Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

Xiaoman Wang; Qian Xie; Linling Ke; Yuanhang Gong; Min Li

doi:10.3791/67535

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

878 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67535

⸱

24 stycznia 2025

Xiaoman Wang¹ , Qian Xie¹ , Linling Ke¹ , Yuanhang Gong¹ , Min Li¹^,²

¹Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, ²National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szybką i skuteczną metodę wykrywania powszechnych delikatnych pęknięć w miejscu przez natywne γH2A. Immunoprecypitacja chromatyny X (ChIP). Takie podejście znacznie skraca zarówno czas, jak i nakład pracy związany z tradycyjnym γH2A. Testy X ChIP przy zachowaniu wysokiej odtwarzalności i wiarygodności wyników.

Streszczenie

Stres replikacyjny wywołany ekspozycją na czynniki zewnętrzne może prowadzić do pęknięć DNA we wspólnych delikatnych miejscach, które są regionami genomu, o których wiadomo, że są podatne na niestabilność strukturalną. W ramach projektu γH2A. Test immunoprecypitacji chromatyny X (ChIP) służy jako potężne narzędzie w badaniach genotoksyczności, jako γH2A. Fosforylacja X jest dobrze znanym markerem pęknięć podwójnej nici DNA. Tradycyjny γH2A. Testy X ChIP są jednak często pracochłonne i obejmują wiele czasochłonnych kroków. W tym badaniu przedstawiamy uproszczoną, ale skuteczną metodę, która łączy frakcjonowanie subkomórkowe z natywnym ChIP w celu wyizolowania γH2A. Kompleksy związane z chromosomem X. Takie podejście jest szczególnie przydatne do analizy γH2A. Interakcje X-chromatyny o zwiększonej swoistości i wydajności. Za pomocą frakcjonowania subkomórkowego materiały niezwiązane z chromatyną są skutecznie usuwane, w wyniku czego uzyskuje się oczyszczoną frakcję chromatyny. Późniejsze trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy) w łagodnych warunkach umożliwia fragmentację chromatyny przy jednoczesnym zachowaniu fizjologicznych interakcji między γH2A. X i związane z nim kompleksy białkowe. To zachowanie jest niezbędne do badania natywnych partnerów interakcji zaangażowanych w szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Ten zoptymalizowany natywny protokół ChIP znacznie skraca czas i zmniejsza nakład pracy związany z konwencjonalnym γH2A. Testy X ChIP. Uproszczona procedura nie tylko upraszcza przepływ pracy, ale także zapewnia wysoce powtarzalne wyniki, co czyni ją szczególnie korzystną w warunkach, w których wymagane jest wysokowydajne przetwarzanie wielu próbek. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniach koncentrujących się na stabilności genomu, naprawie DNA i biologii chromatyny, gdzie dokładne i skuteczne wykrywanie miejsc uszkodzenia DNA ma kluczowe znaczenie. Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanych protokołów i usprawnionych kroków, metoda ta umożliwia wykrywanie uszkodzeń DNA w delikatnych miejscach z lepszą czułością i minimalną obsługą próbki, co czyni ją cennym narzędziem do badań nad stabilnością genomu i odpowiedzią na uszkodzenia DNA.

Wprowadzenie

Common Fragile Sites (CFS) to duże regiony chromosomowe znajdujące się na każdym ludzkim chromosomie, podatne na pękanie podczas metafazy. Pod wpływem stresu replikacyjnego replikacja w tych regionach jest znacznie opóźniona, co uniemożliwia ich całkowitą duplikację przed wejściem mitotycznym¹, co ostatecznie prowadzi do specyficznych dla miejsca luk i pęknięć. CFS są gorącymi punktami niestabilności chromosomowej i są główną przyczyną rearanżacji chromosomów we wczesnym okresie rozwoju raka. Stres replikacyjny, który często występuje w warunkach nowotworowych, może prowadzić do utraty genów supresorowych nowotworów i amplifikacji onkogenów - z....