Ta metoda polega na ekstrakcji retinolu z surowicy, oddzieleniu go za pomocą HPLC oraz określeniu znakowanych i nieznakowanych izotopów retinolu za pomocą GC-MS. Stosunek znakowanego do nieznakowanego retinolu służy do oszacowania całkowitych zapasów witaminy A w organizmie.
Artykuł metodologiczny
Analiza GC-MS wzbogacenia deuteru retinolem w surowicy i oszacowanie całkowitych zapasów witaminy A w organizmie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ta metoda opisuje określanie wzbogacenia deuteru retinolu w surowicę i szacowanie zapasów witaminy A w organizmie. Proces polega na ekstrakcji retinolu z 0,4 ml surowicy przy użyciu 0,5 ml 0,85% roztworu soli fizjologicznej, 100 μl roztworu wzorca wewnętrznego i 5 ml roztworu chloroformu metanolu (2:1 v/v). Po odwirowaniu i usunięciu dolnej warstwy chloroformu, mieszaninę suszy się pod azotem i ponownie zawiesza w 0,1 ml etanolu, a frakcję retinolu oddziela się od pozostałych składników za pomocą systemu HPLC wyposażonego w kolumnę PE C18. Frakcję retinolu można zbierać ręcznie lub za pomocą kolektora frakcji. Następnie frakcję retinolu suszy się pod azotem i derywatyzuje O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidem (BSTFA) zawierającym 10% trimetylochlorosilanu. Wreszcie, znakowane i nieznakowane izotopy retinolu są oznaczane ilościowo za pomocą systemu GC-MS wyposażonego w kolumnę kapilarną 19091z-431 HP-1 metylosiloksanu, wykorzystującą ujemną jonizację chemiczną wychwytu elektronów z helem jako gazem nośnym i metanem jako środkiem jonizującym. Stosunek znakowanego do nieznakowanego retinolu jest następnie wykorzystywany w równaniach Olsona, Greena lub bilansu masy w celu oszacowania zapasów witaminy A.
Wprowadzenie
Witamina A jest niezbędnym składnikiem odżywczym potrzebnym dla układu wzrokowego i utrzymania funkcji komórek do wzrostu, integralności nabłonka, produkcji czerwonych krwinek, odporności i reprodukcji1. Niedobór witaminy A jest poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie, dotykającym ponad 100 krajów. W nieproporcjonalny sposób dotyka małych dzieci i kobiet w ciąży w krajach o niskich dochodach. Około 190 milionów dzieci na całym świecie cierpi na niedobór witaminy A, co sprawia, że jest to krytyczny problem dla zdrowia publicznego i rozwoju dzieci2.
W odpowiedzi na tę sytuację, w wielu krajach o niskich dochodach, od dziesięcioleci wdrażane są różne programy, w tym suplementacja witaminy A z dwurocznym dystrybucją wysokich dawek witaminy A dla dzieci poniżej 5 roku życia oraz wzbogacanie witaminy A w niektórych produktach spożywczych. Jednak interwencje te często nakładają się na siebie, narażając niektóre populacje na niezamierzone, przewlekłe, nadmierne spożycie witaminy A3,4. To podwójne ryzyko niedoboru i nadmiaru podkreśla potrzebę biomarkera, który może dokładnie ocenić stan witaminy A w pełnym spektrum, od niedoboru do toksyczności, aby kierować oceną programu.
Biomarkery witaminy A są kluczowe dla oceny stanu odżywienia. Najczęściej stosowanymi biomarkerami są stężenia retinolu w surowicy oraz białko wiążące retinol (RBP). Należy jednak pamiętać, że te biomarkery mogą być tymczasowo tłumione przez infekcje i stany zapalne, co może obniżyć swoistość ocen witaminy A w niektórych populacjach5,6,7.
Podczas gdy próbki z biopsji wątroby lub autopsji są uważane za złoty standard oceny poziomu witaminy A, najbardziej czułym pośrednim wskaźnikiem całkowitych rezerw witaminy A w wątrobie jest metoda rozcieńczania izotopów retinolu (RID)8. RID zapewnia ilościowe oszacowanie statusu witaminy A w pełnym spektrum, od niedoboru do nadmiernego magazynowania9. W większości zastosowań badawczych metoda RID polega na podawaniu doustnej dawki deuteru (2H) lub 13znakowanego C octanu retinylu, który następnie miesza się z zapasami ciała przez okres od 14 do 21 dni. Po tym okresie pobiera się próbkę krwi, a surowicę przechowuje się w temperaturze -80 °C. Stosunek znakowanego do całkowitego retinolu jest następnie analizowany za pomocą spektrometrii mas w celu oszacowania zapasów witaminy A10, stosując równanie Olsona11, równanie bilansu masy12 lub zielone równanie13. Protokół przedstawiony w tym artykule jest ważny dla podawania octanu retinylu znakowanego deuterem (2H) lub 13C i jest oparty na pracy Tang et al.14. Ogólnym celem tej metody jest dokładna ocena i monitorowanie stanu witaminy A w organizmie11. Jest to potężna metoda, która zapewnia ilościowe oszacowanie stężeń witaminy A w szerokim spektrum stanów, od niedoboru do nadmiaru15. Jest dokładniejszy i bardziej precyzyjny niż inne metody, które często opierają się na miarach pośrednich9.
