Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test ligacji zbliżeniowej do badania konfliktów transkrypcji-replikacji pochodzących z onkogenu

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67537

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Preventio, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy czułą i specyficzną metodę wykrywania konfliktów transkrypcji-replikacji wywołanych onkogenem (TRC) za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Podejście to wykorzystuje specyficzne przeciwciała skierowane przeciwko PCNA i fosfo-CTD RNAPII, umożliwiając ocenę częstości występowania TRC między transkrypcją polimerazy II RNA a maszynerią replikacji DNA.

Streszczenie

Zarówno replikacja DNA, jak i transkrypcja RNA wykorzystują genomowe DNA jako swój szablon, co wymaga przestrzennego i czasowego rozdzielenia tych procesów. Konflikty między maszynerią replikacyjną i transkrypcyjną, zwane konfliktami transkrypcji-replikacji (TRC), stanowią znaczne ryzyko dla stabilności genomu, kluczowego czynnika w rozwoju raka. Chociaż zidentyfikowano kilka czynników regulujących te kolizje, wskazanie głównych przyczyn pozostaje trudne ze względu na ograniczone narzędzia do bezpośredniej wizualizacji i jasnej interpretacji. W tym badaniu bezpośrednio wizualizujemy TRC za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA), wykorzystując przeciwciała specyficzne dla PCNA i fosforylowanego CTD polimerazy RNA II. Takie podejście pozwala na precyzyjny pomiar TRC między procesami replikacji i transkrypcji, w których pośredniczy polimeraza RNA II. Metoda jest dodatkowo udoskonalona dzięki starterom DNA skoniugowanym kowalencyjnie z tymi przeciwciałami, w połączeniu z amplifikacją PCR za pomocą sond fluorescencyjnych, zapewniając wysoce czuły i specyficzny sposób wykrywania endogennych TRC. Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację tych konfliktów, oferując potężne narzędzie do badania mechanizmów niestabilności genomu związanych z rakiem. Technika ta wypełnia lukę w bezpośredniej wizualizacji TRC, umożliwiając bardziej kompleksową analizę i zrozumienie procesów leżących u podstaw niestabilności genomu w komórkach.

Wprowadzenie

Genom służy jako szablon dla podstawowych procesów biologicznych, w tym replikacji i transkrypcji. W zdrowych komórkach maszyneria transkrypcji RNA i replikacji DNA zazwyczaj współpracują i są przestrzennie i czasowo oddzielone1,2,3,4. Jednak w warunkach patologicznych, takich jak nadekspresja onkogenu, ta harmonijna współpraca może zostać zakłócona.

Onkogeny często powodują podwyższony poziom transkrypcji, zwiększając prawdopodobieństwo kolizji między maszynerią transkrypcji i replikacji5. Niektóre onkogeny zmieniają architekturę chromatyny, czyniąc ją bardziej dostępną do transkrypcji, ale potencjalnie utrudniając progresję widełek replikacyjnych5. Dodatkowo, aktywacja onkogenu może indukować stres replikacyjny poprzez przyspieszenie cyklu komórkowego6. Aktywność polimerazy RNA II (RNAPII) jest znacznie podwyższona podczas przejścia fazowego G1 / S z powodu fosforylacji Rb przez kinazę zależną od cyklin (CDK), która uwalnia czynniki transkrypcyjne E2F, które promują transkrypcję niezbędnych białek, w tym cyklin, CDK i genów porządkowych7. Ekspresja genu histonów osiąga szczyt w fazie S, co zbiega się z replikacją DNA8. Co więcej, transkrypcja pełnowymiarowych transkryptów niektórych bardzo długich genów wymaga więcej niż jednego cyklu komórkowego9. Przy każdym wejściu w fazę S, jednoczesna aktywność maszynerii transkrypcyjnej i replikacyjnej w tych samych regionach genomu może skutkować szkodliwymi spotkaniami, prowadzącymi do konfliktów. Konflikty te są głównym wewnętrznym źródłem niestabilności genomu, która jest ściśle związana z nowotworzeniem (ang. cancergeneza). Ważnym pytaniem pozostaje, w jaki sposób maszyneria replikacyjna koordynuje się z transkrypcją RNAPII, aby zapobiec szkodliwym kolizjom i utrzymać stabilność genomu. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja konfliktów transkrypcji-replikacji (TRC) związanych z RNAPII stała się niezbędna do zrozumienia mechanizmów molekularnych, które rozwiązują te konflikty i może ostatecznie położyć podwaliny pod wykorzystanie tych konfliktów do celów terapeutycznych.

