Artykuł metodologiczny

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

932 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67508

⸱

2 maja 2025

 ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Streszczenie

Hematopoetyczne komórki macierzyste posiadają zdolność do długotrwałej samoodnowy i potencjał do różnicowania się w różne typy dojrzałych komórek krwi. Jednak nagromadzenie mutacji nowotworowych w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) może blokować normalne różnicowanie, indukować nieprawidłową proliferację i ostatecznie prowadzić do białaczki. Aby zidentyfikować i/lub ocenić mutacje nowotworowe, połączyliśmy technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu zbadania modelowego genu Trp53, który jest niezbędny do nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej HSPC. W szczególności komórki szpiku kostnego wzbogacone o HSPC od myszy Cas9 zostały pobrane, a następnie poddane transfekcji wirusowej z jednoprowadnicowymi RNA (sgRNA) ukierunkowanymi na jeden lub kilka genów kandydujących w celu wprowadzenia zmian genetycznych w HSPC. Następnie przeprowadzono test CCK-8 w celu zbadania zdolności proliferacyjnej transfekowanych HSPC. Skuteczność celowania w sgRNA została potwierdzona za pomocą testu Tracking of Indels by Decomposition. Te zidentyfikowane geny mogą odgrywać kluczową rolę w białaczce i mogą służyć jako potencjalne cele terapeutyczne.

Wprowadzenie

Hematopoeza, która wytwarza wszystkie linie komórek krwi przez całe życie, jest utrzymywana przez małą populację zwaną hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC). HSC utrzymują się poprzez samoodnawianie i wytwarzają różnych zaangażowanych przodków, którzy dają początek w pełni zróżnicowanym funkcjonalnym komórkom krwi1,2,3. Proces ten jest ściśle regulowany. Jednak akumulacja mutacji nowotworowych w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) utrudnia normalne różnicowanie, nadaje nieprawidłową zdolność proliferacyjną i ostatecznie przekształca HSPC w komórki inicjujące białaczkę (LIC)4,5,6,7. Identyfikacja i potwierdzenie mutacji białaczkowych nadal pozostaje dużym wyzwaniem dla badań nad rakiem.

Ostatnio opracowano system CRISPR/białko 9 (Cas9) związany z regularnymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi/CRISPR, który stał się efektywną i precyzyjną metodą edycji genów, składającą się z nukleazy Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA)8. sgRNA kieruje kompleks Cas9-sgRNA do określonej lokalizacji genomowej poprzez komplementarność RNA-DNA, gdzie nukleaza Cas9 indukuje pęknięcia podwójnej nici. Uszkodzone DNA jest poddawane endogennym mechanizmom edycji genów albo poprzez precyzyjną naprawę kierowaną homologią w obecności szablonów homologii, albo podatne na niedopasowanie, niehomologiczne łączenie końców, co prowadzi do małych insercji lub delecji9. Obecnie system CRISPR/Cas9 stał się potężnym narzędziem do ukierunkowanej edycji genów i regulacji transkrypcji10.

Tutaj użyliśmy technologii CRISPR/Cas9 do wprowadzenia zmian genetycznych w HSPC, a następnie przeprowadziliśmy test Cell Counting Kit-8 (CCK-8), aby zbadać, czy wprowadzone mutacje były krytyczne dla nieprawidłowej proliferacji HSPC. W szczególności, komórki szpiku kostnego wzbogacone o HSPC zostały pobrane od myszy Cas9, a następnie transfekcja wirusa z sgRNA ukierunkowanymi na geny kandydujące. Następnie przeprowadzono test CCK-8 w celu ustalenia, czy mutacje nadawały zwiększoną zdolność proliferacyjną transfekowanym HSPC. Wreszcie, mutacje wprowadzone przez CRISPR/Cas9 zostały potwierdzone przez Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)11 lub targeted deep sequence12. Protokół ten stanowi potężne narzędzie do oceny mutacji nowotworowych i potencjalnych celów terapeutycznych w białaczce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone zgodnie z tym protokołem zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Dobrostanu Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie.

1. Budowa plazmidów sgRNA ukierunkowanych na geny kandydujące (4 - 5 dni)

  1. Zaprojektuj docelowe sgRNA za pomocą narzędzi do projektowania sgRNA online. Wprowadź docelową sekwencję genomowego DNA do internetowego narzędzia do projektowania sgRNA (np. https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Wybierz odpowiednie cele sgRNA i uporządkuj niezbędne oligonukleotydy.
  2. Przygotuj wstawki oligonugologiczne sgRNA. Zawiesić górną i dolną nić zaprojektowanych oligonukleotydów dla każdego sgRNA (krok 1.1) do końcowego stężenia 100 μM. Przygotować mieszaniny zgodnie z tabelą 1 w celu fosforylacji i wyżarzania oligonukleotydów sgRNA. Stosować następujące parametry termocyklingu: 37 °C przez 30 min; 95 °C przez 5 min; obniżyć do 25 °C przy 5 °C min−1.
  3. Dodać 1 μl fosforylowanych i wyżarzonych oligonukleinydów do 199 μl ddH2O o temperaturze pokojowej, aby uzyskać rozcieńczony stosunek 1:200.
  4. Linearyzuj plazmid wektorowy.
    1. Korzystając z przywoływanego wektora szkieletowego (patrz Tabela materiałów), trawić plazmid wektorowy za pomocą enzymu restrykcyjnego Esp3I (BsmBI). Ustawić reakcje zgodnie z tabelą 1 i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę.
    2. Dodać 0,5 μl fosfatazy alkalicznej krewetek (rSAP) do tej samej probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo autokoniugacji liniowego plazmidu.
    3. Sprawdź, czy linearyzacja się powiodła. Załaduj zlinearyzowane plazmidy i nieoszlifowane plazmidy do elektroforezy na 0,8-1% (w/v) żelu agarozowym.
    4. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, eluuj w 20 μl ddH2O i określ ilościowo stężenie DNA.
  5. Sklonuj oligonukleotydy sgRNA do plazmidu wektorowego, ustawiając reakcje ligacji dla każdego sgRNA zgodnie z tabelą 1. Inkubować w temperaturze 16 °C przez 4 godziny.
  6. W celu przemiany dodać 10 μl produktu z etapu 1,5 do 50 μl lodowatych, kompetentnych komórek Stbl3, inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut, szokować ją termicznie w temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie niezwłocznie przywrócić do lodu na 2 minuty. Dodać 200 μl pożywki LB wolnej od antybiotyków do tej samej probówki, Wytrząsać z prędkością 220 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie ułożyć płytkę LB zawierającą 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  7. Następnego dnia zbadaj płytki pod kątem wzrostu kolonii. Z każdej płytki wybierz 6-8 kolonii i sprawdź, czy sgRNA jest prawidłowo wstawione za pomocą colony PCR. Wybierz dodatnie kolonie i zaszczep poszczególne kolonie w 5 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny za pomocą sterylnej końcówki pipety. Inkubować i wstrząsać kulturą w temperaturze 37 °C przez noc.
  8. Wyizoluj plazmidowe DNA z kultur za pomocą mini zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA. Sekwencja z promotora U6, aby upewnić się, że sekwencja prowadząca 20-nt jest prawidłowo włożona.

2. Opakowanie lentiwirusowe (2 - 3 dni)

  1. Hodowla komórek HEK 293T w pożywce DMEM uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% (v/v) roztworem penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Przeprowadź przez HEK293T komórki, odsysając starą pożywkę z szalki Petriego i delikatnie umyj naczynie 2x 3 ml PBS. Dodać 1 ml trypsyny do 10 cm naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę. Dodaj 3 ml ciepłej pożywki DMEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę, zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj w temperaturze 800 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki i w razie potrzeby umieścić komórki w nowych szalkach.
    UWAGA: Do produkcji lentiwirusa należy użyć komórek HEK 293T z mniej niż 10 pasażami.
  3. Szesnaście do 24 godzin przed transfekcją wysiewaj HEK293T komórki na 10 cm szalki o gęstości 2-4 × 106 komórek na talerzu. Upewnij się, że używany DMEM jest wolny od antybiotyków.
  4. Upewnij się, że komórki są zlewane w 70-80% w dniu transfekcji. Przekształć 10-15 μg plazmidu na 10 cm naczynie i utrzymuj stosunek molowy plazmidu do PEI 1:3. Przygotować Mix 1 i Mix 2 do transfekcji zgodnie z Tabelą 2.
  5. Odstaw Mix 2 na 5 minut. Dodaj Mix 2 do Mix 1 (uważaj, aby nie odwrócić kolejności dodawania), dokładnie wymieszaj, a następnie odstaw na 15-20 minut.
  6. Dodać kompleks (krok 2.5) do komórek, delikatnie wstrząsnąć naczyniem do wymieszania i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Sześć do 8 godzin później zastąp pożywkę podłożem DMEM (zawierającym 10% FBS).
  7. Dwa dni po rozpoczęciu transfekcji lentiwirusa zbierz supernatanty lentiwirusa z szalek. Wirować przy 4 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przefiltrować przez membranę mikrofiltracyjną 0,45 μm. Dozować lentiwirusa i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Pobrany lentiwirus można zagęścić w zależności od potrzeb. Unikaj zmniejszania miana wirusa z powodu wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

3. Ekstrakcja i hodowla komórek szpiku kostnego (12 - 13 dni)

UWAGA: Wszystkie linie myszy były utrzymywane w czystym genetycznym tle C57BL/6. Myszy LSL-Cas9 (T002249) skrzyżowano z myszami Mx1-Cre13 w celu wygenerowania LSL-Cas9/+; Myszy Mx1-Cre/+. Tutaj pobraliśmy komórki szpiku kostnego z Mx1-Cre/+; Myszy LSL-Cas9/+ i ich rodzeństwo z miotu.

  1. Aby wywołać ekspresję rekombinazy Cre, należy wstrzyknąć myszom (w wieku 8-12 tygodni) dootrzewnowo 150 μl poliinozyno-polycytidylu (1,5 mg / ml) w dniu 1 i 3. W 6. dniu należy wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 5-fluorouracyl (5-FU, 150 mg/kg).
    UWAGA: Transgeniczne myszy Mx1-Cre są zaprojektowane do ekspresji rekombinazy Cre pod kontrolą indukowalnego promotora Mx113. Dootrzewnowe wstrzyknięcie poliinozyno-polycytydylu może skutecznie aktywować promotor Mx1 i indukować ekspresję rekombinazy Cre14. Wstrzyknięcie 5-FU jest wykorzystywane do zubożenia komórek proliferujących w szpiku kostnym, indukując w ten sposób HSC do cyklu komórkowego i powodując względną obfitość HSPCs15. Po leczeniu 5-FU można pobrać około 2-4 × 106 komórek szpiku kostnego na mysz.
  2. W dniu 11 poświęć myszy przez uduszenie CO2. Weź kość udową i piszczelową myszy, przepłucz jamę szpiku kostnego PBS zawierającym 2% FBS za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i zbierz komórki szpiku kostnego zgodnie z opisem Gavrilescu i wsp.16.
    UWAGA: Przenieś kości do okapu z przepływem laminarnym, gdy tylko kość piszczelowa i strzałkowa zostaną usunięte z myszy, aby zachować sterylność podczas pobierania komórek szpiku kostnego.
  3. Pipetuj komórki szpiku kostnego w górę iw dół (30-50x), aby rozproszyć je na pojedyncze komórki, a następnie przenieś mieszaninę komórek do probówki o pojemności 50 ml i wiruj, aby dobrze wymieszać.
  4. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do 40 μl buforu do lizy erytrocytów i umieścić na lodzie na 5 minut, aby umożliwić lizę erytrocytów. Dodaj 50 μl roztworu błękitu trypanowego, dobrze wymieszaj i policz żywotne komórki.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 800 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  6. Zawiesić komórki w stężeniu 1-2 × 106 komórek/ml w pożywce do prestymulacji szpiku kostnego, jak opisano w Tabeli 3. Wysiewaj komórki w 10-centymetrowych szalkach, 10 ml / talerz i inkubuj przez 24 godziny.

4. Transfekcja lentiwirusowa komórek szpiku kostnego (2 - 3 dni)

  1. Następnego dnia zbierz komórki z wstępnie stymulowanych płytek. Energicznie przepłukać płytkę 5--10 ml PBS zawierającego 2% FBS. Policz żywotne komórki, dodając błękit trypanowy, jak opisano w kroku 3.4.
  2. Odwirować komórki z stężeniem 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór do infekcji wirusowej zgodnie z opisem w Tabeli 4.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżo przygotowanym roztworze do dezynfekcji (∼106 komórek/ml). Wysiewaj zawieszone komórki na 6-dołkową płytkę, 4 ml na dołek. Uszczelnić płytkę 6-dołkową parafilmem i odwirować płytkę o masie 1 500 × g przez 90 minut w temperaturze 32 °C.
  4. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki delikatnie pipetą (ale nie zmieniać pożywki), a następnie inkubować płytkę przez 4-6 godzin w inkubatorze.
  5. Przy pierwszej transfekcji należy ostrożnie odessać jak najwięcej pożywki supernatantowej z każdej studzienki (~3 ml) i dodać równą objętość pożywki do prestymulacji szpiku kostnego. Jeśli niektóre komórki zostaną przypadkowo odessane podczas zabiegu, odwirować przy 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć supernatant, ponownie zamieszaj komórki niewielką ilością pożywki do prestymulacji, a następnie dodaj je z powrotem do studzienki.
  6. W przypadku wtórnej transfekcji, następnego dnia, usunąć 2-3 ml pożywki z każdej studzienki i dodać równą objętość świeżo rozmrożonego roztworu podstawowego retrowirusa wraz z odpowiednimi ilościami HEPES i polibrenu, jak opisano w Tabeli 4. Odwirować płytkę w temperaturze 1 500 × g przez 90 minut, w temperaturze 37 °C.
  7. Po odwirowaniu delikatnie ponownie zawiesić komórki i kontynuować inkubację płytki w inkubatorze przez 4-6 godzin.
  8. Wymień podłoże jak w kroku 4.5. Inkubować przez 24 godziny.

5. Wykonaj test in vitro CCK-8 (3 - 4 dni)

  1. Energicznie przepłucz studzienki, aby zebrać komórki szpiku kostnego. Przemyć płytkę PBS zawierającym 2% FBS, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek. Przefiltrować komórki przez sito o wielkości 70 μm i policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego, jak opisano w kroku 3.4.
  2. Odwirować komórki o masie 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić komórki z DMEM zawierającym 10% FBS i mIL-3, mIL-6 (10 ng / ml), mSCF (100 ng / ml) na 1 × 105 komórek/ml. Weź ~0,5-1 × 106 komórek i odwiruj przy 800 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji genomowego DNA.
  4. Dodaj komórki do 96-dołkowych płytek o gęstości 1 × 104 komórek na dołek. Wykonaj sześć powtórzonych studzienek dla każdej grupy. Dodaj 100 μl sterylnego PBS do kręgu studzienek wokół dołków, w których wysiewane są komórki. Inkubować przez 0, 24, 48 i 72 godziny.
  5. Ostrożnie odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej w odpowiednim punkcie czasowym. Dodać 110 μl pożywki zawierającej 1/10 objętości CCK-8 do studzienek. Skonfiguruj pustą grupę (tylko nośnik i CCK-8, bez komórek). Inkubować w inkubatorze przez 1 godzinę.
  6. Odczytać wartość absorbancji 450 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.
  7. Użyj oprogramowania statystycznego do analizy danych eksperymentalnych i wyraź dane eksperymentalne jako średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD). Przeanalizuj różnice między dwiema grupami za pomocą testu t dla prób niezależnych, gdzie P < 0,05 oznacza statystycznie istotną różnicę.