Protokół
Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Ministerstwa Zdrowia (nr 2015/02/550/CE/CNERSH/SP), a od rodziców/opiekunów uzyskano świadomą zgodę.
UWAGA: Ze względu na światłoczułość witaminy A, niezwykle ważne jest, aby wszystkie procedury były przeprowadzane przy słabym oświetleniu lub pod złotymi lampami fluorescencyjnymi16Wykorzystane materiały szczegółowo opisano w Tabela materiałów.
1. Przygotowanie odczynników
- Chlorek sodu (0,85% w/v): Rozpuścić 0,85 g NaCl w wodzie destylowanej w kolbie miernej o pojemności 100 mL. Dopełnić wodą destylowaną do kreski i wymieszać.
- Chloroform-metanol (2:1 v/v): Przenieść 300 mL chloroformu do kolby miernej o pojemności 500 mL za pomocą cylindra miarowego. Dodać 150 mL metanolu i wymieszać.
- Faza ruchoma A do HPLC: Acetonitryl/Tetrahydrofuran/woda ultrapure (50/20/30, v/v/v): Przenieść 500 mL acetonitrylu do kolby miernej o pojemności 1000 mL. Dodać 200 mL tetrahydrofuranu i 300 mL wody. Wymieszać roztwór, przefiltrować go przez filtr membranowy o rozmiarze porów 0,45 µm i poddać sonikacji (amplituda 100%, częstotliwość 40 kHz, czas 15 min).
- Faza ruchoma B do HPLC: Acetonitryl/Tetrahydrofuran/woda ultrapure (50/44/6, v/v/v): Przenieść 500 mL acetonitrylu do kolby miernej o pojemności 1000 mL. Dodać 440 mL tetrahydrofuranu i 60 mL wody. Wymieszać roztwór, przefiltrować go przez filtr membranowy o rozmiarze porów 0,45 µm i poddać sonikacji.
2. Przygotowanie roztworów wzorcowych
- Przygotować roztwór zapasowy, rozpuszczając 40 mg standardu w etanolu w kolbie miarowej o pojemności 100 mL, zgodnie z ilustracją w Table 1. Dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem i dokładnie wymieszać.
- Rozcieńczone roztwory zapasowe: Przygotować rozcieńczony roztwór zapasowy, przenosząc 1 mL roztworu zapasowego do kolby miarowej o pojemności 50 mL, jak pokazano w Table 2. Dopełnić do kreski odpowiednim rozpuszczalnikiem i dokładnie wymieszać.
- Wyznaczanie stężenia rozcieńczonych roztworów zapasowych: Przenieść alikwot (1 mL) rozcieńczonego roztworu do kuwety kwarcowej i zmierzyć jego absorbancję w spektrofotometrze przy określonej długości fali (Table 3), używając etanolu jako wzorca (blanku). Obliczyć stężenie zgodnie z prawem Lamberta-Beera17. Przed analizą upewnić się, że spektrofotometr jest skalibrowany poprzez rozgrzanie instrumentu przez 15-30 min, wybranie żądanej długości fali i wyzerowanie urządzenia po umieszczeniu wzorca w uchwycie na próbkę. Obliczyć stężenie według następującego wzoru:
Stężenie = (absorbancja/współczynnik absorpcji) x 106 (µg/dL)
UWAGA: Aby przeliczyć wartości z jednostek konwencjonalnych (µg/dL) na jednostki SI (µmol/L), pomnożyć wartość konwencjonalną przez następujące współczynniki konwersji: 0,0304 dla octanu retinylu i 0,0349 dla retinolu18. - Przygotowanie standardów roboczych: Za pomocą pipety miarowej przenieść 2 mL rozcieńczonych roztworów zapasowych do kolby stożkowej o pojemności 100 mL. Dopełnić kolbę do kreski etanolem, dokładnie wymieszać i zamknąć korkiem.
- Aby wyznaczyć dokładne stężenie każdego roztworu, ocenić czystość każdego składnika za pomocą HPLC wyposażonego w kolumnę C18 i detektor matrycy diodowej ustawiony na 340 nm. Zaprogramować pompę tak, aby używała fazy ruchomej A i fazy ruchomej B zgodnie z harmonogramem przedstawionym w Table 4. Przed analizą upewnić się, że system HPLC jest skalibrowany poprzez walidację poszczególnych komponentów, takich jak pompa, detektor, autosampler oraz wydajność całego systemu.
- Przenieść 1 mL rozcieńczonych roztworów zapasowych do fiolek zakręcanych i wstrzyknąć próbki do systemu HPLC zgodnie ze standardową procedurą. Wyznaczyć czystość, korzystając z następującego równania:
RÓWNANIE 1
Z zastosowaniem tej korekty czystości obliczyć dokładne stężenie poszczególnych składników w roztworze standardowym.
- Przygotowanie standardu wewnętrznego (OD octanu retinylu ~ 0,2): Za pomocą pipety miarowej przenieść 30 mL roboczego standardu octanu retinylu do kolby stożkowej o pojemności 100 mL. Dopełnić kolbę do kreski etanolem, dokładnie wymieszać i zamknąć korkiem.
- Przygotowanie roztworów roboczych: Dodać 20 µg nieznaczonego retinolu do 10,00, 3,33, 1,00, 0,33 i 0,00 µg retinolu znakowanego, aby uzyskać stosunki retinolu znakowanego do nieznakowanego wynoszące odpowiednio 0,500, 0,167, 0,050, 0,0167 i 0,00.
