Artykuł metodologiczny

Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

DOI:

10.3791/67535

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy szybką i skuteczną metodę wykrywania powszechnych delikatnych pęknięć w miejscu przez natywne γH2A. Immunoprecypitacja chromatyny X (ChIP). Takie podejście znacznie skraca zarówno czas, jak i nakład pracy związany z tradycyjnym γH2A. Testy X ChIP przy zachowaniu wysokiej odtwarzalności i wiarygodności wyników.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stres replikacyjny wywołany ekspozycją na czynniki zewnętrzne może prowadzić do pęknięć DNA we wspólnych delikatnych miejscach, które są regionami genomu, o których wiadomo, że są podatne na niestabilność strukturalną. W ramach projektu γH2A. Test immunoprecypitacji chromatyny X (ChIP) służy jako potężne narzędzie w badaniach genotoksyczności, jako γH2A. Fosforylacja X jest dobrze znanym markerem pęknięć podwójnej nici DNA. Tradycyjny γH2A. Testy X ChIP są jednak często pracochłonne i obejmują wiele czasochłonnych kroków. W tym badaniu przedstawiamy uproszczoną, ale skuteczną metodę, która łączy frakcjonowanie subkomórkowe z natywnym ChIP w celu wyizolowania γH2A. Kompleksy związane z chromosomem X. Takie podejście jest szczególnie przydatne do analizy γH2A. Interakcje X-chromatyny o zwiększonej swoistości i wydajności. Za pomocą frakcjonowania subkomórkowego materiały niezwiązane z chromatyną są skutecznie usuwane, w wyniku czego uzyskuje się oczyszczoną frakcję chromatyny. Późniejsze trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy) w łagodnych warunkach umożliwia fragmentację chromatyny przy jednoczesnym zachowaniu fizjologicznych interakcji między γH2A. X i związane z nim kompleksy białkowe. To zachowanie jest niezbędne do badania natywnych partnerów interakcji zaangażowanych w szlaki odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Ten zoptymalizowany natywny protokół ChIP znacznie skraca czas i zmniejsza nakład pracy związany z konwencjonalnym γH2A. Testy X ChIP. Uproszczona procedura nie tylko upraszcza przepływ pracy, ale także zapewnia wysoce powtarzalne wyniki, co czyni ją szczególnie korzystną w warunkach, w których wymagane jest wysokowydajne przetwarzanie wielu próbek. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniach koncentrujących się na stabilności genomu, naprawie DNA i biologii chromatyny, gdzie dokładne i skuteczne wykrywanie miejsc uszkodzenia DNA ma kluczowe znaczenie. Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanych protokołów i usprawnionych kroków, metoda ta umożliwia wykrywanie uszkodzeń DNA w delikatnych miejscach z lepszą czułością i minimalną obsługą próbki, co czyni ją cennym narzędziem do badań nad stabilnością genomu i odpowiedzią na uszkodzenia DNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Common Fragile Sites (CFS) to duże regiony chromosomowe znajdujące się na każdym ludzkim chromosomie, podatne na pękanie podczas metafazy. Pod wpływem stresu replikacyjnego replikacja w tych regionach jest znacznie opóźniona, co uniemożliwia ich całkowitą duplikację przed wejściem mitotycznym1, co ostatecznie prowadzi do specyficznych dla miejsca luk i pęknięć. CFS są gorącymi punktami niestabilności chromosomowej i są główną przyczyną rearanżacji chromosomów we wczesnym okresie rozwoju raka. Stres replikacyjny, który często występuje w warunkach nowotworowych, może prowadzić do utraty genów supresorowych nowotworów i amplifikacji onkogenów - zbiorczo określanych jako zmienność liczby kopii (CNV)2,3,4,5,6. Ponadto CFS są bardzo podatne na integrację wirusów, co dodatkowo sprzyja rozwojowi raka 7,8,9,10. Wielokrotne homozygotyczne delecje genów supresorowych nowotworów wykryto w regionach CFS podczas analiz pan-rakowych guzów pierwotnych. Do najczęściej dotkniętych CFS w nowotworach należą FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H i FRA16D11. CFS są szczególnie podatne na pękanie w obecności zewnętrznych czynników rakotwórczych12. Aby ocenić szkodliwe rakotwórcze skutki zanieczyszczeń środowiska, potrzebna jest szybka i wiarygodna metoda ilościowego określania występowania pęknięć CFS.

