Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Kanały jonowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych. Podczas gdy powierzchniowe kanały jonowe cieszą się dużym zainteresowaniem, stopniowo uznaje się znaczenie kanałów wewnątrzkomórkowych, szczególnie tych w endolizosomach. Układ endolizosomalny składa się z wielofunkcyjnych, związanych z błoną organelli wyspecjalizowanych w podstawowych funkcjach komórkowych, w tym endosomów recyklingowych (RE), wczesnych endosomów (EE), późnych endosomów (LE), lizosomów (LY) i organelli hybrydowych o cechach zarówno endolizosomalnych, jak i innych cechach przedziałów, takich jak fagosomy i autofagosomy.

EE, znane również jako endosomy sortujące (SE), są jednym z wcześniejszych miejsc docelowych dla materiałów internalizowanych z błony plazmatycznej (PM). EE są krytycznymi kompartmentami odpowiedzialnymi za sortowanie ładunku na różne szlaki endocytarne, takie jak ścieżka dojrzewania do LE/LY w celu degradacji, szybka ścieżka recyklingu z powrotem do PM oraz ścieżka powolnego recyklingu obejmująca komorę recyklingu lub peryferyjną RE. Ciała wielopęcherzykowe (MVB) pochodzące z endosomów to kuliste przedziały otoczone błoną ograniczającą, która może być wypełniona pęcherzykami śródświetlnymi (ILV)¹. Aby utrzymać normalne funkcjonowanie tych organelli, wymagają one błonowych kanałów jonowych do regulacji pęcherzykowego pH, osmolarności i transdukcji sygnału. Jednak mierzenie aktywności tych kanałów nie jest proste.

Dla kanałów jonowych zlokalizowanych na błonie plazmatycznej, technika patch-clamp opracowana w latach siedemdziesiątych od dawna jest złotym standardem². Jednak dostęp do kanałów elektrofizjologicznych w małych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych pozostał wyzwaniem. Zastosowanie złotego standardu pomiaru kanałów jonowych na błonie komórkowej do kanałów na organellach wewnątrzkomórkowych wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, rozmiar endolizosomów jest zazwyczaj bardzo mały (średnica mniejsza niż 1 μm), co utrudnia ich obserwację i izolację pod mikroskopem i jest mniejszy niż średnica otworu typowych mikropipet szklanych, co sprawia, że eksperyment jest nieoperacyjny. Po drugie, izolowanie endolizosomów bezpośrednio z komórek docelowych przy zachowaniu integralności organelli wymaga specjalnych umiejętności. Po trzecie, ze względu na brak cytoszkieletu w organellach wewnątrzkomórkowych, utworzenie uszczelnienia na błonie endolizosomalnej w pipecie łatowej, a następnie jej pęknięcie w celu uzyskania konfiguracji całego endolizosomu może być trudne, ponieważ narusza integralność strukturalną organelli³.

Opracowano kilka metod przezwyciężenia tych problemów, w tym zapis dwuwarstwowy lipidów, modyfikację lizosomalnych sekwencji docelowych oraz techniki elektrofizjologii opartej na membranach (SSM lub SSME) oparte na solidnych włóknach. Metoda zapisu dwuwarstwowego lipidów polega na rekonstrukcji syntetycznych błon fosfolipidowych z oczyszczonymi kanałami jonowymi, umożliwiając szczegółowe badanie elektrofizjologiczne funkcji białek błonowych w kontrolowanych warunkach^4,5. Modyfikacja lizosomalnych sekwencji docelowych na kanałach jonowych polega na przekierowaniu endolizosomalnych kanałów jonowych do błony plazmatycznej w celu pomiaru przy użyciu konwencjonalnych metod patch-clamp⁶. Techniki elektrofizjologii opartej na membranach opartych na ciałach stałych (SSM lub SSME), znane również jako metoda endolizosomalnego płaskiego zacisku krosowego, wykorzystują płaskie wióry szklane o stałym podłożu z małymi otworami (<1 μm średnicy) w mikrostrukturalnych płaskich wiórach borokrzemianowych. Te szklane chipy o małej aperturze pozwalają na analizę małych, nawet natywnych endolizosomów za pomocą systemu kontroli ciśnienia i ssania (Nanion). Jednak w pierwszych dwóch metodach kanały jonowe nie znajdują się w swoim naturalnym środowisku fizjologicznym. Próby zarejestrowania kanałów lizosomalnych ulegających ekspresji na błonie plazmatycznej lub odtworzonych w dwuwarstwy lipidowe w dużej mierze przyniosły niepewne i sprzeczne wyniki.

