Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Summary

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Abstract

Endolizosomalne kanały jonowe są kluczowe dla endolizosomalnej homeostazy jonów i pH, regulacji potencjału błonowego i transportu pęcherzyków. Jednak elektrofizjologiczny dostęp do tych kanałów w małych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych był wyzwaniem. Rozwój technik endolizosomalnych patch-clamp odegrał zasadniczą rolę w pokonaniu tej bariery, umożliwiając bezpośredni pomiar aktywności kanałów jonowych w błonach endolizosomalnych.

W porównaniu do istniejących technik płaskiego zacisku płaskiego, endolizosomalny patch-clamp może jednocześnie rejestrować wiele komórek i łatwo łączyć się z innymi metodami pomiaru. Obsługa ręczna ma tę zaletę, że umożliwia wizualizację docelowych pęcherzyków. Odnosi się również do ograniczenia niezbędnej obecności Ca²⁺ po jednej stronie błony endolizosomalnej, zwiększając elastyczność projektu eksperymentalnego. Wykorzystanie technik endolizosomalnych patch-clamp umożliwia bezpośredni pomiar i analizę aktywności kanałów jonowych w endolizosomach.

Biorąc pod uwagę ścisły związek między nieprawidłową funkcją endolizosomalnych kanałów jonowych a chorobami, takimi jak choroby neurodegeneracyjne i zaburzenia metaboliczne, badanie i modulowanie tych kanałów może ujawnić nowe cele leków. Przywracając wewnątrzkomórkową równowagę jonową, możemy złagodzić lub wyleczyć choroby z tym związane. Dlatego technika ta ma kluczowe znaczenie dla odkrywania nowych celów leków i opracowywania odpowiednich leków.

Introduction

Kanały jonowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych. Podczas gdy powierzchniowe kanały jonowe cieszą się dużym zainteresowaniem, stopniowo uznaje się znaczenie kanałów wewnątrzkomórkowych, szczególnie tych w endolizosomach. Układ endolizosomalny składa się z wielofunkcyjnych, związanych z błoną organelli wyspecjalizowanych w podstawowych funkcjach komórkowych, w tym endosomów recyklingowych (RE), wczesnych endosomów (EE), późnych endosomów (LE), lizosomów (LY) i organelli hybrydowych o cechach zarówno endolizosomalnych, jak i innych cechach przedziałów, takich jak fagosomy i autofagosomy.

EE, znane również jako endosomy sortujące (SE), są jednym z wcześniejszych miejsc docelowych dla materiałów internalizowanych z błony plazmatycznej (PM). EE są krytycznymi kompartmentami odpowiedzialnymi za sortowanie ładunku na różne szlaki endocytarne, takie jak ścieżka dojrzewania do LE/LY w celu degradacji, szybka ścieżka recyklingu z powrotem do PM oraz ścieżka powolnego recyklingu obejmująca komorę recyklingu lub peryferyjną RE. Ciała wielopęcherzykowe (MVB) pochodzące z endosomów to kuliste przedziały otoczone błoną ograniczającą, która może być wypełniona pęcherzykami śródświetlnymi (ILV)¹. Aby utrzymać normalne funkcjonowanie tych organelli, wymagają one błonowych kanałów jonowych do regulacji pęcherzykowego pH, osmolarności i transdukcji sygnału. Jednak mierzenie aktywności tych kanałów nie jest proste.

Dla kanałów jonowych zlokalizowanych na błonie plazmatycznej, technika patch-clamp opracowana w latach siedemdziesiątych od dawna jest złotym standardem². Jednak dostęp do kanałów elektrofizjologicznych w małych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych pozostał wyzwaniem. Zastosowanie złotego standardu pomiaru kanałów jonowych na błonie komórkowej do kanałów na organellach wewnątrzkomórkowych wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, rozmiar endolizosomów jest zazwyczaj bardzo mały (średnica mniejsza niż 1 μm), co utrudnia ich obserwację i izolację pod mikroskopem i jest mniejszy niż średnica otworu typowych mikropipet szklanych, co sprawia, że eksperyment jest nieoperacyjny. Po drugie, izolowanie endolizosomów bezpośrednio z komórek docelowych przy zachowaniu integralności organelli wymaga specjalnych umiejętności. Po trzecie, ze względu na brak cytoszkieletu w organellach wewnątrzkomórkowych, utworzenie uszczelnienia na błonie endolizosomalnej w pipecie łatowej, a następnie jej pęknięcie w celu uzyskania konfiguracji całego endolizosomu może być trudne, ponieważ narusza integralność strukturalną organelli³.