Fosforylacja H2A. X na resztę seryny 139 (γH2A. X) przez ataksję teleangiektazję i białko związane z Rad3 (ATR) lub ataksję zmutowaną teleangiektazją (ATM) jest kluczowym zdarzeniem w zatrzymaniu widełek replikacyjnychsygnalizacji 13. γH2A. X służy jako wskaźnik zatrzymanych widełek replikacyjnych przed utworzeniem pęknięcia podwójnej nici (DSB)13, tworząc korzystne środowisko chromatyny, aby ułatwić wydajną rekrutację białek naprawczych do zatrzymanych miejsc. Dodatkowo γH2A. X może zostać zwerbowany do zniszczenia miejsc po załamaniu się widelca14,15, co jest zgodne z jego podstawową rolą w naprawie DSB. Ponieważ pęknięcia CFS są ściśle związane z aberracjami chromosomowymi, które napędzają progresję raka, wykrycie tych pęknięć może być pomocne w zrozumieniu wczesnych etapów nowotworzenia. Obecność γH2A. X w CFS może być używany jako biomarker do wykrywania wczesnych zdarzeń niestabilności genomu. Informacje te mogą pomóc w identyfikacji potencjalnych czynników rakotwórczych i ocenie ryzyka związanego z narażeniem na różne czynniki zewnętrzne. Mierząc pęknięcia DNA w CFS indukowane przez czynniki zewnętrzne, γH2A. Chromatyna X IP (ChIP) może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób takie czynniki przyczyniają się do mechanizmów leżących u podstaw nowotworzenia.

W konwencjonalnym ChIP (tj. Usieciowanym ChIP, X-ChIP) asocjacja γH2A. X z docelowymi sekwencjami DNA jest stabilizowany przez odwracalne sieciowanie formaldehydu. Chromatyna jest następnie ścinana na fragmenty około 500 par zasad (bp) poprzez sonikację, a otrzymany roztwór jest oczyszczany z zanieczyszczeń przez sedymentację 16,17,18. Klasa ChIP γH2A. Przeciwciało X jest następnie dodawane do oczyszczonej frakcji chromatyny, a następnie dodaje się kulki agarozowe białka A / G w celu wzbogacenia w γH2A. Regiony chromatyny związane z chromosomem X 16,17,18. Kompleksy immunologiczne (tj. koraliki-przeciwciało-γH2A. Kompleks DNA ukierunkowany na X) są wielokrotnie myte rygorystycznymi myjącymi w celu usunięcia niespecyficznie związanych fragmentów DNA 16,17,18. Po umyciu specyficznie związane DNA jest eluowane z kompleksów immunologicznych. Wiązania krzyżowe formaldehydu są następnie odwracane, po czym następuje trawienie białek za pomocą proteinazy K, po czym wzbogacone DNA jest oczyszczane i zagęszczane 16,17,18. Aby ocenić γH2A. Stosuje się regiony związane z X, PCR, ilościowy PCR (qPCR) lub sekwencjonowanie bezpośrednie 16,17,18. Zajętość γH2A. X w określonych regionach, takich jak CFS, jest określane przez intensywność sygnału PCR lub qPCR, która jest proporcjonalna do ilości γH2A. X związany w tym miejscu, dostarczając wglądu w specyficzne dla miejsca uszkodzenia DNA i zdarzenia naprawy 16,17,18.

Pomimo tego, że jest to potężne podejście eksperymentalne, X-ChIP ma kilka istotnych ograniczeń: (i) wymaga dużej liczby komórek, zwykle w zakresie od 1 x 107 do 5 x 107, ze względu na nieefektywność wytrącania przeciwciał związanego z fiksacją, co zwiększa całkowity koszt eksperymentu19; (ii) proces odwracania wiązań krzyżowych formaldehydu i późniejszego oczyszczania DNA jest czasochłonny i pracochłonny, co utrudnia utrzymanie spójności i wiarygodności wyników; oraz (iii) γH2A. Interakcje X-DNA o niewielkim znaczeniu funkcjonalnym mogą nie być odróżniane od tych o większym znaczeniu, ponieważ etap sieciowania może stabilizować interakcje przejściowe, prowadząc do wykrycia interakcji, które mogą nie być biologicznie istotne19.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej (Native ChIP lub N-ChIP) jest podstawową techniką biochemiczną stosowaną do badania interakcji białko-DNA w ich natywnym kontekście chromatyny w fizjologicznych warunkach soli. Odegrał zasadniczą rolę w wyjaśnieniu przestrzennej i czasowej organizacji chromatyny, wiązania czynnika transkrypcyjnego i modyfikacji histonów. Natywny ChIP od dawna odgrywa rolę w szerszej dziedzinie biologii chromatyny i epigenetyki, zapewniając unikalne zalety i ograniczenia w porównaniu z X-ChIP. Metoda ta, wprowadzona pod koniec lat osiemdziesiątych XXwieku20, polega na izolacji chromatyny z komórek za pomocą metod zachowujących jej natywną strukturę, takich jak trawienie nukleazą mikrokokkową (MNazą)21. Zachowuje to nieodłączne kontakty białko-DNA i histon-DNA, co sprawia, że Native ChIP szczególnie dobrze nadaje się do badania modyfikacji histonów i pozycjonowania nukleosomów w ich naturalnym ustawieniu chromatyny22. Badania natywnego ChIP o wysokiej rozdzielczości wykazały zastosowanie trawienia MNazy do redukcji chromatyny do poszczególnych nukleosomów, co ułatwia mapowanie modyfikacji histonów z większą dokładnością23. Ponadto, ponieważ nie ma udziału w chemicznym sieciowaniu, ryzyko wprowadzenia uprzedzeń lub artefaktów, które mogą fałszywie przedstawiać interakcje białko-DNA, jest zminimalizowane24.