Chociaż techniki płaskiego zacisku punktowego skutecznie rozwiązały problem sztucznej interferencji i oferują przewagę w postaci pomiarów o wysokiej przepustowości, stosowane rozwiązania są również ograniczone przez tę metodę. Przedstawiona w tym artykule technika endolizosomalnego patch-clamp może jednocześnie rejestrować wiele komórek i łatwo łączyć się z innymi metodami pomiaru. Obsługa ręczna ma tę zaletę, że umożliwia wizualizację docelowych pęcherzyków. Przezwycięża również nieuniknione ograniczenie Ca²⁺ w roztworze po jednej stronie błony endolizosomalnej, zwiększając swobodę projektowania eksperymentalnego³. Ostatnio techniki endolizosomalnej klamki punktowej odegrały kluczową rolę w badaniach nad opracowywaniem leków. Na przykład w chorobach neurodegeneracyjnych technika ta pomogła zidentyfikować nowe leki ukierunkowane na endolizosomalne kanały jonowe związane z chorobami Alzheimera i Parkinsona^7,8. Naukowcy mogą również wykorzystać tę technikę do zbadania roli endolizosomalnych kanałów jonowych w komórkach nowotworowych⁹, kontrolując w ten sposób wzrost i proliferację guza. Jeśli chodzi o choroby metaboliczne, badania endolizosomalne typu patch-clamp ujawniają związki, które regulują endolizosomalne kanały jonowe, oferując nowe podejścia do leczenia cukrzycy i otyłości. Technika endolizosomalnej klamry pomaga w zrozumieniu dysfunkcji endolizosomalnej i znalezieniu potencjalnych terapii⁶, znacznie poszerzając naszą wiedzę na temat funkcji endolizosomalnych kanałów jonowych i promując odkrywanie nowych celów leków.

