Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie biblioteki ATAC-Seq mysich neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67490

⸱

3 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania biblioteki ATAC-seq neutrofili z mysiego szpiku kostnego, mający na celu zagwarantowanie optymalnej żywotności neutrofili i wysokiej jakości biblioteki. Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania BMC, sortowania immunomagnetycznego i budowy biblioteki, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w badaniu neutrofili.

Streszczenie

Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq) jest potężną, wysokoprzepustową techniką oceny dostępności chromatyny i zrozumienia regulacji epigenomicznej. Neutrofile, jako kluczowy typ leukocytów w odpowiedzi immunologicznej, podczas różnicowania i aktywacji ulegają znacznym zmianom w architekturze chromatyny, które znacząco wpływają na ekspresję genów niezbędną do ich funkcji. Projekt ATAC-seq odegrał zasadniczą rolę w odkryciu kluczowych czynników transkrypcyjnych w dojrzewaniu neutrofili, ujawnieniu specyficznych dla patogenów sygnatur epigenomicznych oraz identyfikacji celów terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych. Jednak wrażliwość neutrofili na środowisko zewnętrzne komplikuje tworzenie wysokiej jakości danych sekwencyjnych ATAC. W tym miejscu proponujemy skalowalny protokół przygotowania bibliotek ATAC-seq z neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego gryzoni, charakteryzujący się ulepszoną separacją immunomagnetyczną w celu zapewnienia optymalnej żywotności komórek i wysokiej jakości bibliotek. Szczegółowo omówiono istotne elementy wpływające na jakość biblioteki oraz zasady optymalizacji jej rozbudowy metodologicznej. Protokół ten będzie wspierał naukowców, którzy chcą badać architekturę chromatyny i epigenomiczne przeprogramowanie neutrofili, posuwając naprzód badania w zakresie immunologii podstawowej i klinicznej.

Wprowadzenie

Neutrofile są jednym z najliczniejszych i najbardziej kluczowych typów komórek odpornościowych u kręgowców, stanowiąc 50%-70% ludzkich leukocytów1. Neutrofile odgrywają kluczową rolę w wykrywaniu i eliminowaniu mikroorganizmów w gospodarzach. Podczas sepsy dojrzałe neutrofile należą do osób udzielających pierwszej pomocy2. Szybko mobilizują się do miejsc infekcji za pośrednictwem chemotaksji3, gdzie zwalczają patogeny poprzez spożywanie mikroorganizmów (fagocytoza), wytwarzanie reaktywnych form tlenu zależnych od oksydazy NADPH (wybuchy oddechowe), wydzielanie granulek (degranulacja) i tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET), które wyłapują i zabijają bakterie zewnątrzkomórkowe po dotarciu do miejsca zapalenia4. Niedojrzałe neutrofile są również szybko mobilizowane ze szpiku kostnego do krążenia obwodowego przez chemokiny5,6. Te neutrofile przyciągane do miejsca zakażenia uwalniają również cytokiny, które biorą udział w kilku procesach fizjologicznych, takich jak hematopoeza, angiogeneza i gojenie się ran7,8. Pacjenci cierpiący na choroby wrodzone lub nabyte, które skutkują zmniejszeniem liczby granulocytów obojętnochłonnych, są bardziej podatni na infekcje9,10. Jednak aktywacja neutrofili jest mieczem obosiecznym. Nadmierna aktywacja i uwalnianie cytokin może powodować uszkodzenia tkanek i narządów, prowadząc do dysfunkcji wielu narządów, jeśli infekcje nie są natychmiast kontrolowane11,12. Ponadto neutrofile przyczyniają się również do różnych chorób zapalnych i autoimmunologicznych oraz mogą wpływać na progresję raka i przerzuty13,14. Podkreśla to potrzebę zbadania regulacji aktywności neutrofili w celu zrównoważenia skutecznej odpowiedzi immunologicznej i zapobiegania uszkodzeniom gospodarza.

