Artykuł metodologiczny

Optymalizacja reakcji transkrypcji in vitro do produkcji mRNA z wykorzystaniem chromatograficznego monitorowania at-line

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67503

⸱

4 kwietnia 2025

 ,  ,  , 
1Sartorius BIA Separations d.o.o., a Sartorius company, 2Biotechnical Faculty, University of Ljubljana

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Optymalizacja transkrypcji in vitro (IVT) jest kluczowa dla opłacalnej produkcji mRNA. Protokół ten szczegółowo opisuje analityczną metodę chromatograficzną do analizy at-line reakcji IVT, monitorowania zubożenia NTP i produkcji mRNA w trybie wsadowym lub wsadowym, mającą zastosowanie do różnych modalności RNA, zwiększającą wydajność i obniżającą koszty.

Streszczenie

Reakcja transkrypcyjna in vitro (IVT) to złożona, wieloskładnikowa enzymatyczna synteza mRNA z liniowego matrycy DNA, katalizowana przez polimerazę RNA, np. T7. Ze względu na wysoki koszt odczynników IVT, IVT jest krytycznym krokiem w procesie produkcji substancji leczniczych mRNA i jest przedmiotem intensywnej optymalizacji w tej dziedzinie. Aby obniżyć koszty produkcji mRNA, odczynniki muszą być wykorzystywane optymalnie. Skuteczna optymalizacja wymaga kompleksowego zrozumienia wpływu poszczególnych odczynników na kinetykę reakcji, tj. zużycie trifosforanów nukleozydów (NTP) i produkcję mRNA. Tradycyjnie, do analizy mRNA stosowano niskoprzepustowe techniki analityczne punktu końcowego. Chociaż takie metody dostarczają cennych informacji na temat zawartości mRNA, aby w pełni zrozumieć reakcję IVT, potrzebna jest analiza w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Pokazujemy, w jaki sposób metoda analityczna chromatografii cieczowej, która oddziela NTP, a także pDNA i mRNA, może być wykorzystywana w czasie zbliżonym do rzeczywistego do badania kinetyki reakcji IVT. Dzięki wiedzy na temat wpływu różnych składników IVT na kinetykę i wydajność, szybka analiza chromatograficzna może być wykorzystana do przekształcenia wsadowej reakcji IVT w tryb karmienia wsadowego, co dodatkowo zwiększa produktywność i obniża całkowity koszt reakcji.

Wprowadzenie

Pandemia COVID-19 stała się katalizatorem bezprecedensowej rewolucji w biomedycynie, prowadząc do szybkiego rozwoju i autoryzacji szczepionek opartych na mRNA, takich jak Comirnaty firmy BioNTech/Pfizer i Spikevax firmy Moderna, zarówno w Europie, jak i w USA1,2,3. Imponująca skuteczność i szybki rozwój tych szczepionek podkreśliły ogromny potencjał terapeutyczny technologii mRNA, nie tylko w chorobach zakaźnych, ale także w immunoterapii nowotworów, terapiach zastępczych białkami, medycynie regeneracyjnej i przeprogramowaniu komórek4,5. Epoka ta, często nazywana rewolucją mRNA, podkreśla potrzebę wydajnych i opłacalnych procesów produkcji mRNA.

Produkcja mRNA obejmuje operacje wielu jednostek, przy czym reakcja transkrypcji in vitro (IVT) jest krytyczną i najbardziej kosztowną operacją jednostkową6,7,8. Reakcja IVT syntetyzuje mRNA z matrycy DNA przy użyciu polimerazy RNA, zwykle polimerazy RNA T7 i trifosforanów nukleozydów (NTP) w obecności jonów magnezu. Proces jest stosunkowo prosty i pozwala na wytworzenie dużych ilości mRNA w krótkim czasie, osiągając wydajność reakcji na poziomie 2-5 g/L w ciągu kilku godzin i do 14 g/L w niektórych raportach9,10,11. Jednak optymalizacja wydajności reakcji IVT ma kluczowe znaczenie dla obniżenia kosztów produkcji i zapewnienia skalowalności szczepionek i terapii mRNA12 i, ze względu na różnice w sekwencji, które wpływają na zużycie NTP, może być wymagana dla każdego konstruktu lub rodziny konstruktów.

Reakcja jest zwykle przeprowadzana jako proces wsadowy, ale ostatnie postępy w przetwarzaniu wsadowym i analityce na linii otworzyły nowe możliwości optymalizacji produkcji mRNA7,13. Reakcje wsadowe, które obejmują bolus lub ciągłe dodawanie odczynników, mogą potencjalnie wydłużyć czas reakcji i zwiększyć wydajność, zapobiegając hamowaniu substratu i degradacji produktu zależnej od współczynnika14,15.