1. Konfiguracja instrumentu

1. Sprzęt
   UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla standardowej konfiguracji stanowiska do elektrofizjologii.
   1. Chroń zestaw przed zakłóceniami zewnętrznymi za pomocą stołu i klatki Faradaya.
   2. Użyj odwróconego mikroskopu z mikromanipulatorem, aby stabilnie ustawić mikroelektrodę.
   3. Skonfiguruj wzmacniacz, aby zbierać i wzmacniać pozyskane sygnały.
   4. Użyj digitizera, aby przekonwertować sygnały analogowe na sygnały cyfrowe.
   5. Korzystaj z oprogramowania do akwizycji i analizy danych, aby tworzyć protokoły eksperymentalne i wyodrębniać znaczące, możliwe do przeanalizowania wyniki z zebranych danych.
2. Elektrody
   1. Stosować dwie elektrody: elektrodę do kąpieli i elektrodę do pipet.
      UWAGA: Platyna i chlorek srebra mają najlepsze właściwości polaryzacyjne. Elektrody chlorku srebra składają się z drutu lub granulek srebra, które zostały zchlorkowane, dzięki czemu mają warstwę AgCl na zewnętrznej powierzchni drutu lub granulki (Rysunek 2).
3. Przygotowanie pipet
   1. Ciągnąc
      1. Zamontuj rurkę kapilarną w ściągaczu.
         UWAGA: Poniższe parametry używane do produkcji pipet są specyficzne dla danego urządzenia. Instrument, którego użyliśmy w tym artykule, jest wymieniony w Tabeli materiałów.
      2. W warunkach eksperymentalnych (temperatura pokojowa 22 °C, żarnik grzałki w kształcie przelotowym, szkło borokrzemianowe z żarnikiem), które nie powodują wypalenia żarnika grzałki, należy przeprowadzić test RAMP na ściągaczu w celu określenia wartości ciepła (HEAT) wymaganej do stopienia szklanej kapilary.
      3. Zaprojektuj nowy program ciągnięcia z sześcioma oddzielnymi cyklami ciągnięcia, korzystając z parametrów HEAT, prędkości (VEL) i czasu (TIME) (Tabela 1).
         UWAGA: CIEPŁO odnosi się do parametru, który podgrzewa żarnik grzałki, umożliwiając stopienie żarnika szklanego. Prędkość wskazuje prędkość, z jaką ściągacz ciągnie filament w obu kierunkach. Czas reprezentuje czas trwania interwału między każdym cyklem.
      4. Naciśnij zielony przycisk Pull na klawiaturze.
      5. Poluzuj clamppokrętło i wyjmij pipety ze ściągacza.
      6. Sprawdź końcówki pipet pod okularem mikrokuźni, aby określić średnicę, ostrość i geometrię końcówki. Upewnij się, że średnica końcówki wynosi 0,5-0,9 μm,
         UWAGA: Ponieważ żarnik jest używany częściej, wartość ciepła wymagana do stopienia szklanej kapilary będzie się zmieniać.
      7. Jeśli rozmiar końcówki nie spełnia oczekiwań, dostosuj parametry HEAT i VEL. Wyższe temperatury i większe prędkości spowodują uzyskanie drobniejszych, dłuższych końcówek i odwrotnie. Dostosuj HEAT w krokach co 5 stopni, a prędkość w krokach co 3.
   2. polerowanie
      1. Umieść wyciągnięte pipety z plastrami w uchwycie microforge
      .
      2. Sprawdź końcówki pipet za pomocą soczewki obiektywowej 35x (w połączeniu z okularem 15x, co daje powiększenie 525x).
      3. Użyj mikromanipulatora, aby zbliżyć pipety z plastrem do filamentu.
      4. Ustaw pokrętło temperatury na 80.
      5. Za pomocą przełącznika nożnego włącz grzałkę i zastosuj krótki impuls cieplny (1 - 2 s), monitorując proces polerowania przez okular microforge.
      6. Powtarzaj proces, aż wszystkie pipety zostaną wypolerowane.
      7. Umieść gotowe pipety w szczelnie zamkniętym pudełku, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu.
         UWAGA: Celem jest szybkie stopienie końcówki, tak aby szkło zreformowało ostateczną geometrię końcówki, nie czyniąc jej zbyt ostrą. Zapobiega to przenikaniu pipety przez błonę pęcherzyka, do której jest dociskana, i skutecznie wspomaga tworzenie się uszczelnienia. Po ostatecznym polerowaniu wewnętrzna ścieżka końcówki pipety powinna być bardzo wąska, prosta i liniowa.
         Najlepsze pipety rejestrujące mają zazwyczaj rezystancję 5 - 8 MΩ po polerowaniu ogniowym. Średnica otworu końcówki powinna wynosić 2 μm. Idealnie wypolerowana pipeta punktowa jest niezbędna do udanego tworzenia gigaseal, ponieważ jest to jedna z kluczowych technik decydujących o powodzeniu zabiegu.

2. Przygotowanie próbki

1. Hodowla komórkowa (na przykładzie HEK293)
   1. Hodować komórki w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. Hodowla komórek HEK293 w DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U / ml penicyliny i 100 mg / ml streptomycyny.
   3. Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryte poli-L-lizyną w płytce 24-dołkowej.
2. Powiększanie organelli
   1. Dodać 1 μM vacuolin-1 do komórek HEK293 na płytce 24-dołkowej (od kroku 2.1) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez noc, aż zaczną tworzyć się powiększone pęcherzyki.
      UWAGA: Wielkość powiększonych endolizosomów może osiągnąć 1-10 μm, w zależności od narzędzia, związku, czasu inkubacji i typu komórki (Rysunek 3 i Tabela 2).
3. Przygotowanie roztworu
   UWAGA: Przygotowanie roztworu wzorcowego ma na celu symulację stężeń jonów wewnątrz komórki i organelli. Na przykład standardowe roztwory do pomiaru kanałów jonowych na lizosomach są następujące:
   1. Przygotować roztwór do kąpieli (w mM): 140 K-metanosulfonian (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Dostosuj osmolarność do 300 m²/l z glukozą.
   2. Przygotować roztwór pipet (w mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Dostosuj pH do 4,6 za pomocą MSA. Dostosuj osmolarność do 310 mosm/L z glukozą.
      UWAGA: Przepuścić roztwór przez filtr 0,2 μm, przygotować 45 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do 2-4 tygodni.