6. Weryfikacja edycji genów (5 - 7 dni)

  1. Wyodrębnij genomowe DNA (krok 5.3) za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Zaprojektuj startery, które wzmacniają region od 200 do 500 pz skoncentrowany wokół miejsca cięcia sgRNA (Tabela 5).
  3. W przypadku sekwencjonowania Sangera należy przygotować mieszaninę zgodnie z tabelą 6 dla PCR. Amplifikować docelowe fragmenty genów za pomocą termocyklera w następujący sposób: 95 °C przez 5 minut, 40 cykli (95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 9 s), 72 °C przez 10 min, 4 °C ∞,
    UWAGA: Edycję genów można również zweryfikować za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS), a produkt PCR musi zostać oczyszczony za pomocą zestawu do oczyszczania NGS.
  4. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania Sangera na stronie internetowej TIDE (http://tide.nki.nl). Oblicz wydajność edycji sgRNA, wprowadzając sekwencję sgRNA i wyniki sekwencjonowania zarówno z grupy eksperymentalnej, jak i kontrolnej do tego narzędzia online.
    UWAGA: Przeanalizuj wyniki NGS za pomocą CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17. Odczyty wejściowe z parowanym końcem (dwa pliki) lub odczyty z jednym końcem (pojedynczy plik) w formacie fastq lub fastq.gz z eksperymentu z głębokim sekwencjonowaniem, wraz z sekwencją referencyjną i sekwencją sgRNA. Oprogramowanie oceni i określi ilościowo docelową mutagenezę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ nokautu Trp53 na zdolność proliferacyjną mysich HSPCs
Tutaj użyliśmy nokautu Trp53 jako przykładu, aby zademonstrować ten protokół. Aby zbadać wpływ nokautu Trp53 na zdolność proliferacyjną mysich HSPC, zastosowaliśmy transfekcję lentiwirusową w celu wprowadzenia sgRNA Trp53 do komórek szpiku kostnego z ekspresją Cas9 wzbogaconych o HSPC po leczeniu 5-FU. Jednocześnie niespokrewnione sgRNA transfekowano do komórek szpiku kos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologia CRISPR/Cas9 jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych ze względu na jej przyjazny dla użytkownika charakter i wysoką wydajność, ułatwiając takie zastosowania, jak badania przesiewowe funkcji genów18, modelowanie chorób19, immunoterapia20 oraz znakowanie i obrazowanie żywych komórek21. W ostatnich badaniach przeprowadzono zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe CRISPR w celu zidentyfikowania nowych cel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Uniwersytetowi Medycyny Chińskiej w Pekinie za korzystanie z jego wspólnych usług w celu przeprowadzenia tych badań. Praca ta była wspierana przez Fundusz Młodych Naukowców Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31701280 J. Zhanga).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m membrana mikrofiltracyjnaSartoriu16533K-1
1,5 ml probówkaEP LABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm miskaCorning430167
15 ml ProbówkaLABLEADLXG1500
1 mL sterylna strzykawka
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)Dokładnabiologia AG11010Do PCR kolonii
Probówka 50 mlLABLEADLXG5000
5-FluorouracylSigmaF6627-1
Płytka 6-dołkowaCorning3516
70 µ m sito komórkoweFalcon®352350
Płytki 96-dołkoweCorning3599
ACK Bufor do lizyLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpicillinSolarbioA8180
Stosowane termocyklery Biosystems do PCRThermofisher
Cell Counting Kit-8BimakeB34304
WirówkaeppendorfWirówka 5810R
Inkubator CO2Thermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Clean& Koncentrator-5ZYMOD4014
Dneasy Krew & Zestaw TissureQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Surowica bydlęca płoduExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC; Wirginia, Stany Zjednoczone
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963wektor szkieletowy
LSL-Cas9myszy Model Animal
Centrum Badawcze
UNIWERSYTET NANJING 
spektrofotometr absorbancji mikropłytekBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100xplazmid SolarbioP1400
pMD2.GAddgene12259
polybreneBeyotimeC0351
Sól sodowa kwasu poliinozynowo-policytydylowegoSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen28104
RecombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RecombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Regularna agarozaBIOWESTBY-R0100
Fosfataza alkaliczna z krewetkami (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro SpektrofotometrURZĄDZENIA MOLEKULARNE
Stbl3 Kompetentne komórkiBioMedBC108-01 
Kinaza polinukleotydowa T4NEBM0201L
T4-LigazaTakara2011B
TIANprep Szybki zestaw mini plazmidówTIANGENDP105-03
Roztwór błękitu trypanowegoLABLEADC0040-100ml
Trypsyna-EDTAGibco25200072
TryptonOXOIDLP0042
WEHI-CMBiotechnologia Nanjing Fuksai 
CBP50079 EKSTRAKT DROŻDŻOWYOXOIDLP0021
T002249

Bibliografia

  1. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  4. Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml. Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).
  5. Chopra, M., Bohlander, S. K. The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).
  6. Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all. Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).
  7. González-García, S., et al. IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763-763 (2003).
  10. Wang, S. -W., et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 21 (1), (2022).
  11. Zhao, C., et al. HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control. Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).
  12. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  13. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  14. Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell. 62 (1), 51-61 (1990).
  15. Randall, T. D., Weissman, I. L. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).
  16. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).
  17. Pinello, L., et al. Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso. Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).
  18. Cai, P., et al. A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis. Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).
  19. Ng, S. R., et al. CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).
  20. Crowther, M. D., et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1. Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).
  21. Ma, H., et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).
  22. Szlachta, K., et al. CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response. Nat Commun. 9 (1), 4275(2018).
  23. Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions. Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).
  24. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).
  25. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hematopoetyczne kom rki macierzysteknockout genuzestaw do liczenia kom reknieprawid owa proliferacjaleukemogenezaizolacja szpiku kostnegoknockout Trp53analiza TIDE

Powiązane artykuły