Konflikty między transkrypcją a replikacją (TRC) mogą pojawiać się w dwóch kierunkach: czołowej, gdzie transkrypcja i replikacja postępują względem siebie, oraz współkierunkowej, gdzie poruszają się w tym samym kierunku. Zderzenia czołowe są o wiele bardziej destrukcyjne niż zderzenia współkierunkowe10,11,12,13. Tworzenie hybryd DNA-RNA (R-loops) zostało zidentyfikowane jako główny czynnik napędzający TRC; w związku z tym znaczna liczba badań wywnioskowała obecność TRC, oceniając występowanie pętli R i ich regionów w odpowiedzi na rozregulowaną replikację i/lub transkrypcję10,11. Jednak to, czy akumulacja pętli R pochodzących z transkrypcji służy jako proporcjonalna przeszkoda w replikacji i bezpośrednio koreluje z TRC, pozostaje nierozwiązanym pytaniem. Naukowcy zbadali również TRC, analizując dynamikę widełek replikacyjnych. Na przykład, dwuwymiarowa elektroforeza żelowa genów reporterowych może ujawnić specyficzne dla locus pausing12, podczas gdy testy włókien DNA pozwalają badaczom badać zmiany w prędkości widełek replikacyjnych, gęstości pochodzenia i asymetrii wideł13. Postęp technologii sekwencjonowania nowej generacji doprowadził do opracowania kilku innowacyjnych metod, takich jak sekwencjonowanie fragmentów Okazaki (Ok-seq)14,15, sekwencjonowanie miejsca inicjacji (ini-seq)16,17, sekwencjonowanie krótkich nici powstających (SNS-seq)18, Repli-seq19 oraz sekwencjonowanie użycia polimerazy (Pu-seq)20. Techniki te dostarczyły profili całego genomu w zakresie wykorzystania początków replikacji, kierunkowości widełek i zakończenia replikacji, ujawniając kluczowe czynniki zaangażowane w koordynację replikacji i transkrypcji. TRIPn-seq jest jedną z niewielu metod zdolnych do bezpośredniego wykrywania jednoczesnego zajmowania transkrypcji i replikacji, znacznie poszerzając naszą wiedzę na temat dynamicznej organizacji replikacji i transkrypcji DNA w warunkach fizjologicznych i patologicznych21. Pomimo cennych spostrzeżeń dostarczanych przez te metody oparte na sekwencjonowaniu, ich wysoki koszt i czasochłonność ograniczają ich szersze zastosowanie. Dlatego tak ważne jest ustanowienie bardziej definitywnej, wysoce czułej, wygodnej i szybkiej metody wykrywania w celu wizualizacji i ilościowego określenia TRC na poziomie pojedynczej komórki.

