Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Komórki są stale narażone na działanie sił mechanicznych w sytuacjach fizjologicznych i patologicznych, w tym na różne naprężenia rozciągające i ściskające. Prowadzone są bardzo aktywne badania nad tym, w jaki sposób komórki i tkanki reagują i przystosowują się do takich stresów oraz jak te reakcje integrują się z sygnalizacją mechanochemiczną. Spowodowało to zapotrzebowanie na zaawansowane narzędzia kompatybilne ze standardowymi protokołami hodowli komórkowych i metodami mikroskopowymi, odtwarzające stresy fizjologiczne w badaniach in vitro. W pracy przedstawiono konstrukcję, działanie i charakterystykę urządzenia do rozciągania kompatybilnego z mikroskopią optyczną i fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości. Opracowano i zastosowano w terenie liczne urządzenia do rozciągania, zarówno pneumatyczne, jak i silnikowe. Przedstawiamy szczegółowo jeden z tych systemów, w tym wytyczne projektowe, różnorodne aplikacje i wszystkie narzędzia do wytworzenia podobnej konfiguracji. System oparty jest na odkształcalnej membranie polidimetylosiloksanu (PDMS), rozciąganej równoosiowo po zastosowaniu próżni, co zapewnia jednorodny, powtarzalny i kontrolowany szczep próbki. Zapewnia różnorodne naprężenia rozciągające, od punktowego i natychmiastowego rozciągania po powtarzające się cykle rozciągania i zwalniania o kontrolowanej amplitudzie i częstotliwości. Powlekanie podłoża białkami adhezyjnymi umożliwia wysiewanie komórek z fluorescencyjnymi reporterami w urządzeniu rozciągającym i wykonywanie obrazowania na żywo tych komórek po rozciągnięciu za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych o dużym powiększeniu. Naprężenia ściskające można również zastosować, pozwalając próbce dostosować się do rozciągania, a następnie zwalniając ją lub umieszczając próbkę na wstępnie rozciągniętym podłożu przed zwolnieniem rozciągliwym. Dodatkowe wzorce topograficzne podłoża PDMS umożliwiają obrazowanie tej samej próbki w różnych trybach mikroskopii (takich jak mikroskopia fluorescencyjna i elektronowa). Żele poliakrylamidowe mogą być również przyłączane do membrany PDMS, co powoduje rozciąganie komórek wysianych na podłożach o różnej sztywności. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki zastosowaniu kontrolowanych naprężeń rozciągających na żywych próbkach, to urządzenie rozciągające, w połączeniu z wysokiej jakości mikroskopią fluorescencyjną, może odpowiedzieć na wiele różnych pytań z zakresu mechanobiologii.

Wprowadzenie

Cienkie, odkształcalne membrany polidimetylosiloksanu (PDMS) są szeroko stosowane w różnych niestandardowych urządzeniach do rozciągania ^1,2,3, ponieważ PDMS jest dobrze znanym biokompatybilnym materiałem obojętnym kompatybilnym kompatybilnym z obrazowaniem mikroskopowym. Tutaj, podobnie jak w wielu innych 4,5,6,7,8,9, prosta koncepcja zastosowania próżni jest wykorzystywana do odkształcenia membrany w celu zmontowania solidnego i kontrolowanego urządzenia do rozciągania równoosiowego. Poprzez zaciśnięcie membrany wewnątrz okrągłego pierścienia i uszczelnienie pierścienia na "słupku rozciągającym" (rysunek 1A-C), uzyskuje się równomierne i izotropowe odkształcenie. Próbka biologiczna znajduje się w środku pierścienia na wolnostojącej membranie PDMS, co umożliwia obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W tym miejscu zaprezentowane są dwie niestandardowe konfiguracje, kompatybilne z dwoma modelami stolików mikroskopowych (ryc. 1D-F) i bardzo wszechstronne pod względem zastosowań biologicznych. Chociaż ogólny projekt jest prosty i można go przenieść na inne etapy, wymiary zestawu muszą być starannie dobrane, aby pasowały do wymagań obrazowania. Po osiągnięciu tego poziomu, profil odkształcenia urządzenia musi zostać scharakteryzowany i zwalidowany.

Oprócz samej konfiguracji przedstawiono prostą metodę wraz z kodem Matlab do charakteryzowania wielkości odkształcenia, jednorodności i izotropii. Urządzenie rozciągające może być następnie wykorzystane do przyłożenia równoosiowych naprężeń rozciągających do układów syntetycznych¹⁰, pojedynczych komórek^11,12 lub monowarstw¹³, jednocześnie rejestrując z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną odpowiedź biologiczną próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Błona może być pokryta różnymi białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej^14,15. Dodatkowe funkcje mogą być dodawane zgodnie z potrzebami badania biologicznego. Na przykład żele poliakrylamidowe mogą być wiązane z membraną PDMS w celu dostrojenia sztywności podłoża podczas rozciągania^13,16, a membrany PDMS mogą być wytwarzane z siatką referencyjną o numerze do późniejszego obrazowania tego samego obszaru zainteresowania w próbce¹². Utrwalone próbki można również przetworzyć przez barwienie immunologiczne, a następnie ponownie rozciągnąć w celu obrazowania fluorescencyjnego¹⁷. Zastosowany wzór rozciągania może być kontrolowany, od pojedynczego natychmiastowego impulsu rozciągania do cyklicznego odkształcenia o różnych wielkościach, częstotliwościach lub kształtach^14,16.

Protokół

1. Projektowanie sceny i słupka rozciągającego (rysunek 1)

1. Zaprojektuj słupek rozciągliwy zgodny wymiarami z rozmiarem stolika/uchwytami i konfiguracją obiektywu. Dwa konkretne słupki rozciągające są pokazane na rysunku 1A,D.
   UWAGA: Pliki FreeCAD zawarte w tym protokole (Folder Uzupełniający 1) są kompatybilne z następującymi mikroskopami i stolikami firmy Nikon: Eclipse Ni-E pionowy wyposażony w stolik NI-SH-E i Eclipse Ti-E/B odwrócony wyposażony w stolik TI-S-ER, Rysunek 1D. Słupek może być drukowany trójwymiarowo (3D), ale może się odkształcać po wielokrotnym użyciu; Słupki na bazie aluminium nie będą cierpieć z powodu tej wady. Upewnij się, że anodujesz słupki na bazie aluminium, aby zapobiec utlenianiu. Pionowa konfiguracja pozwala na większą amplitudę ruchu. Ponadto konfiguracja pionowa zapewnia bezpośrednie obrazowanie próbki bez interfejsu, co jest optycznie korzystne w przypadku odkształcalnego podłoża membranowego PDMS. Zamiast tego, w konfiguracji odwróconej, wiązka oświetlenia przechodzi przez membranę PDMS (rysunek 1F); ponieważ po rozciągnięciu membrana PDMS będzie się poruszać, media zanurzeniowe do obiektywu powinny być starannie dobrane (zalecane rodzaje zanurzenia w wodzie, powietrze lub glicerol; zanurzenie w oleju nie jest zalecane ze względu na niekompatybilność z podłożami PDMS). Uchwyty komercyjne można modyfikować za pomocą dodatkowych otworów na; uważaj na używanie plastikowej lub teflonowej, aby uniknąć kurzu podczas wkręcania. Wygodne może być zaprojektowanie uchwytu, który umożliwia zamontowanie słupka do rozciągania na górze stolika, jak pokazano na rysunku 1E. Plik FreeCAD dostarczony w tym protokole jest kompatybilny ze stolikiem mikroskopu pionowego Eclipse Ni-E.
2. Zaprojektuj pierścienie rozciągliwe (Rysunek 1C) kompatybilne rozmiarem ze słupkiem rozciągającym (Rysunek 1A,B). Pliki FreeCAD zawarte w tym protokole są kompatybilne z odpowiednimi słupkami (aby zakryć pierścienie podczas obsługi próbek, ich średnicę można wybrać tak, aby była zgodna z rozmiarem szalki Petriego).
   UWAGA: Pierścionek może być również na bazie aluminium (anodowany) lub drukowany w 3D. Dołącz uszczelki o odpowiednich średnicach, aby uszczelnić próżniowo słupek naciągowy i pierścienie.
3. Opcjonalnie: Wyprodukuj regulator podciśnienia. Mapa elektryczna skrzynki sterowniczej podciśnienia używanej w tym protokole znajduje się w informacjach uzupełniających (patrz folder uzupełniający 2). Umożliwia ręczną kontrolę poziomu podciśnienia przyłożonego do urządzenia rozciągającego.
   UWAGA: Komercyjne regulatory podciśnienia mogą również zapewniać podobne funkcje i zwykle może im towarzyszyć oprogramowanie sterujące umożliwiające zastosowanie różnych typów sygnałów (sinusoidalnych, trójkątnych itp.) (płynny, kobaltowy).

