Method Article

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

DOI:

10.3791/67519

⸱

April 4th, 2025

 , 
1Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endolizosomalne kanały jonowe są kluczowe dla endolizosomalnej homeostazy jonów i pH, regulacji potencjału błonowego i transportu pęcherzyków. Jednak elektrofizjologiczny dostęp do tych kanałów w małych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych był wyzwaniem. Rozwój technik endolizosomalnych patch-clamp odegrał zasadniczą rolę w pokonaniu tej bariery, umożliwiając bezpośredni pomiar aktywności kanałów jonowych w błonach endolizosomalnych.

W porównaniu do istniejących technik płaskiego zacisku płaskiego, endolizosomalny patch-clamp może jednocześnie rejestrować wiele komórek i łatwo łączyć się z innymi metodami pomiaru. Obsługa ręczna ma tę zaletę, że umożliwia wizualizację docelowych pęcherzyków. Odnosi się również do ograniczenia niezbędnej obecności Ca2+ po jednej stronie błony endolizosomalnej, zwiększając elastyczność projektu eksperymentalnego. Wykorzystanie technik endolizosomalnych patch-clamp umożliwia bezpośredni pomiar i analizę aktywności kanałów jonowych w endolizosomach.

Biorąc pod uwagę ścisły związek między nieprawidłową funkcją endolizosomalnych kanałów jonowych a chorobami, takimi jak choroby neurodegeneracyjne i zaburzenia metaboliczne, badanie i modulowanie tych kanałów może ujawnić nowe cele leków. Przywracając wewnątrzkomórkową równowagę jonową, możemy złagodzić lub wyleczyć choroby z tym związane. Dlatego technika ta ma kluczowe znaczenie dla odkrywania nowych celów leków i opracowywania odpowiednich leków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanały jonowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych. Podczas gdy powierzchniowe kanały jonowe cieszą się dużym zainteresowaniem, stopniowo uznaje się znaczenie kanałów wewnątrzkomórkowych, szczególnie tych w endolizosomach. Układ endolizosomalny składa się z wielofunkcyjnych, związanych z błoną organelli wyspecjalizowanych w podstawowych funkcjach komórkowych, w tym endosomów recyklingowych (RE), wczesnych endosomów (EE), późnych endosomów (LE), lizosomów (LY) i organelli hybrydowych o cechach zarówno endolizosomalnych, jak i innych cechach przedziałów, takich jak fagosomy i autofagosomy.

EE, znane również jako endosomy ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja instrumentu

  1. Sprzęt
    UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla standardowej konfiguracji stanowiska do elektrofizjologii.
    1. Chroń zestaw przed zakłóceniami zewnętrznymi za pomocą stołu i klatki Faradaya.
    2. Użyj odwróconego mikroskopu z mikromanipulatorem, aby stabilnie ustawić mikroelektrodę.
    3. Skonfiguruj wzmacniacz, aby zbierać i wzmacniać pozyskane sygnały.
    4. Użyj digitizera, aby przekonwertować sygnały analogowe na sygnały cyfrowe.
    5. Korzystaj z oprogramowania do akwizycji i analizy danych, aby tworzyć protokoły eksperymentalne i wyodrębniać znaczące, mo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej opisano obecne kształty obserwowane podczas eksperymentów z endolizosomalnymi klamrami. Jeśli obecny kształt nie jest zgodny z oczekiwaniami, może to być spowodowane słabym kontaktem lub wyciekiem. Słaby kontakt może wystąpić, jeśli elektroda referencyjna nie styka się w pełni z roztworem do kąpieli lub jeśli elektroda pipety jest bliska pęknięcia. Nieszczelność może wystąpić, jeśli między komorą a szkiełkiem nakrywkowym znajduje się szczelina umożliwiająca przepływ płynu na soczewkę obiektywu lub stolik; Zbyt du.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizjologiczne układy eksperymentalne mają cztery główne wymagania laboratoryjne: i) środowisko: metody utrzymania próbki w dobrym stanie; ii) optyka: metody wizualizacji próbki; iii) mechanika: metody stabilnego pozycjonowania mikroelektrody; oraz iv) elektronika: metody wzmacniania i nagrywania sygnału.

Aby skutecznie przeprowadzić eksperymenty z endolizosomalnymi patch-clampami, kluczowe jest kilka kluczowych kroków. Po pierwsze, stan komórek - komórki muszą być ściśle przylegające do.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narodowa Rada Nauki i Technologii, Tajwan (MOST 110-2320-B-002-022), Narodowy Uniwersytet Tajwański (NTU-112L7818) oraz Narodowe Instytuty Badawcze Zdrowia, Tajwan (NHRI-EX112-11119SC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
INSTRUMENT SUTTERSZKŁA BOROKRZEMIANOWEGOBF150-75-10OD: 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm o długości 10 cm, z żarnikiem
Digidata 1140AAxon Instruments
Mikroskop odwrócony IX73OLYMPUS
MODEL P-97 ściągacz do mikropipetINSTRUMENT
MPC-200PRZYRZĄD
MultiClamp 700BAxon Instruments
POLISHER
Komora szybkiego zwalnianiaInstrumenty Warner641943QR-40LP, do szkiełek nakrywkowych 25 mm
ZE SUTTER SUTTER

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable mem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endolysosomal Patch ClampIon Channel RecordingSingle Vesicle AnalysisEndolysosomal Ion ChannelsVesicle TraffickingMembrane PotentialLysosomal Ion ChannelsWhole Vesicle RecordingGigaseal FormationVoltage Clamp

Related Articles