Rozwój szybkiej analizy na linii był znaczącym postępem w dziedzinie IVT, umożliwiając monitorowanie kluczowych komponentów reakcji, takich jak NTP i mRNA, z minimalnym opóźnieniem analitycznym13,16, dodając dodatkowy wymiar do monitorowania IVT, które zazwyczaj koncentruje się tylko na stężeniu mRNA17. Tradycyjnie, mRNA były analizowane przy użyciu technik takich jak elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE), elektroforeza w żelu agarozowym lub elektroforeza kapilarna. Są to metody punktu końcowego i dlatego nie mogą być używane do monitorowania IVT w czasie rzeczywistym. Alternatywą dla analityki opisanej w tym protokole są metody wykorzystujące świecące pary aptamerów RNA i barwników fluorescencyjnych. W tej metodzie aptamer RNA jest znakowany do RNA i inkubowany ze świecącym barwnikiem fluorescencyjnym. Aktywność transkrypcji można następnie zobrazować za pomocą intensywności fluorescencji17. Umożliwia to analizę w czasie rzeczywistym ilości i jakości transkrybowanego mRNA podczas IVT 21, ale nie pozwala na jednoczesne monitorowanie innych składników IVT, np. NTP. Inną alternatywą, która potencjalnie umożliwia kwantyfikację NTP i mRNA w czasie rzeczywistym, jest spektroskopia Ramana18, ale do tej pory żaden raport nie wykazał jej przydatności do monitorowania IVT, co sugeruje, że nadal wymagana jest dalsza optymalizacja metody w celu uzyskania niezbędnej selektywności i czułości.

Ciągły rozwój szybszych i bardziej selektywnych analiz wspiera optymalizację IVT pod kątem wyższej wydajności w trybie wsadowym i wsadowym. Reakcja pozostaje złożonym, wieloparametrowym procesem z wieloma oddziałującymi na siebie czynnikami, dla których optima mogą się różnić w zależności od typu konstruktu (np. mRNA vs saRNA). Stężenie i stosunek jonów Mg2+ i NTP są szczególnie wpływowe, a ich optymalne poziomy muszą być starannie zrównoważone, aby zmaksymalizować wydajność mRNA, jednocześnie minimalizując tworzenie dwuniciowego RNA (dsRNA), silnego stymulanta wrodzonego układu odpornościowego19,20. Ostatnio podawanie UTP na poziomie stacjonarnym zostało zgłoszone jako podejście do ograniczenia tworzenia dsRNA21. Monitorowanie poziomów UTP w czasie zbliżonym do rzeczywistego zapewniłoby dodatkowy poziom kontroli procesu.

W tym protokole pokazujemy, jak monitorowanie reakcji IVT w linii produkcyjnej może zwiększyć wydajność produkcji mRNA w trybie wsadowym i wsadowym.

Protokół

1. Przygotowanie bufora

UWAGA: Wszystkie muszą być przygotowane bez RNaz, co oznacza, że wszystkie chemikalia i szkło muszą być używane tylko do pracy bez RNaz i muszą być traktowane z zachowaniem ostrożności. Woda używana do przygotowania buforu i czyszczenia naczyń szklanych musi być certyfikowana jako wolna od nukleaz. Przed przeprowadzeniem eksperymentu wszystkie powierzchnie robocze i szkło należy spryskać odczynnikiem odkażającym, który eliminuje RNazy. Odczynnik do odkażania należy dokładnie zmyć wodą wolną od RNaz przed użyciem szkła/miejsca pracy. Jeśli to możliwe, używaj sterylnych i jednorazowych materiałów eksploatacyjnych.

  1. Przygotowanie IVT: przygotować 10x bufor IVT, dodając 400 mM Tris, 10 mM DTT, 20 mM spermidyny, pH 7,9. Przygotować bufor hartowniczy zawierający 100 mM EDTA, pH 8. Przefiltruj każdy bufor przez filtr PES 0,22 μm.
  2. Przygotowanie faz ruchomych: przygotować fazę ruchomą A (MPA) przez dodanie 50 mM HEPES, pH 7,0, fazę ruchomą B (MPB) przez dodanie 50 mM HEPES, 100 mM Na4P2O7, pH 8,3, fazę ruchomą C (MPC) przez dodanie 0,1 M NaOH, 1 M NaCl, fazę ruchomą D (MPD) przez dodanie 0,5 M HEPES, pH 7,0. Przefiltruj każdy bufor przez filtr PES 0,22 μm.