2. Wykonanie rozciągliwej membrany

1. Zaprojektuj okrągłe płyty (zalecany materiał: polimetakrylan, PMMA). Upewnij się, że płytki te są szersze niż pierścienie i mają rozmiar zgodny z powlekarką wirową (Rysunek 2A). Patrz Tabela 1 , aby zapoznać się z sugerowanymi wymiarami i Folder uzupełniający 3.
   UWAGA: W przypadku słupka 1 zastosowano średnicę 12 cm; Dla słupka 2 o średnicy 18-21 cm. Przed każdym użyciem i pomiędzy nimi płytki należy dokładnie wyczyścić chusteczkami z włókniny i 96% etanolem. Ważne jest, aby unikać gromadzenia się PDMS na płytach, a także na krawędziach i pod spodem.
2. Przygotuj PDMS 1:10 i dobrze wymieszaj, aby uzyskać bardzo jednorodną emulsję (użyj zalecanych łyżek do mieszania).
   UWAGA: Na 12 cm przygotuj 4,5 g na talerz; Na talerze 18 cm, 8 g na talerz. W przypadku przygotowania wielu płytek należy przygotować dodatkowe PDMS, na przykład 10 ml więcej niż jest to konieczne na 10 płytek. Na 10 płytek o średnicy 12 cm należy przygotować 50 g składnika A i 5 g składnika B. Wygodne jest korzystanie z dużych pojemników do łatwego pipetowania. Pojemnik nie może zawierać kurzu ani żadnych innych zabrudzeń, które mogłyby utrudnić prawidłowe wirowanie i utwardzanie PDMS. Używaj rękawic z kompatybilnego materiału (unikaj lateksu; odpowiednie są rękawice winylowe), aby zapewnić utwardzenie PDMS.
3. Odgazowuje się przez minimum 1 godzinę przy użyciu komory próżniowej.
   UWAGA: Alternatywnie, PDMS można odwirować przy 0,2 × g przez 5 minut za pomocą probówki o pojemności 50 ml, ale należy pamiętać, że zassanie mieszaniny PDMS z probówki ze strzykawką dozującą jest skomplikowane (konieczne w kroku 2.4). Nie odgazowuj zbyt długo (nie dłużej niż 2 godziny) przy bezpośrednim świetle, aby uniknąć wstępnego utwardzenia PDMS.
4. Powłoka wirowa PDMS na wierzchu płyt PMMA
   1. Dozuj 4,2 ml lub 7,5 ml odgazowanego PDMS na wierzch płytek PMMA.
   2. Pokryj płytki wirowo, stosując następujące zalecane ustawienia:
      1. Wirowanie przez 5 s przy 500 obr./min z przyspieszeniem 100 obr./min/s.
      2. Wirowanie warstwy przez 1 min przy 500 obr./min z przyspieszeniem 300 obr./min.
         UWAGA: Wygodne może być zaznaczenie środka płytki PMMA na jej spodniej stronie, aby zapewnić wyśrodkowanie płytek podczas wirowania i jednorodnego wirowania. Krok 2.4.2.1 nie jest obowiązkowy, zwłaszcza jeżeli parametr przyspieszenia nie może być dostosowany; pomaga rozprowadzić PDMS przed wirowaniem. Protokół ten daje membrany PDMS o grubości około 140 μm (mierzonej za pomocą interferometrii; patrz rysunek uzupełniający 1 i tabela 2). Kalibracje muszą być przeprowadzone przed eksperymentami w przypadku, gdy model lub parametry powlekarki spinowej prowadzą do różnych charakterystyk membrany.
5. Przechowuj każdą płytkę na szalce Petriego, aby uniknąć gromadzenia się kurzu i polimeryzuj przez noc w temperaturze 65 °C wewnątrz piekarnika.
   UWAGA: Uważaj na używanie naczyń odpornych na temperaturę. Warunek utwardzania będzie miał wpływ na odkształcalność PDMS dla danego zastosowanego poziomu podciśnienia.