3. Analiza próbki
UWAGA: Próbki surowicy wykorzystane w niniejszym badaniu pobrano w 14tym dniu od dzieci, które otrzymały doustną dawkę (2 mg ekwiwalentu retinolu) D8-retinolu w ramach badania mającego na celu monitorowanie i ocenę poziomu witaminy A u dzieci w Kamerunie.
- Ekstrakcja retinoidów z surowicy: Ekstrakcja ta opiera się na pracy Folcha i wsp.19 w modyfikacji Tanga i wsp.14. Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
- Przed analizą pozwolić zamrożonym próbkom surowicy powoli rozmrozić się w temperaturze pokojowej (20-25 °C). Odmierzyć 400 µL surowicy do jednorazowej probówki hodowlanej o wymiarach 16 x 100 mm. Dodać 500 µL 0,85% soli fizjologicznej oraz 100 µL standardu wewnętrznego i 5 mL roztworu chloroform-metanol (2:1 v/v).
- Mieszać na wortexie przez 30 s i wirować przy 1157 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Za pomocą szklanej pipety Pasteura ostrożnie przenieść dolną warstwę chloroformu do jednorazowej probówki hodowlanej o wymiarach 13 x 100 mm. Suszyć pod strumieniem azotu w łaźni wodnej (40 °C) i resuspender pozostałość w 100 µL etanolu. Mieszać na wortexie i poddać sonikacji przez 30 s. Przenieść próbkę do fiolki z wkładką, zamknąć i opisać. Próbka jest gotowa do wydzielenia retinolu metodą HPLC.
- Przeprowadzić wydzielenie retinolu metodą HPLC zgodnie z poniższym opisem.
- Wprowadzić 70 µL każdej próbki surowicy do systemu HPLC wyposażonego w kolumnę C18 i detektor z macierzą diod ustawiony na 340 nm. Zaprogramować pompę tak, aby dostarczała fazy ruchome A i B ze stałą prędkością przepływu 1 mL/min, zgodnie z harmonogramem przedstawionym w Tabeli 4.
- Przed wstrzyknięciem próbek surowicy wprowadzić 70 µL roztworu roboczego retinolu do systemu HPLC i odnotować czas retencji piku retinolu. Następnie ustawić zbieracz frakcji tak, aby zbierał eluowaną frakcję retinolu w określonym zakresie do probówki 5 mL ze szlifowanym korkiem. W tym przypadku frakcja retinolu była zbierana w odstępie 3 min, od 7,5 do 10,5 min.
UWAGA: Stężenie retinolu można również obliczyć na tym etapie, korzystając z krzywej kalibracyjnej standardów retinolu oraz stopnia odzysku uzyskanego z wykorzystaniem standardu wewnętrznego.
- Przeprowadzić derywatyzację retinolu zgodnie z poniższym opisem.
- Frakcję retinolu zebraną z HPLC suszyć pod strumieniem azotu w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C przez co najmniej 3 h. Dodać etanol, aby ułatwić odparowanie wilgoci podczas suszenia (próbki powinny być całkowicie suche, ponieważ derywatyzacja jest wrażliwa na wilgoć). Dodać do probówki 20 µL BSTFA z 10% TMCS.
- Umieścić probówkę w suchym grzejniku blokowym ustawionym na 70 °C i inkubować przez 30 min. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieść mieszaninę reakcyjną do fiolki z wkładką, szczelnie zamknąć zakrętką krymponą za pomocą zaciskarki do zakrętek i opisać. Próbka jest teraz gotowa do analizy GC/MS i może być przechowywana w eksykatore w temperaturze 4 °C do momentu analizy.
- Dodatkowo wysuszyć zestaw 100 µL roztworów standardowych roboczych i przeprowadzić derywatyzację w opisany wyżej sposób, aby skalibrować urządzenie GC/MS.
UWAGA: Derywatyzacja retinolu przy użyciu BSTFA polega na reakcji chemicznej, w której grupa hydroksylowa (-OH) retinolu zostaje zastąpiona grupą trymetylosylową (-Si(CH3)3), tworząc eter trymetylosylowy retinylu. Proces ten zwiększa lotność i stabilność retinolu, czyniąc go bardziej odpowiednim do analizy GC/MS20.
- Analiza GC/MS: Analizę GC/MS przeprowadza się zgodnie z procedurą opisaną przez Tanga i wsp.14. Należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
- Wprowadzić 3 µL derywatyzowanej próbki retinolu za pomocą autosamplera do chromatografu gazowego (GC) z wtryskiwaczem on-column, połączonym przez łącznik o zerowej objętości martwej z 15-metrową kolumną kapilarną z topionego szkła kwarcowego o średnicy wewnętrznej 0,25 mm, powleczoną fazą stacjonarną DB-1 o grubości warstwy 0,25 µm.
- Zaprogramować temperaturę pieca kolumnowego oraz wtryskiwacza on-column tak, aby wzrosła z 50 °C do 285 °C w tempie 15 °C/min, a temperaturę interfejsu GC/MS ustawić na 285 °C. Użyć helu jako gazu nośnego do elucji derywatu trymetylosylowego retinolu w czasie około 12 min.
- Eluat GC wykrywać za pomocą kwadrupolowego spektrometru mas stosując chemiczną jonizację ujemnymi jonami metanu przy ciśnieniu 0,5 torr, z temperaturą źródła jonów ustawioną na 150 °C. Ustawić spektrometr mas na skanowanie w zakresie od 260 do 280 daltonów.