3. Izolacja organelli

1. Usunąć szkiełko nakrywkowe z leczonymi komórkami (patrz sekcja 2) z płytki 24-dołkowej, przenieść ją do komory mikroskopu i dodać 1 ml roztworu do kąpieli.
   UWAGA: Komórek nie wolno przechowywać w roztworze kąpieli przez >1 godzinę w przypadku eksperymentów z klamrą krosową całego endolizosomatu, które obejmują izolację, uszczelnianie i rejestrację endolizosomów. Po 1 godzinie powiększone endolizosomy skurczą się, przylgną do pipety i staną się trudne do wyizolowania.
2. Użyj domowej roboty plastikowej igły do napełniania, aby napełnić pipetę izolacyjną roztworem pipety i zainstaluj pipetę na przednim końcu zestawu zacisków krosowych.
3. Ustaw kąt ruchu po przekątnej mikromanipulatora na blisko 30° (domyślna wartość fabryczna).
4. Pod mikroskopem (obiektyw 40x i okular 10x) zbadaj komórki pod kątem wystarczająco powiększonych endosomów lub lizosomów znajdujących się w pobliżu krawędzi błony komórkowej w celu izolacji. Przesuń pipetę izolacyjną bliżej wybranej komórki.
5. Opuść pipetę izolacyjną za pomocą mikromanipulatora, aż dotknie krawędzi błony plazmatycznej (Rysunek 4). Szybko przesuń pipetę izolacyjną poziomo, aby oderwać mały kawałek błony plazmatycznej.
6. Za pomocą tej samej pipety dociśnij komórkę z przeciwnej strony, aby wycisnąć endosom/lizosomy na odległość ~2 μm od komórki.
   UWAGA: Jeśli na organellach znajdują się resztki błony komórkowej, może to zapobiec tworzeniu się gigaseal.
7. Zbadaj wyizolowany endolizosom pod mikroskopem.

4. Formacja Gigaseal

1. Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę z plastrem odpowiednim roztworem pipety i zainstaluj pipetę na przednim końcu amplifier.
2. Zastosuj nadciśnienie 20 - 50 mbar do pipety (lub użyj 0,03-0,05 ml ze strzykawki o pojemności 1 ml do kontroli ciśnienia) i utrzymuj to ciśnienie (zablokuj zawór).
   UWAGA: 1 mbar (milibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopaskal) = 1 hPa (hektopaskal) = 1,000 dyn/cm2.
3. Przesuwając końcówkę pipety do roztworu kąpieli, w środku pola widzenia, upewnij się, że ciśnienie jest wystarczająco wysokie, aby zobaczyć ciecz wpływającą do roztworu kąpieli.
4. Zastosuj powtarzające się impulsy prądowe (+5 mV; 5 ms), aby określić rezystancję pipety, rezystancję uszczelki i rezystancję szeregową. Monitoruj rozmiar końcówki pipety, formację uszczelnienia i ustalenie konfiguracji całego endolizosomatu.
5. Szybko przesuń pipetę w pobliże górnej części docelowego pęcherzyka. Zbliż pipetę do pęcherzyka, aż pęcherzyk zacznie się poruszać lub toczyć pod wpływem przepływu płynu z pipety (Rysunek 5).
6. Ustaw napięcie przesunięcia pipety na 0 mV. Natychmiast uwolnij nadciśnienie. Idealnie byłoby, gdyby pęcherzyk został przyciągnięty w kierunku pipety i połączył się z membraną, tworząc gigaseal (1-20 GΩ) w ciągu 1 s. Zwróć uwagę na spadek do <10 pA amplitudy prądu wywołanej impulsem napięcia 5 mV, co wskazuje na pomyślne utworzenie gigaseal.
   UWAGA: Stabilne nadciśnienie jest niezbędne do tworzenia gigaseal. Czasami nieszczelności w rurkach mogą zapobiec tworzeniu się gigaseal. Zaleca się użycie manometru, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Jeśli zostanie wykryty wyciek, ponownie przymocuj rurkę lub nałóż niewielką ilość wazeliny na szwy, aby poprawić uszczelnienie.