3. Przekładanie membrany w pierścienie

1. Projekt materiału montażowego.
   1. Zaprojektuj pierścienie PMMA o średnicy wewnętrznej/zewnętrznej do ułożenia okrągłej membrany PDMS z powłoką spinową (rysunek 2A). Patrz proponowane wymiary w Tabeli 1 i Folderze Uzupełniającym 3.
   2. Zaprojektuj wspornik montażowy (Rysunek 2B), na którym będzie pasował pierścień, a wysokość będzie również określać rozciągnięcie wstępne podczas montażu membrany w pierścieniu.
      UWAGA: Wspornik montażowy może być prostym rozwiązaniem opartym na istniejącym sprzęcie laboratoryjnym (np. szalce Petriego). Bardziej eleganckim rozwiązaniem jest wydrukowanie podpory w 3D (zobacz plik FreeCAD tej części dostarczony w tym protokole, patrz Folder Uzupełniający 3), ponieważ wysokość może być zdefiniowana przez użytkownika i łatwo zmieniana (w tym protokole zastosowano wysokość 10 mm dla małych pierścieni). Wysokość środkowej części podpory powinna być mniejsza niż wysokość półpierścienia, tak aby podłoże PDMS nie dotykało podpory podczas montażu (patrz dalsze zastosowanie w kroku 3.4.2). Nadaje się do tego drukarka 3D wykorzystująca filamenty kwasu polimlekowego (PLA) (patrz Tabela materiałów). Można również zaprojektować pierścień zacinający, również wydrukowany w 3D, który będzie służył jako prowadnica skalpela (rysunek 2A).
   3. Zaprojektuj i wyprodukuj mosiężne obciążniki o kompatybilnych rozmiarach, aby wywierać nacisk na pierścień podczas montażu membrany (rysunek 2C) i prowadzić do powtarzalnego naprężenia wstępnego.
      UWAGA: Dostarczone tutaj pliki FreeCAD (patrz Folder Uzupełniający 3) są zgodne z wymiarami pierścienia przedstawionymi w tym protokole.
2. Usuń membranę PDMS z płyty PMMA.
   1. Przygotuj pierścienie PMMA na arkuszu białego papieru stołowego.
      UWAGA: Ważne jest, aby ławka i papier pozostały płaskie, aby papier nie dotykał membrany PDMS podczas montażu.
   2. Ostrożnie obejdź krawędź płytki ostrzem (raz lub dwa razy), a następnie prześledź tę samą krawędź ostrą pęsetą, aby upewnić się, że PDMS ma czyste cięcie na całym obwodzie (Rysunek 2A).
   3. Użyj pęsety, aby ostrożnie podnieść membranę na jednej krawędzi. Następnie delikatnie oderwij krawędź arkusza PDMS kciukami, aby równomiernie podnieść membranę na krawędzi. Oderwij krawędź membrany od płytki wzdłuż połowy obwodu płyty (rysunek 2A).
      UWAGA: Wlanie kilku kropli 96% etanolu pod membranę PDMS pomoże podnieść membranę bez jej łamania.
3. Wysuszyć membranę PDMS.
   1. Przetrzyj 96% etanolu wokół całej górnej powierzchni wcześniej przygotowanego pierścienia PMMA (krok 3.2.1), używając palców do równomiernego rozprowadzenia.
   2. Ostrożnie zdejmij membranę PDMS, podnosząc ją od poprzednio podniesionej krawędzi (wyjaśnionej w kroku 3.2.3) i umieść ją symetrycznie na pierścieniu PMMA pokrytym etanolem. Usuń wszelkie zmarszczki z PDMS, ale uważaj, aby nie rozciągać membrany; tylko go wyprostuj.
      UWAGA: Zastosowanie wstępnego rozciągania na tym etapie wpłynie na odkształcalność PDMS dla danego zastosowanego poziomu podciśnienia.
   3. Po całkowitym wyschnięciu etanolu upewnij się, że membrana PDMS jest szczelnie przyklejona do pierścienia PMMA.
4. Zamontuj pierścień rozciągliwy.
   1. Weź kolejny pusty pierścień PMMA. Umieść go na pierścieniu montażowym i użyj metalowych zacisków, aby je ze sobą uszczelnić, umieszczając membranę PDMS między dwoma pierścieniami (kanapka z membraną PDMS, rysunek 2B).
   2. Umieść dolną połowę pierścienia rozciągającego na wsporniku montażowym zaprojektowanym w kroku 3.1.2 (Rysunek 2B).
   3. Umieść kanapkę z pierścieniem PDMS na rozciągliwym pierścieniu i mocno dociśnij ją, aż sięgnie do samego dołu. Podłoże PDMS nie styka się ze wspornikiem montażowym. Zabezpiecz uszczelkę we właściwej pozycji (Rysunek 2B).
   4. Umieść okrągłe mosiężne ciężarki na górze sample (Rysunek 2C). Powoduje to zastosowanie stałego naprężenia wstępnego, podobnego do tego, jakie występuje we wszystkich zamontowanych pierścieniach, co zapewnia dalszą powtarzalność podczas kalibracji systemu.
   5. Umieść górną połowę metalowego pierścienia rozciągającego na górze, tak aby otwory na były wyrównane, umieść wszystkie i dokręć (Rysunek 2C).
      UWAGA: Na tym etapie membrana PDMS ma otwory, więc nie próbuj odmontowywać ani cofać się w protokole.
   6. Delikatnie przetnij PDMS wokół pierścienia za pomocą ostrza (Rysunek 2C).
   7. Przykryj (np. szalką Petriego), aby chronić membranę przed kurzem (rysunek 2C).
      UWAGA: Jeśli PDMS wymaga funkcjonalizacji żelem poliakrylamidowym, przejdź do sekcji 5. Aby uzyskać wstępne pomiary kalibracyjne, przejdź do sekcji 6. Jeśli pierścień PDMS ma być używany do wysiewu komórek, przejdź do sekcji 7.

4. Wariant wytwarzania membrany PDMS: wzór siatki referencyjnej

1. Przygotować płytkę PMMA (przed powlekaniem wirowym PDMS) "wzorzystą" z siatką na bazie SU8 utworzoną za pomocą fotolitografii (rysunek 2D). W tym celu zaprojektuj interesujący Cię wzór, aby stworzyć film fotomaski (maska octanowa).
   UWAGA: Plik pdf dostarczony w tym protokole (patrz Folder uzupełniający 4) tworzy siatkę z numerami alternatywnymi; patrz rysunek 2D. Siatkę można utworzyć za pomocą prostego oprogramowania, takiego jak Inkscape, w zależności od rozmiaru wzoru (lub alternatyw, takich jak Clewin lub FreeCAD). Projekt może być wydrukowany przez firmy zewnętrzne na kliszach fotograficznych (patrz Spis materiałów).
2. Protokół fotolitografii na płycie PMMA (patrz Folder Uzupełniający 3 dla właściwości optycznych PMMA).
   1. Wykonać obróbkę plazmą tlenową płytek PMMA przez 20 minut przy 7 W przy stałym przepływie tlenu 0,8 bara.
      UWAGA: Upewnij się, że ewentualna plastikowa ochrona płyt została usunięta, a płyty PMMA są całkowicie przezroczyste.
   2. Piecz przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
   3. Schłodzić płytkę PMMA za pomocą pistoletu do azotu, a następnie umieścić 4 ml żywicy SU-8 2100 na 12-centymetrowej płytce PMMA (dostosuj objętość, jeśli używasz różnych rozmiarów płytek).
   4. Wirować z następującymi parametrami (lub dostosować parametry wirowania, aby utworzyć warstwę o wysokości około 10 μm): 5 s przy 500 obr./min z przyspieszeniem 100 obr./min, a następnie 30 s przy 4000 obr./min z przyspieszeniem 300 obr./min.
   5. Piecz przez 2,5 minuty w temperaturze 95 °C.
   6. Umieść płytkę PMMA na wyrównywaczu maski w obecności maski octanowej i użyj następujących parametrów: bez i-line. Ekspozycja szerokopasmowa (od 260 do 460 nm), 25 mW/^cm2, ekspozycja 7,5 s.
   7. Piecz przez 3,5 minuty w temperaturze 95°C.
   8. Opracuj wzór przez 1 minutę z octanem eteru monometylowego glikolu propylenowego.
   9. Dokładnie umyć izopropanolem.
   10. Przeprowadź wizualną weryfikację jakości wzoru za pomocą obiektywu o małym powiększeniu (2-10x) w mikroskopie jasnego pola.
       UWAGA: Silanizacja płytki z wzorem PMMA zwiększa trwałość wzoru przy wielokrotnym użyciu. W tym celu aktywuj wzorzystą płytkę PMMA na 30 s za pomocą plazmy tlenowej, a następnie wykonaj 1-godzinną obróbkę trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan pod próżnią w kapturze chemicznym.
3. Użyj wzorzystej płytki PMMA, jak w krokach od 2.2 do 2.5, aby pokryć rozciągliwą membranę PDMS.
   UWAGA: Wzorzysty PDMS można uwidocznić w mikroskopie jasnego pola, jak wspomniano wcześniej, a także w skaningowym mikroskopie elektronowym (rysunek 2D). Zwróć uwagę, która strona wzoru jest skierowana do góry podczas montażu membrany PDMS w pierścieniu rozciągliwym, aby uzyskać wzór w żądanej orientacji.