2. Przygotowanie reakcji transkrypcji in vitro (IVT)

UWAGA 1: Reakcja IVT może być reakcją wsadową, gdzie wszystkie odczynniki są dodawane na początku, a reakcja jest zatrzymywana po wyczerpaniu NTP / produkcja mRNA osiąga plateau, lub może być reakcją z karmieniem wsadowym, gdzie zubożone NTP są uzupełniane dodatkowymi NTP, co dodatkowo zwiększa produkcję mRNA. Liniową matrycę pDNA stosowaną w reakcji IVT można uzyskać za pomocą enzymu restrykcyjnego, który rozszczepia się zaraz po sekwencji poli(A) w plazmidowym DNA lub w reakcji PCR. W obu przypadkach po reakcji musi nastąpić oczyszczanie, chromatograficzne lub przy użyciu dostępnych w handlu zestawów do oczyszczania DNA.

  1. Okresowa reakcja IVT
    1. Ustawić termoblok na 37 °C i 300 obr./min. Rozmrozić wszystkie odczynniki wymienione w tabeli 1 z wyjątkiem enzymów i podgrzać je w temperaturze 37 °C w termobloku. Przygotować mieszaninę 25 mM NTP, używając 100 mM roztworu podstawowego ATP, CTP, UTP i GTP.
    2. Podczas rozmrażania odczynników przygotuj porcje próbek do eksperymentu z biegiem czasu. Weź sterylne probówki o pojemności 0,5 ml i odpipetuj 2 μl 100 mM EDTA do każdej probówki. Oznacz każdą probówkę oznaczonym numerem IVT (np. IVT001, IVT002 itp.) i punktem czasowym (np. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min itp.).
    3. Po rozmrożeniu odczynników i przechowywaniu ich w temperaturze 37 °C przez około 15 minut, należy usunąć enzymy (polimerazę RNA T7, pirofosfatazę, inhibitor rnazy) z zamrażarki o temperaturze -20 °C i przechowywać w chłodziarce do czasu ponownego włożenia do zamrażarki.
    4. Do mieszania poszczególnych odczynników IVT (z wyjątkiem enzymów) należy użyć wiru. Wymieszaj enzymy, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    5. Wymieszaj odczynniki IVT w proporcjach określonych w projekcie eksperymentalnym (np. ogólny protokół IVT pokazano w tabeli 1) w probówce o pojemności 1,5 ml. Podczas optymalizacji IVT końcowa objętość IVT może wynosić od 50 do 100 μL. Projektując całkowitą objętość IVT, należy wziąć pod uwagę liczbę 2 μl próbek, które należy pobrać z reakcji podczas eksperymentu w czasie. Upewnij się, że całkowita objętość próbek nie przekracza 50 % całkowitej objętości IVT (np. jeśli pobiera się próbki 2 μl co 15 minut przez 3 godziny, całkowita objętość pobranych podwielokrotności wynosi 30 μl, co oznacza, że całkowita objętość IVT powinna wynosić co najmniej 60 μl).
    6. Dokładnie wymieszaj IVT, dodaj polimerazę RNA T7 jako ostatni odczynnik. Po dodaniu wszystkich odczynników dokładnie wymieszaj IVT, pipetując w górę i w dół, nie używaj wiru.
    7. Natychmiast po dodaniu i homogenizacji wszystkich odczynników IVT należy wyjąć 2 μl mieszaniny IVT z probówki i pipetować ją do wcześniej przygotowanych probówek o pojemności 0,5 ml zawierających 2 μl 100 mM EDTA opisanych w kroku 2.1.2 (punkt czasowy 0 min).
    8. Umieścić probówki reakcyjne zawierające mieszaniny reakcyjne IVT w termobloku i inkubować je w temperaturze 37 °C.
    9. Ustaw timer na żądane przedziały czasowe (np. 15 min/30 min). W każdym punkcie czasowym pobrać 2 μl próbki IVT z każdej przygotowanej mieszaniny reakcyjnej IVT i pipetować ją do wcześniej przygotowanej probówki (patrz krok 2.1.2) zawierającej 2 μL 100 mM EDTA. Podmiary te zostaną wykorzystane do analizy chromatograficznej (patrz krok 3).
    10. Po analizie chromatograficznej potwierdzonej całkowitemu wyczerpaniu NTP, należy wygasić masowe reakcje IVT z EDTA do końcowego stężenia 50 mM (np. 30 μL IVT inaktywować 30 μL 100 mM EDTA).
  2. Reakcja IVT partii zasilającej
    UWAGA: Produkcję mRNA można dodatkowo zwiększyć, dodając NTP i jony Mg2+ po wyczerpaniu NTP.
    1. Wymieszać wsadową reakcję IVT i pobrać z niej próbkę zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przygotuj paszę NTP+MgCl2 do podawanej partii. Aby przygotować np. 500 μL mieszaniny NTP+MgCl2 należy wymieszać 106 μL z każdych 200 mM NTP, 76,25 μL z 1 M MgCl2 i 5,5 μLDDh 2O. Końcowe stężenia w mieszaninie wynoszą 42,4 mM każdy NTP i 152,5 mM MgCl2.
    2. Monitorowanie zużycia NTP za pomocą analizy at-line opisanej w kroku 3. Gdy analiza na linii produkcyjnej potwierdzi, że stężenie NTP spadnie poniżej 10% stężenia początkowego, dodaj paszę zawierającą NTP+Mg2+ do masowego IVT.
    3. Zmierz/oblicz dokładną objętość masowej reakcji IVT pozostałej w probówce o pojemności 1,5 ml po pobraniu wszystkich porcji do analizy. Dodać odpowiednią objętość mieszaniny NTP+MgCl2 do IVT, tak aby końcowe stężenie wynosiło 4 mM każdego NTP i 12 mM MgCl2. Na przykład, aby uzyskać 80 μl objętości IVT pozostawionej w probówce o pojemności 1,5 ml, dodaj 16,8 μl mieszaniny NTP+MgCl2
      4. .
    4. Kontynuować pobieranie próbek zgodnie z opisem w kroku 2.1. Po ponownym wyczerpaniu NTP powtórzyć sekcję 2.2.2. Kontynuuj karmienie i pobieranie próbek, aż do osiągnięcia pożądanej produkcji mRNA.
    5. Po osiągnięciu pożądanej produkcji mRNA należy dezaktywować całą reakcję, jak w kroku 2.1.10.

