i późną kolonizacją przez określone mikroorganizmy. Tworzenie się naddziąsłowej i poddziąsłowej płytki nazębnej silnie charakteryzuje się początkowym przyczepieniem się błonki ślinowej znajdującej się na szkliwie przez gatunki pionierskie (np. gatunki Streptococcus ), z pośrednimi i późniejszymi patogenami wymagającymi ich jako rusztowania do kolonizacji43. Podobne zjawisko zaproponowano w środowisku pochwy podczas bakteryjnego zapalenia pochwy, przy czym uważa się, że Gardnerella vaginalis jest początkowym kolonizatorem, a następnie następują beztlenowce44. Należy jednak pamiętać, że może to nie dotyczyć innych chorób w innych niszach ekologicznych.

Gęstość wysiewu dla każdego mikroorganizmu
Mikroorganizmy będą miały różne rozmiary i/lub dynamikę wzrostu, gdy będą hodowane in vitro; Dlatego ważne jest, aby wziąć to pod uwagę podczas procesu standaryzacji. Na przykład C. albicans jest 100-150 razy większy od komórek bakteryjnych45,46, dlatego może wymagać dodania w niższym stężeniu, np. 1 x 106 komórek/ml, do takich modeli biofilmu.

Antagonizm gatunkowy
Niektóre mikroorganizmy (w tym te same gatunki, ale różne izolaty, szczepy laboratoryjne i/lub kliniczne) wykorzystane w tych modelach mogą konkurować z innymi podczas tworzenia biofilmu, prowadząc do zahamowania wzrostu niektórych gatunków drobnoustrojów47. Badanie przeprowadzone przez Sadiqa i wsp. podkreśliło, w jaki sposób różne kombinacje mikroorganizmów mogą wpływać na biomasę biofilmu wynikającą z synergii (lub antagonizmu) mikroorganizmów48. Chociaż badanie takich interakcji w modelu biofilmu może być interesujące dla grup badawczych (np. testowanie leczenia prebiotycznego lub probiotycznego), inne mogą nie uwzględniać takiego antagonizmu, co może mieć wpływ na złożoność wielogatunkową podczas tworzenia modelu.

Czas dojrzewania biofilmu
Bardzo ważne jest zoptymalizowanie ram czasowych dojrzewania biofilmu, ponieważ może to zależeć od dynamiki wzrostu zawartych mikroorganizmów i systemu modelowego (w tym substratów) zastosowanego do hodowli. Dłuższy czas dojrzewania może skutkować lepszą kolonizacją późniejszych patogenów, ale większą śmiercią komórek w modelach, szczególnie wcześniejszych kolonizatorów. I odwrotnie, krótszy czas inkubacji może być ważny, jeśli chcesz zbadać wpływ niedojrzałych modeli biofilmu na gospodarza. Badanie przeprowadzone przez Browna i wsp. opisało, w jaki sposób ten sam 10-gatunkowy model biofilmu rany miał różne profile zapalne w ludzkich komórkach THP-1, gdy dojrzewały przez 24 godziny, 48 godzin i 72 godziny, co sugeruje, że im mniej dojrzały biofilm, tym bardziej jest prozapalny7. Podobne wyniki można było zaobserwować w wielowarstwowych modelach tkankowych. Ważne jest również, aby pamiętać, że regularna codzienna zmiana pożywki jest koniecznością, aby zminimalizować śmierć komórek w biofilmie, chociaż można to zmienić w zależności od trwających schematów leczenia, np. w przypadku oceny skutków przedłużonych interwencji przeciwdrobnoustrojowych.

W przypadku sekcji "obchodzenie się z tkankami organotypowymi, konfiguracja eksperymentalna i przetwarzanie tkanek" ramy czasowe inkubacji można dostosować do potrzeb badacza. Interakcje gospodarz-patogen można badać we wcześniejszych punktach czasowych, np. 1-12 godzin, do późniejszych punktów czasowych 48 godzin i 72 godzin, w zależności od pytania badawczego. Po drugie, dostarczane są wszystkie pożywki konserwacyjne zawierające antybiotyki; W związku z tym przy składaniu zamówienia należy zwrócić się do firmy z prośbą o ich usunięcie, w zależności od projektu eksperymentalnego. Chociaż podłoże znajdujące się pod wkładką nie ma bezpośredniego kontaktu z górnym obwodem tkanki, chyba że w modelu 6,8 zostanie zadana rana, usunięcie antybiotyków może zasługiwać na rozważenie w przypadku badania inwazji drobnoustrojów w tkance.