5. Mocowanie żelu poliakryloamidowego (PAA) na wierzchu membrany PDMS

UWAGA: Ten krok można wykonać na membranie PDMS przymocowanej do płyty PMMA (patrz rozdział 2) lub na wcześniej zamontowanych pierścieniach rozciągających (patrz rozdział 3). Praca pod maską chemiczną; w przypadku etapów związanych z ogrzewaniem wygodnie jest użyć małej armatury piekarnika pod okapem chemicznym, patrz Tabela materiałów; w przeciwnym razie próbki należy przechowywać w hermetycznym pudełku w piekarniku).

1. Wstępne powlekanie membrany PDMS (rysunek 2E)
   1. Przygotować roztwór powlekający, mieszając 96% etanolu z 10% (3-aminopropylo)trietoksysilanem (APTES) w probówce do mikrowirówek (np. 20 μl APTES w 180 μl etanolu).
   2. Aktywuj membrany PDMS za pomocą wyładowania plazmy koronowej na 1 minutę (lub aktywuj na 30 s za pomocą myjki plazmowej tlenowej).
   3. Umieścić 200 μl roztworu APTES/etanolu na środku membrany.
   4. Pozostawić membranę w temperaturze 65 °C w piekarniku na 1 godzinę.
   5. Umyć dwukrotnie PBS. Do drugiego prania pozostaw PBS na 10 minut, wstrząsając.
   6. Przygotować 3% roztwór aldehydu glutarowego (GA) w PBS. Umieścić 200 μl GA na membranę w tym samym obszarze membrany potraktowanej APTES.
   7. Odczekaj 25 minut (nie dłużej niż 30 minut).
   8. Umyć dwa razy PBS, drugi raz wstrząsając.
   9. Zassać płyn i umieścić pierścień w pozycji opadającej, aż PBS całkowicie wyschnie.
2. Silanizacja szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotuj 6 ml Repel Silane i wlej go na szalkę Petriego.
   2. Ostrożnie umieść kwadratowe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w płynie, jeden po drugim.
   3. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 5 minut.
   4. Przygotuj dwie zlewki; jeden zawiera 96% etanolu, a drugi ultraczystą wodę.
   5. Usuń szkiełko nakrywkowe z Repel Silane za pomocą pęsety i umyj najpierw w 96% etanolu, a następnie umyj w ultraczystej wodzie (szkiełko nakrywkowe powinno wyjść "suche" z mycia wodą).
   6. Pozostaw do wyschnięcia na dodatkowe 30 minut na granicy szalki Petriego.
3. Mocowanie żelu poliakryloamidowego (PAA) do membrany PDMS
   1. Ułóż połowę szkiełek nakrywkowych poddanych działaniu Repel Silane na dnie szalki Petriego.
   2. Przygotować mieszaninę żelu PAA o pożądanej sztywności ^16,18.
   3. Umieść kroplę 10 μl mieszanki żelowej na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego.
   4. Umieść na wierzchu kolejne szkiełko nakrywkowe impregnowane preparatem Repel Silane, aby rozprowadzić żel. Nie wyrównywać dwóch szkiełek nakrywkowych. Upewnij się, że są ułożone w kształcie gwiazdy, aby ułatwić rozdzielenie. Dociśnij delikatnie, aby żel był spłaszczony, ale nie przekraczał obszaru szkiełka nakrywkowego.
   5. Poczekaj od 45 minut do 1 godziny.
   6. Delikatnie oddziel szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety. Upewnij się, że żel pozostaje przymocowany do jednego z szkiełek nakrywkowych.
   7. Weź szkiełko nakrywkowe, do którego przymocowany jest żel i umieść żel w kontakcie z obszarem PDMS uprzednio leczonym GA (ryc. 2E).
   8. Naciskaj dwoma palcami od dołu i od góry przez 5 sekund.
   9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
   10. Następnego dnia napełnij pierścień PBS przez 30 minut.
   11. Delikatnie odczep górne szkiełko nakrywkowe pęsetą.
   12. Narysuj obwód żelu PAA za pomocą markera permanentnego z drugiej strony membrany PDMS. Pomaga to zlokalizować próbkę w poniższych krokach.
   13. Zassać PBS.
   14. Wykonaj etap funkcjonalizacji, aby ułatwić przyłączenie pożądanego białka macierzy zewnątrzkomórkowej do żelu¹⁵.