4. Analiza danych
- Użyć oprogramowania do analizy danych GC/MS.
- Wyekstrahować wszystkie interesujące jony na podstawie ich stosunków masy do ładunku (m/z), zintegrować obszar piku (stosując integrację ręczną w celu dostosowania punktów początkowego i końcowego piku) i przenieść wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
UWAGA: W zależności od zastosowanego izotopu, interesujące jony będą następujące: 268-270 m/z dla retinolu natywnego; 271-274 m/z dla [2H4]-retinolu; 278-280 m/z dla [13C]-retinolu oraz 276-280 m/z dla [2H8]-retinolu. - Obliczyć sumę pików dla retinolu znakowanego (ΣD), sumując obszary pików przy m/z 274, 275, 276, 277 i 278. Obliczyć sumę pików dla retinolu nieznakowanego (ΣH), sumując obszary pików przy m/z 268, 269 i 270.
- Obliczyć wzbogacenie w retinol znakowany (D), korzystając z następującego równania: D = ΣD/(ΣH + ΣD). Obliczyć ilość retinolu nieznakowanego (H), korzystając z następującego równania: H = 1 - D.
UWAGA: Chromatografia gazowa sprzężona z masową spektrometrią z ujemną chemiczną jonizacją z wychwytem elektronów dla trimetylosilowego eteru retinylu nie daje jonu molekularnego, lecz główny jon fragmentacyjny przy m/z 268 do 271 dla retinolu nieznakowanego, przy m/z 272 do 275 dla D4-retinolu i przy m/z 276 do 280 dla D8-retinolu14. - W celu kontroli układu obliczyć równanie regresji liniowej pomiędzy stosunkami mas standardów kalibracyjnych a zintegrowanymi obszarami dla retinolu znakowanego i retinolu nieznakowanego.
5. Oznaczanie zapasów witaminy A
UWAGA: Ten etap pozwala na ocenę stanu witaminy A u danej osoby.
- Oblicz całkowite zapasy witaminy A w wątrobie, korzystając z równania Olsona11
Vitamin A Total Liver Stores = F x Dose x [S x a x (H/D - 1)]
gdzie F jest współczynnikiem wydajności wchłaniania i magazynowania podanej doustnie dawki (F = 0,50), Dose to ilość podanej doustnie znakowanej witaminy A (µmol), S jest współczynnikiem korygującym nierówność stosunku retinolu znakowanego do nieznakowanego w osoczu w stosunku do wątroby (S = 0,65), a jest współczynnikiem korygującym nieodwracalną utratę znakowanej witaminy A podczas okresu mieszania; konkretnie a = e-kt, gdzie k jest szacowaną frakcyjną szybkością katabolizmu systemowego (k = ln 2/32 dni dla dzieci), a t to czas wyrażony w dniach od podania dawki; D/H to izotopowy stosunek retinolu znakowanego do nieznakowanego w surowicy, -1 koryguje wpływ dawki znakowanej witaminy A na całkowitą pulę witaminy A w organizmie. - Do obliczenia całkowitych zapasów witaminy A w organizmie (TBS) należy użyć równania Greena13
TBS = Fa × S × (1/SAp)
gdzie Fa jest frakcją znakowanej dawki witaminy A podanej doustnie, która została wchłonięta i znajduje się w wymiennych pulach zapasów organizmu w czasie t, a S jest stosunkiem aktywności specyficznej retinolu w surowicy do aktywności w zapasach w czasie t (dla dzieci Fa × S = 0,642 w 14. dniu)21. SAp to frakcja dawki w surowicy na µmol dawki (tj. [retinol znakowany] / ([retinol nieznakowany + znakowany] w surowicy) / doustna dawka retinolu znakowanego (µmol)).
Wyniki
Wtryskiwanie 3 µL pochodnej próbki z wysuszonego roztworu zawierającego około 50 pM/µL kalibrantów (retinol i D8-retinol) do układu GC/MS nie wykazało obecności jonu molekularnego, lecz ujawniło główny jon fragmentacyjny przy m/z 268 dla retinolu (Rysunek 1) oraz m/z 278 dla D8-retinolu (Rysunek 2). Wskazuje to, że jony molekularne trimetylosylowego eteru retinylu, powstałe podczas derywatyzacji retinolu i D8-retinolu, nie są stabilne w warunkach jonizacji stosowanych w GC/MS. Ulegają one rozpadowi na mniejsze fragmenty, głównie poprzez rozszczepienie alfa. Ten powszechny wzór fragmentacji obejmuje zerwanie wiązania sąsiedniego z grupą eteru trimetylosylowego. Rozszczepienie alfa prowadzi do utraty grupy trimetylosylowej (TMS, o masie 73 Da) oraz atomu wodoru, co skutkuje powstaniem jonu fragmentacyjnego o masie 268 Da dla retinolu i 278 Da dla D8-retinolu22. Mechanizm ten pomaga w identyfikacji i potwierdzeniu obecności retinolu oraz jego pochodnych w próbce poprzez analizę specyficznych jonów fragmentacyjnych powstających podczas spektrometrii mas. Wtryskiwanie mieszanin retinolu i D8-retinolu wykazało dwa główne jony fragmentacyjne przy m/z 268 dla retinolu i m/z 276 dla D8-retinolu (Rysunek 3), co potwierdza obecność tych związków w próbce. Krzywa kalibracyjna wykazała doskonałą liniowość, o czym świadczy wysoki współczynnik korelacji (Rysunek 4), co pokazuje, że zależność między stosunkiem piku a stosunkiem mas ma bardzo prosty i przewidywalny charakter.