3. Przygotowanie analizy chromatograficznej

  1. Przygotowanie testów zgodności norm i systemów (SST)
    1. Przygotuj SST, łącząc odczynnik do zamykania, NTP, matrycę pDNA i mRNA. Upewnij się, że końcowe stężenia wynoszą około 3 μM dla odczynnika zamykającego, 5 μM dla każdego NTP, 4 ng/μL dla matrycy pDNA i 10 ng/μL dla mRNA. Upewnij się, że końcowy SST zawiera 0,1 M NaCl.
    2. Przed każdą analizą należy przygotować nową krzywą kalibracyjną. Stwórz wzorzec kalibracyjny, rozcieńczając oczyszczoną próbkę mRNA o znanym stężeniu za pomocą MPA. Punkty kalibracji powinny wynosić 0,5 ng/μL, 2 ng/μL, 5 ng/μL, 10 ng/μL, 15 ng/μL i 20 ng/μL, każdy o końcowym stężeniu 0,1 M NaCl.
    3. W razie potrzeby przygotuj krzywą kalibracyjną dla wszystkich NTP. Upewnij się, że końcowe stężenia każdego NTP w wzorcach kalibracyjnych wynoszą 0,5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM i 20 μM.
  2. Kondycjonowanie kolumny i przygotowanie do analizy
    1. Równoważyć 0,1 ml kolumny analitycznej w temperaturze pokojowej przez 12 godzin przed analizą. Przymocować kolumnę do układu chromatograficznego w kierunku wskazanym na obudowie kolumny.
    2. Przepłukać kolumnę z natężeniem przepływu 1 ml/min: najpierw 50 objętościami kolumny (CV) ddH2O, a następnie 50 CV MPA.
    3. Uruchom co najmniej 3 ślepe próbki (wstrzykując tylko MPA) przed analizą, aby ustalić linię bazową. Użyj metody chromatograficznej opisanej w Skok et al.15.
    4. Gdy linia podstawowa jest stabilna, a dwie kolejne ślepe próby są porównywalne (odtwarzalna linia podstawowa), przystąp do uruchomienia próbki SST i próbki krzywej kalibracyjnej.
    5. Jeżeli kryteria SST są spełnione, a oddzielenie odczynnika zamykającego i NTP jest zadowalające, należy przystąpić do analizy próbek IVT. Po przeanalizowaniu wszystkich próbek IVT należy ponownie wstrzyknąć wzorzec SST, aby potwierdzić, że warunki systemu pozostały stabilne przez cały czas trwania analizy.
  3. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Próbki do analizy chromatograficznej przygotowuje się bezpośrednio przed analizą. W przeciwnym razie próbki przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20 °C (maksymalnie 24 godziny) lub <-65 °C (ponad 24 godziny).
    1. Przed rozcieńczeniem do analizy chromatograficznej należy odwirować i odwirować schłodzoną próbkę IVT. Przeanalizować wszystkie próbki IVT inaktywowane EDTA (patrz krok 2.1.9) za pomocą analizy chromatograficznej przy użyciu metody opisanej w Skok et al.15.
    2. Przed analizą należy rozcieńczyć próbki IVT, aby uzyskać stężenie w krzywej kalibracyjnej. Użyj tego samego współczynnika rozcieńczenia przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że obszary NTP mogą być porównane w celu określenia, kiedy NTP jest wyczerpany.
    3. Aby określić minimalne rozcieńczenie potrzebne do próbek IVT, należy użyć następującego wzoru: Potrzebne rozcieńczenie = (oczekiwane końcowe stężenie mRNA) / (rozcieńczenie podczas inaktywacji) / (najwyższy standard kalibracji)