W przeciwieństwie do X-ChIP, gdzie formaldehyd lub inne środki sieciujące są używane do naprawy interakcji białko-DNA, Native ChIP zapewnia bardziej realistyczny obraz chromatyny, unikając potencjalnych artefaktów sieciowania. Jednakże, podczas gdy X-ChIP jest ogólnie lepiej przystosowany do wykrywania przejściowych lub dynamicznych interakcji między DNA a białkami regulatorowymi25, Native ChIP jest idealny do stabilnych interakcji białko-DNA, takich jak histony lub inne białka związane z chromatyną 26,27. Jednym z ograniczeń zauważonych dla natywnego ChIP jest niezdolność do przechwytywania zdarzeń wiązania o niskim powinowactwie lub przejściowych, które często są stabilizowane przez sieciowanie krzyżowe w X-ChIP25.

Znaczna część prac w dziedzinie epigenetyki wykorzystała Native ChIP do odkrycia modyfikacji histonów w różnych warunkach biologicznych28. Wysiłki te miały kluczowe znaczenie w zdefiniowaniu kodu histonowego - wzorca modyfikacji histonów, które regulują ekspresję genów i dynamikę chromatyny29. Chociaż H2A. X jest słabiej powiązanym histonem łącznikowym, natywnym H2A. Metoda X ChIP została z powodzeniem zastosowana w embrionalnych komórkach macierzystych30. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy procedurę ekstrakcji chromatyny, aby wykonać natywny ChIP γH2A. X w ludzkich komórkach 293T (ryc. 1). Hydroksymocznik i afidikolina są szeroko stosowane w badaniach nad stresem replikacji DNA, uszkodzeniami i niestabilnością genomu31. W tym badaniu środki te zastosowano do komórek w celu wywołania stresu replikacyjnego i wygenerowania pęknięć DNA w CFS.

Wykorzystując materiał wyjściowy składający się z około 1 x 106 do 5 x 106 komórek, metodę tę można podzielić na cztery główne etapy: (i) frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania chromatyny, (ii) trawienie nukleazy mikrokokowej (MNazy) w celu fragmentacji chromatyny, (iii) immunoprecypitacja i elucja oraz (iv) analiza DNA metodą ilościowego PCR (qPCR). Przeprowadzanie ChIP po frakcjonowaniu subkomórkowym zapewnia wiele korzyści i zostało dobrze udokumentowane w licznych badaniach 32,33,34,35. Takie podejście pozwala na usunięcie białek niezwiązanych z chromatyną i innych zanieczyszczeń komórkowych, co skutkuje wysoce oczyszczoną frakcją chromatyny. Poprzez wyizolowanie chromatyny przed immunoprecypitacją, frakcjonowanie subkomórkowe pomaga utrzymać natywne interakcje chromatyny i redukuje szum tła z białek niezwiązanych z chromatyną, co prowadzi do bardziej szczegółowych i wiarygodnych wyników, ponieważ do analizy zachowuje się tylko kompleksy związane z chromatyną. Co więcej, frakcjonowanie subkomórkowe umożliwia łagodniejsze warunki trawienia chromatyny, zachowując w ten sposób fizjologiczne interakcje białko-DNA i oferując dokładniejsze odwzorowanie dynamiki chromatyny w natywnym środowisku komórkowym.

Wykorzystanie natywnego ChIP γH2AX do pomiaru wpływu czynników zewnętrznych na powszechne kruche pęknięcia miejsc ma znaczny potencjał w badaniach nad rakiem. Technika ta umożliwia wykrywanie uszkodzeń DNA wywołanych narażeniem na środowiskowe czynniki rakotwórcze, dostarczając informacji na temat mechanizmów molekularnych, za pomocą których zanieczyszczenia przyczyniają się do niestabilności genomu i rozwoju raka. Zachowując natywny kontekst chromatyny, metoda ta ułatwia dokładną ocenę wzorców uszkodzeń DNA związanych z narażeniem na działanie rakotwórcze, pomagając w ocenie zagrożeń środowiskowych i badaniu nowotworzenia spowodowanego zanieczyszczeniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie komórek

  1. Wysiewać około 5 x 105 komórek HEK 293T do każdej z czterech 6-centymetrowych szalek, z których każda zawiera 4 ml kompletnego podłoża DMEM.
  2. Po 24 godzinach potraktować jedno naczynie 2 μl 1 mM roztworu podstawowego afidikoliny (patrz tabela materiałów) (końcowe stężenie 0,5 μM) i inne naczynie 20 μl 1 M roztworu podstawowego hydroksymocznika (patrz tabela materiałów) (końcowe stężenie 5 mM) w celu wywołania stresu replikacyjnego. Dodaj DMSO do pozostałych dwóch potraw, aby służyły jako kontrole.
  3. Po 24 godzinach od poddania działaniu należy wyrzucić pożywkę hodowlaną. Jedna płytka o średnicy 6 cm zwykle daje około 2 x 106 komórek przy zbiegu 60%-70%.
  4. Opłucz każde naczynie 2x 5 ml lodowatego 1x PBS. Użyj skrobaków do komórek, aby odłączyć komórki i przenieść zawiesinę komórek do czterech pojedynczych probówek o pojemności 1,5 ml. Delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą pipety P1000, aby oddzielić wszelkie grudki komórek.
  5. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant. Umieść komórki na lodzie.