6. Działanie urządzenia rozciągającego, kalibracja odkształcenia i ocena rozdzielczości

1. Przygotuj pierścień rozciągliwy PDMS z koralikami fluorescencyjnymi do kalibracji szczepu.
   1. Przygotować rozcieńczenie 0,1 μm lub 0,2 μm kulki fluorescencyjnej w stosunku 1:50000 (patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) przez seryjne rozcieńczanie (roztwór pośredni 1:500 1 ml w PBS z 2 μl roztworu podstawowego kulek, a następnie końcowe rozcieńczenie 10 μl z roztworu pośredniego w 1 ml PBS).
      UWAGA: Wysoka gęstość ściegów na membranie jest optymalna dla etapu kalibracji; Nie należy poddawać roztworu sonikacją, ponieważ grudki kulek ułatwiają operację podczas kalibracji.
   2. Umieść kroplę o pojemności 10-30 μl na środku PDMS.
      UWAGA: Wspornik montażowy można wygodnie zaprojektować z osadzaniem próbki od krzyża do środka
   3. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze nie wyższej niż 40 °C, aby uniknąć problemów zakłócających po utwardzeniu.
2. Przygotuj pierścień rozciągający PDMS z koralikami fluorescencyjnymi do oceny rozdzielczości.
   1. Postępuj zgodnie z protokołem Cole'a i ^wsp.19 , aby przygotować roztwór kulki przy użyciu kulek o średnicach mniejszych niż granica dyfrakcji, zwykle kulek o średnicy 0,1 μm.
      (patrz Tabela materiałów). Ostrożnie sonikować roztwory kulek na każdym etapie pośrednim.
   2. Użyj obróbki koronowej w środku pierścienia, aby aktywować podłoże PDMS.
   3. Natychmiast rozprowadzić 20 μl roztworu kulek na wierzchu poddanego działaniu PDMS centralnego obszaru i pozostawić do wyschnięcia.
      UWAGA: W tym przypadku roztwór kulki jest silnie rozcieńczany i inkubowany na hydrofilowym PDMS, aby zapewnić rozległe rozprowadzenie i uzyskać pojedyncze, oddzielone kulki 0,1 μm zaadsorbowane na podłożu.
3. Montaż urządzenia do rozciągania na mikroskopie stage uchwyt (Rysunek 1F).
   1. Zamontuj drążek do rozciągania w mikroskopie.
   2. Obficie nałóż smar (wazelinę) na okrągły obszar słupka (środkowa część, rysunek 1D, F).
      UWAGA: Stosowanie smaru jest obowiązkowe, aby podłoże PDMS mogło przezwyciężyć tarcia i ślizgać się po słupku, a także konieczne jest odświeżenie smaru między każdą próbką. Wazelina jest stosowana jako bardzo wygodny smar w konfiguracji przedstawionej w tym protokole.
   3. Zamontuj pierścień rozciągliwy przygotowany w kroku 6.1 w słupku rozciągliwym i przykręć górną nakrętkę, aby uszczelnić zespół.
   4. Podłącz regulator podciśnienia do źródła podciśnienia i słupka rozciągającego (Rysunek 3A).
      1. Podłącz tylną część skrzynki sterowniczej podciśnienia do źródła podciśnienia (Rysunek 3A).
      2. Połącz przód pudełka z elastycznym słupkiem (Rysunek 1B, D, F).
         UWAGA: Źródłem podciśnienia może być linia podciśnieniowa dostępna w infrastrukturze budynku. Umiarkowane podciśnienie jest wymagane do wystarczającego rozciągnięcia, ale zależy od średnicy pierścienia rozciągającego (mniejsze odkształcenie zostanie uzyskane przy tym samym poziomie próżni dla mniejszej średnicy). Alternatywnie na rynku dostępne są pompy próżniowe (Fluigent lub Elveflow zapewniają autonomiczne pompy próżniowe); W takim przypadku postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi podłączenia do źródła podciśnienia. Nie używaj zasilacza próżniowego bez źródła kontrolowanego podciśnieniem (takiego jak wykonana na zamówienie skrzynka kontrolna podciśnienia przedstawiona w niniejszym protokole lub dostępne na rynku systemy)
4. Kalibracja szczepu
   1. Wybierz pole zainteresowania, które obejmuje dużą gęstość ściegów w całym polu widzenia i rozpoznawalne dla użytkownika grudki ściegów (patrz rysunek 3B).
   2. Uzyskujesz obraz "w spoczynku" wybranego pola widzenia (zapisz pozycję).
   3. Zastosuj rozciąganie przy niskim poziomie podciśnienia (w tej konfiguracji -20 mbar). Próbka będzie poruszać się we wszystkich kierunkach (X-Y-Z).
   4. Najpierw ustaw ostrość na płaszczyźnie z.
   5. Przesuń stół montażowy w kierunkach x-y, aby znaleźć ten sam obszar zainteresowania, który jest obrazowany w spoczynku, precyzyjnie ustawić ostrość obrazu koralików w stanie rozciągniętym i uzyskać obraz.
      UWAGA: Jeśli próbka jest bardzo wyśrodkowana, obszar zainteresowania przesunie się znacząco, w zależności od wielkości odkształcenia. Przemieszczenie będzie większe od środka, ale wielkość odkształcenia jest niezależna od położenia próbki na podłożu. Nagrywaj obrazy bez łączenia w grupy, w rozdzielczości 2048x2048.
   6. Uwolnij napięcie. Powtórzyć kroki 6.4.3-6.4.5 z wyższym poziomem podciśnienia (-30 mbar, -40 mbar itd.).
      UWAGA: W celu kalibracji zawsze wracaj do stanu spoczynku przed ponownym rozciąganiem (patrz rysunek uzupełniający 3A), ponieważ PDMS zachowuje się histereza po odkształceniu.
   7. Zamontuj drugi pierścień rozciągający i powtórz kroki 6.4.1-6.4.6. Wykonaj tę kalibrację dla co najmniej 3 różnych pierścieni rozciągających.
   8. Przechowuj pozyskane obrazy w folderze uporządkowanym według przykładów.
   9. W każdym folderze nazwij obraz koralika referencyjnego uzyskany w spoczynku reference_str1 oraz obrazy rozciągnięte przy rosnącym próżni, stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 itp.
      UWAGA: Ten krok stanowi podstawową kalibrację systemu. W zależności od potrzeb użytkownika należy wykonać dodatkową kalibrację przy użyciu podobnych próbek ściegów, ale przy użyciu innych protokołów aplikacji próżniowej. Zastosować protokół szczepu podobny do szczepu zastosowanego do próbki biologicznej (patrz sekcja dotycząca wyników reprezentatywnych).
5. Użyj kodu Matlab, aby określić ilościowo szczep²⁰.
   1. Pobierz cały folder Matlab pod następującym linkiem https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      UWAGA: Główny kod do uruchomienia ma nazwę gel_strain i wywołuje inne pliki kodu Matlab, które muszą być przechowywane w takiej postaci, w jakiej zostały dostarczone, przechowywane w tym samym folderze co kod główny.
   2. Otwórz Matlab i otwórz kod gel_strain.
   3. Ustaw parametry (patrz Tabela 3, Code_Parameter dla zalecanych ustawień).
   4. Zdefiniuj ścieżki folderów nadrzędnych i eksperymentalnych zgodnie ze wskazaniami w kodzie.
      UWAGA: Jeśli folder nie istnieje, w kodzie pojawi się wyskakujące okienko z ostrzeżeniem; Wybierz pozycję Dodaj do ścieżki i przeglądaj do folderu eksperymentalnego, w którym są przechowywane obrazy.
   5. Uruchom kod gel_strain .
   6. Otwórz stretched_str1 zgodnie z żądaniem kodu.
   7. Otwórz reference_str1 zgodnie z żądaniem kodu.
      UWAGA: Wygodnie jest przetwarzać wszystkie rozciągnięte obrazy na różnych poziomach próżni jednocześnie, jak wskazano w tym protokole; Wszystkie pliki muszą być przechowywane w tym samym folderze eksperymentalnym, ale kod żąda tylko otwarcia pierwszego rozciągniętego obrazu. Nazwy obrazów powinny kończyć się nazwami strX, gdzie X to liczby przyrostowe 1, 2, 3 itd., jak wskazano w punkcie 6.4.9 tego rozdziału.
   8. Sprawdź, czy folder wyników jest wyświetlany z 4 podfolderami: Przycięte dane zawierające przycięte i wyrównane dane; Przemieszczenia zawierające plik przemieszczeń ściegu; Obrazy zawierające wykres przemieszczeń promieniowych i odkształceń; Szczepy zawierające arkusz kalkulacyjny macierzy odkształceń otrzymanej dla każdego poziomu próżni.
      1. Obliczyć medianę macierzy odkształcenia dla każdego poziomu podciśnienia.
      2. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki (minimum 3).
      3. Wykreślić macierz mediany odkształcenia w funkcji poziomu próżni dla 3 próbek, aby uzyskać krzywą kalibracyjną (rysunek 3C).
         UWAGA: Kilka parametrów można zmodyfikować w przypadku, gdy obraz koralika nie jest prawidłowo przetworzony z kodu. Aby to zrobić, otwórz plik set_settings_stretch w Matlabie i zmodyfikuj Settings.Resolution i Settings.Overlap zgodnie z zaleceniami w komentarzach do kodu (zobacz również Tabela 3). W zależności od potrzeb doświadczalnych, szczep zastosowany do próbki biologicznej może być zróżnicowany (szczep cykliczny, większy szczep itp.): zalecana jest kalibracja tych warunków (patrz przykłady na rysunku uzupełniającym 2 i rysunku uzupełniającym 3).
6. Ocena rozdzielczości (postępuj zgodnie z protokołem Cole'a i ^wsp.19)
   1. Zamontuj pierścień rozciągliwy przygotowany w kroku 6.2.
   2. Wyobraź sobie pole widzenia zawierające pojedyncze kropki koralików (wyobraź sobie stos z odległością kroku Z odpowiednią do użytego obiektywu).
   3. Użyj MetroloJ (wtyczka Fiji), jak wskazano w Cole i wsp., aby scharakteryzować rozdzielczość X-Y-Z konfiguracji rozciągania (rysunek 3D i rysunek uzupełniający 4).