U neutrofili architektura chromatyny ulega wyraźnym i dynamicznym zmianom w ich różnicowaniu, migracji i aktywacji, odgrywając kluczowe role regulacyjne przez cały okres życia komórki. Ta podróż, od dużego, okrągłego, bogatego w euchromatynę jądra mieloblastów do bardziej wciętego jądra w mielocytach i metamielocytach, a następnie do komórek w paśmie C lub S i silnie zrazikowanych z gęsto upakowaną chromatyną w neutrofilach wielojądrzastych15,16, jest świadectwem złożoności biologii neutrofili. Wyspecjalizowana konfiguracja chromatyny zapewnia selektywną ekspresję genów niezbędnych do funkcjonowania neutrofili, takich jak te zaangażowane w produkcję granulek i szybkie odpowiedzi transkrypcyjne niezbędne do skutecznej eliminacji patogenów17. Kiedy neutrofile są mobilizowane do miejsc zapalnych poprzez chemotaksję, migracja przezśródbłonkowa wywiera nacisk na kompleks łącznika nukleoszkieletu/cytoszkieletu (LINC), powodując przebudowę chromatyny i większy potencjał aktywacji18. W sepsie aktywowane neutrofile wykazują "przesunięcie jądra w lewo", z nieprawidłową morfologią chromatyny, taką jak dwupłatowe lub niepłatowane jądra i znacznie luźniejszą kondensacją chromatyny19. Powoduje to zwiększoną dostępność w regionach genów związanych z odpowiedzią zapalną, indukując w ten sposób znaczącą ekspresję tych genów. Jeśli infekcje nie są odpowiednio kontrolowane, cytrulinacja histonów i późniejsza dekonstrukcja chromatyny są konieczne do utworzenia NETs20,21. Dlatego zrozumienie architektury chromatyny neutrofili ma kluczowe znaczenie dla postępu w biologii neutrofili i opracowywaniu metod leczenia chorób zapalnych i autoimmunologicznych, dając nadzieję na przyszłe leczenie chorób.

Dostępność chromatyny służy jako miernik architektury chromatyny na poziomie epigenomicznym. Wskazuje, w jaki sposób regiony genomu są fizycznie dopuszczalne dla wzmacniaczy, promotorów, izolatorów i czynników wiążących chromatynę oraz jak te elementy wpływają na ekspresję genów22. Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq) jest szeroko stosowaną techniką oceny dostępności chromatyny w całym genomie23. Nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat elementów regulacyjnych, co czyni go potężnym narzędziem do badań epigenetycznych. Metoda ta polega na izolowaniu jąder próbek, fragmentacji genomowego DNA przez transpozazę Tn5 i dodaniu starterów sekwencjonowania w celu przygotowania biblioteki, sekwencjonowania i analizy danych23. ATAC-seq odegrał zasadniczą rolę w badaniu mapowania nukleosomów, analizy wiązania czynnika transkrypcyjnego, mechanizmów regulacyjnych w różnych typach komórek lub chorobach, identyfikacji nowych wzmacniaczy, odkrywaniu biomarkerów itp22,23. Często łączy się go z innymi technikami, takimi jak sekwencjonowanie RNA, w celu kompleksowej analizy ekspresji genów.

ATAC-seq poszerzyło naszą wiedzę na temat biologii neutrofili, odkrywając precyzyjne mechanizmy epigenetyczne w zdrowiu i chorobie. Ujawnił kilka kluczowych czynników transkrypcyjnych (tj. RUNX1, KLF6, PU.1, itp.) w dojrzewaniu neutrofili i odpowiedziach efektorowych24,25, odkrył specyficzne dla patogenu sygnatury z potencjałem biomarkera w sepsis26, wyjaśnił mechanizmy epigenomiczne wrodzonej pamięci immunologicznej12 i zidentyfikował cele terapeutyczne w pediatrycznej ostrej białaczce szpikowej (AML)27. Jednak jako ważny składnik komórkowy w nadzorze immunologicznym, neutrofile wykazują wysoką wrażliwość na środowisko zewnętrzne, a tym samym stanowią wyzwanie w tworzeniu wysokiej jakości danych sekwencyjnych ATAC. W warunkach fizjologicznych mediana okresu półtrwania ludzkich neutrofili wynosi 3,8 dnia, podczas gdy średni okres półtrwania neutrofili myszy wynosi 12,5 godziny. Warto zauważyć, że ich okres półtrwania jest znacznie krótszy, gdy bada się go in vitro28,29. Podczas operacji in vitro izolowanych neutrofili narażenie na mikroorganizmy lub wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), a także zbędne procedury eksperymentalne i ostre operacje, mogą skutkować nieprawidłową aktywacją neutrofili i zmniejszoną żywotnością komórek z powodu apoptozy lub NETozy. W martwych komórkach często znajdują się znaczne ilości niechromatynizowanego DNA wysoce podatnego na Tn5, co w konsekwencji podnosi poziom szumu tła ATAC-seq23.