5. Pomiar prądu

1. Pęknięcie membrany
   UWAGA: W zależności od potrzeb eksperymentalnych, kontakt elektroda-membrana można podzielić na cztery tryby: tryb podłączony do komórki, tryb całego ogniwa, tryb na zewnątrz i tryb na zewnątrz (Rysunek 6).
   1. Do rejestracji całych pęcherzyków należy użyć krótkiego impulsu wysokiego napięcia (impulsu ZAP) o długości 200 μs lub 500 μs, aby przerwać membranę w miejscu styku pipety z organellą. Ustaw napięcie od -500 mV do -1 200 mV, zmniejszając się za każdym razem o 100 mV, aż do przerwania membrany.
   2. W trybie inside-out (nagrywanie jednokanałowe), po uformowaniu gigaseal, odciągnij pipetę od organelli, odrywając mały kawałek membrany, odsłaniając stronę, która pierwotnie była skierowana w stronę światła pęcherzyka.
   3. W trybie outside-out, po uformowaniu gigaseal i przejściu do trybu całego pęcherzyka, należy odciągnąć pipetę od organelli, odrywając niewielki kawałek błony, zachowując małą strukturę pęcherzykową.
2. Bieżące nagranie
   1. Rejestruj prąd przepływający przez błonę endolizosomalną, gdy napięcie wejściowe zmienia się w eksperymentach z endolizosomalnym zaciskiem napięciowym.
      1. Kontroluj te napięcia za pomocą kroków napięcia lub ramp napięcia; używaj szerokiego zakresu napięć wejściowych (np. od -100 mV do +100 mV) w endolizosomalnych eksperymentach z cęgami napięcia.

Poniżej opisano obecne kształty obserwowane podczas eksperymentów z endolizosomalnymi klamrami. Jeśli obecny kształt nie jest zgodny z oczekiwaniami, może to być spowodowane słabym kontaktem lub wyciekiem. Słaby kontakt może wystąpić, jeśli elektroda referencyjna nie styka się w pełni z roztworem do kąpieli lub jeśli elektroda pipety jest bliska pęknięcia. Nieszczelność może wystąpić, jeśli między komorą a szkiełkiem nakrywkowym znajduje się szczelina umożliwiająca przepływ płynu na soczewkę obiektywu lub stolik; Zbyt duża lub zbyt mała ilość roztworu do pipet może również powodować takie nieprawidłowości.

Wprowadzenie igły do roztworu/kontakt igły z powierzchnią komórki/ZAP
Podczas ustanawiania trybu przyłączania lizosomów (tworzenie gigaseal) odpowiedź prądowa gwałtownie spada. Rezystancję uszczelnienia można określić, dzieląc napięcie sterujące przez niską ilość pozostałego prądu (Rysunek 7).

rampa/przeciek<br /> Wielokrotne stosowanie ciągłego napięcia wejściowego w zakresie od -100 mV do +100 mV może rejestrować prąd przepływający przez błonę endolizosomalną w czasie (Rysunek 8). Stosując standardowe roztwory, skład jonowy wewnątrz i na zewnątrz organelli różni się. Jeśli kanał wykazuje selektywność, punkt przecięcia krzywej prąd-napięcie nie będzie wynosił zero ze względu na różną przepuszczalność jonów wpływających i wychodzących. Ten punkt przecięcia jest określany jako potencjał odwrotny kanału i można go obliczyć za pomocą następującego wzoru10:

Gdzie dv: jony dwuwartościowe; mv: jony jednowartościowe; i: wewnętrzny; o: zewnętrzny; P: przepuszczalność membrany dla jonu S mierzona w m·s−1; V: potencjał transbłonowy w woltach; F: stała Faradaya, równa 96 485 C·mol−1 lub J·V−1·mol−1; R: stała gazowa, równa 8,314 J·K−1·mol−1; T: temperatura bezwzględna mierzona w kelwinach (= °C + 273,15).

Mogą istnieć pasywne składowe prądu związane z przewodnictwem upływowym i specyficznymi kanałami jonowymi w endolizosomach. Prąd upływowy charakteryzuje się liniową zależnością prądu (I) od napięcia (V), z przecięciem w punkcie początkowym. Prądy upływowe z endolizosomów wyizolowanych z nietransfekowanych komórek HEK293 są mniejsze niż 50 pA przy 100 mV; Leżące poniżej kanały jonowe to prawdopodobnie kanały przewodnictwa potasu/sodu i kanały chlorkowe.