7. Wysiewanie i rozciąganie komórek

1. Powlekanie PDMS białkiem adhezyjnym komórek
   1. Wysterylizuj pierścień PDMS, wystawiając go na działanie światła UV przez 15 minut (Rysunek 4A). Wykonaj wszystkie kolejne kroki protokołu pod biokapturem, aby zapewnić sterylność.
   2. Opłucz płytkę pod pokrywą jałowego PBS.
   3. Inkubować białko adhezyjne 11,14,15, umieszczając 100-200 μl kropli roztworu w środku pierścienia (ryc. 4A).
      UWAGA: Zwykle odpowiedni jest roztwór 10 μg/ml fibronektyny¹¹. Inne interesujące białka adhezyjne mogą być używane do powlekania PDMS (np. laminina, keratyna¹⁵; mogą być wymagane określone zabiegi/protokoły). Zaleca się inkubację w celu otoczenia fibronektyną przez noc w temperaturze 4 °C; alternatywną metodą jest 1 h w temperaturze 37 °C.
   4. Narysuj obwód kropli markerem permanentnym od spodu membrany PDMS. Pomaga to zlokalizować próbkę w poniższych krokach.
2. Wysiewanie komórek na pierścieniu PDMS (Rysunek 4A).
   1. W razie potrzeby należy przetoczyć transfekcję komórek za pomocą białka fluorescencyjnego przed eksperymentem rozciągania (w przypadku transfekcji przejściowych 1-3 dni przed eksperymentem, w zależności od metody transfekcji i cech) lub użyć określonych protokołów do wizualizacji markerów fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Do wstępnych eksperymentów wygodnie jest użyć markera błony plazmatycznej, takiego jak GFP-mem^11,12, do wizualizacji odpowiedzi błony komórkowej i potencjalnych pęknięć. Marker jest łatwy do transfekcji i zaleca się rozciąganie transfekowanych komórek przy rosnących poziomach odkształcenia, aby ocenić próg szczepu, który doprowadzi do pęknięcia błony plazmatycznej. Zobacz mapę plazmidu w folderze uzupełniającym 5. Zależy to od typu komórki i będzie niższe w eksperymentach z pojedynczymi komórkami w porównaniu z monowarstwami komórek. Ten marker błonowy jest kompatybilny z rozciąganiem komórek, w przeciwieństwie do niektórych barwników wprowadzających błonę, które zaobserwowano, że prowadzą do pęknięcia błony plazmatycznej przy niskich poziomach rozciągnięcia.
   2. W dniu eksperymentu należy ogrzać pożywkę komórkową i przygotować pożywkę niezależną od CO₂ .
      UWAGA: Jeśli mikroskop jest wyposażony w kontrolę CO₂ kompatybilną z systemem rozciągania, eksperymenty można przeprowadzić na zwykłych pożywkach do hodowli komórkowych (byłaby to niezbędna konfiguracja dla delikatnych próbek, które nie mogą przetrwać w pożywkach niezależnych od CO₂). Zaleca się niezależność od CO₂ uzupełnioną środkiem wybielającym (np. w przypadku białek GFP, suplement rutyny²¹ w dawce 10 mg/ml).
   3. Trypsynizuj komórki i policz je.
   4. Wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w małej objętości (20-50 μl) standardową pożywką komórkową, aby ułatwić przyczepianie się komórek i trzymaj w inkubatorze o kontrolowanej wilgotności CO₂.
      UWAGA: W przypadku płaskich i dużych fibroblastów oraz eksperymentów jednokomórkowych 5000 komórek; Liczby zależą od typu komórki i samego eksperymentu.
   5. Po 20-30 minutach inkubacji (sprawdź początkowe przyczepienie komórek), delikatnie dodaj 500 μl pożywki na wierzch komórek. Umieścić z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić dalsze rozprzestrzenianie się komórek.
      UWAGA: Czas wysiewu zależy od typu komórki i wymagań doświadczalnych; Możliwe jest również utworzenie monowarstwy z inkubacją przez noc. Objętość pożywek hodowlanych musi być odpowiednio dostosowana. Wtórne barwienie komórek: po przyczepieniu komórki można zabarwić barwnikiem, takim jak SpyDNA (patrz Tabela materiałów) w celu wizualizacji jąder (rysunek uzupełniający 5) lub innym barwieniem w celu uwidocznienia dowolnej interesującej struktury. Zawsze należy pamiętać, że barwienie żywych komórek lub nadmierna ekspresja białka przez transfekcję może wpływać na odpowiedź komórek na rozciąganie, szczególnie w korze komórkowej, błonie plazmatycznej lub mechanowrażliwych białkach/strukturach.
   6. Zamień na media niezależne od CO₂ i natychmiast użyj w urządzeniu rozciągającym.
      UWAGA: Teraz próbka jest gotowa do eksperymentu rozciągającego.
3. Eksperyment z rozciąganiem komórek: przykład pojedynczego cyklu rozciągania i uwalniania i obrazowania błony plazmatycznej (PM) w celu uchwycenia dynamicznej przebudowy fibroblastów PM.
   1. Zamontuj pierścień rozciągający na stoliku mikroskopu, jak w rozdziale 6, kroku 6.2.
   2. Znajdź interesującą Cię komórkę, zapisz jej położenie i zrób zdjęcie wstępnie rozciągniętej komórki (Rysunek 4B).
   3. Zastosuj żądaną próżnię, która, zgodnie z krzywą kalibracyjną, odpowiada pożądanemu odkształceniu podłoża.
   4. Aby znaleźć rozciągniętą komórkę, najpierw ponownie ustaw ostrość w polu Z, a następnie przesuń w kierunku X-Y, aby znaleźć i wyśrodkować komórkę z powrotem w polu widzenia.
   5. Nagrywaj obrazy przez żądany czas (Rysunek 4B).
      UWAGA: Wstępne eksperymenty są powszechnie potrzebne do określenia odpowiedzi komórki na odkształcenie rozciągające w zależności od jej typu (średnio). Rozciągnij komórki na różnych odkształceniach podłoża, aby określić maksymalne obciążenie, jakie mogą wytrzymać. Pęknięcie błony plazmatycznej nastąpi, jak uwidoczniono za pomocą fluorescencyjnego markera błony plazmatycznej, jeśli obciążenie jest nadmierne dla komórki.
   6. W celu uwolnienia komórek wróć do pozycji komórki w spoczynku i włącz tryb akwizycji mikroskopu , aby upewnić się, że akwizycja może się rozpocząć, gdy tylko próbka zostanie ponownie zogniskowana.
   7. Zwolnij rozciągnięcie i szybko zmień ostrość ręcznie w Z.
   8. Rejestruj obrazy zwolnionej komórki przez żądany czas (Rysunek 4B). Ze względu na elastyczny charakter membrany PDMS, próbka łatwo rozogniskowuje się z czasem. Dlatego ręcznie dostosuj ostrość podczas akwizycji obrazu.
      UWAGA: Aby pomyślnie ustawić ostrość podczas obrazowania po zwolnieniu, obrazy muszą być wizualizowane wystarczająco często; Obrazowanie wideo w ciągu 3-5 minut co 3 sekundy jest rozsądne. Podłoże PDMS nie jest kompatybilne z systemem idealnego ustawiania ostrości mikroskopu, dlatego zwykle wymagana jest ręczna regulacja przez użytkownika w celu szybkiej akwizycji. Ustawianie ostrości za pomocą oprogramowania może być ustalone, ale uważaj na możliwe błędy i duże ruchy sceny, które mogą uszkodzić cel poprzez uderzenie w część rozciągającego się słupka. Użytkownik może zdecydować się na wykonanie wielu odcinków próbki w zależności od eksperymentu.
4. Przetwarzanie końcowe: Wyrównywanie obrazów za pomocą Fidżi
   1. Otwórz obrazy w spoczynku i nadwyręż.
   2. Użyj dopasowania szablonu wtyczki Fiji i wybierz region komórki do wyrównania (Rysunek 4C).
      UWAGA: Przemieszczenia względne wyrównanego obrazu odkształcenia są renderowane przez Fidżi, a obrazy są przycinane i wyrównywane. Pobierz wtyczkę template_matching z tego linku : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Wysiew komórek na wstępnie rozciągniętym podłożu

1. Zamontuj rozciągnięty pierścień pokryty białkiem adhezyjnym w urządzeniu do rozciągania.
2. Rozciągnij podłoże PDMS do żądanego poziomu odkształcenia.
3. Zasiać komórki jak w sekcji 7.
   UWAGA: W tym eksperymencie wysiew nie jest przeprowadzany w sterylnych warunkach, więc protokół może nie być odpowiedni dla wszystkich typów komórek.
4. Po przyleganiu komórek wymień pożywkę na pożywkę niezależną od CO₂ .
   UWAGA: Wybierz szybko przylegające komórki, aby zminimalizować czas przylegania.
5. Po pożądanym czasie inkubacji zwolnij rozciąganie i zobrazuj interesującą Cię komórkę.
   UWAGA: Na tym etapie znalezienie tej samej komórki po uwolnieniu rozciągającym jest trudne, ponieważ pozycja komórki w spoczynku jest nieznana, a ruch substratu PDMS nie jest łatwy do przewidzenia.

9. Naprawianie rozciągniętych lub rozluźnionych komórek

1. Napraw komórki w stanach rozciągniętych (praca pod kapturem chemicznym)
   UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest standardowym środkiem utrwalającym; używaj go na ciepło w temperaturze 37 °C, aby zapewnić szybkie utrwalenie. Alternatywnie, roztwór glioksalu²² pozwala na szybkie utrwalenie próbki przy dobrej konserwacji próbki.
   1. Przygotować środek utrwalający.
   2. Komórki nasienne na pierścieniach zgodnie z krokiem 7.2.
   3. Zamontuj drążek rozciągliwy i sterownik wewnątrz okapu chemicznego i podłącz do źródła podciśnienia.
   4. Umieść pierścień z wysianymi komórkami w słupku rozciągającym.
   5. Aby naprawić stan rozciągnięcia, rozciągnij się do żądanego obciążenia. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i utrwalić, dodając 4% roztwór PFA do komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie umyj za pomocą PBS, zawsze trzymając rozciąganie. Powoli zwolnij odkurzacz i umyj większą ilością PBS.
      UWAGA: Nie zapomnij przygotować stanu kontroli bez rozciągania (w tym celu mały kawałek PDMS można pokroić i wysuszyć z niewielką ilością 96% roztworu etanolu pod spodem, na szklanym szkiełku nakrywkowym). Aby zobrazować utrwaloną próbkę, zaleca się rozciągnięcie próbki z powrotem do tej samej wielkości. Ponieważ PFA jest toksyczny, na tym etapie należy podjąć odpowiednie środki ostrożności. Wygodne jest korzystanie z małego piekarnika, który można przechowywać pod maską, patrz Tabela materiałów).
   6. Zobrazuj próbkę, najlepiej ponownie stosując próżnię, do tego samego poziomu, który był używany podczas utrwalania, co zapewnia "ponowne spłaszczenie" próbki (rysunek 4D).
2. Napraw komórkę po rozciągnięciu (pracuj pod kapturem chemicznym).
   1. Rozciągnij komórki do pożądanego napięcia i czasu. Tuż przed uwolnieniem rozciągającym należy usunąć większość pożywki bez całkowitego wysuszenia próbki i uwolnić naprężenie. Alternatywnie zastosuj cykliczny odcinek o określonym czasie trwania.
   2. Szybko usuń podłoże i natychmiast utrwal roztworem utrwalającym przez 10 minut. Umyj za pomocą PBS i obrazu.
      UWAGA: Próbkę można również wysiać na wstępnie rozciągniętym podłożu i po zdefiniowanym przez użytkownika czasie wysiewu, utrwalić uwalnianie po rozciągnięciu, jak w kroku 9.2.2.
3. Immunofluorescencja utrwalonej próbki: postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami immunofluorescencji po rozciągnięciu lub uwolnieniu; blokowanie żelatyną rybną jest preferowane zamiast BSA¹⁷.
4. Zobrazuj próbkę (Rysunek 4E).
5. Konserwacja próbek
   1. Przygotuj podłoże montażowe do konserwacji próbki (Mowiol lub Prolong).
   2. Wyjmij PBS i dodaj kroplę (około 75 μl) podłoża montażowego.
   3. Chwyć szkiełko nakrywkowe pęsetą i delikatnie połóż je na wierzchu (unikaj bąbelków, które utrudniałyby wizualizację).
   4. Suszyć przez co najmniej 48 godzin w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Wyciąć wokół utrwalonej próbki PDMS i zamontować na innym szklanym szkiełku nakrywkowym w celu późniejszego obrazowania.
      UWAGA: Ten krok nie jest zgodny z obrazowaniem po obrazowaniu próbki na rozciągniętej membranie, ponieważ montaż membrany PDMS na szkiełku nakrywkowym z podłożem konserwującym wiąże się z zachowaniem membrany tylko w stanie zrelaksowanym.

10. Fiksacja z siatką do obrazowania tego samego obszaru próbki w różnych trybach - obrazowanie SEM jako przykład

UWAGA: Ten protokół może być używany do obrazowania tej samej pojedynczej komórki w dwóch różnych mikroskopach, mikroskopii fluorescencyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej, jak pokazano tutaj. Obrazowanie korelacyjne wymaga zaawansowanego przetwarzania obrazu, które nie jest objęte zakresem tego protokołu. Innymi użytecznymi zastosowaniami mogą być, na przykład, wizualizacja próbki w trybie na żywo, dalsza fiksacja pod maską i wizualizacja tej samej komórki po barwieniu immunologicznym (protokół używany dla rysunku uzupełniającego 5).