2. Frakcjonowanie subkomórkowe

  1. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl świeżo przygotowanego zimnego buforu A (patrz Tabela 1), zapewniając całkowitą dysocjację grudek komórek poprzez delikatne pipetowanie.
  2. Inkubować lizaty na lodzie przez 5-10 minut. Sprawdź postęp lizy pod mikroskopem, aby upewnić się, że całkowita liza komórek.
    1. Pobrać niewielką porcję lizatu (około 5 - 10 μl) i umieścić ją na czystym szkiełku mikroskopowym. Przykryj go szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    2. Użyj mikroskopu świetlnego o odpowiednim powiększeniu (np. 20x - 40x), aby uwidocznić komórki lub szczątki. Porównaj z niezlizowaną próbką kontrolną, aby odróżnić nienaruszone komórki od materiału poddanego lizie.
      UWAGA: Prawidłowo zlizowana próbka nie będzie miała wyraźnych konturów komórek, a jedynie rozproszoną chromatynę lub materiał komórkowy. Dostosuj ostrość, aby wyraźnie obserwować lizat. W razie potrzeby należy zastosować siłę mechaniczną na etapie lizy, na przykład przy użyciu homogenizatora Dounce, podczas pracy z niektórymi typami komórek.
  3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, gdy komórki są całkowicie zwapnione. Ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad jądrowy w 500 μl zimnego buforu A za pomocą końcówek pipet o szerokim otworze.
    UWAGA: Końcówki o szerokich otworach pomagają zminimalizować siły ścinające i chronić delikatne próbki, takie jak chromatyna. Wykonuj końcówki o szerokim otworze, odcinając koniec standardowych końcówek ostrym ostrzem.
  4. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
  5. Rozgrzać inkubator do temperatury 37 °C i przygotować bufor zatrzymujący (100 mM EDTA, pH 8,0; Tabela 1).
  6. Zoptymalizuj z wyprzedzeniem stężenia nukleazy mikrokokowej (MNazy, patrz tabela materiałów) i czas inkubacji.
    1. Podzielić 40 μl badanej próbki chromatyny na kilka równych podwielokrotności, aby przetestować różne stężenia MNazy i czasy inkubacji.
    2. Stosować różne stężenia MNazy (np. 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U na reakcję) i testować wielokrotne czasy inkubacji (np. 2, 5, 10 i 15 min).
    3. Dodać bufor MNazy (patrz Tabela 1) zawierający różne stężenia MNazy do podwielokrotności chromatyny i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez określony czas.
    4. Zakończyć reakcję przez dodanie 1/4 objętości buforu zatrzymującego (stężenie końcowe: 20 mM EDTA) natychmiast po pożądanym czasie inkubacji.
    5. Wyizolować DNA z strawionych próbek chromatyny przy użyciu metody ekstrakcji fenolem/chloroformem/alkoholem izoamylowym.
    6. Uruchom wyekstrahowane DNA na 1,5% żelu agarozowym, aby uwidocznić wzorce trawienia: Niedostateczne trawienie pokaże pasma o dużej masie cząsteczkowej (ryc. 2, pas 1-4); nadmierne trawienie spowoduje rozmaz lub bardzo krótkie fragmenty (Figura 2, tor 6-8), a optymalne trawienie da wyraźny wzór drabiny nukleosomalnej (Figura 2, ścieżka 5, np. mono-, di-, trinukleosomy).
    7. Zidentyfikuj warunki, które wytwarzają pożądaną rozdzielczość nukleosomalną bez nadmiernego trawienia.
      UWAGA: CaCl2 działa jako kofaktor dla aktywności MNazy. Zoptymalizuj trawienie, dostosowując stężenie CaCl2 w zakresie od 1 mM do 5 mM.
  7. Delikatnie zawiesić nienaruszone jądra za pomocą 100 μl buforu MNazy, pipetując 5 - 10 razy końcówkami o szerokich otworach. Natychmiast dodać do próbek wcześniej określoną ilość MNazy (1,25 U MNazy/100 μL buforu MNazy).
    UWAGA: Podczas pracy z wieloma próbkami trawić każdą z nich osobno, aby uniknąć nadmiernego trawienia.
  8. Umieścić probówki na rotatorze i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiast umieścić probówki z powrotem w lodzie i zakończyć trawienie MNazy poprzez dodanie EDTA do końcowego stężenia 20 mM i wymieszać przez wirowanie.
  9. Dodać 500 μl buforu B (patrz tabela 1) do każdej próbki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 5-10 razy. Rozpuszczaj białka przez inkubację na lodzie przez 5 minut.
    UWAGA: Sól i detergent zawarte w buforze B pomagają dysocjować słabe białka związane z chromatyną i wystawiać epitopy na immunoprecypitację.
  10. Osadzać nierozpuszczalny materiał przez odwirowywanie z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść klarowny supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml oznaczonych jako natywna frakcja chromatyny. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub wykorzystane do walidacji skuteczności fragmentacji chromatyny.
    UWAGA: Unikaj częstych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one zakłócić interesujące interakcje białko-DNA. Zminimalizuj cykle zamrażania i rozmrażania, gdy tylko jest to możliwe.