Odpowiedź GC/MS uzyskana z wstrzyknięć próbek surowicy (surowica od dzieci, które otrzymały doustną dawkę 2 mg ekwiwalentów retinolu w postaci D8-retinolu; Rysunek 5) wykazuje obecność retinolu i D8-retinolu, z dwoma głównymi jonami fragmentowymi zaobserwowanymi przy m/z 268 i m/z 274. Wyniki uzyskane po ekstrakcji jonów i całkowaniu pól powierzchni pików przy m/z 274, 275, 276, 277 i 278 dla D8-retinolu oraz przy m/z 268, 269 i 270 dla nieznakowanego retinolu przedstawiono w Tabułce 5. Wyniki te należy podstawić do równania Olsona11 lub równania Greena13 w celu obliczenia zapasów witaminy A w organizmie.
Technika rozcieńczenia izotopem stabilnym pozwala na pomiar stężeń witaminy A, których nie można uzyskać innymi metodami, co umożliwia dokładną ocenę statusu witaminy A. Metoda ta jest cenna w badaniach żywieniowych, diagnostyce klinicznej oraz badaniach epidemiologicznych.
Rysunek 1: Chromatogram i widmo masowe retinolu. Rysunek przedstawia chromatogram z chromatografii gazowej/ujemnej chemicznej jonizacji z wychwytem elektronów na metanie sprzężonej ze spektrometrią mas (panel górny) z analizy zderatyzowanego standardu retinolu. Panel dolny to widmo masowe wykazujące m/z 268 dla retinolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Chromatogram i widmo masowe D8-retinolu. Na rycinie przedstawiono chromatogram z analizy standaryzowanego, zderatyzowanego D8-retinolu uzyskaną metodą chromatografii gazowej z detekcją spektrometrią mas przy użyciu negatywnej chemicznej jonizacji z wychwytywaniem elektronów w obecności metanu (panel górny). Panel dolny przedstawia widmo masowe wykazujące m/z 278 dla D8-retinolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Chromatogram i widmo masowe mieszaniny retinolu i D8-retinolu.Na rycinie przedstawiono chromatogram z chromatografii gazowej ze spektrometrią mas przy użyciu ujemnej chemicznej jonizacji z wychwytywaniem elektronów metanu (górny panel) z analizy zderatyzowanej mieszaniny standardów retinolu i D8-retinolu. Dolny panel przedstawia widmo masowe z m/z 268 dla retinolu i m/z 276 dla D8-retinolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Krzywa kalibracyjna. Ten rysunek przedstawia zależność między odpowiedzią GC/MS a stężeniem nieznakowanego i znakowanego retinolu. Jest ona opisana równaniem y = 9,8379x + 0,7019, gdzie y (stosunki pól) reprezentuje odpowiedź instrumentu, 9,8379 to czułość, x (stosunki masowe) reprezentuje stężenie analityczne, a 0,7019 to sygnał tła. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Chromatogram i widmo masowe próbki surowicy. Na rysunku przedstawiono chromatogram z analizy pochodnej frakcji retinolu w surowicy, wykonanej metodą chromatografii gazowej z detekcją spektrometrią mas z negatywną chemiczną jonizacją z wychwytem elektronów metanowych (panel górny). Panel dolny przedstawia widmo masowe z sygnałem m/z 274 dla D8-retinolu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Standard | Masa (mg) | Kolba pomiarowa (ml) | Rozpuszczalnik |
| Retinol | 40 | 100 | Etanol |
| Octan retinylu | 40 | 100 | Etanol |
| Retinyl acetate znakowany deuterem | 40 | 100 | Etanol |
Tabela 1: Przygotowanie roztworu zapasu. Tabela ta przedstawia sposób przygotowania stężonych roztworów retinolu oraz znakowanego deuterem octanu retinylu, które mogą być następnie rozcieńczane do niższych stężeń w przyszłych eksperymentach.
| Standard | Roztwór zapasowy (ml) | Kolba miarowa (ml) | Rozpuszczalnik |
| Retinol | 1 | 50 | Etanol |
| Octan retinylu | 1 | 50 | Etanol |
| Retinyl acetate znakowany deuterem | 1 | 50 | Etanol |
Tabela 2: Przygotowanie rozcieńczonych roztworów zapasowych.Tabela ta przedstawia sposób przygotowania gotowych do użycia roztworów retinolu oraz retinylu octanu znakowanego deuterem.
| Standard | Długość fali (nm) | E1%1 cm |
| Retinol | 325 | 1850 |
| Octan retinylu | 326 | 1550 |
Tabela 3: Długość fali i E1% 1 cm (Współczynnik absorpcji).
| Czas (min) | Przepływ (ml/min) | Faza ruchoma A (%) | Faza ruchoma B (%) |
| 0 – 6 | 1 | 100 | 0 |
| 6 – 13 | 1 | 100 → 50 | 0 → 50 |
| 13 - 18 | 1 | 50 | 50 |
| 18 - 20 | 1 | 50 → 0 | 50 → 100 |
| 20 - 28 | 1 | 0 | 100 |
| 28 - 29 | 1 | 0 → 100 | 100 → 0 |
Tabela 4: Harmonogram faz ruchomych HPLC. Tabela ta przedstawia zaplanowaną sekwencję i czas trwania poszczególnych faz podczas przebiegu chromatografii HPLC.