Tutaj proponujemy skalowalny protokół do przygotowania bibliotek ATAC-seq zoptymalizowanych pod kątem neutrofili pochodzących z próbek szpiku kostnego gryzoni. Rysunek 1 przedstawia graficzny przegląd protokołu, który obejmuje immunomagnetyczne oddzielanie neutrofili od szpiku kostnego, a następnie sekwencję ATAC. Ulepszone sortowanie immunomagnetyczne gwarantuje optymalną żywotność neutrofili przed ekstrakcją jądra do biblioteki ATAC-seq, zapewniając w ten sposób wysoką jakość bibliotek i ułatwiając włączenie dodatkowych ocen neutrofili do schematu. Wdrożenie tego protokołu pomoże naukowcom w zrozumieniu cech architektury chromatyny i epigenomicznych mechanizmów przeprogramowania neutrofili pod wpływem różnych wyzwań mikrośrodowiskowych. Oczekuje się, że będzie to miało szerokie zastosowanie w podstawowych i klinicznych badaniach immunologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach przedstawione poniżej były zgodne z krajowymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi etyki i dobrostanu zwierząt, które zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań nad Opieką nad Zwierzętami Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie, Chiny (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Przygotowanie zawiesin komórek szpiku kostnego (BMC)

  1. Wybierz samce myszy C57BL/6J w wieku 6-8 tygodni o wadze 19-21 g. Myszy należy poddać eutanazji za pomocą komory CO2, a następnie zwichnąć szyjkę macicy po zniknięciu głębokiego odruchu. Zdezynfekuj je sprayem 70% etanolu na macie preparcyjnej.
  2. Za pomocą małych nożyczek i kleszczy ostrożnie oddzielić kość udową od stawu biodrowego i piszczelowej, usunąć przyczepioną skórę i mięśnie szkieletowe, a następnie przepłukać kość udową zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) na 10-centymetrowej szalce Petriego.
  3. Odetnij nasady kości udowej, delikatnie włóż igłę 28 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 2 ml do jamy szpiku i wypłucz szpik kostny zimnym PBS zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  4. Powtarzaj poprzedni krok, aż spłukiwany ciemnoczerwony płyn stanie się przezroczysty. Zwykle wymagane są trzy płukania.
    UWAGA: Unikaj zbyt głębokiego wkładania igły do jamy szpiku kostnego, aby zapewnić optymalne pobieranie komórek.
  5. Użyj sitka komórkowego o wielkości 70 μm, aby przefiltrować zawiesinę komórek do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (5 ml).
  6. Lizować erytrocyty w BMC za pomocą komercyjnego buforu do lizy erytrocytów bez poliformaldehydu.
    1. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C, ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając na dnie około 100 μl płynu, a następnie delikatnie postukać w probówkę, aby poluzować osad.
    2. Dodać 2 ml buforu do lizy, rozcieńczonego z buforu do lizy erytrocytów (10x) i wymieszać, trzykrotnie obracając probówkę do góry nogami. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 500 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne stukanie.
    3. Umyj komórki dwukrotnie pożywką RPMI 1640 zawierającą 10% FBS i ponownie je zawieś w objętości 2 ml.
      UWAGA: W przypadku nierozproszonych grudek komórek zaleca się użycie końcówki do pipety o pojemności 200 μl w celu ich wybrania zamiast filtrowania zawiesin komórek przez sitko o pojemności 70 μm. Ta metoda może zmniejszyć utratę komórek.
  7. Obliczyć żywotność komórkową i całkowitą liczbę żywych komórek w próbce za pomocą barwienia błękitem trypanowym.