3. Weryfikacja fragmentacji chromatyny

  1. Porcję 10 μl supernatantu z każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Zmieszać z 20 μl wody destylowanej i 30 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1).
  2. Zamknij szczelnie rurki i energicznie wiruj przez 15-30 s. Wirować przy 20 000 x g (lub maksymalnej prędkości wirówki) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu będą obserwowane trzy wyraźne warstwy: przezroczysta warstwa górna, biała warstwa środkowa i żółta warstwa dolna.
  3. Ostrożnie przenieść 20 μl górnej fazy wodnej (zawierającej DNA) do świeżej probówki. Oddziel oczyszczone DNA w 1,5% żelu agarozowym przez 30 minut przy 100 V i uwidocznij wzorce trawienia. Upewnij się, że wielkość fragmentów chromatyny wynosi przede wszystkim od 200 do 1000 par zasad.
    UWAGA: Właściwe rozmiary fragmentów chromatyny mają kluczowe znaczenie dla powodzenia natywnego ChIP i zależą od warunków leczenia MNazą, w tym jednostek enzymatycznych, czasu inkubacji i stężenia CaCl2. Wydajność trawienia MNazy może się również różnić w zależności od typu i liczby komórek. Wzór fragmentacji chromatyny pokazany na rysunku 2 (tor 5) jest zalecany dla tego testu ChIP.

4. Immunoprecypitacja

  1. Porcję 20 μl strawionej chromatyny z każdej próbki do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszać ze 180 μl buforu elucyjnego (patrz tabela 1). Oznaczyć te probówki jako próbki wejściowe i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przenieść 400 μl próbki chromatyny do innej probówki o pojemności 1,5 ml dla ChIP.
  3. Dodać γH2A. X przeciwciała (patrz tabela materiałów) do jednej próbki poddanej działaniu DMSO, jednej próbki poddanej działaniu afidikoliny i jednej próbki poddanej działaniu hydroksymocznika. Dodać taką samą ilość normalnej IgG (patrz tabela materiałów) do innej próbki poddanej działaniu DMSO jako kontrolę ujemną dla testu ChIP.
    UWAGA: W tym przypadku 1 μg przeciwciała pierwszorzędowego jest zwykle używany na 400 μl chromatyny (tj. końcowe stężenie przeciwciała wynosi 2,5 μg / ml). Jednak optymalna ilość powinna być empirycznie określona dla różnych γH2A. Przeciwciała X.
  4. Umieścić probówki ChIP na rotatorze w temperaturze 4 °C i inkubować przez co najmniej 5 godzin, a najlepiej przez noc.
  5. W międzyczasie przelej 100 μl magnetycznych kulek białkowych A/G klasy ChIP (patrz Tabela Materiałów) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Używaj końcówek z szerokim otworem i powoli pipetuj, aby zapewnić dokładny pomiar kulek. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 1 minutę, a następnie ostrożnie wylej płyn.
  6. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml 1x PBS zawierającego 0,5% BSA. Obracać w temperaturze 4 °C przez około 4 godziny. Umieścić probówkę na stojaku magnetycznym na co najmniej 1 minutę i wyrzucić supernatant.
  7. Ponownie umyj kulki 1 ml 1x PBS zawierającego 0,5% BSA. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby ogranulować kulki magnetyczne, a następnie wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Kroki od 4.5 do 4.7 to wstępne powlekanie kulek w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania przeciwciał z kulkami magnetycznymi.
  8. Ponownie zawiesić wstępnie powlekane kulki w 100 μl buforu B za pomocą końcówek o szerokich otworach. Dodać 25 μl wstępnie powlekanej zawiesiny kulek magnetycznych do każdej probówki z próbką ChIP. Obracać w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
  9. Umieść rurki ChIP na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż koraliki zostaną całkowicie przymocowane do boku rurki, a roztwór stanie się klarowny.
  10. Odrzucić klarowny supernatant bez naruszania kulek magnetycznych. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml buforu do przemywania (patrz Tabela 1) i obracać w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  11. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Wyrzuć bufor do mycia. Powtórz pranie, w sumie cztery prania.
  12. Po ostatnim płukaniu odrzucić bufor do płukania i krótko odwirować probówki o sile 400 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, aby odwirować pozostałą ciecz. Umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym i ostrożnie usuń pozostały płyn z dna tuby.