| SH | SD | D | H | |
| Próbujący 1 | 64030809 | 566089.7 | 0.008763 | 0.991237 |
| Próbujący 2 | 194354 | 43861.39 | 0.184125 | 0.815875 |
| Próbujący 3 | 793490 | 80179.28 | 0.091773 | 0.908227 |
| Próbujący 4 | 2002063 | 45286.7 | 0.02212 | 0.97788 |
| Próbujący 5 | 80999193 | 355980.7 | 0.004376 | 0.995624 |
| Próbujący 6 | 32196717.7 | 216152.7 | 0.006669 | 0.993331 |
| Próbujący 7 | 40905724.5 | 334818.1 | 0.008119 | 0.991881 |
| Próbujący 8 | 28336711.5 | 218924.1 | 0.007667 | 0.992333 |
| Próbujący 9 | 8695135.5 | 542077 | 0.058684 | 0.941316 |
| Próbujący 10 | 103260212 | 1717728 | 0.016363 | 0.983637 |
| SH: suma pól pików dla m/z 268, 269 i 270 | ||||
| SD: suma pól pików dla m/z 274, 275, 276, 277 i 278 | ||||
| D: wzbogacenie znakowanego retinolu | ||||
| H: poziom nieznakowanego retinolu |
Tabela 5: Wyniki analizy GC/MS pochodnej frakcji retinolu w surowicy. Tabela ta przedstawia wyniki GC/MS niezbędne do obliczenia całkowitego zapasu witaminy A w organizmie. H jest sumą pól pików przy m/z 268, 269 i 270; D jest sumą pól pików przy m/z 274, 275, 276, 277 i 278; D oznacza wzbogacenie znakowanego retinolu; H oznacza poziom nieznakowanego retinolu; TBS oznacza całkowity zapas witaminy A w organizmie (Total Body Store).
Dyskusja
Pomyślne wdrożenie tego protokołu zależy od skutecznego wykonania każdego kroku. Odpowiednie przygotowanie rozwiązań i norm jest kluczowe, aby zebrane dane były dokładne i wiarygodne. Procedury opisane w protokole zostały przetestowane w różnych warunkach i są odpowiednie do uzyskania roztworów i wzorców, które spełniają cele analizy próbki.
Analiza próbek rozpoczyna się od ekstrakcji i oddzielenia retinolu w surowicy. Przechowywanie próbek surowicy w temperaturze -80 °C do czasu analizy jest niezbędne, aby zapobiec degradacji witaminy A. Dodatkowo konieczna jest praca w słabym świetle16. Procedura HPLC stosowana do zbierania frakcji retinolu ma na celu oddzielenie retinolu od innych składników rozpuszczalnych w tłuszczach, aby uniknąć ingerencji w proces derywatyzacji. Umożliwia również uruchamianie setek próbek bez przepłukiwania kolumny.
Frakcję retinolu pobraną z HPLC poddaje się derywatyzacji BSTFA w temperaturze 70 °C przez 30 min. Etap derywatyzacji ma kluczowe znaczenie dla poprawy lotności retinolu i jego wykrywalności w GC-MS. Ponieważ jest wrażliwy na wodę, ważne jest, aby całkowicie wysuszyć próbkę przed derywatyzacją i dać wystarczająco dużo czasu na zajście reakcji derywatyzacji przed analizą GC-MS. Zauważono, że proces derywatyzacji za pomocą BSTFA jest bardzo łagodny i wydajny w porównaniu z procesem z użyciem N-metylo-N-(tert-butylodimetylosililo)trifluoroacetamidu (MTBSTFA)23,24 i zapewnia bardzo ostry pik dla derywatyzowanego retinolu, bez ogonów lub pików tła w skanowanym zakresie mas14. Derywatyzowany retinol w szczelnie zamkniętej fiolce można przechowywać w eksykatorze w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc bez degradacji14.
W przypadku analizy GC-MS kluczowe znaczenie ma zapewnienie prawidłowej kalibracji i konserwacji kolumny oraz optymalizacja objętości wtrysku, temperatury i natężenia przepływu. Zastosowane tutaj warunki z iniekcją na kolumnie wykazały dobre i wiarygodne wyniki14. Podczas analizy GC-MS deuterowanego i nieznakowanego retinolu, Tang i wsp.14 zaobserwowali, że szczyty deuterowanego retinolu pojawiły się zarówno w podanej dawce, jak i w surowicy osób, które otrzymały dawkę. Ten wzór nie był obserwowany w przypadku nieoznakowanego retinolu. W związku z tym doszli do wniosku, że piki deuterowanego retinolu są wstępnie uformowane w dawce, a nie są wynikiem fragmentacji w spektrometrze mas, co sugeruje, że deuterowany retinol zachowuje swoją strukturę w procesie metabolicznym, zapewniając wiarygodny marker do śledzenia retinolu w badaniach biologicznych. Wzbogacenie deuterowanego retinolu w surowicy po podaniu 2 mg D8-retinolu dzieciom w wieku przedszkolnym zaczęło wzrastać po 7 godzinach i osiągnęło szczyt po 14 dniach, co jest krótszym optymalnym czasem pobierania próbek25. W 200 μl ludzkiej surowicy minimalny wykrywalny procent wzbogacenia retinolu wynosi 0,01%, co pokazuje, że metoda jest wystarczająco czuła, aby analizować próbki surowicy pobrane od osób o szerokim zakresie poziomów witaminy A14.