      Na przykład, jeśli w IVT spodziewana jest produkcja mRNA na poziomie 8 mg/ml, stężenie w wygaszonej próbce wyniesie 4 mg/ml. Aby uzyskać stężenie w krzywej kalibracyjnej, należy następnie rozcieńczyć próbkę 200-krotnie.
      Wymagane rozcieńczenie = (8000 ng/μL]) / 2 / (20 ng/μL) = 200
    4. Odpipetować MPA i 4 M NaCl do stożkowej szklanej fiolki. Upewnij się, że końcowe stężenie NaCl w próbce wynosi 100 mM. Na koniec dodać wygaszoną próbkę IVT.
    5. Vortex przygotował próbkę i włożył ją do automatycznego podajnika próbek w celu analizy. Ustaw temperaturę automatycznego podajnika próbek na 4 °C.
    6. Wstrzyknąć 100 μl rozcieńczonych próbek do kolumny analitycznej. Zmierzyć absorbancję A260 i A280 dla każdej próbki IVT.
    7. W przypadku analizowania próbek o znanych stężeniach lub jeśli śledzenie zużycia NTP na podstawie różnic obszarowych nie jest wymagane, należy rozcieńczyć próbki, aby osiągnąć docelowe stężenie 10 ng/μl.

4. Kwantyfikacja próbki i analiza danych

  1. Przed włączeniem każdej próbki IVT należy odjąć próbkę ślepą od chromatogramu próbki.
  2. Zintegruj wszystkie piki NTP, pDNA i mRNA w A260 i użyj obszarów pików do obliczenia stężeń NTP i mRNA w IVT.
    UWAGA: Alternatywnie, obszary pików można wykorzystać do porównania procentu każdego NTP pozostałego w reakcji IVT, pod warunkiem, że współczynnik rozcieńczenia był spójny we wszystkich punktach czasowych.
  3. Na podstawie stężeń mRNA/NTP, oznaczonych za pomocą analizy chromatograficznej at-line, zdecyduj, czy IVT można inaktywować, czy też należy wprowadzić dodatkowe NTP do reakcji IVT (patrz krok 2).

Wyniki

Analiza chromatograficzna opisana w niniejszym protokole może być wykorzystana zarówno do optymalizacji IVT, jak i do przekształcenia reakcji IVT w systemie okresowym w reakcję w systemie fed-batch (Rycina 1).

Aby zbadać wpływ różnych składów buforów na kinetykę reakcji IVT, zmieszano trzy różne reakcje IVT zgodnie z protokołem opisanym w Tabuły 2. Bufor zawierający Tris, w którym pH dostosowano za pomocą HCl, porównano z buforem Tris, w którym pH dostosowano za pomocą kwasu octowego. Następnie oba bufory Tris porównano z buforem HEPES, w którym pH dostosowano za pomocą NaOH. Skład wszystkich buforów IVT 1x wynosił 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM spermidyny i pH 7,9.

Z 100 µL mieszaniny reakcji IVT pobierano 2 µL próbki IVT i gasiło ją 2 µL 100 mM EDTA co 15 min w pierwszej godzinie inkubacji, a następnie co 30 min aż do 180 min inkubacji. Przewidywana końcowa wydajność mRNA dla tych warunków reakcji wynosiła 15 mg/mL, co oznacza, że po 2-krotnym rozcieńczeniu wynikającym z gaszenia reakcji zastosowano 400-krotne rozcieńczenie w MPA+NaCl do analizy. Próbkę rozcieńczono łącznie 800-krotnie, co oznacza, że nawet przy produkcji na poziomie 15 mg/mL stężenie mRNA naniesione na analityczną kolumnę chromatograficzną nadal mieściło się w zakresie stężeń krzywej kalibracyjnej.