Opracowano kilka metod przezwyciężenia tych problemów, w tym zapis dwuwarstwowy lipidów, modyfikację lizosomalnych sekwencji docelowych oraz techniki elektrofizjologii opartej na membranach (SSM lub SSME) oparte na solidnych włóknach. Metoda zapisu dwuwarstwowego lipidów polega na rekonstrukcji syntetycznych błon fosfolipidowych z oczyszczonymi kanałami jonowymi, umożliwiając szczegółowe badanie elektrofizjologiczne funkcji białek błonowych w kontrolowanych warunkach^4,5. Modyfikacja lizosomalnych sekwencji docelowych na kanałach jonowych polega na przekierowaniu endolizosomalnych kanałów jonowych do błony plazmatycznej w celu pomiaru przy użyciu konwencjonalnych metod patch-clamp⁶. Techniki elektrofizjologii opartej na membranach opartych na ciałach stałych (SSM lub SSME), znane również jako metoda endolizosomalnego płaskiego zacisku krosowego, wykorzystują płaskie wióry szklane o stałym podłożu z małymi otworami (<1 μm średnicy) w mikrostrukturalnych płaskich wiórach borokrzemianowych. Te szklane chipy o małej aperturze pozwalają na analizę małych, nawet natywnych endolizosomów za pomocą systemu kontroli ciśnienia i ssania (Nanion). Jednak w pierwszych dwóch metodach kanały jonowe nie znajdują się w swoim naturalnym środowisku fizjologicznym. Próby zarejestrowania kanałów lizosomalnych ulegających ekspresji na błonie plazmatycznej lub odtworzonych w dwuwarstwy lipidowe w dużej mierze przyniosły niepewne i sprzeczne wyniki.

Chociaż techniki płaskiego zacisku punktowego skutecznie rozwiązały problem sztucznej interferencji i oferują przewagę w postaci pomiarów o wysokiej przepustowości, stosowane rozwiązania są również ograniczone przez tę metodę. Przedstawiona w tym artykule technika endolizosomalnego patch-clamp może jednocześnie rejestrować wiele komórek i łatwo łączyć się z innymi metodami pomiaru. Obsługa ręczna ma tę zaletę, że umożliwia wizualizację docelowych pęcherzyków. Przezwycięża również nieuniknione ograniczenie Ca²⁺ w roztworze po jednej stronie błony endolizosomalnej, zwiększając swobodę projektowania eksperymentalnego³. Ostatnio techniki endolizosomalnej klamki punktowej odegrały kluczową rolę w badaniach nad opracowywaniem leków. Na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych technika ta pomogła zidentyfikować nowe leki ukierunkowane na endolizosomalne kanały jonowe związane z chorobami Alzheimera i Parkinsona^7,8. Naukowcy mogą również wykorzystać tę technikę do zbadania roli endolizosomalnych kanałów jonowych w komórkach nowotworowych⁹, kontrolując w ten sposób wzrost i proliferację guza. Jeśli chodzi o choroby metaboliczne, badania endolizosomalne typu patch-clamp ujawniają związki, które regulują endolizosomalne kanały jonowe, oferując nowe podejścia do leczenia cukrzycy i otyłości. Technika endolizosomalnej klamry pomaga w zrozumieniu dysfunkcji endolizosomalnej i znalezieniu potencjalnych terapii⁶, znacznie poszerzając naszą wiedzę na temat funkcji endolizosomalnych kanałów jonowych i promując odkrywanie nowych celów leków.