5. Elucja i wytrącanie DNA

UWAGA: Skuteczność przeciwciał może się różnić w zależności od partii. Ważne jest, aby potwierdzić powinowactwo wiązania nowego przeciwciała poprzez sprawdzenie próbek wytrąconych immunologicznie za pomocą analizy Western blot.

  1. Sprawdź skuteczność obniżania przeciwciał ChIP za pomocą Western blot (WB), jak opisano poniżej.
    1. Do analizy należy pobrać niewielką podwielokrotność próbki ChIP (tj. zwykle 10% próbki ChIP). Dla porównania uwzględnij chromatynę wejściową (pre-immunoprecypitacja) i kontrolę negatywną (np. IgG pull-down).
    2. Eluować białka z kulek związanych z przeciwciałami przez ogrzewanie w 20 μl 1x buforu ładującego SDS-PAGE (patrz tabela materiałów) w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    3. Załaduj próbki IP, dane wejściowe i elementy sterujące na 15% żel SDS-PAGE. Uruchom żel.
    4. Przenieść białka na nitrocelulozę 0,2 μm (patrz tabela materiałów) lub membranę PVDF za pomocą mokrego lub półsuchego systemu transferowego.
    5. Zablokować membranę 5% mlekiem beztłuszczowym lub BSA w TBST (patrz Tabela 1) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    6. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko γH2A. X (patrz tabela materiałów) rozcieńczony w buforze blokującym przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Przemyj membranę 3x TBST, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (patrz tabela materiału) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj membranę, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.
    8. Rozwinąć membranę za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego i zwizualizować sygnał za pomocą imagera. Porównaj intensywność sygnału między pasmami IP, wejściowymi i sterującymi, aby ocenić wydajność i specyfikę pull-down.
      UWAGA: Prążek odpowiadający białku docelowemu na pasie IP potwierdza pomyślne usunięcie przeciwciał. Takie podejście zapewnia możliwość oceny skuteczności przeciwciała w wychwytywaniu białka docelowego podczas eksperymentu ChIP.
  2. Dodać 50 μl buforu elucyjnego (patrz tabela 1) do każdej z pozostałych próbek ChIP. Umieść probówki na termomikserze i potrząsaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść probówki na uchwycie magnetycznym na co najmniej 1 minutę. Zebrać elucję do nowych probówek. Powtórz 1x i zbierz elucję w tych samych probówkach.
  4. Dodać dodatkowe 100 μl buforu elucyjnego do każdej próbki elucyjnej ChIP i 180 μl buforu elucyjnego do każdej próbki wejściowej.
  5. Dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) do każdej próbki i energicznie wirować. Odwirować próbki przy 20 000 x g (lub maksymalnej prędkości) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Dodać 19 μl octanu sodu 3M (NaOAc, pH 5,2; patrz tabela 1) i 2 μl roztworu glikogenu (20 mg/ml, patrz tabela materiałów) do każdej nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  7. Po odwirowaniu ostrożnie przenieść górną warstwę wodną (około 190 μl) do probówek zawierających NaOAc i glikogen i wymieszać przez wirowanie.
  8. Dodaj 500 μl 100% etanolu i wiruj. Wytrącić DNA przez inkubację próbek w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
  9. Odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g (lub maksymalnej prędkości) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad, uważając, aby nie naruszyć białego osadu. Zawiesić granulkę w 1 ml 70% etanolu i dokładnie wymieszać.
  10. Odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g (lub maksymalnej prędkości) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie krótko odwirować probówki, aby odwirować resztki etanolu. Ostrożnie usuń etanol za pomocą pipety P20. Suszyć granulki DNA na powietrzu przez 2-3 minuty.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego wysuszania granulki, ponieważ może to utrudnić ponowne rozpuszczenie DNA.
  11. W przypadku próbek ChIP należy ponownie zawiesić DNA w 400 μl buforu TE (patrz Tabela 1). W przypadku wejściowego DNA zawiesić ponownie w 1000 μl buforu TE. Wymyte próbki można teraz przechowywać w temperaturze -20°C.