Powierzchnie obszarów NTP i mRNA przy A260 zintegrowano dla każdej pojedynczej próbki w każdym poszczególnym punkcie czasowym (tx). Następnie powierzchnie te przekształcono w stężenia dla mRNA, wykorzystując krzywą kalibracyjną mRNA, oraz w procent zużycia dla NTP, przyjmując powierzchnię A260 dla NTP w 0 min (t0) jako 100% (patrz. poniższe równanie).

Wzór na procent pozostałych NTP dla ilościowego oznaczenia kwasów nukleinowych, przedstawiający stosunek wartości absorbancji.

Wyniki można przedstawić w formie wykresów dla każdej pojedynczej reakcji IVT, gdzie na osi x zaznaczono czas, a na osi y stężenie mRNA oraz pozostałe NTP (Rycyna 2A). Wszystkie krzywe IVT, czyli stężenia mRNA w zależności od czasu, można również nanieść na jeden wspólny wykres, co pozwala na badanie kinetyki produkcji mRNA oraz wybór optymalnych warunków IVT (Rycina 2B).

W przypadku eksperymentu w trybie fed-batch, mieszaninę IVT przygotowano zgodnie z Tabelą 3. Z 300 µL mieszaniny reakcyjnej IVT pobierano próbkę o objętości 2 µL co 30 min, którą następnie gasiło się za pomocą 2 µL 100 mM EDTA. Dodatkowo próbki pobierano bezpośrednio po każdym dodaniu zbiorczej porcji NTP+MgCl2. Wcześniej przygotowano roztwór do zasilania zawierający po 42,4 mM każdego NTP oraz 152,5 mM MgCl2, mieszając 106 µL każdego z poszczególnych 200 mM NTP z 76,2 µL 1 M MgCl2. Ustalono harmonogram zasilania, w którym dawki bolus dodawano co godzinę (w 60, 120, 180 i 240 minucie inkubacji). Harmonogram zasilania opisano w Tabeli 3. Próbki analizowano niemal w czasie rzeczywistym przy użyciu metod analitycznych opisanych dla zbiorczej reakcji IVT. Po 300 min monitorowania reakcję IVT zgaszono.

Wyniki można przedstawić jako ilość pozostałych NTP lub produkcję mRNA w czasie inkubacji. Ponieważ dodatki w formie bolusa rozcieńczają również reakcję IVT, stężenie mRNA w IVT spada przy każdym dodaniu pożywki (Rysunek 3A). Przyrost masy mRNA można również zmierzyć i przedstawić za pomocą czynników transkrypcyjnych (zdefiniowanych jako mmRNA/mpDNA), co wykazuje liniowy wzrost produkcji mRNA w czasie (Rysunek 3B).