W przypadku kanałów jonowych aktywowanych napięciem, składowe prądu upływowego w mierzonym prądzie mogą być odejmowane poprzez rejestrację serii skalowanych impulsów napięcia przed lub po stymulujących prądach endolizosomalnych bramkowanych napięciem. Wyciek można również odjąć w trybie offline. Amplituda tych skalowanych impulsów wynosi zazwyczaj jedną czwartą lub jedną piątą eksperymentalnej amplitudy impulsu, proces znany jako odejmowanie przecieków P/4 lub P/511. Ze względu na bardzo małą wielkość prądów upływowych, odejmowanie P/4 lub P/5 nie jest zwykle stosowane.

Napięcie cęgowe
Wielokrotne stosowanie skokowych skoków napięcia wejściowego może rejestrować prąd przepływający przez błonę endolizosomalną wraz ze zmianami napięcia. Pomaga to w ustaleniu, czy kanał jest kanałem jonowym bramkowanym napięciem12. Oprócz cęgów napięciowych możliwe jest również cęgi prądowe. Aktywność jednokanałowa może być rejestrowana przy użyciu dostępnych konfiguracji w trybie cęgów napięciowych12. Zazwyczaj niska gęstość endolizosomalnych kanałów jonowych może utrudniać proces uzyskiwania plastrów zawierających pojedynczy kanał. Grubościenne szkło do pipet jest najlepszym materiałem do produkcji elektrod z małymi końcówkami do pipet i niską pojemnością. Pokrycie szkła preparatem Sylgard lub woskiem może zmniejszyć pojemność pipety.