Protocol

1. Konfiguracja instrumentu

1. Sprzęt
   UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla standardowej konfiguracji stanowiska do elektrofizjologii.
   1. Chroń zestaw przed zakłóceniami zewnętrznymi za pomocą stołu i klatki Faradaya.
   2. Użyj odwróconego mikroskopu z mikromanipulatorem, aby stabilnie ustawić mikroelektrodę.
   3. Skonfiguruj wzmacniacz, aby zbierać i wzmacniać pozyskane sygnały.
   4. Użyj digitizera, aby przekonwertować sygnały analogowe na sygnały cyfrowe.
   5. Korzystaj z oprogramowania do akwizycji i analizy danych, aby tworzyć protokoły eksperymentalne i wyodrębniać znaczące, możliwe do przeanalizowania wyniki z zebranych danych.
2. Elektrody
   1. Stosować dwie elektrody: elektrodę do kąpieli i elektrodę do pipet.
      UWAGA: Platyna i chlorek srebra mają najlepsze właściwości polaryzacyjne. Elektrody chlorku srebra składają się z drutu lub granulek srebra, które zostały zchlorkowane, dzięki czemu mają warstwę AgCl na zewnętrznej powierzchni drutu lub granulki (Rysunek 2).
3. Przygotowanie pipet
   1. Ciągnąc
      1. Zamontuj rurkę kapilarną w ściągaczu.
         UWAGA: Poniższe parametry używane do produkcji pipet są specyficzne dla danego urządzenia. Instrument, którego użyliśmy w tym artykule, jest wymieniony w Tabeli materiałów.
      2. W warunkach eksperymentalnych (temperatura pokojowa 22 °C, żarnik grzałki w kształcie przelotowym, szkło borokrzemianowe z żarnikiem), które nie powodują wypalenia żarnika grzałki, należy przeprowadzić test RAMP na ściągaczu w celu określenia wartości ciepła (HEAT) wymaganej do stopienia szklanej kapilary.
      3. Zaprojektuj nowy program ciągnięcia z sześcioma oddzielnymi cyklami ciągnięcia, korzystając z parametrów HEAT, prędkości (VEL) i czasu (TIME) (Tabela 1).
         UWAGA: CIEPŁO odnosi się do parametru, który podgrzewa żarnik grzałki, umożliwiając stopienie żarnika szklanego. Prędkość wskazuje prędkość, z jaką ściągacz ciągnie filament w obu kierunkach. Czas reprezentuje czas trwania interwału między każdym cyklem.
      4. Naciśnij zielony przycisk Pull na klawiaturze.
      5. Poluzuj clamppokrętło i wyjmij pipety ze ściągacza.
      6. Sprawdź końcówki pipet pod okularem mikrokuźni, aby określić średnicę, ostrość i geometrię końcówki. Upewnij się, że średnica końcówki wynosi 0,5-0,9 μm,
         UWAGA: Ponieważ żarnik jest używany częściej, wartość ciepła wymagana do stopienia szklanej kapilary będzie się zmieniać.
      7. Jeśli rozmiar końcówki nie spełnia oczekiwań, dostosuj parametry HEAT i VEL. Wyższe temperatury i większe prędkości spowodują uzyskanie drobniejszych, dłuższych końcówek i odwrotnie. Dostosuj HEAT w krokach co 5 stopni, a prędkość w krokach co 3.
   2. polerowanie
      1. Umieść wyciągnięte pipety z plastrami w uchwycie microforge
      .
      2. Sprawdź końcówki pipet za pomocą soczewki obiektywowej 35x (w połączeniu z okularem 15x, co daje powiększenie 525x).
      3. Użyj mikromanipulatora, aby zbliżyć pipety z plastrem do filamentu.
      4. Ustaw pokrętło temperatury na 80.
      5. Za pomocą przełącznika nożnego włącz grzałkę i zastosuj krótki impuls cieplny (1 - 2 s), monitorując proces polerowania przez okular microforge.
      6. Powtarzaj proces, aż wszystkie pipety zostaną wypolerowane.
      7. Umieść gotowe pipety w szczelnie zamkniętym pudełku, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
         UWAGA: Celem jest szybkie stopienie końcówki, tak aby szkło zreformowało ostateczną geometrię końcówki, nie czyniąc jej zbyt ostrą. Zapobiega to przenikaniu pipety przez błonę pęcherzyka, do której jest dociskana, i skutecznie wspomaga tworzenie się uszczelnienia. Po ostatecznym polerowaniu wewnętrzna ścieżka końcówki pipety powinna być bardzo wąska, prosta i liniowa.
         Najlepsze pipety rejestrujące mają zazwyczaj rezystancję 5 - 8 MΩ po polerowaniu ogniowym. Średnica otworu końcówki powinna wynosić 2 μm. Idealnie wypolerowana pipeta punktowa jest niezbędna do udanego tworzenia gigaseal, ponieważ jest to jedna z kluczowych technik decydujących o powodzeniu zabiegu.