Chociaż przedstawiona tutaj technika rozcieńczania izotopów stabilnych oferuje znaczne korzyści w ocenie statusu witaminy A, należy zauważyć, że metoda ta wymaga zaawansowanego sprzętu i wiedzy technicznej, co czyni ją kosztowną i mniej dostępną do rutynowego stosowania w wielu warunkach26. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę to ograniczenie przy planowaniu stosowania tej techniki.
Oświadczenia
Ten manuskrypt jest częścią serii zatytułowanej Wykorzystanie metody rozcieńczania izotopów retinolu do oceny zapasów witaminy A w organizmie i stężenia witaminy A w wątrobie wspieranej przez MAEA.
Podziękowania
Nauczyliśmy się tego protokołu podczas stypendium w Laboratorium Karotenoidów i Zdrowia, Jean Mayer USDA Human Nutrition Research Center on Aging, Tufts University, Boston, USA, pod nadzorem Guangwen Tang i przy wsparciu finansowym Międzynarodowej Agencji Energii Atomowej (MAEA).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki hodowlane jednorazowe 13x100 mm | 99445-13 | Jednorazowe probówki hodowlane bez kołnierza | |
| 16x100 mm jednorazowe probówki hodowlane | 99445-16 | PYREX Jednorazowe probówki hodowlane bez kołnierza | |
| 24-pozycyjne N-EVAP Parownik azotu | Organomation Associates, Inc | 11250 | N-EVAP 112, Parownik azotu, z systemem grzewczym OA-SYS |
| Acetonitryl | Sigma-Aldrich | 00687 | Acetonitryl, odpowiedni do HPLC, klasa gradientowa, ≥ 99,9% |
| fiolki do karbania w kolorze bursztynowym, 2 ml, | SU860033 | fiolka z krótkim gwintem, fiolka z bursztynową 11,6 x 32 mm | |
| Waga analityczna | Waga precyzyjna | Mettler Toledo | 30133525 |
| Kolumna C18 | Perkin-Elmer Inc | 2580195 | Brownlee Pecosphere RA C18 - 33 mm x 4,6 mm średnica wewnętrzna, opakowanie 5 |
| nasadek zaciskarka | MilliporeSigma | Z114243 | Ręczna zaciskarka do nakrętek aluminiowych Średnica zewnętrzna 20 mm |
| Kolumna kapilarna | J & W Scientific | 122-1011 | 15 m i razy; 0,25 mm Wewnętrzna kolumna kapilarna ze stopionej krzemionki pokryta fazą stacjonarną DB-1 o grubości warstwy 0,25 mm |
| Wirówka | Sigma 3-18KS | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 528730 | Chloroform, klasa HPLC, ≥ 99,9% |
| Kolby stożkowe: 100 ml,4980016 | Kolby Borosil Erlenmeyer Stożkowe borokrzemianowe NM z podziałką | ||
| Nasadki zaciskowe z uszczelką PTFE | Supelco | 27455-U | Uszczelki zaciskane z przegrodą PTFE/silikon |
| octan D8-retinylu | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-2244-PK | Octan witaminy A 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%) |
| Dozownik do 1-10 ml | Gilson | F110103 | DISPENSMAN Dozownik butelkowy |
| Suchy podgrzewacz blokowy | Grant | Grant QBH2 Wysokowydajny cyfrowy suchy podgrzewacz blokowy | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 459844 | Alkohol etylowy, czysty, ≥ 99,5%, odczynnik ACS, 200-proof |
| GC-MS | Agilent | Agilent 7890 Seria A Chromatografia gazowa ze spektrometrem masowym 5975C wyposażony w obojętny system XL EI/CI MSD/DS Turbo CI 5975C, automatyczny wtryskiwacz 7693A Zawiera wieżyczkę transferową i tackę na próbki 7693 | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 2000 ml | 956854 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 100 ml | 956849 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 1000 ml | 956853 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 25 ml | 956841 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 50 ml | 956847 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Kolby miarowe z korkiem szklanym: 500 ml | 956852 | MARKA BLAUBRAND kolba miarowa, korek szklany, szkło bezbarwne | |
| Hel (najwyższa czystość) | Air Liquide | UN 1046 Hel sprężony, klasa 2.2 | |
| HPLC | Varian | Varian 940LC HPLC z kolektorem frakcji | |
| Wkładki do fiolek do zaciskania, 5 mm, 175 μ | L,AR0-4521-12 | Wkładka Verex, średnica 5 mm, 175 &mikro; L, przezroczyste, stożkowe dno, ze sprężyną dolną | |
| Cylindry miarowe: 100 ml | 213902402 | Cylinder miarowy DURAN, z sześciokątną podstawą, klasa A | |
| Butle miarowe: 250 ml | 213903604 | Cylinder miarowy DURAN, z sześciokątną podstawą, klasa A | |
| Metan (najwyższa czystość) | Air Liquide | UN1971 Metan sprężony, klasa 2.1 | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Metanol, odpowiedni do HPLC, ≥ 99,9% |
| N, O-bis(trmethylsilyi)trifluoroacetamid (BSTFA) z 10% trimetylochlorosilanem (TMCS) | Thermo Scientific | 043939.22 | |
| Azot | Wyprodukowane przez Parker Balston NitroVap Generator | ||
| Pipety Pasteura, szkło, | 13-678-20A Marka | rybna Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego | |
| Kuwety | EW-83301-12 | Cole-Parmer Standard Pojedyncze kuwety kwarcowe | |
| Retinol | Sigma-Aldrich | 17772 | ≥ 95,0% (HPLC), ~2700 U / mg |