Materiał mikrobiologiczny używany do stymulacji kokultur może być również zmieniany, jak omówiono powyżej, w zakresie oceny planktonu, zużytych supernatantów biofilmu (filtrowanych i niefiltrowanych), całych biofilmów lub inkubacji sonikacji biofilmu z tkanką. Na przykład wcześniejsze dowody wykazały, że modele tkankowe, takie jak te dostarczone przez EpiSkin, dostarczają użytecznych modeli do badania interakcji grzyb-gospodarz planktonowy: wykazano, że komórki C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur i Trichophyton rubrum przyczepiają się i oddziałują z warstwami tkanek obwodowych w HOE, zrekonstruowanym ludzkim naskórku (RHE) lub ludzkim nabłonku pochwy, przy czym niektóre z tych badań wykazują stymulację odpowiedzi gospodarza po zakażeniu grzybiczym 1,5,6,11,12,49. Istnieją podobne publikacje dotyczące interakcji bakteria-gospodarz, np. tworzenie się biofilmu u Cutibacterium acnes, powszechnego patogenu związanego z mikrobiotą skóry głowy w łupieżu, badano na powierzchni RHE, gdy jest hodowany samodzielnie i z organizmem grzybowym skóry, Malassezia restricta10. Inni badali zdolność Staphylococcus spp. do przyłączania się do RHE, mierząc fizykochemiczne i mikrobiologiczne cechy tej interakcji bakteria-gospodarz50. N'Diaye i współautorzy zbadali, w jaki sposób neuropeptyd pochodzenia ludzkiego, peptyd związany z genem kalcytoniny, wpłynął na zjadliwość Staphylococcus aureus w modelu tkankowym RHE51. Inni badali ochronne działanie interwencji probiotycznych na zakażenie Pseudomonas aeruginosa ludzkiego nabłonka rogówki14. Tymczasem, z perspektywy wielomikrobiologicznej, różne grupy badały wpływ biofilmów mieszanych gatunków na różne podłoża tkankowe 2,3,7,13.

Ogólnie rzecz biorąc, te protokoły i badania, o których mowa powyżej, dokumentują szeroki wachlarz zastosowań organotypowych modeli tkanek do badania interakcji gospodarz-patogen. Chociaż badania wykazały, że modele EpiSkin, w szczególności model skóry RHE, mają dobrą przydatność do testowania produktów kosmetycznych pod kątem korozji/podrażnienia 52,53,54,55, istnieją pewne ograniczenia między nimi a rzeczywistymi eksplantatami tkanek ex vivo lub innymi dostawcami dostępnych na rynku tkanek56,57. Jednym z oczywistych ograniczeń byłoby to, że wszystkie dostępne na rynku modele tkanek są generowane z linii komórkowych w sterylnym, "wolnym od zarazków" środowisku, co oznacza, że tkanka nigdy nie była narażona na zaburzenia mikrobiologiczne: może to zaostrzyć każdą reakcję zapalną u gospodarza, znacznie wykraczającą poza to, co można by zaobserwować in vivo lub po stymulacji eksplantatów tkanek ex vivo 57. I odwrotnie, te systemy modeli laboratoryjnych nie będą zawierały leżących pod spodem warstw łącznych ani naczyń krwionośnych, które można by kojarzyć z tkankami in vivo, cech, które można zachować podczas eksplantacji tkanek ex vivo, oraz cech wpływających na reakcje zapalne. Rzeczywiście, niedawny przegląd systematyczny podkreślił, że należy dokładnie rozważyć wykorzystanie modeli tkanek z odpowiednim unaczynieniem, stworzonych przy użyciu różnych technologii inżynieryjnych, w tym biomateriałów58. Na przykład w jednym z ostatnich badań wykorzystano matrycę opartą na fibrynie osadzoną w fibroblastach dziąseł i komórkach śródbłonka mikronaczyniowego w celu stworzenia unaczynionego odpowiednika tkanki dziąsełowej. Autorzy opisali zróżnicowaną odpowiedź zapalną w modelu po ekspozycji na mikroorganizmy związane ze zdrowiem lub chorobą59. Z komercyjnego punktu widzenia istnieją obecnie bardziej złożone modele, takie jak "model T-Skin", który zawiera tkankę o pełnej grubości składającą się ze skóry właściwej składającej się z fibroblastów pokrytych naskórkiem. Ciekawie byłoby zobaczyć, jak takie złożone modele wypadają w porównaniu z systemami opartymi wyłącznie na naskórku.

Chociaż żaden model nie jest doskonały, organotypowe modele tkanek stanowią obiecującą alternatywę dla badań przedklinicznych, dostosowując się do ram nakreślonych przez trzy R, dotyczące wymiany, redukcji i udoskonalenia w podejmowaniu badań na zwierzętach. W tym celu, chociaż modele zwierzęce dostarczają ważnych informacji na temat złożonej patofizjologicznej natury chorób człowieka związanych z biofilmem, mają one oczywiste wady. Te modele 3D są łatwe do manipulowania, co pozwala na duże, subtelne zmiany w dochodzeniach bez zgody etyki. Połączenie tych modeli z istniejącymi złożonymi systemami biofilmu opisanymi powyżej może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat interakcji gospodarz-patogen i lepiej przewidywać powodzenie nowych terapii przed badaniami in vivo .

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Haleon za wsparcie finansowe dla Saeeda Alqahtaniego w prowadzeniu powiązanych projektów związanych z opisanymi modelami tkanek, a także Ministerstwu Edukacji Arabii Saudyjskiej za sfinansowanie doktoratu Muhanny Alshehri.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Krążki hydroksyapatytu (HA) 13 mmPlasma Biotal Limitedn/a (na zamówienie)Podłoże do tworzenia biofilmu w jamie ustnej, naśladujące powierzchnię zęba
Igła 19 G (40 mm) VWR613-2028Służy do pomocy w usuwaniu krążków kwasu hialuronowego z płytek i wycinaniu tkanki z wkładek
24-dołkowe płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem poddane obróbce TC z pokrywkami Materiały do laboratoriów naukowych3524 (opakowanie 100 szt.)Płytki do hodowli biofilmów i eksperymentów z kokulturą tkankową
Koraliki szklane płukane kwasem (425-600 μ m)Merck: Sigma-AldrichG8772Do lizy tkanek w celu poprawy wydajności ekstrakcji RNA   
Actinomyces naeslundii DSM 17233 Instytut Leibniza DSMZn/aJeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu
Homogenizator Bead Mill 24 (lub równoważny) Fisher Scientific15-340-163Do lizy tkanek w celu poprawy wydajności ekstrakcji RNA   
Bijouxes  (7 ml)Greiner Bio-One189170 (700 w opakowaniu)Służy do sonikacji biofilmu   
Zestaw do syntezy cDNA (o dużej pojemności)Thermo Fisher Scientific4368814 (na 200 reakcji)synteza cDNA z tkanki RNA
na bazie agaru Columbia Blood Agar (CBA) Thermo Fisher ScientificCM0331B (na 500 gramów)Służy do przygotowania płytek CBA do hodowli mikroorganizmów tlenowych
Defibrynowana krew końskaE& O LaboratoriesDHBSłuży do uzupełniania płytek CBA i FAA do hodowli mikroorganizmów tlenowych i beztlenowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (dPBS: bez CaCl2 i MgCl2)Merck: Sigma-AldrichDB537dPBS do kohodowli komórek z sonikatem biofilmu
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953Kolekcja kultur typu amerykańskiegon/aJeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn/aJeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w złożonym modelu biofilmu
GraphPad Prism (Version 10)GraphPad Software, Incn/aDo tworzenia wykresów i analizy danych 
Zestaw ELISA Human IL-8 (niepowlekany zestaw ELISA z płytkami)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (do testów 10 x 96)Zestaw ELISA i płytki do oceny białek w zużytych pożywkach tkankowych