Proces transkrypcji in vitro; schemat rozdziału chromatograficznego; analiza mRNA; piki absorbancji.
Rycina 1: Schematycznie przedstawiony przegląd (A) Przedstawienie schematu optymalizacji IVT z ilościowym pomiarem NTP i mRNA za pomocą analizy chromatograficznej w trybie at-line. (B) Reprezentatywne chromatogramy z reakcji IVT w skali batch pobranych w punktach czasowych: (i) t0, (ii) w połowie procesu, (iii) w końcowym punkcie czasowym reakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy kinetyki syntezy mRNA i stężenia z wykorzystaniem NTP i buforów; trendy danych w czasie.
Rysunek 2: Wykresy IVT w systemie okresowym. (A) Reprezentatywny wykres reakcji IVT z produkcją mRNA i zużyciem NTP na osi y. Plateau stężenia mRNA widoczne w 120 – 180 min inkubacji, co koreluje z zużyciem NTP, ponieważ ograniczający NTP (ATP) zostaje zużyty w 120 min. (B) Wykres IVT pokazujący wpływ buforu IVT na kinetykę IVT. IVT z zastosowaniem Buforu A (Tris+kwas octowy) wykazało najszybszą produkcję mRNA, następnie Bufor B (Tris+HCl) oraz Bufor C (HEPES+NaOH) jako najwolniejszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Szybkości syntezy mRNA; Wykres A: stężenie nukleotydów w czasie, Wykres B: wydajność mRNA w funkcji czasu, badanie kinetyczne.
Rysunek 3: Wykres IVT w trybie fed-batch. (A) Wykres IVT, w którym dozowanie NTP+MgCl2 odbywało się w 60, 120, 180 i 240 minucie. Stężenie mRNA w reakcji IVT spada przy każdym dodaniu pożywki ze względu na rozcieńczenie roztworem NTP+MgCl2. (B) Wzrost masy mRNA wykazany przez czynnik transkrypcyjny jest liniowy przez cały czas inkubacji reakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Ogólny protokół IVT. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Protokół seryjnej transkrypcji in vitro (IVT). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Protokół IVT w trybie fed-batch. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tej metodzie próbki IVT są analizowane w różnych punktach czasowych podczas inkubacji przy użyciu analitycznej chromatograficznej kolumny multimodalnej, która oddziela NTP, pDNA i mRNA, umożliwiając w ten sposób ścisłe monitorowanie zużycia NTP i produkcji mRNA. Metoda ta mierzy NTP i stężenie mRNA w sposób ilościowy w oparciu o zmiany w obszarach A260 w wyznaczonych punktach czasowych. Ponieważ metoda dostarcza informacji o stężeniu NTP i mRNA, doskonale nadaje się do optymalizacji IVT, gdzie głównym celem jest często maksymalizacja wydajności mRNA i zminimalizowanie czasu reakcji; dlatego zrozumienie wpływu różnych odczynników IVT na kinetykę produkcji mRNA ma kluczowe znaczenie22. Pokazujemy, w jaki sposób można zastosować monitorowanie na linii produkcyjnej w celu optymalizacji reakcji IVT w trybie wsadowym i wsadowym.

Główną zaletą tej metody jest analiza at-line, która pozwala na monitorowanie IVT w czasie zbliżonym do rzeczywistego, ponieważ każda próbka jest analizowana w czasie poniżej 8 minut. Przygotowanie próbek do analizy jest proste, ponieważ wymagane jest tylko rozcieńczenie w MPA bez wcześniejszej obróbki wstępnej próbki. Objętość próbki wymagana do analizy jest bardzo niska, np. 1 μl IVT. Tak mała objętość pipetowania może potencjalnie powodować odchylenia analityczne spowodowane błędami pipetowania. Ponieważ jednak wysoka przepustowość podejścia analitycznego pozwala na trzykrotne pomiary, wartości odstające są łatwe do zidentyfikowania, a odchylenia od oczekiwanej krzywej kinetycznej nie są trudne do wykrycia.

Jednym z ograniczeń metody jest chromatograficzna koelucja UTP i CTP. Precyzyjna kwantyfikacja UTP i CTP zwykle nie jest konieczna, ponieważ ograniczającym NTP w sekwencji mRNA jest często ATP lub GTP. Jeżeli wymagane jest oddzielne oznaczanie ilościowe UTP i CTP, różnica w absorbancji UV przy 260 nm i 280 nm dla UTP i CTP może być wykorzystana do wyznaczenia względnej obfitości każdego NTP w piku chromatograficznym.