2. Immunomagnetyczne znakowanie neutrofili za pomocą kulek magnetycznych anty-Ly6G

  1. Zawiesić komórki szpiku kostnego (~2 x 10,7 żywych komórek na mysz) w 2 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę ograniczone zapotrzebowanie na 1 x 105 komórek do sekwencji ATAC, nadwyżkę neutrofili można przeznaczyć do dodatkowych analiz epigenomicznych (np. ChIP-seq i Hi-C) lub oceny funkcji immunologicznych (np. produkcji cytokin, fagocytozy i NET) przy użyciu neutrofili uzyskanych od tej samej myszy.
  2. Odessać większość supernatantu, pozostawiając około 100 μl, i delikatnie postukać w probówkę, aby poluzować osad.
  3. Dodaj 30 μl kulek Ly6G i wymieszaj z BMC, delikatnie stukając.
    UWAGA: Koraliki magnetyczne należy wirować przez co najmniej 10 sekund przed użyciem. Po dodaniu kulek do BMC zaleca się powstrzymanie się od wirowania.
  4. Inkubować probówkę w temperaturze 25 °C przez 15 minut.
  5. Dodać 2 ml PBS w celu ponownego zawieszenia kulek i komórek, a następnie odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
  6. Odessać większość supernatantu, pozostawiając około 100 μl, i delikatnie postukać w probówkę, aby poluzować osad. Dodaj dodatkowy PBS, aby uzyskać końcową objętość 1 ml.
    UWAGA: W przypadku nierozproszonych grudek komórek zaleca się użycie końcówki do pipety o pojemności 200 μl w celu ich wybrania zamiast filtrowania zawiesin komórek przez sitko o pojemności 70 μm. Ta metoda może zmniejszyć utratę komórek.

3. Separacja neutrofili z immunomagnetycznym sortowaniem komórek

  1. Wstępnie potraktować kolumnę MS PBS.
    1. Umieść kolumnę MS w polu magnetycznym kompatybilnego separatora do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Umieść wolną probówkę o pojemności 5 ml pod płynem wypływającym z kolumny MS.
    2. Przepłukać kolumnę 500 μl PBS. Powtórz ten krok po całkowitym przepływie PBS do kolumny MS.
      UWAGA: PBS powinien mieć możliwość stopniowego przepływu, kropla po kropli, do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) o pojemności 5 ml przez kolumnę MS. Upewnij się, że do kolumny nie dostaje się powietrze, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zasłaniać kolumnę.
  2. Nałóż magnetycznie oznakowaną zawiesinę BMC na kolumnę MS, dodając jednorazowo 500 μl, natychmiast napełniając, gdy zbiornik kolumny jest pusty.
    UWAGA: Upewnij się, że zawiesiny komórek są pozbawione masy komórkowej. W razie potrzeby umieść nową probówkę FACS o pojemności 5 ml pod kolumną MS, aby zebrać nieznakowane komórki (np. monocyty i limfocyty) przed tym etapem.
    UWAGA: Zwróć uwagę na natężenie przepływu kropel. Powolne natężenie przepływu może sugerować, że kolumna sortująca jest zatkana.
  3. Przemyć kolumnę MS, dodając 500 μl PBS za każdym razem, gdy zbiornik jest pusty, powtarzając ten proces dwukrotnie.
    UWAGA: Przedwczesne dodanie PBS może utrudnić wejście niektórych komórek do kolumny sortującej, potencjalnie zagrażając czystości sortowania komórek.
  4. Zbierz magnetycznie znakowane neutrofile.
    1. Po wyczerpaniu zbiornika kolumny usuń kolumnę z pola magnetycznego i ostrożnie umieść ją na probówce o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Przed usunięciem kolumny należy upewnić się, że nie ma w niej resztek cieczy, aby zapobiec utracie neutrofili w wyniku wyładowania kropelkowego podczas procesu. Pozostałości w kolumnie można usunąć za pomocą pipety.
    2. Dozować 2 ml PBS na kolumnę, a następnie natychmiast i stanowczo wcisnąć tłok do kolumny, aby usunąć magnetycznie znakowane neutrofile.
      UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość neutrofili, należy zapewnić odpowiednią objętość elucji i zachować krótki czas podczas wciskania tłoka do kolumny.
  5. Użyj hemocytometru, aby wyliczyć izolowane komórki. Określić czystość wyizolowanych neutrofili, pobierając 100 μl zawiesiny komórek po sortowaniu i analizując ją za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Ekstrakcja jądra

  1. Odwirować 50 000 zawiesin jednokomórkowych zawierających neutrofile w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w probówce o pojemności 0,2 ml, a następnie odrzucić supernatant.
  2. Zawiesić neutrofile w 50 μl wstępnie schłodzonego buforu do lizy (patrz Tabela 1), delikatnie wymieszać roztwór za pomocą pipety i inkubować na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 5 μl, dopuszczalne jest bezpośrednie dodanie buforu do lizy. Stężenie zawiesiny komórek nie przekracza 1 x 107 komórek/ml.
  3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, następnie odrzucić supernatant i zebrać jądro. Umieść rurkę na lodzie przed rozpoczęciem kolejnych procedur.
    UWAGA: Aby zminimalizować straty próbki, należy oznaczyć stronę ścianki probówki, w której gromadzą się granulki i delikatnie zasysać ciecz z przeciwnej strony podczas usuwania supernatantu.

5. Znakowanie na uwięzi nukleosomów za pomocą transpozazy

  1. Przygotować mieszaninę reakcji znakowania zawierającą transpozazę Tn5 w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie z wytycznymi zestawu do przygotowania biblioteki DNA (patrz Tabela 2) i wstępnie podgrzać schłodzone kulki do oczyszczania amplikonu w temperaturze 25 °C przez co najmniej 30 minut.
  2. Zawiesić jądro neutrofili za pomocą 50 μl mieszanki reakcyjnej znakowania i delikatnie wymieszać pipetą, a następnie wirować przez 5 sekund za pomocą wirówki ręcznej (~2600 x g).
  3. Inkubować probówkę reakcyjną w przyrządzie do PCR w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  4. Dodać 100 μl wstępnie wirowanych kulek oczyszczających amplikon do lizatu, a następnie dokładnie wymieszać kulki magnetyczne w roztworze, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    UWAGA: Kulki magnetyczne są lepkie i można je łatwo przymocować do końcówek pipet, dlatego należy upewnić się, że zasysają odpowiednią objętość i powoli dozują je z końcówek podczas przenoszenia kulek.
  5. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 °C przez 5 minut, a następnie odwirowywać przez 5 s za pomocą wirówki ręcznej (~2600 × g).
  6. Oczyść przerwany fragment DNA, umieszczając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny (około 5 min). Następnie ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.
  7. Za każdym razem umyj kulkę magnetyczną 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu, trzymając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym przez 30 sekund. Unikaj naruszania kulek podczas dodawania etanolu. Powtórz procedurę opisaną w kroku 5.7.
  8. Odwirować probówkę reakcyjną za pomocą wirówki ręcznej (około 2600 × g), zassać etanol za pomocą końcówek do pipet o pojemności 10 μl, a następnie wysuszyć kulki magnetyczne przez 3-5 minut, otwierając pokrywę.
    UWAGA: Czas schnięcia kulek magnetycznych może się różnić w zależności od regionu ze względu na różnice w poziomie wilgotności. Koraliki należy suszyć tylko do momentu, aż stracą połysk. Nadmierne suszenie może skomplikować proces elucji, natomiast nieodpowiednie suszenie może skutkować obecnością pozostałości alkoholu, co wpływa na późniejsze eksperymenty. Ponadto ustawienie stojaka magnetycznego w pozycji poziomej bardziej sprzyja równomiernemu suszeniu kulek magnetycznych.
  9. Po wyjęciu probówki reakcyjnej ze stojaka magnetycznego dodać 26 μl ddH2O, aby przykryć kulki magnetyczne, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Następnie inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 min.
    UWAGA: Odpowiednio wydłuż czas inkubacji, jeśli kulki magnetyczne są przesuszone.
  10. Krótko odwirować probówkę reakcyjną za pomocą wirówki ręcznej (około 2600 × g) i oddzielić kulki magnetyczne za pomocą stojaka magnetycznego, aż roztwór stanie się klarowny (około 5 min).
  11. Ostrożnie przenieść 24 μl supernatantu do nowej probówki do PCR.

6. Budowa biblioteki dla sekwencjonowania nowej generacji (NGS)

  1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w wysterylizowanej probówce, wykorzystując oczyszczone fragmenty DNA i startery zawierające adaptery do sekwencjonowania (patrz Tabela 3).
  2. Reakcję PCR należy przeprowadzić zgodnie z zalecanymi procedurami (patrz Tabela 4), zwykle wymagającą około 1 godz.
    UWAGA: Po tej procedurze eksperyment może zostać tymczasowo wstrzymany, a produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub co najmniej 2 tygodnie.
  3. Dodać 27,5 μl wstępnie wirowanych kulek oczyszczających amplikon do 50 μl produktów PCR, a następnie dokładnie wymieszać kulki magnetyczne w roztworze, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    UWAGA: Nieprawidłowy stosunek kulek magnetycznych do produktów PCR może skutkować rozbieżnościami w długościach sortowanych fragmentów. Użyj ddH2O, aby napełnić odparowaną objętość produktu PCR do 50 μl. Upewnij się, że zasysasz odpowiednią objętość kulek magnetycznych i powoli dozuj je z końcówek pipet, aby zminimalizować ilość kulek, które mogą być przyczepione.
  4. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 °C przez 5 minut, a następnie odwirowywać ją przez 5 sekund za pomocą wirówki ręcznej (około 2600 x g).
  5. Oczyść DNA biblioteki, umieszczając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny (około 5 minut). Następnie ostrożnie przenieś supernatant do nowej wysterylizowanej probówki do PCR i wyrzuć kulki magnetyczne.
  6. Dodać 50 μl wstępnie wirowanych amplikonów oczyszczających do supernatantu, a następnie dokładnie wymieszać kulki magnetyczne w roztworze, pipetując w górę i w dół 10 razy.
  7. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 °C przez 5 minut, a następnie odwirowywać ją przez 5 sekund za pomocą wirówki ręcznej (około 2600 x g).
  8. Umieść probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny (około 5 minut), a następnie ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając kulek magnetycznych.
  9. Umyj kulkę magnetyczną dwukrotnie 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu za każdym razem, trzymając probówkę reakcyjną na stojaku magnetycznym przez 30 sekund. Unikaj naruszania kulek podczas dodawania etanolu.
  10. Suszyć koraliki magnetyczne przez 5 minut, otwierając pokrywę.
  11. Po wyjęciu probówki reakcyjnej ze stojaka magnetycznego dodaj 22 μl ddH2O, aby przykryć kulki magnetyczne, pipetując w górę iw dół przez 10 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Następnie inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
  12. Krótko odwirować probówkę reakcyjną za pomocą wirówki ręcznej (około 2600 × g) i oddzielić kulki magnetyczne za pomocą stojaka magnetycznego, aż roztwór stanie się klarowny (około 5 min).
  13. Ostrożnie przenieść 20 μl supernatantu do nowej wysterylizowanej probówki do PCR i przechowywać ją w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Aby uzyskać bibliotekę o bardziej skoncentrowanym rozkładzie długości, rozważ użycie zestawu do odzyskiwania żelu do sortowania amplifikowanego produktu. Alternatywnie, jeśli nie ma szczególnych wymagań dotyczących zakresu rozkładu długości, wzmocniony produkt można bezpośrednio oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania kulek magnetycznych lub kolumn bez sortowania długości.

7. Kontrola jakości biblioteki i sekwencjonowanie

  1. Wykorzystaj platformy analizatora fragmentów DNA, aby ocenić rozkład długości DNA biblioteki.
  2. Wykorzystaj platformy NGS do przeprowadzenia sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w bibliotekach, które przeszły kontrolę jakości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany protokół został zastosowany do izolacji neutrofilów z szpiku kostnego myszy C57BL/6 oraz porównania różnic w dostępności chromatyny przed i po stymulacji lipopolisarydem (LPS) za pomocą ATAC-seq. Z obu kości udowych myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni można zazwyczaj pobrać 2 x 107 komórek szpiku kostnego (BMC), z których następnie można wyizolować 2-5 x 106 neutrofilów. Z tej liczby 1 x 105 komórek wykorzystuje się do ATAC-seq, natomiast pozostałe komórki można przeznaczyć do kompl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy manuskrypt przedstawia eksperymentalny protokół przygotowania bibliotek ATAC-seq zoptymalizowanych pod kątem neutrofili pochodzących z próbek szpiku kostnego gryzoni. Ze względu na to, że neutrofile są bardzo podatnymi i łatwo aktywowanymi komórkami odpornościowymi, wysiłki optymalizacyjne priorytetowo potraktowały utrzymanie żywotności izolowanych neutrofili. Niewłaściwe leczenie może prowadzić do NETozy i innych form śmierci komórki, powodując uwalnianie znacznych ilości niechromatynowego DNA, a tym samym prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Programu Badawczo-Rozwojowego Miejskiej Komisji Edukacji w Pekinie (KZ202010025041) oraz Chińskich Instytutów Badań Medycznych w Pekinie (Grant No. CX24PY29).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% TrypanBlueScientific T10282
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBiosharpBL302A
20 bp– Marker wyrównania 5000 pzBioptycznyanalizator fragmentów DNAC109102-100A
Marker o rozmiarze 5k (standardowa drabina 50 pz)BiopticC109101-100AAnalizator fragmentów DNA
Produkty pomocnicze Amplicons Amplicons PurificationBeckmanA63881Amplicons Purification Beads to zestaw do oczyszczania kwasów nukleinowych do uzyskiwania wysokiej jakości produktów DNA.
Mikrogranulki anty-Ly6G Ultrapure, myszmiltenyi130-120-337Mikrogranulki anty-Ly-6G UltraPure, mysz zostały opracowane do pozytywnej selekcji lub zubożenia mysich neutrofili z jednokomórkowych zawiesin szpiku kostnego myszy.
Anty-mysz CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Anty-mysz CD48-PE-CY7 (1:400)BDCat#560731
Anty-mysz Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
Myszy C57BL/6J, typ dziki, 8-tygodniowy, samiecInstytut Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych, Chińska Akademia Nauk MedycznychInstytut Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych, Chińska Akademia Medyczna Sciences
DNA Separation BufferBiopticC104406Analizator fragmentów DNA Produkty wspierające
ultraczysty LPS pochodzący z E. coli (serotyp0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
Odczynnik ilościowy DNAvazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt to prosty, czuły i dokładny zestaw do ilościowego oznaczania fluorescencji dwuniciowego DNA (dsDNA).
Bufor do lizy erytrocytów (10x)BioLegendCat#420301
Płodowa surowica bydlęcaGibcoCat#10099141C
MS Kolumny separacyjnemiltenyi130-042-201MS Kolumny są przeznaczone do pozytywnej selekcji komórek. 
RPMI 1640 mediumGibcoC11875500BT
S2 Żelowa igła do elektroforezy BioptycznyC105101analizator fragmentów DNA Produkty wspomagające
Narzędzia chirurgiczne: skalpel, nożyczki preparacyjne, nożyczki do mikrodysekcji, kleszcze cienkie, kleszcze anatomiczne, uchwyt na igłęFisher Scientifichttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsMożna kupić od innych kwalifikowanych dostawców
Strzykawka (1  mL)Fisher Naukowy https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Można kupić od innych kwalifikowanych dostawców
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA TruePrepTM V2 dla IlluminavazymeTD501-01Zestaw do przygotowania biblioteki TruePrep DNA V2 dla Illumina to specjalnie zaprojektowany zestaw opracowany specjalnie dla platformy sekwencjonowania o wysokiej przepustowości firmy Illumina. Korzystając z zestawu, DNA można przygotować w bibliotekach sekwencjonowania dedykowanych wysokoprzepustowej platformie sekwencjonowania firmy Illumina.
TruePrepTM Index Kit V2 dla IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 dla Illumina to zestaw do TruePrep DNA Library Prep Prep Kit V2 dla Illumina. Można go użyć do przygotowania 96 różnych bibliotek indeksów dwustronnych.
produkty pomocnicze Beads

Bibliografia

  1. Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
  2. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  3. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  4. Herrera-Uribe, J., et al. Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils. Front Genet. 14, 1107462(2023).
  5. Kipnis, E. Neutrophils in sepsis: Battle of the bands. Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).
  6. Kong, Y., et al. Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis. Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).
  7. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound. Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).
  8. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  9. Newburger, P. E. Autoimmune and other acquired neutropenias. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).
  10. Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers. 3, 17032(2017).
  11. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  12. Wang, B., et al. Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils. Cell Rep. 42 (9), 113044(2023).
  13. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).
  14. Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).
  15. Hong, C. W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).
  16. Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function. J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).
  17. Tamassia, N., et al. Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils. J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).
  18. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  19. Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms. QJM. 110 (6), 393-394 (2017).
  20. Walling, B. L., Murphy, P. M. Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins. Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).
  21. Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization. Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).
  22. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).
  23. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  24. Khoyratty, T. E., et al. Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation. Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).
  25. Fischer, J., et al. Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils. Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).
  26. Ram-Mohan, N., et al. Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection. Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976(2021).
  27. Wei, L., et al. Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML. Blood. 136 (1), 29(2020).
  28. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  29. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  30. Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv. Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostępność chromatynyneutrofile szpiku kostnegoseparacja immunomagnetycznaizolacja neutrofilitranspozaza Tn5regulacja epigenomicznapozycjonowanie nukleosomówoczyszczanie PCRreprogramowanie chromatyny
Przygotowanie biblioteki ATAC-Seq mysich neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.