2. Przygotowanie próbki

1. Hodowla komórkowa (na przykładzie HEK293)
   1. Hodować komórki w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. Hodowla komórek HEK293 w DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U / ml penicyliny i 100 mg / ml streptomycyny.
   3. Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryte poli-L-lizyną w płytce 24-dołkowej.
2. Powiększanie organelli
   1. Dodać 1 μM vacuolin-1 do komórek HEK293 na płytce 24-dołkowej (od kroku 2.1) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez noc, aż zaczną tworzyć się powiększone pęcherzyki.
      UWAGA: Wielkość powiększonych endolizosomów może osiągnąć 1-10 μm, w zależności od narzędzia, związku, czasu inkubacji i typu komórki (Rysunek 3 i Tabela 2).
3. Przygotowanie roztworu
   UWAGA: Przygotowanie roztworu wzorcowego ma na celu symulację stężeń jonów wewnątrz komórki i organelli. Na przykład standardowe roztwory do pomiaru kanałów jonowych na lizosomach są następujące:
   1. Przygotować roztwór do kąpieli (w mM): 140 K-metanosulfonian (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Dostosuj osmolarność do 300 m²/l z glukozą.
   2. Przygotować roztwór pipet (w mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Dostosuj pH do 4,6 za pomocą MSA. Dostosuj osmolarność do 310 mosm/L z glukozą.
      UWAGA: Przepuścić roztwór przez filtr 0,2 μm, przygotować 45 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do 2-4 tygodni.

3. Izolacja organelli

1. Usunąć szkiełko nakrywkowe z leczonymi komórkami (patrz sekcja 2) z płytki 24-dołkowej, przenieść ją do komory mikroskopu i dodać 1 ml roztworu do kąpieli.
   UWAGA: Komórek nie wolno przechowywać w roztworze kąpieli przez >1 godzinę w przypadku eksperymentów z klamrą krosową całego endolizosomatu, które obejmują izolację, uszczelnianie i rejestrację endolizosomów. Po 1 godzinie powiększone endolizosomy skurczą się, przylgną do pipety i staną się trudne do wyizolowania.
2. Użyj domowej roboty plastikowej igły do napełniania, aby napełnić pipetę izolacyjną roztworem pipety i zainstaluj pipetę na przednim końcu zestawu zacisków krosowych.
3. Ustaw kąt ruchu po przekątnej mikromanipulatora na blisko 30° (domyślna wartość fabryczna).
4. Pod mikroskopem (obiektyw 40x i okular 10x) zbadaj komórki pod kątem wystarczająco powiększonych endosomów lub lizosomów znajdujących się w pobliżu krawędzi błony komórkowej w celu izolacji. Przesuń pipetę izolacyjną bliżej wybranej komórki.
5. Opuść pipetę izolacyjną za pomocą mikromanipulatora, aż dotknie krawędzi błony plazmatycznej (Rysunek 4). Szybko przesuń pipetę izolacyjną poziomo, aby oderwać mały kawałek błony plazmatycznej.
6. Za pomocą tej samej pipety dociśnij komórkę z przeciwnej strony, aby wycisnąć endosom/lizosomy na odległość ~2 μm od komórki.
   UWAGA: Jeśli na organellach znajdują się resztki błony komórkowej, może to zapobiec tworzeniu się gigaseal.
7. Zbadaj wyizolowany endolizosom pod mikroskopem.

4. Formacja Gigaseal

1. Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę z plastrem odpowiednim roztworem pipety i zainstaluj pipetę na przednim końcu amplifier.
2. Zastosuj nadciśnienie 20 - 50 mbar do pipety (lub użyj 0,03-0,05 ml ze strzykawki o pojemności 1 ml do kontroli ciśnienia) i utrzymuj to ciśnienie (zablokuj zawór).
   UWAGA: 1 mbar (milibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopaskal) = 1 hPa (hektopaskal) = 1,000 dyn/cm2.
3. Przesuwając końcówkę pipety do roztworu kąpieli, w środku pola widzenia, upewnij się, że ciśnienie jest wystarczająco wysokie, aby zobaczyć ciecz wpływającą do roztworu kąpieli.
4. Zastosuj powtarzające się impulsy prądowe (+5 mV; 5 ms), aby określić rezystancję pipety, rezystancję uszczelki i rezystancję szeregową. Monitoruj rozmiar końcówki pipety, formację uszczelnienia i ustalenie konfiguracji całego endolizosomatu.
5. Szybko przesuń pipetę w pobliże górnej części docelowego pęcherzyka. Zbliż pipetę do pęcherzyka, aż pęcherzyk zacznie się poruszać lub toczyć pod wpływem przepływu płynu z pipety (Rysunek 5).
6. Ustaw napięcie przesunięcia pipety na 0 mV. Natychmiast uwolnij nadciśnienie. Idealnie byłoby, gdyby pęcherzyk został przyciągnięty w kierunku pipety i połączył się z membraną, tworząc gigaseal (1-20 GΩ) w ciągu 1 s. Zwróć uwagę na spadek do <10 pA amplitudy prądu wywołanej impulsem napięcia 5 mV, co wskazuje na pomyślne utworzenie gigaseal.
   UWAGA: Stabilne nadciśnienie jest niezbędne do tworzenia gigaseal. Czasami nieszczelności w rurkach mogą zapobiec tworzeniu się gigaseal. Zaleca się użycie manometru, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Jeśli zostanie wykryty wyciek, ponownie przymocuj rurkę lub nałóż niewielką ilość wazeliny na szwy, aby poprawić uszczelnienie.