Ta metoda analityczna nie rozdziela gatunków RNA o długości powyżej 100 nukleotydów; w związku z tym nie może być używany do wykrywania różnic w jakości mRNA, np. nie rozróżnia mRNA niepoliadenylowanego i poliadenylowanego, między dsRNA lub transkryptami nieudanymi a ssRNA i nie nadaje się do badań stabilności, ponieważ nie może rozróżnić mRNA zdegradowanego i niezdegradowanego. Jednak metoda ta może być wykorzystana do ilościowego oznaczania innych modalności RNA, takich jak circRNA, tRNA i saRNA. Chociaż cząsteczki te różnią się wielkością i strukturą, tę samą metodę analityczną można zastosować do zbadania wydajności produkcji każdej z nich w reakcji IVT.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Tomasowi Kostelecowi, Blažowi Bakalarowi, Nejcowi Pavlinowi, Andreji Gramc Livk i Anže Martinčič Celjarowi za pomocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Filtr membranowy PES, np. Sartolab BT 500Sartorius180E14---------E
0,5 ml probówki plastikowe; np. np. DNA LoBind, PCR cleanEppendorf30108035
1,5 ml probówek plastikowych; np. DNA LoBind, PCR cleanEppendorf30108051
ATP SolutionMEBEP BIOSCIENCE 
Lodówka stołowa -20 ° CMarka114935
Kolumna analityczna CIMac PrimaS 0,1 ml (2 &mikro; m)Separacje Sartorius BIA110.5118-2, 2 i mikro; m kanały
Rozwiązanie CTPMEBEP BIOSCIENCE&NBSP;
Naziemna telewizja cyfrowaSigma10197777001
EDTA-Na2 x 2H2OKemika np. 11368 08
GTP SolutionMEBEP BIOSCIENCE 
HEPESMerck1.10110.1000
Fiolka o wysokim odzysku HPLCMacherey-Nagel702860
MgCl2InvitrogenAM 9530G
Spektrofotometr mikroobjętościowyThermo ScienticNanodrop
mRNA standard, mFix4, 4000 ntSartorius BIA SeparacjeBIA-mFix4.1.1
Na4P2O7 + 10 H2OSigmaS6422-500G
NaClFluka31434-1KG-M
NaOHMerck1064691000
Platforma analityczna mRNA PATfix Sartorius BIA SeparacjePAT0021
Pipeta 100 – 1000 μ LEppendorfReference 2
Pipeta 2 – 10 μ LEppendorfReference 2
Pipeta 20 – 200 μ LEppendorfReference 2
PirofosfatazaMEBEP BIOSCIENCE M2403L
Odczynnik do odkażania Rnase AwayThermo Scientic10328011
inhibitor RNAzyMEBEP BIOSCIENCE 
SpermidineSigma85558-5G
T7 Polimeraza mRNAMEBEP BIOSCIENCETR01
ThermoblockThermo ScienticEPPE5382000.015
Trizma BaseSigmaT6066-1KG
Rozwiązanie UTPMEBEP BIOSCIENCE 
Nakrętki na fiolkiMacherey-Nagel70245
VortexIKAV1900
R1331T2R3331T2R2331T2RNK3501R5331T2

Bibliografia

  1. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).
  2. Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 384 (5), 403(2021).
  3. Lopez Bernal, J., et al. Effectiveness of Covid-19 Vaccines against the B.1.617.2 (Delta) Variant. N Engl J Med. 385 (7), 585-594 (2021).
  4. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö mRNA-based therapeutics - developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 13, 759-780 (2014).
  5. Baptista, B. R., Carapito, N., Pichon, C., Sousa, F. mRNA, a revolution in Biomedicine. Pharmaceutics. 13, 2090(2021).
  6. Rosa, S. S., Prazeres, D. M. F., Azevedo, A. M., Marques, M. P. C. mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks. Vaccine. 39, 2190(2021).
  7. Whitley, J., et al. Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics: mRNA platform requirements and development of a scalable production process to support early phase clinical trials. Transl. Res. 242, 38-55 (2022).
  8. Kis, Z., Kontoravdi, C., Shattock, R., Shah, N. Resources, production scales and time required for producing RNA vaccines for the global pandemic demand. Vaccines. 9 (1), 3(2021).
  9. Hengelbrock, A., Schmidt, A., Helgers, H., Vetter, F. L., Strube, J. Scalable mRNA machine for regulatory approval of variable scale between 1000 clinical doses to 10 million manufacturing scale doses. Processes. 11, 745(2023).
  10. Rosa, S. S., et al. Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization. Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).
  11. Sari, Y., Sousa, S. S., Jeffries, J., Marques, M. P. C. Comprehensive evaluation of T7 promoter for enhanced yield and quality in mRNA production. Sci Rep. 14, 9655(2024).
  12. Kumar, A., et al. The mRNA vaccine development landscape for infectious diseases. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 333-334 (2022).
  13. Pregeljc, D., et al. Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).
  14. Kern, J. A., Davis, R. H. Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription. Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).
  15. Skok, J., et al. Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor. Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).
  16. Welbourne, E. N., et al. Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development. Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).
  17. Lee, K. H., Song, J., Kim, S., Han, S. R., Lee, S. W. Real-time monitoring strategies for optimization of in vitro transcription and quality control of RNA. Front Mol Biosci. 10, 1229246(2023).
  18. Matuszczyk, J. C., et al. Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products. Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).
  19. Mu, X., Hur, S. Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA. Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).
  20. Cho, E., et al. Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA. Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).
  21. Ziegenhals, T., et al. Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP. Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).
  22. Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis. J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monitorowanie chromatograficzneoptymalizacja IVTzużycie NTPIVT w trybie fed-batchpolimeraza RNAkinetyka reakcjichromatografia analitycznatechnologia analityczna procesów
Optymalizacja reakcji transkrypcji in vitro do produkcji mRNA z wykorzystaniem chromatograficznego monitorowania at-line
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.