| octan retinylu | Sigma-Aldrich | R0635 | analityczny standard klasy |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9888 | Chlorure de sodium, odczynnik ACS, ≥ 99,0% |
| Spektrofotometr | Shimadzu | Uvmini-1240 UV-Vis | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 439215 | Tetrahydrofuran, klasa HPLC, ≥ 99,9%, |
| myjka ultradźwiękowa | inhibitorów Bransonic | CPX-952-339R | Branson CPX Płuczka ultradźwiękowa do kąpieli Bransonic |
| Pipety wolumetryczne: 100-1000 i mikro; L | 3123000063 | Mikropipeta 1-kanałowa Eppendorf z pipetami miarowymi T.I.P.S. Box 2.1 | |
| : 20-200 i mikro; L | 3123000055 | Eppendorf 1-kanałowa mikropipeta z mieszalnikiem T.I.P.S. Box 2.0 | |
| Vortex | Ika | Vortx Genius 3 |
Bibliografia
- D'Ambrosio, D., Clugston, R., Blaner, W. Vitamin A metabolism: an update. Nutrients. 3 (1), 63-103 (2011).
- WHO. Global prevalence of vitamin A deficiency in populations at risk 1995-2005. WHO Global Database on Vitamin A Deficiency. , Geneva. (2009).
- Kraemer, K., et al. Are low tolerable upper intake levels vitamin A undermining effective food fortification efforts. Nutr Rev. 66 (9), 517-525 (2008).
- Allen, L. H., Haskell, M. Estimating the potential for vitamin A toxicity in women and young children. J Nutr. 132 (9 Suppl), 2907S-2919S (2002).
- Filteau, S. M., et al. Influence of morbidity on serum retinol of children in a community-based study in northern Ghana. Am J Clin Nutr. 58 (2), 192-197 (1993).
- Rubin, L. P., Ross, A. C., Stephensen, C. B., Bohn, T., Tanumihardjo, S. A. Metabolic effects of inflammation on vitamin A and carotenoids in humans and animal models. Adv Nutr. 8 (2), 197-212 (2017).
- Suri, D. J., et al. Inflammation adjustments to serum retinol and retinol-binding protein improve specificity but reduce sensitivity when estimating vitamin A deficiency compared with the modified relative dose-response test in Ghanaian children. Curr Dev Nutr. 5 (8), nzab098(2021).
- Tanumihardjo, S. A. Vitamin A: biomarkers of nutrition for development. Am J Clin Nutr. 94 (2), 658S-665S (2011).
- Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
- Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. the Vitamin A Tracer Task Force. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. Technical Monograph 5. , (2005).
- Furr, H. C., Amedee-Manesme, O., Bergen, H. R., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
- Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
- Green, M. H. Evaluation of the "Olson equation", an isotope dilution method for estimating vitamin A stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 9-15 (2014).
- Tang, G., Qin, J., Gregory, G., Dolnikowski, G. G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
- Tanumihardjo, S., et al. Appropriate uses of vitamin A tracer (stable isotope) methodology. Vitamin A tracer task force. , ILSI Human Nutrition Institute. Washington D.C. (2004).
- Barua, A. B., Furr, H. C. Properties of retinoids: structure, handling, and preparation. Mol Biotechnol. 2 (2), 167-182 (1998).
- Swinehart, D. F. The Beer-Lambert Law. J Chem Edu. 39, 333-335 (1962).
- Barua, A. B., Furr, H. C. Properties of retinoids. Structure, handling, and preparation. Methods Mol Biol. 89, 3-28 (1998).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, S. G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Knapp, D. R. Handbook of analytical derivatization reactions. , John Wiley & Sons. New York. (1979).
- Green, M. H., Green, J. B. Use of model-based compartmental analysis and theoretical data to further explore choice of sampling time for assessing vitamin A status in groups and individual human subjects by the retinol isotope dilution method. J Nutr. 157 (7), 2068-2074 (2021).
- Todd, J. F. J. Recommendations for nomenclature and symbolism for mass spectroscopy (including an appendix of terms used in vacuum technology). (Recommendations 1991). Pure and Appl Chem. 63 (10), 1541-1566 (1991).
- Handelman, G. J., Haskell, M. J., Jones, A. D., Clifford, A. J. An improved protocol for determining ratios of retinol-d4 to retinol isolated from human plasma. Anal Chem. 65 (15), 2024-2028 (1993).
- Tang, G., Andrien, B. A. Jr, Dolnikowski, G., Russell, R. M. Methods in Enzymology, Vitamins and Coenzymes. Part L. 282, 140-154 (1997).
- Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-age Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
- Lopez-Teros, V., et al. International experiences in assessing vitamin A status and applying the vitamin A-labeled isotope dilution method. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 40-51 (2014).
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny