Tutaj opisujemy technikę pobierania ludzkich narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii i ich analizę za pomocą barwienia immunologicznego.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie końcowych narządów przedsionkowych w warunkach fizjologicznych podczas labiryntektomii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Żywe ludzkie ucho wewnętrzne jest trudne do zbadania, ponieważ jest zamknięte w gęstej kości torebki usznej, która ogranicza dostęp do tkanki biologicznej. Tradycyjne metody histopatologii kości skroniowej opierają się na długich, kosztownych protokołach odwapnienia, które trwają 9-10 miesięcy i zmniejszają liczbę rodzajów analizy tkanek możliwych do przeprowadzenia z powodu degradacji RNA. Istnieje pilna potrzeba opracowania metod dostępu do świeżych tkanek ucha wewnętrznego człowieka, aby lepiej zrozumieć choroby otologiczne, takie jak choroba Meniere'a, na poziomie komórkowym i molekularnym. W pracy opisano technikę pobierania ludzkich przedsionkowych narządów końcowych od żywego dawcy w warunkach fizjologicznych. Osoba z chorobą Meniere'a i "atakami kropli", które były oporne na wstrzyknięcie gentamycyny do błony bębenkowej, została poddana labiryntektomii. Najpierw wykonano tradycyjną mastoidektomię, w której zidentyfikowano kanały półkoliste poziome i górne (SCC). Jama wyrostka sutkowatego została wypełniona zrównoważonym roztworem soli, dzięki czemu błędnik mógł zostać otwarty w bardziej fizjologicznych warunkach, aby zachować integralność komórkową. Do wizualizacji zanurzonej jamy wyrostka sutkowatego użyto endoskopu o zerowym kącie z systemem irygacji osłonki do czyszczenia soczewek, a do szkieletowania i otwarcia poziomych i górnych SCC, a następnie przedsionka, użyto diamentowego zadzioru o średnicy 2 mm. Pobrano bańki i część kanałów dla SCC górnego i bocznego. W podobny sposób zebrano łagiewkę. Pobraną tkankę natychmiast umieszczono w lodowatym buforze, a następnie utrwalono na godzinę w 4% paraformaldehydzie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Tkankę przepłukano kilkakrotnie w 1x PBS i przechowywano przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Próbki tkanek poddano barwieniu immunologicznemu kombinacją pierwotnych przeciwciał przeciwko tenascynie-C (Calyx), onkomoduliny (streolarne komórki rzęsate), kalretyniny (Kielich i komórki rzęsate typu II), białka pęcherzyków synaptycznych 2 (włókna odprowadzające i butony), β-tubuliny 1 (kielich i aferentne butony), a następnie inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Próbki tkanek zostały następnie przepłukane i zamontowane do badania pod mikroskopią konfokalną. Zdjęcia ujawniły obecność ampullarnych i plamkowych komórek rzęsatych oraz struktur nerwowych. Protokół ten pokazuje, że możliwe jest pobranie nienaruszonej, wysokiej jakości tkanki ucha wewnętrznego od żywych dawców i może stanowić ważne narzędzie do badania chorób otologicznych.
Wprowadzenie
Żywe ludzkie ucho wewnętrzne jest trudne do zbadania ze względu na jego lokalizację w gęstej kości torebki usznej kości skroniowej. W związku z tym dostęp do ludzkich tkanek wewnętrznych był ograniczony, a naukowcy polegali głównie na pośmiertnym pobieraniu tkanek. Pośmiertna histopatologia kości skroniowej (TBH) od ponad 100 lat jest kluczowym narzędziem do zrozumienia ludzkich chorób otologicznych1,2,3. Tkanka do TBH jest przygotowywana przez pośmiertne pobranie kości skroniowej, długotrwały (9-10 miesięcy) proces odwapniania i przygotowania tkanek, a następnie barwienie hematoksyliną i eozyną. Podczas gdy TBH pozostanie podstawowym narzędziem do ujawniania nowych informacji na temat zdrowego i chorego ludzkiego ucha wewnętrznego, długie badania pośmiertne oraz długie i trudne metody przetwarzania tkanek ograniczają jego użyteczność do niektórych celów, co wymaga stosowania metod uzupełniających w celu badania tkanki ucha wewnętrznego człowieka. Rezonans magnetyczny o wysokiej rozdzielczości może wizualizować narządy ucha wewnętrznego, ale nie ma wystarczającej rozdzielczości, aby zobaczyć struktury na poziomie komórkowym lub molekularnym4,5. Ze względu na te wyzwania wiele chorób ucha wewnętrznego u ludzi pozostaje słabo poznanych.
Alternatywnym podejściem jest pobranie tkanki ucha wewnętrznego podczas operacji. Podczas labiryntektomii lub translabiryntowej resekcji schwannoma przedsionkowego tkanki ucha wewnętrznego są celowo poświęcane. Łagiewki pobrane od pacjentów podczas translabiryntowej resekcji nerwiaka osłonkowego przedsionka wykorzystano do scharakteryzowania morfologii komórek rzęsatych przedsionkowych6,7,8 i badania regeneracji komórek włosa9,10. Niedawno opracowano techniki pobierania narządów ucha wewnętrznego od dawców narządów przy użyciu podejścia transkanałowego, które można wykorzystać do usunięcia łagiewki i potencjalnie innych przedsionkowych narządów końcowych przez poszerzone owalne okno przy minimalnym uszkodzeniu tkanki11,12. Korzystając z tej techniki, udało się scharakteryzować profile transkryptomiczne pojedynczych komórek dla ludzkiej łagiewki13. Jednak techniki te narażają narządy ucha wewnętrznego na warunki niefizjologiczne podczas zbiorów. W szczególności narządy ucha wewnętrznego mogą być narażone na brak płynu perylimfatycznego i zanurzenie w normalnym nawadnianiu wiertłem solnym, które ma zasadniczo inny skład jonowy niż płyn perylimfatyczny. Co więcej, odwodniony błędnik błoniasty jest trudny do uwidocznienia, nawet przy maksymalnym powiększeniu mikroskopu operacyjnego, co sprawia, że atraumatyczne rozwarstwienie chirurgiczne jest trudne. Uraz mechaniczny może dodatkowo uszkodzić tkankę, a nasze anegdotyczne doświadczenie sugeruje, że tkanka chirurgiczna często ma niewystarczającą jakość barwienia immunologicznego z powodu uszkodzeń mechanicznych i zwyrodnienia komórek. Istnieje zapotrzebowanie na nowe techniki atraumatycznego pobierania tkanki ucha wewnętrznego człowieka do badań biologicznych, które mogą wyjaśnić słabo poznane choroby ucha wewnętrznego u ludzi. Tutaj opisujemy podwodną technikę pobierania ludzkich przedsionkowych narządów końcowych w bardziej fizjologicznych warunkach podczas labiryntektomii i ich analizy za pomocą barwienia immunologicznego.
Protokół
Ten protokół został opracowany za zgodą instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) Johns Hopkins University School of Medicine (IRB00203441) oraz zgodnie z instytucjonalnymi zasadami dotyczącymi używania tkanek ludzkich i potencjalnie zakaźnego materiału. Pobranie tkanek przeprowadzono podczas labiryntektomii, która jest częścią standardowej opieki klinicznej w przypadku opornej choroby Meniere'a z atakami kropli.
1. Labiryntektomia i pobieranie tkanek
- Uzyskaj zgodę lokalnej instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB), dokonaj przeglądu polityki uczelni dotyczącej wykorzystania materiału ludzkiego i zakaźnego oraz uzyskaj zgodę na dawstwo tkanek przed zastosowaniem tego protokołu. Pobranie tkanek należy wykonać podczas chirurgicznej labiryntektomii lub dostępu translabiryntowego do przewodu słuchowego wewnętrznego, co jest częścią standardowej opieki klinicznej.
- Przygotuj pacjenta.
- Przed indukcją znieczulenia należy omówić z zespołem anestezjologicznym unikanie długo działającego paraliżu, aby można było monitorować nerw twarzowy.
- Po wywołaniu znieczulenia ogólnego należy zaintubować pacjenta i obrócić stół operacyjny o 180°. Umieść elektrody monitorujące nerw twarzowy i upewnij się, że podawana jest przedoperacyjna profilaktyka antybiotykowa.
- Wstrzyknij 1% lidokainy z epinefryną w skali 1:100 000 do zewnętrznego przewodu słuchowego i okolicy zausznej. Przygotuj ucho w standardowy sposób za pomocą betadyny.
- Użyj ostrza #15, aby wykonać standardowe (5-6 cm) krzywoliniowe nacięcie pouszne 1 cm za fałdem zausznym.
- Podnieś tkankę miękką zauszną.
- Zidentyfikuj powięź skroniową wyżej i podnieś zauszny płat skóry do przodu w kierunku kanału słuchowego.
- Wykonaj standardowe nacięcie okostnej w kształcie litery 7 i unieś okostną do przodu, aż do zidentyfikowania kręgosłupa Henlego i kostnego przewodu słuchowego. Umieść zwijacze do samodzielnego trenowania.
- Wykonaj mastoidektomię.
- Wykonaj całkowitą mastoidektomię, identyfikując nakrywkę górnie, zatokę esicy z tyłu i przerzedzenie zewnętrznego kanału słuchowego z przodu.
- Zidentyfikuj poziomy kanał półkolisty i krótki wyrostek kowadełka.
UWAGA: Wyrostek sutkowaty nie powinien być spodkowany, aby zapewnić, że pozostanie naczyniem zdolnym do przechowywania płynu do zbierania podwodnych tkanek.
- Zidentyfikuj kanały półkoliste (SC).
- Pod mikroskopem operacyjnym (powiększenie 2-4x) użyj gruboziarnistego diamentowego zadzioru o średnicy 3 mm, aby usunąć okołolabiryntowe komórki powietrzne boczne do górnego SC, subłukowate komórki powietrzne i retrolabiryntowe komórki powietrzne za tylnym SC, rozciągające się wyżej do wspólnego crus.
- Zanurz labirynt.
- Zanurz jamę wyrostka sutkowatego w zrównoważonym roztworze soli (BSS) i uwidocznij błędnik za pomocą endoskopu o zerowym stopniu z systemem irygacji osłonki do czyszczenia soczewek.
- Użyj systemu irygacji osłonki do czyszczenia soczewek, aby przepłukać jamę wyrostka sutkowatego za pomocą BSS, zmywając krew i umożliwiając lepszą wizualizację błędnika.
- Niebieskie linie SC.
- Utrzymując odpowiedni poziom BSS w jamie wyrostka sutkowatego i używając endoskopu do wizualizacji, użyj 3-milimetrowego diamentowego zadzioru, aby "niebieską linią" wszystkie trzy kanały półkoliste, ostrożnie wiercąc kość torebki usznej, aż kanał półkolisty pojawi się jako niebieskawa linia, gdy patrzy się na niego za pomocą endoskopu.
- Nawadniaj z przerwami roztworem BSS za pomocą systemu irygacyjnego w celu zmycia krwi i uzyskania odpowiedniej wizualizacji, jak pokazano na Rysunek 1.
- Zbierz bańki SC.
- Pod BSS wejdź w kopułę bocznego kanału półkolistego i podążaj nim do przodu, aż zostaną zidentyfikowane jego bańki. Wejdź do górnego SC i podążaj nim przyśrodkowo w kierunku jego bańek, które mogą być zbierane wraz z bańkami górnego SC. Ostro przeciąć boczny przewód SC, aby ułatwić usunięcie.
- Podnieś poziome i górne ampułki SC z crista za pomocą igły Rosena i oddziel włókna doprowadzające od nabłonka i błędnika błoniastego. Następnie usuń te struktury.
- Przeciąć kopułę tylnego SC i podążać za nią niżej i do przodu do jego ampułki. Podobnie, zbierz tylne bańki SC i umieść wszystkie tkanki w BSS na lodzie.
- Zbierz plamkę żółtą.
- Usuń kość między poziomymi i tylnymi bańkami SC, aby odsłonić przedsionek. Błoniaste ściany łagiewki zostaną rozerwane wraz z usunięciem bańek. Dopóki utrzymywany jest poziom płynów, plamki żółte pozostaną przyczepione do przodu; Podnieś go i usuń.
- Sakkula znajduje się w sferycznym wgłębieniu; gwałtownie podnieś i wyjmij ją z wgłębienia. Podobnie umieść próbki tkanek w BSS na lodzie.
- Próbki tkanek należy przetransportować na lodzie z sali operacyjnej do laboratorium w celu utrwalenia w ciągu 1 godziny od pobrania.
2. Immunohistochemia i obrazowanie
- Napraw próbkę.
- Umieścić próbkę tkanki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS) w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym kołysaniem lub wytrząsaniem orbitalnym (100 obr./min) przez 1 h.
UWAGA: 4% roztwór PFA (dla łącznie 5 ml): 625 ml 32% roztworu podstawowego PFA + 500 ml 10xPBS + 3875 ml ddH2O.
- Umieścić próbkę tkanki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS) w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym kołysaniem lub wytrząsaniem orbitalnym (100 obr./min) przez 1 h.
- Przenieść próbki tkanek do 1x roztworu PBS i płukać 3x 15 minut (lub dłużej, jeśli to konieczne) w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem lub wytrząsaniem orbitalnym.
- Usuń nadmiar tkanki łącznej pod mikroskopem preparacyjnym w 1x PBS przy RT.
- Odwapnić próbkę.
- Przenieś próbki tkanek do 5% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 1x roztworze PBS, aby oczyścić nabłonek czuciowy z drobnych resztek kostnych i otokonii. Uruchom inkubację przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej, z delikatnym kołysaniem lub wytrząsaniem orbitalnym.
- Ponownie przenieś próbki tkanek do 1x roztworu PBS i płucz 3x 15 minut (lub dłużej, jeśli to konieczne) w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem lub potrząsaniem orbitalnym.
- Do każdej próbki nanieść 125-200 ml 2x buforu blokującego (2x BB) i inkubować przez 1,5-5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc (ON) w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić inkubację pod ciągłym wytrząsaniem orbitalnym.
UWAGA: 2x Bufor blokujący (2x BB): 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w objętości do 5 ml 1x PBS uzupełnionej 0,5% Triton X-100. BSA służy jako czynnik blokujący dla niespecyficznych miejsc wiązania antygenu. - Barwienie za pomocą przeciwciał pierwotnych.
- Nałożyć 120-150 ml kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych rozpuszczonych w 1x BB do pożądanego rozcieńczenia. Zastosuj królicze przeciwciała anty-tenascyny-C w rozcieńczeniu 1:200 (2,5 μg/ml), kozie przeciwciała antyonkomodulinowe w rozcieńczeniu 1:200 (2,5 μg/ml), mysią antykalretyninę w rozcieńczeniu 1:300 (2,2 μg/ml) i DAPI w rozcieńczeniu 1:1000 (1 μg/ml). Następnie przenieść próbkę (pod przykryciem) do temperatury 4 °C (w lodówce lub chłodni) pod delikatnym wytrząsaniem orbitalnym w celu inkubacji ON.
UWAGA: 1x BB: Wymieszaj równą objętość 2x BB i 1x PBS uzupełnioną 0,5% Triton X-100.
- Nałożyć 120-150 ml kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych rozpuszczonych w 1x BB do pożądanego rozcieńczenia. Zastosuj królicze przeciwciała anty-tenascyny-C w rozcieńczeniu 1:200 (2,5 μg/ml), kozie przeciwciała antyonkomodulinowe w rozcieńczeniu 1:200 (2,5 μg/ml), mysią antykalretyninę w rozcieńczeniu 1:300 (2,2 μg/ml) i DAPI w rozcieńczeniu 1:1000 (1 μg/ml). Następnie przenieść próbkę (pod przykryciem) do temperatury 4 °C (w lodówce lub chłodni) pod delikatnym wytrząsaniem orbitalnym w celu inkubacji ON.
- Przepłukać próbki tkanek w 1 x roztworze PBS, 3 x 15 minut (lub dłużej, jeśli to konieczne), w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
- Barwienie za pomocą przeciwciała wtórnego.
- Zastosować 120-150 ml kombinacji przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem rozpuszczonych w 1x BB w rozcieńczeniu 1:2000 (1 μg/ml). Zastosuj sprzężone przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi o długości 488 nm, przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom o długości 568 nm i przeciwciało wtórne przeciwko kozom o długości fali 647 nm.
- Następnie inkubować próbkę (pod przykryciem) w temperaturze pokojowej pod delikatnym wytrząsaniem orbitalnym przez 1,5-2 godziny (lub ON w temperaturze 4 °C).
- Przepłukać próbki tkanek w 1 x roztworze PBS, 3 x 15 minut (lub dłużej, jeśli to konieczne), w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
- Wykonaj mikrodysekcję i montaż.
- Pod mikroskopem preparacyjnym usuń nadmiar tkanki i błon z okolic czuciowego nabłonka przedsionkowego. Użyj 70% etanolu do oczyszczenia powierzchni szklanego szkiełka histologicznego, wysusz na powietrzu i nałóż 55 ml kropli odpowiedniego podłoża montażowego.
- Przenieść próbki tkanek sensorycznych na podłoże montażowe. Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie zorientować próbki wiązką włosów do góry w podłożu montażowym.
- Delikatnie położyć szklankę nakrywkową o odpowiednim rozmiarze na podłożu montażowym zawierającym próbki, starając się ograniczyć pęcherzyki powietrza. Upewnij się, że szkło nakrywkowe ma klasę grubości #1.5 wymaganą do mikroskopii konfokalnej.
- Umieść prowadnice w ciemnym miejscu (np. w szufladzie ławki), aby nośnik montażowy zastygł. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia w ciemnym miejscu przed zbadaniem go pod mikroskopem konfokalnym. Następnie należy przechowywać zapieczętowane szkiełka w ciemności (pudełko ze slajdami lub folder slajdów) pod kątem 4° do czasu obrazowania.
- Użyj mikroskopu konfokalnego o powiększeniu 40x-100x z kanałami 488 nm i 657 nm, aby zobrazować próbkę.
Wyniki
Stosując tę technikę, ludzki utrykuł oraz ampullae kanału bocznego i górnego zostały pobrane w całości przy minimalnej traumatyzacji (Rysunek 2). Jak widać na Rysunku 2, ampullae można pobrać wraz ze znaczną częścią przewodu błoniastego. Markowanie immunofluorescencyjne przeciwciałami przeciwko tenascynie-C (białko macierzy zewnątrzkomórkowej) oraz onkomodulinie (małe białko wiążące wapń z rodziny białek parwalbuminy) wykazało obecność nienaruszonych komórek rzęskowych przedsionka typu 1 (Rysunek 3). Gęstość komórek rzęskowych wynosiła 82 na 10 000 μm2. Wyniki te demonstrują użyteczność tej techniki w pobieraniu tkanek ludzkiego ucha wewnętrznego przy minimalnym uszkodzeniu neuroepitelium.
Rycina 1: Ilustracja przygotowania chirurgicznego. Ilustracja przygotowania chirurgicznego: Przedstawiono lewą jamę sutkową z bocznym, górnym i tylnym kanałem półkolistym. Jama sutkowa jest zanurzona w zrównoważonym roztworze soli, a do wizualizacji jamy sutkowej używa się endoskopu zero-stopniowego, podczas gdy do otwarcia labiryntu wykorzystuje się wiertło diamentowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Labirynt błoniasty. Pobrany (A) ludzki utriculus oraz ampulla kanału bocznego i (B) górnego pod stereomikroskopem świetlnym przy powiększeniu 5x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Utriculus (utricula). Maksymalne projekcje intensywności obrazowania immunofluorescencyjnego ludzkiego utriculus przy powiększeniu 40x, wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Szczeliny synaptyczne kielichowe zostały znakowane przeciwciałami anty-tenascyna-C (kolor zielony). Komórki przedsionkowe typu 1 zostały zabarwione anty-onkomoduliną (kolor czerwony). Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
W artykule opisano nową technikę podwodnego pobierania narządów przedsionkowych w BSS za pomocą endoskopów i ich analizy za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Tutaj pokazujemy pobieranie nienaruszonych przedsionkowych narządów końcowych z nienaruszonymi przedsionkowymi komórkami rzęsatymi i wystarczającą jakością tkanek do skutecznego znakowania immunologicznego. Gęstość komórek rzęsatych w naszej próbce była podobna do tej uzyskanej w innych badaniach od żywych dawców narządów13. Według naszej wiedzy jest to pierwsze doniesienie o podwodnej technice grabieży przedsionkowych narządów końcowych, która pozwala na utrzymanie warunków zbliżonych do fizjologicznych. Była to adaptacja podwodnej techniki do lepszej naprawy rozejścia się kanału półkolistego, która wykorzystuje BSS do utrzymania warunków fizjologicznych, podczas gdy błędnik jest otwarty w celu zatkania14,15.
Praca ta rozszerza wcześniejsze techniki opracowane do pobierania narządów przedsionkowych podczas labiryntektomii lub resekcji schwannoma przedsionkowego 6,7,8 oraz od żywych dawców narządów 11,12. Technikę podwodną można łatwo dostosować do resekcji nerwiaka osłonkowego przedsionkowego, podczas której błędnik jest podobnie otwierany po wycięciu mastoidektomii. Pobieranie narządów przedsionkowych od żywych dawców narządów odbywa się w ograniczonym zakresie i przy użyciu dostępu transkanałowego12. To podejście transkanałowe polega na usunięciu błony bębenkowej i kosteczek słuchowych oraz poszerzeniu okna owalnego przed pobraniem przedsionkowych narządów końcowych. Pobieranie tkanek od żywych dawców narządów wymaga jednoczesnej pracy z zespołem chirurgii transplantacyjnej w ograniczonej przestrzeni, która jest dzielona ze znieczuleniem u wezgłowia łóżka pacjenta. Jest mało prawdopodobne, aby przedstawiona tu technika była możliwa do zaadaptowania do ograniczeń czasowych i przestrzennych związanych z pobieraniem narządów przedsionkowych podczas dawstwa narządów od żywego dawcy. Jednak ta technika ma tę zaletę, że łatwo odsłania i zbiera bańki kanałów półkolistych, co byłoby trudne do wykonania przez owalne okienko.
Badanie tkanki ucha wewnętrznego człowieka będzie miało kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii zaburzeń ucha wewnętrznego, z których wiele pozostaje idiopatycznych. Na przykład choroba Meniere'a jest powszechnie spotykana w klinikach otologicznych, jednak jej etiologia pozostaje nieznana i nie ma udowodnionych opcji leczenia16,17. Techniki takie jak transkryptomika przestrzenna i obrazowanie immunofluorescencyjne oferują ekscytującą okazję do rzucenia światła na choroby ucha wewnętrznego i do tej pory były wykorzystywane tylko w ograniczonym zakresie. Metody pobierania zachowanych narządów ucha wewnętrznego dają możliwość wykorzystania nowszych technik molekularnych i mogą stanowić użyteczne uzupełnienie standardowego TBH. Chociaż opisana tutaj metoda została wykorzystana tylko do barwienia immunofluorescencyjnego, uważamy, że ta tkanka byłaby wystarczającej jakości dla transkryptomiki przestrzennej.
Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że opiera się on na łatwo dostępnym materiale chirurgicznym. Labiryntektomia jest obecnie rzadko stosowaną metodą leczenia choroby Meniere'a, a nawet zatłoczone ośrodki referencyjne mogą wykonywać tylko kilka takich zabiegów rocznie. Translabiryntowa resekcja schwannoma przedsionkowego jest wykonywana częściej; Jednak ta technika może wydłużyć i tak już długotrwałą procedurę. Szacujemy, że zanurzenie jamy wyrostka sutkowatego i otwarcie kanałów pod wodą wydłuża operację o około 30 minut. Ponadto nie przeprowadzono jeszcze analizy side-by-side porównującej jakość tkanki uzyskanej tą techniką ze standardowym pobraniem narządów przedsionkowych podczas labiryntektomii lub resekcji nerwiaka osłonkowego, ponieważ nie jest możliwe przeprowadzenie takiej analizy na tkance pobranej od jednego dawcy. Potrzebne są dalsze badania, aby określić wpływ warunków panujących podczas pobierania narządów na jakość tkanek w mikroskopii i innych technikach.
Podsumowując, opisano nową technikę podwodnego pobierania narządów końcowych układu przedsionkowego podczas labiryntektomii i jej zdolność do uzyskiwania wysokiej jakości próbek tkanek z zachowanymi komórkami rzęsatymi przedsionkowymi i kontaktami nerwowymi. Technika ta pozwala na pobieranie tkanek w środowisku jak najbardziej zbliżonym do normalnych warunków fizjologicznych i może stanowić użyteczne narzędzie do badania ludzkiego ucha wewnętrznego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Mohamedowi Leharowi za pomoc w tym projekcie. Prace te były wspierane przez National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (U24DC020850).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x Bulion soli fizjologicznej buforowanej fosforanami | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 32% roztwór podstawowy paraformaldehydu | ThermoFisher Scientific | 50-980-495 | |
| Alexa Fluor 488 Przeciwciało wtórne przeciw królikowi | Jackson Immunoresearch | 111545144 | |
| Alexa Fluor 568 Przeciwciało wtórne przeciw mysi | Jackson | Immunoresearch 115575146 | |
| Alexa Fluor 647 Przeciwciało wtórne przeciw kozom | Jackson Immunoresearch | 705607003 | |
| Zrównoważony roztwór soli | ThermoFisher Scientific | 14040117 | |
| Albumina surowicy bydlęcej Mikroskop | Sigma-Aldrich | 10711454001 | |
| Nikon A1 | A1 | ||
| (18 mm x 18 mm, grubość #1.5 ) | Corning | 2850-18 | |
| Endo-Scrub 2 Osłona do czyszczenia soczewek | Medtronic | IPCES2SYSKIT | |
| Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008 | |
| Koza Przeciwciało antyonkomodulinowe | R& D Systems | AF6345 | |
| Hopkins 0 Degree Teleskop | Storz | ||
| Mouse Przeciwciało antykalretyninowe | BD Biosciences | 610908 | |
| ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu | Invitrogen | P10144 | |
| Królik Przeciwciało anty-tenascynowe C | Millipore | AB19013 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 |
Bibliografia
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, Current Situation, and Future Perspectives. Otol Neurotol. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal. , Williams and Wilkins Pubs. Baltimore, MD. (1993).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger Pubs. Philadelphia, PA. (1993).
- Swartz, J. D., Loevner, L. A. Imaging of the Temporal Bone. , 4th edition, Thieme Medical Pubs. Stuttgart. (2009).
- Nagururu, N. V., Akbar, A., Ward, B. K. Using magnetic resonance imaging to improve diagnosis of peripheral vestibular disorders. J Neurol Sci. 439, 120300(2022).
- Hızlı, Ö, et al. Quantitative vestibular labyrinthine otopathology in temporal bones with vestibular schwannoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 154 (1), 150-156 (2016).
- Sans, A., Bartolami, S., Fraysse, B. Histopathology of the peripheral vestibular system in small vestibular schwannomas. Am J Otol. 17 (2), 326-324 (1996).
- Johnson Chacko, L., et al. Growth and cellular patterning during fetal human inner ear development studied by a correlative imaging approach. BMC Dev Biol. 19 (1), 11(2019).
- Taylor, R. R., et al. Regenerating hair cells in vestibular sensory epithelia from humans. Elife. 7, e34817(2018).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Aaron, K. A., et al. Selection criteria optimal for recovery of inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e507-e514 (2022).
- Vaisbuch, Y., et al. Surgical Approach for rapid and minimally traumatic recovery of human inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e519-e525 (2022).
- Wang, T., et al. Single-cell transcriptomic atlas reveals increased regeneration in diseased human inner ear balance organs. Nat Commun. 15 (1), 4833(2024).
- Creighton, F. X., Zhang, L., Ward, B., Carey, J. P. Hearing outcomes for an underwater endoscopic technique for transmastoid repair of superior semicircular canal dehiscence. Otol Neurotol. 42 (10), e1691-e1697 (2021).
- Schoo, W. W., Schoo, D. P., Chen, J. X., Carey, J. P. Underwater plugging of superior canal dehiscence via the middle cranial fossa is possible. Otolaryngol Head Neck Surg. 169 (6), 1702-1703 (2023).
- Basura, G. J., et al. Clinical practice guideline: Ménière's disease. Otolaryngol Head Neck Surg. 162 (2_suppl), S1-S55 (2020).
- Chandrasekhar, S. S., et al. Clinical practice guideline: Sudden hearing loss (Update). Otolaryngol Head Neck Surg. 161 (1_suppl), S1-S45 (2019).
Przedruki i uprawnienia