6. Kwantyfikacja qPCR

  1. Przeprowadzić qPCR przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) z technicznymi potrójnymi próbkami dla każdej próbki. Potwierdź obecność pojedynczego specyficznego produktu PCR, przeprowadzając analizę krzywej topnienia w celu zapewnienia swoistości amplifikacji36.
  2. Analiza danych
    UWAGA: W względnej analizie ilościowej badana próbka jest wyrażona jako krotna zmiana w stosunku do próbki kontrolnej (immunoprecypitowana przy użyciu normalnej oczyszczonej IgG lub imitacji IP). Loci DNA, o których wiadomo, że nie są zajęte przez białko immunoprecypitowane (locus ujemny), mogą być używane w ten sposób jako gen referencyjny w porównaniu ze znanymi, zajętymi, kontrolnymi loci DNA36.
    1. Oblicz procent danych wejściowych dla każdego ChIP, korzystając z poniższego wzoru
      %Input = 2(-ΔCt [znormalizowane ChIP])
    2. Znormalizować dodatnie wartości locus ΔCt do ujemnego locus (ΔΔCt), odejmując wartość ΔCt uzyskaną dla dodatniego locus od wartości ΔCt dla ujemnego locus, korzystając z poniższego wzoru
      (ΔΔCt = ΔCtdodatni - ΔCtujemny)
    3. Oblicz wzbogacenie fałdowania dodatniej sekwencji locus w DNA ChIP w stosunku do ujemnego locus, korzystając z poniższego wzoru
      Wzbogacenie fałdy =2ΔΔCt
      Sekwencje starterów qPCR użytych do analizy przedstawiono w tabeli 2. Organizacja genomowa FRA3B i FRA16D37jest przedstawiona na rysunku 3A,B.
  3. Analiza statystyczna
    1. Przeanalizuj wyniki statystycznie za pomocą sparowanego testu t-Studenta. Wartość p ≤0,05 jest uważana za statystycznie istotną, co wskazuje, że obserwowane różnice prawdopodobnie nie wynikają z losowej zmienności38.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielkość fragmentów chromatyny ma kluczowe znaczenie dla powodzenia Native ChIP, ponieważ bezpośrednio wpływa na dostępność regionów DNA do wiązania przeciwciał. W celu wyznaczenia optymalnego stężenia MNazy do fragmentacji chromatyny przygotowaliśmy serię probówek mikrowirówkowych zawierających różne stężenia MNazy (tj. 0,0625 U, 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U na reakcję) oraz 40 μL izolowanych jąder. Każdą reakcję inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby uzyskać zakres rozmiarów fragmentów chromat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanieczyszczenie środowiska jest znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do powstawania nowotworów u ludzi. Wiele zanieczyszczeń jest rakotwórczych, co oznacza, że mogą powodować uszkodzenia genetyczne, które prowadzą do rozwoju raka40,41. Jednak ustalenie, czy dana substancja jest rakotwórcza, jest trudnym zadaniem. Szybka, niezawodna i ekonomiczna metoda identyfikacji potencjału rakotwórczego umożliwiłaby naukowcom skuteczne badania przesiewowe zanieczyszczeń ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez fundusze start-upów Uniwersytetu Południowych Chin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m Membrana nitrocelulozowaAmersham10600011
Aktyna BTechnologia białkowa20536-1-AP
AfidikolinMedChemExpress (Ekspres Medyczny)HY-N6733 (wersja angielska)
Magnetyczne kulki białkowe A / G klasy ChIPRybak termiczny26162
Czystość Zachodnie podłoże ECLBio-Rad#1705061
Glikogen klasy biologii molekularnejRybak termicznyKot. Nie.  Czynnik R0561
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP Technologia białkowaSA00001-2
hydroksymocznik MedChemExpress (Ekspres Medyczny)HY-B0313 powiedział:
Nukleaza mikrokokowa NEBZobacz materiał M0247S
normalne IgG Santa CruzSC-2025 powiedział:
Taq Universal SYBR Green Supermix Przedsiębiorstwo BioRad1725120
γ H2A. Przeciwciało X  (dla ChIP)Sigma-Aldrich05-636
γ H2A. Przeciwciało X (dla WB)Sygnalizacja komórkowa#25955