1. Przygotuj pierścień rozciągliwy, używając wzorzystych płytek PMMA z rozdziału 4.
2. Zasiej komórki jak w kroku 7.2.
   UWAGA: Należy pamiętać, że roztwór powłokowy musi być ostrożnie nałożony, aby zapewnić pełne pokrycie PDMS, nawet w małych otworach siatki.
3. Utrwalić zgodnie z opisem w sekcji 8, ale przy użyciu odpowiedniego utrwalacza i protokołu zgodnego z obrazowaniem próbki i mikroskopii elektronowej.
   UWAGA: W przypadku stosowania mieszanki PFA + aldehydu glutarowego (np. 2%-2.5%), należy uważać na autofluorescencję pochodzącą z obecności odczynnika aldehydu glutarowego i ostatecznie wykonaj etap hartowania²³.
4. Zobrazuj próbkę w trybie fluorescencji i zapisz pozycję komórki (wydrukuj siatkę i zanotuj pozycję za pomocą krzyżyka, na przykładample).
5. Po wykonaniu wszystkich obrazów przygotuj próbkę do EM, najpierw przecinając PDMS wokół próbki (wcześniej usuwając smar).
6. Przetwórz membranę PDMS + próbkę do skaningowej mikroskopii elektronowej (która obejmuje standardowy protokół odwadniania próbki i rozpylania metalu)¹².
7. Podczas obrazowania w mikroskopie SEM znajdź pozycje siatki i poszukaj komórek wcześniej zobrazowanych w trybie fluorescencyjnym (Rysunek 4F,G).

Wyniki

Kalibracja i radialność
Właściwa charakterystyka otrzymanego szczepu jest gwarancją powtarzalności i kontroli eksperymentów. Podczas gdy kulki fluorescencyjne mogą być dodawane do każdej próbki, aby precyzyjnie zarejestrować szczep, poprzedni etap kalibracji zapewnia właściwe planowanie eksperymentu, znając wielkość odkształcenia, które eksperymentator chce zastosować do próbki przed właściwym rozciąganiem. Naprężenie będzie zależało nie tylko od zastosowanej próżni, ale będzie się różnić w zależności...

Dyskusja

Do mechanicznego rozciągania próbek biologicznych użyto dużej liczby urządzeń do rozciągania, naśladując warunki fizjologiczne w organizmie^24,25. W literaturze dostępnych jest wiele konfiguracji, a obserwacja reakcji próbki jest zwykle wykonywana przez sprzęganie urządzeń rozciągających z siłą atomową²⁶ lub mikroskopią fluorescencyjną^27,11.

Przedstawiona...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maska octanowa	Zdjęcie JD
Akrylamid	Biorad	161-0140	40% roztwór akryloamidu
APS	Sigma Aldrich	A3678 (wersja angielska)	Nadsiarczan amonu do elektroforezy, ≥ 98%
Aptes powiedział:	Sigma Aldrich	281778	(3-aminopropylo)trietoksysilan
Autonomiczna pompa mikroprzepływowa	Elveflow Kobalt	Kobaltowy podwójny	Kobaltowy podwójny
Bisakryloamid	Biorad	161-0142	2% roztwór bis
Ostrze	Fisher Naukowy	11733919	Grupa Dydaktyczna Hoja zrobiła &aaacute; ctica X100 LAME BISTOURI STERYLNE N° 23  LAMD23
Klipy	Sprintis (Sprintis)	AKXX000001	Bull Dog Clips, 32 mm, wykonany z metalu, pojemność 10 mm, niklowany
Obróbka koronowa	Produkty elektrotechniczne	BD-20AC, kod produktu:12051A	BD-20AC LABORATORYJNA OBRÓBKA KORONOWA
Filiżanek	Firma VWR	611-1368	VWR - Kubki na zlewki, jednorazowe, 250 ml
DAPI (interfejs DAPI)	Roche	10236276001	Barwienie DAPI
Etanol 96%	Panreac Quí mika, SLU	131085-1212	Etanol 96% v/v na aaaostry; lisis, ACS- 2,5 L
Fibronektyna	Sigma	F0895 powiedział:	Fibronektyna, z ludzkiego osocza, płyn  0.1%
FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,1 i mikro; m	Technologia życiowa	F8801, F8803	Żółte, zielone i czerwone koraliki fluorescencyjne do oceny rozdzielczości
FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,2 i mikro; m	Fisher Naukowy	F8809, F8810	Żółte, zielone i czerwone koraliki fluorescencyjne do kalibracji szczepu
Aldehyd glutarowy	Sigma Aldrich	G6403 powiedział:	Roztwór aldehydu glutarowego 50% w klasie H2O
Interferometr	Veeco	Wyko NT1100	Interferometr do pomiaru grubości membran PDMS
Izopropanol	Panreac Quí mika, SLU	Numer katalogowy: 131090-1212	2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Laiton waży			Wykonane na zamówienie
Chusteczki niestrzępiące się	Berkshire	DURX670, DR670090920	Włókniny-chusteczki
Smar (wazelina)	Sigma	16415	Wazelina
Nakładka maski	Sü ss MicroTec	MJB4	Wyrównywacz masek do fotolitografii na płytach PMMA
Mówił	Calbiochem - Merck	475904	MOWIOL 4-88 Odczynnik
Mikroskop NIKON wirujący dysk konfokalny	Nikon	Zaćmienie Ti-E/B	wyposażony w aparat Nikon Ti-S-ER  scena
Mikroskop NIKON pionowy	Nikon	Zaćmienie Ni-E	wyposażony w stopień Nikon NI-SH-E
Obiektyw 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
Rozwiązanie PBS	Gibco (firma Gibco)	14200067	DPBS, 10x
PDMS (system zarządzania zasobami ludzkimi)	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Zestaw elastomerów silikonowych DN 109
Osłona pierścienia szalki Petriego (duża)	Szczepionka	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100
Osłona pierścienia szalki Petriego (mała)	Szczepionka	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Czyścik plazmowy	Harrick	PDC-002 (wersja CDC-002)	Generator plazmy tlenowej
Płyty i pierścienie z PMMA			Zobacz tabelę specyfikacji programu Excel w dokumentach uzupełniających
Przedłużać	Invitrogen	P36930 /P36934	Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold
Odpychanie-silan	GE Opieka zdrowotna	17-1332-01	PlusOne Repel-Silane ES
Pierścienie / gumowy pierścień	Tecnifil powiedział:		Wykonane na zamówienie
Powlekarka wirowa	Laur	WS-650Sz	Powlekarka wirowa
SPY650-DNA	Spirochrom	Zobacz materiał SC 501	SPY650-DNA
Łyżka sterująca	Firma VWR	231-0416	Szpatułka jednorazowa eko krótka, dwustronna łyżka i szufelka, dodatek PP i EcoPure
Żywica SU8 2100	Mikrochemia	Y111075	SU8-2100 powiedział:
Deweloper SU8	Sigma-Aldrich	484431	Octan eteru monometylowego glikolu propylenowego
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina, odpowiedni odczynnik. Odczynnik do elektroforezy
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan	Sigma Aldrich	448931	Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan
Pęseta	IESMAT	T5039	Pęseta Dumont HP 7 ze stali nierdzewnej. Końcówka 0,17 x 0,10 mm. (Agar Scientific Ltd)
Regulator podciśnienia	GARCAP/Parker	990-005203-005	Controlador de vacio
Płynny regulator podciśnienia	Biegły	LU-FEZ-N800	LineUp Flow EZ (n800mbar)
Biały papier na ławkę	Raima powiedział:	931.1001	Papier Raima 42 x 52