5. Pomiar prądu

1. Pęknięcie membrany
   UWAGA: W zależności od potrzeb eksperymentalnych, kontakt elektroda-membrana można podzielić na cztery tryby: tryb podłączony do komórki, tryb całego ogniwa, tryb na zewnątrz i tryb na zewnątrz (Rysunek 6).
   1. Do rejestracji całych pęcherzyków należy użyć krótkiego impulsu wysokiego napięcia (impulsu ZAP) o długości 200 μs lub 500 μs, aby przerwać membranę w miejscu styku pipety z organellą. Ustaw napięcie od -500 mV do -1 200 mV, zmniejszając się za każdym razem o 100 mV, aż do przerwania membrany.
   2. W trybie inside-out (nagrywanie jednokanałowe), po uformowaniu gigaseal, odciągnij pipetę od organelli, odrywając mały kawałek membrany, odsłaniając stronę, która pierwotnie była skierowana w stronę światła pęcherzyka.
   3. W trybie outside-out, po uformowaniu gigaseal i przejściu do trybu całego pęcherzyka, należy odciągnąć pipetę od organelli, odrywając niewielki kawałek błony, zachowując małą strukturę pęcherzykową.
2. Bieżące nagranie
   1. Rejestruj prąd przepływający przez błonę endolizosomalną, gdy napięcie wejściowe zmienia się w eksperymentach z endolizosomalnym zaciskiem napięciowym.
      1. Kontroluj te napięcia za pomocą kroków napięcia lub ramp napięcia; używaj szerokiego zakresu napięć wejściowych (np. od -100 mV do +100 mV) w endolizosomalnych eksperymentach z cęgami napięcia.

Results

Poniżej opisano obecne kształty obserwowane podczas eksperymentów z endolizosomalnymi klamrami. Jeśli obecny kształt nie jest zgodny z oczekiwaniami, może to być spowodowane słabym kontaktem lub wyciekiem. Słaby kontakt może wystąpić, jeśli elektroda referencyjna nie styka się w pełni z roztworem do kąpieli lub jeśli elektroda pipety jest bliska pęknięcia. Nieszczelność może wystąpić, jeśli między komorą a szkiełkiem nakrywkowym znajduje się szczelina umożliwiająca przepływ płynu na soczewkę obiektywu lub stolik; Zbyt du...

Discussion

Elektrofizjologiczne układy eksperymentalne mają cztery główne wymagania laboratoryjne: i) środowisko: metody utrzymania próbki w dobrym stanie; ii) optyka: metody wizualizacji próbki; iii) mechanika: metody stabilnego pozycjonowania mikroelektrody; oraz iv) elektronika: metody wzmacniania i nagrywania sygnału.

Aby skutecznie przeprowadzić eksperymenty z endolizosomalnymi patch-clampami, kluczowe jest kilka kluczowych kroków. Po pierwsze, stan komórek - komórki muszą być ściśle przylegające do...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
INSTRUMENT SUTTER	SZKŁA BOROKRZEMIANOWEGO	BF150-75-10	OD: 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm o długości 10 cm, z żarnikiem
Digidata 1140A	Axon Instruments
Mikroskop odwrócony IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 ściągacz do mikropipet	INSTRUMENT
MPC-200	PRZYRZĄD
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Komora szybkiego zwalniania	Instrumenty Warner	641943	QR-40LP, do szkiełek nakrywkowych 25 mm