Rysunek 1: Przegląd etapów endolizosomalnej klamry. Protokół oceny aktywności kanałów jonowych w pęcherzykach wewnątrzkomórkowych za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp można nakreślić na schemacie blokowym z następującymi kluczowymi krokami: (1) Przygotowanie roztworu: Zbierz wszystkie wymagane roztwory chemiczne. (2) Przygotowanie komórek: Wyhoduj i przygotuj komórki do ekstrakcji endolizosomalnej. (3) Produkcja pipet: Utwórz i wypoleruj pipetę z zaciskiem krosowym, aby zapewnić precyzyjną obsługę. (4) Izolacja endolizosomów: Ręcznie oddziel endolizosomy od hodowanych komórek. (5) Łatanie pęcherzyków: Przymocuj pipetę do pojedynczego pęcherzyka endolizosomalnego. (6) Akwizycja sygnału: Przechwytywanie i wzmacnianie sygnałów elektrycznych z pęcherzyka. (7) Digitalizacja sygnałów: Przekształć sygnały analogowe w postać cyfrową w celu analizy. (8) Gromadzenie i analiza danych: Zbierz dane i zinterpretuj je w celu zbadania funkcji kanału jonowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja sprzętu elektrofizjologicznego. Podczas pomiarów dwuelektrodowych elektroda pomiarowa styka się z membraną docelową, podczas gdy elektroda referencyjna jest umieszczana w roztworze kąpieli. Różnica potencjałów między nimi jest wzmacniana przez wzmacniacz, digitalizowana przez digitizer, a następnie przechwytywana przez komputer. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Narzędzia farmakologiczne używane do analizy endolizosomalnej klamry. Schemat przedstawiający zakresy aktywności różnych środków farmakologicznych do patch-clamp. Połączenie Wortmanniny i Latrunkuliny B jest wysoce specyficzne dla wczesnych endosomów, z wyłączeniem endosomów recyklingowych. YM201636 selektywnie powiększa późne endosomy/lizosomy. Wakuolina powiększa wczesne endosomy, endosomy recyklingowe, a także późne endosomy/lizosomy13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Izolacja powiększonych organelli. Schematyczna ilustracja procesu ręcznej izolacji docelowego pęcherzyka od komórki. Kroki są następujące: (1) Przygotowanie szkiełka nakrywkowego: Komórkę docelową zawierającą pęcherzyk docelowy umieszcza się na szkiełku nakrywkowym. (2) Rozciąć błonę plazmatyczną: Błonę plazmatyczną komórki docelowej przecina się za pomocą pipety izolacyjnej. (3) Pipeta izolacyjna: Pipeta izolacyjna jest umieszczona tak, aby celować w pęcherzyk. (4) Wyciśnij pęcherzyk docelowy na zewnątrz komórki: Pęcherzyk docelowy jest ostrożnie wyciskany na zewnątrz komórki za pomocą pipety izolacyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zalecana względna pozycja między pipetą a pęcherzykiem do tworzenia gigaseal. Po zastosowaniu nadciśnienia podejdź do organelli od góry za pomocą pipety łatkowej. Umieść końcówkę około jednej trzeciej odległości od góry organelli i powoli (tryb 3-6) opuść pipetę z plastrem, aż dodatnie ciśnienie spowoduje ruch błony organelli. Pod mikroskopem organelle muszą się zwinąć lub zostać odepchnięte od końcówki. W tym momencie zwolnij nadciśnienie i poczekaj, aż utworzy się gigaseal. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Rodzaje konfiguracji. W zależności od metody kontaktu pipety z organellą istnieją cztery różne tryby pomiaru: organelle lub pęcherzyki, całe pęcherzyki, lewa strona i zewnętrzna strona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Prądy do obliczania rezystancji pipety, rezystancji zgrzewu, rezystancji szeregowej i pojemności ogniwa. Pipeta rejestrująca jest umieszczona w roztworze kąpieli, a prostokątny impuls napięcia (czas trwania 5 ms, 5 mV) wytwarza prawie prostokątną odpowiedź prądową. Rezystancję pipety można określić, dzieląc przyłożone napięcie przez zmierzony prąd. Ponieważ gigaseal powstaje w trybie przyłączania lizosomów, odpowiedź prądowa szybko maleje. Rezystancję uszczelnienia można obliczyć, dzieląc napięcie przez pozostały, bardzo mały prąd. Po zastosowaniu impulsu ZAP membrana szybko pęka, co prowadzi do wzrostu prądów pojemnościowych, sygnalizując przejście do konfiguracji całościowej endolizosomalnej. W przypadku endolizosomu sferycznego wynikowy prąd podąża za pojedynczą funkcją wykładniczą czasu. Rezystancja szeregowa jest określana przez podzielenie amplitudy prądu pojemnościowego przez napięcie sterujące, a pojemność endolizosomu oblicza się, dzieląc stałą czasową prądów pojemnościowych przez rezystancję szeregową12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Prądy obserwowane podczas nagrywania rampy (np. TPC2). Jest to wykres zależności prąd-napięcie (I-V), przy czym oś X reprezentuje napięcie w zakresie od -100 do +100 mV, a oś Y wskazuje prąd generowany przy różnych napięciach. Wykres wykorzystuje pomiary z kanału TPC2 jako przykład. linia pokazuje wyniki uzyskane bezpośrednio po zastosowaniu impulsu ZAP, czerwona linia reprezentuje prąd generowany, gdy kanał TPC2 jest aktywowany przez agonistę TPC2-A1N, a zielona linia oznacza prąd upływowy, który może wynikać z niepełnego uszczelnienia. Udany pomiar można określić nie tylko na podstawie uchwycenia kształtu kanału, ale także na podstawie braku prądów upływowych. Jeśli obecne są prądy upływowe, przecięcie prądu i osi X będzie miało wartość 0, tworząc linię prostą (z różnymi jonami wewnątrz i na zewnątrz membrany). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Protokół pobierania pipet z łatką. Najpierw użyj funkcji rampy, aby znaleźć odpowiednią temperaturę OGRZEWANIA, a następnie postępuj zgodnie z tabelą, aby dostosować sześć cykli ciągnięcia.

Tabela 2: Stężenie i czas trwania leczenia wymagane do powiększenia endolizosomów w różnych typach komórek za pomocą środków farmakologicznych. Różne typy komórek wykazują istotne różnice w skuteczności powiększania się w leczeniu farmakologicznym. Ogólnie rzecz biorąc, komórki z bardziej aktywnym układem endolizosomalnym wymagają krótszego czasu leczenia. Jednak optymalny czas leczenia i stężenie nadal muszą zostać określone eksperymentalnie13.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.