Nabłonek jamy ustnej człowieka (HOE) Episkinn/a (na zamówienie)Tkanka nabłonkowa wykorzystana w systemie modelu kohodowli
Pętle inokulacyjne (jednorazowe, 10 i mikro; L lub odpowiednik) Fisher Scientific12870155 (opakowanie 1000 szt.)Do hodowli mikrobiologicznej w podłożach stałych i płynnych
MicroAmp Fast Reaction 96-dołkowe płytki qPCR (0,1 ml) Thermo Fisher Scientific4346907 (na 10 płytek)Do profilowania ekspresji genów qPCR w tkankach
Kulki mikrobankowePro-Lab DiagnosticsPL.170Przechowywanie i cyrokonserwacja mikroorganizmów 
Woda wolna od nukleazThermo Fisher ScientificAM9935 (10 x 1,5 mL)Woda klasy RT-PCR do eksperymentów qPCR 
Szalki Petriego (90 mm)Fisher Scientific (Sterilin) 11309283 (opakowanie 500 szt.)Służy do przygotowania płytek agarowych do hodowli drobnoustrojów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific 18912014 (opakowanie 100 tabletek)PBS do standaryzacji mikroorganizmów i etapów płukania biofilmu
Mini zestaw RneasyQiagen74106 (na 250 reakcji)Kolumnowy zestaw do ekstrakcji RNA do tkanek 
Roswell Park Memorial Institute 1640 średniMerck: Sigma-AldrichR7755-10L (na 10 L) Pożywki do hodowli biofilmu 
Matryca profilująca RT2Qiagen330171 (na zamówienie)Tablica qPCR zawierająca gotowe startery do profilowania ekspresji genów
Baza agaru beztlenowego SchaedlerMerck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (na 500 g)Służy do przygotowania płytek agarowych Fastdious Anerob Agar 
Rosół beztlenowy SchaedlerThermo Fisher Scientific CM0497B (na 500 g)Płynne podłoża do rozwoju mikroorganizmów beztlenowych
Nakrętka Beadbug O-Ring tube Materiały do laboratoriów naukowychZ763837-1000EA (opakowanie 1000 szt)Do stosowania w homogenizatorze Bead Mill 24, do lizy tkanek
Kąpiel sonikacyjnaFisher Scientific (Fisherbrand)n/aDo sonikacji biofilmów z krążków HA 
Streptococcus intermedius DSM 20753 Instytut Leibniza DSMZn/aJeden z mikroorganizmów użytych w złożonym modelu biofilmu
Streptococcus mitis NCTC 12261Krajowa kolekcja kultur typun/aJeden z mikroorganizmów użytych w złożonym modelu biofilmu
Streptococcus oralis NTCC 11427 Krajowa Kolekcja Kultur Typun/aJeden z mikroorganizmów wykorzystywanych w modelu złożonego biofilmu
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12SYBR-green mix do qPCR 
Rosół Todda HewittaMerck: Sigma-AldrichT1438 Pożywki do hodowli biofilmu 
Bulion sojowy z tryptonem (TSB) średniMerck: Sigma-Aldrich22092 (na 500 g)Płynne podłoże do wzrostu mikroorganizmów tlenowych
Pęseta (150 mm, stal nierdzewna, ząbkowana)RS-Pro 545-187Służy do przemieszczania krążków HA i wkładek tkankowych/ekstraktów tkankowych
Rurki uniwersalne  (30 ml)Greiner Bio-One201150 (400 za worek)Naczynia do hodowli mikroorganizmów w płynnych kulturach 
Veillonella dispar NCTC 11831Krajowa kolekcja kultur typun/a'Jedenz mikroorganizmów wykorzystywanych do złożonego modelu biofilmu
i beta;-metakaptoetanoluDezaktywacja RNazySigma-AldrichM3148
, Merck: w próbkach tkanek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organotypowe modele tkankowemodele nab onkowekokultura biofilmuzaka enie in vitroadhezja drobnoustroj wanaliza ekspresji gen wprofilowanie proteomicznemultiplex qPCRbiomarkery stanu zapalnego

Powiązane artykuły