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glover, T. W., Berger, C., Coyle, J., Echo, B. DNA polymerase alpha inhibition by aphidicolin induces gaps and breaks at common fragile sites in human chromosomes. Hum Genet. 67 (2), 136-142 (1984).
  2. Bignell, G. R., et al. Signatures of mutation and selection in the cancer genome. Nature. 463 (7283), 893-898 (2010).
  3. Hellman, A., et al. A role for common fragile site induction in amplification of human oncogenes. Cancer Cell. 1 (1), 89-97 (2002).
  4. Kotzot, D., et al. Parental origin and mechanisms of formation of cytogenetically recognisable de novo direct and inverted duplications. J Med Genet. 37 (4), 281-286 (2000).
  5. Miller, C. T., et al. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. Oncogene. 25 (3), 409-418 (2006).
  6. Zack, T. I., et al. Pan-cancer patterns of somatic copy number alteration. Nat Genet. 45 (10), 1134-1140 (2013).
  7. Gao, G., et al. Common fragile sites (CFS) and extremely large CFS genes are targets for human papillomavirus integrations and chromosome rearrangements in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer. 56 (1), 59-74 (2017).
  8. Thorland, E. C., Myers, S. L., Gostout, B. S., Smith, D. I. Common fragile sites are preferential targets for HPV16 integrations in cervical tumors. Oncogene. 22 (8), 1225-1377 (2003).
  9. Matovina, M., Sabol, I., Grubisić, G., Gasperov, N. M., Grce, M. Identification of human papillomavirus type 16 integration sites in high-grade precancerous cervical lesions. Gynecol Oncol. 113 (1), 120-127 (2009).
  10. Yu, T., et al. The role of viral integration in the development of cervical cancer. Cancer Genet Cytogenet. 158 (1), 27-34 (2005).
  11. Bignell, G. R., et al. Signatures of mutation and selection in the cancer genome. Nature. 463 (7283), 893-898 (2010).
  12. Thavathiru, E., Ludes-Meyers, J. H., MacLeod, M. C., Aldaz, C. M. Expression of common chromosomal fragile site genes, WWOX/FRA16D and FHIT/FRA3B is downregulated by exposure to environmental carcinogens, UV, and BPDE but not by IR. Mol Carcinog. 44 (3), 174-182 (2005).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  14. Barlow, J. H., et al. Identification of early replicating fragile sites that contribute to genome instability. Cell. 152 (3), 620-632 (2013).
  15. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Shanbhag, N. M., Rafalska-Metcalf, I. U., Balane-Bolivar, C., Janicki, S. M., Greenberg, R. A. ATM-dependent chromatin changes silence transcription in cis to DNA double-strand breaks. Cell. 141 (6), 970-981 (2010).
  18. Stiff, T., et al. ATR-dependent phosphorylation and activation of ATM in response to UV treatment or replication fork stalling. EMBO J. 25 (24), 5775-5782 (2006).
  19. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nuc Acids Res. 34 (5), e2(2006).
  20. Dorbic, T., Wittig, B. Isolation of oligonucleosomes from active chromatin using HMG17-specific monoclonal antibodies. Nuc Acids Res. 14 (8), 3363-3376 (1986).
  21. Dorbic, T., Wittig, B. Chromatin from transcribed genes contains HMG17 only downstream from the starting point of transcription. EMBO J. 6 (8), 2393-2399 (1987).
  22. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO J. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  23. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Clayton, A. L., Crane-Robinson, C. Histone acetylation and globin gene switching. Nuc Acids Res. 20 (5), 1017-1022 (1992).
  24. Hebbes, T. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBO J. 13 (8), 1823-1830 (1994).
  25. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trend Biochem, Sci. 25 (3), 99-104 (2000).
  26. Myers, F. A., Evans, D. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Targeted and extended acetylation of histones H4 and H3 at active and inactive genes in chicken embryo erythrocytes. J Biol Chem. 276 (23), 20197-20205 (2001).
  27. Litt, M. D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M. N., Felsenfeld, G. Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J. 20 (9), 2224-2235 (2001).
  28. Madisen, L., Krumm, A., Hebbes, T. R., Groudine, M. The immunoglobulin heavy chain locus control region increases histone acetylation along linked c-myc genes. Mol Cell Biol. 18 (11), 6281-6292 (1998).
  29. Clayton, A. L., Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Histone acetylation and gene induction in human cells. FEBS Lett. 336 (1), 23-26 (1993).
  30. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  31. Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Ann Rev Genetics. 41, 169-192 (2007).
  32. Lee, J. B., Keung, A. J. Chromatin immunoprecipitation in human and yeast cells. Methods Mol Biol. 1767, 257-269 (2018).
  33. Miyamoto, R., Yokoyama, A. Protocol for fractionation-assisted native ChIP (fanChIP) to capture protein-protein/DNA interactions on chromatin. STAR Protoc. 2 (2), 100404(2021).
  34. Mendez, J., Stillman, B. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: Assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol Cell Biol. 20 (22), 8602-8612 (2000).
  35. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-κB gene network by chromatin immunoprecipitation. BioTechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
  36. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  37. Lu, X., Parvathaneni, S., Hara, T., Lal, A., Sharma, S. Replication stress induces specific enrichment of RECQ1 at common fragile sites FRA3B and FRA16D. Mol Cancer. 12, 29(2013).
  38. Ruijter, J. M., et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucl Acids Res. 37 (6), e45(2009).
  39. Lyu, X., Chastain, M., Chai, W. Genome-wide mapping and profiling of γH2AX binding hotspots in response to different replication stress inducers. BMC Genomics. 20, 579(2019).
  40. Farmer, P. B., et al. Molecular epidemiology studies of carcinogenic environmental pollutants. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environmental pollution on exogenous and oxidative DNA damage. Mutat Res. 544 (2-3), 397-402 (2003).
  41. Phillips, D. H., Arlt, V. M. Genotoxicity: damage to DNA and its consequences. EXS. 99, 87-110 (2009).
  42. Nitsch, S., Schneider, R. Native ChIP: Studying the genome-wide distribution of histone modifications in cells and tissue. Meth Mol Biol. 2846, (2024).
  43. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  44. Teves, S. S., Henikoff, S. Salt fractionation of nucleosomes for genome-wide profiling. Methods Mol Biol. 833, 421-432 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ChIP dla Gamma H2A Xstres replikacyjnyimmunoprecypitacja chromatynyodpowied na uszkodzenia DNAfrakcjonowanie subkom rkowetrawienie nukleaz mikrokokkowfragmentacja chromatynystabilno genomunaprawa DNA

Powiązane artykuły