Test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA), znany również jako technologia Duolink PLA, jest potężną metodą oceny fizycznej bliskości docelowych białek w sekcjach tkanek lub hodowlach komórkowych. Technika ta generuje sygnał tylko wtedy, gdy dwa białka lub kompleksy białkowe znajdują się w odległości 40 nm od siebie. Wymaga dwóch podstawowych przeciwciał przeciwko białkom docelowym, z których każde pochodzi z innego gatunku (np. mysz / królik, królik / koza lub mysz / koza). Po inkubacji próbki z tymi przeciwciałami pierwszorzędowymi stosuje się przeciwciała drugorzędowe znane jako sondy PLA (jedna PLUS i jedna MINUS). W przeciwieństwie do zwykłych przeciwciał drugorzędowych, które wiążą się ze stałymi regionami przeciwciał pierwszorzędowych, sondy PLA są kowalencyjnie połączone ze specyficznymi starterami DNA. Gdy białka docelowe znajdują się w bliskiej odległości (mniej niż 40 nm), oligonukleotyd konektorowy może hybrydyzować z obiema sondami PLA, ułatwiając enzymatyczną ligację przyłączonych oligonukleotydów do cząsteczki DNA o pełnej długości. To nowo utworzone DNA służy jako zastępczy marker dla wykrytej interakcji białkowej i działa jako matryca do amplifikacji. Amplifikowany produkt jest następnie wizualizowany za pomocą znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych. Jeśli białka są oddalone od siebie o więcej niż 40 nm, sondy PLA nie mogą utworzyć matrycy DNA, co skutkuje brakiem wykrywalnego sygnału. Schemat ideowy PLA jest przedstawiony w Rysunek 1. Bliskość i/lub oddziaływanie są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej jako kropki fluorescencyjne, a liczbę i intensywność tych punktów można określić ilościowo. Od czasu wynalezienia w 2002 roku, PLA stał się popularny w monitorowaniu interakcji białek ze względu na swoją wysoką czułość i specyficzność. W przeciwieństwie do testów opartych na sekwencjonowaniu, PLA wymaga tylko niewielkich ilości próbek, co czyni go korzystnym do analizy rzadkich próbek.

Badania wykazały, że ekspresja onkogennej mutacji KRAS G12D prowadzi do konfliktów transkrypcji-replikacji (TRC)22,23. Na przykład badania przedstawione przez Meng et al.23 wskazują, że ektopowa ekspresja KRAS G12D w ludzkich komórkach nabłonka przewodowego trzustki (HPNE) wzmacnia TRC i pętle R związane z TRC. Aby umożliwić wykrywanie kolizji między maszynerią transkrypcji i replikacji RNAPII w liniach komórkowych, udostępniamy protokół opracowany specjalnie w tym celu. Plazmid KRAS (G12D) i kontrola wektora są transfekowane do ludzkich komórek BEAS-2B nabłonka płuc, a ekspresja KRAS (G12D) wraz z uszkodzeniem DNA (γH2AX) jest weryfikowana za pomocą Western blot. Akumulacja pętli R jest potwierdzana przez analizę S9.6 dot blot, co razem wskazuje na akumulację blokad replikacyjnych i niestabilność genomu w komórkach wykazujących ekspresję KRAS (G12D). Na koniec komórki są mocowane na szkiełkach do testu PLA. W celu miejscowego wykrywania zderzeń komórki są najpierw barwione przeciwciałami pierwszorzędowymi RNAPII i PCNA, a następnie barwione przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z sondami PLA. W wyniku udanej ligacji powstaje okrągła cząsteczka DNA, która służy jako matryca do późniejszej amplifikacji toczącego się koła (RCA). Preparaty są następnie montowane za pomocą odpowiednich mediów montażowych i wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obrazy można analizować za pomocą ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja i transdukcja lentiwirusa do docelowej linii komórkowej

  1. Lentivirus production24
    1. Wysiewaj komórki pakujące 293T po 3 × 10 6 komórek na 10 cm - płytka w zmodyfikowanym podłożu Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (DMEM; kompletne podłoże). Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez dodatkowe 18-20 godzin.
    2. W dwóch probówkach o pojemności 1,5 ml przygotuj mieszaninę DNA zawierającą łącznie 24 μg plazmidowego DNA w 500 μl Opti-MEM (zredukowanej pożywki surowicy), która zawiera 9,2 μg psPAX2, 2,8 μg pMD2.G, wraz z 12 μg plazmidu pLVX-KRAS lub pustego wektora odpowiednio.
      UWAGA: Ponieważ endotoksyny znacznie zmniejszają wydajność transfekcji, zaleca się usunięcie endotoksyny z plazmidu podczas oczyszczania.
    3. Rozcieńczyć 144 μl polietylenininy (PEI; 1 mg/ml) w 1 ml zredukowanej pożywki surowicy, wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Dodać kroplami 500 μl rozcieńczonego PEI do rozcieńczonej mieszaniny DNA, delikatnie przesuwając probówkę. Inkubować mieszaniny PEI/DNA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Podczas inkubacji delikatnie zassać pożywkę z wcześniej wysianych 10 cm płytek. Zastąp 10 ml świeżego kompletnego DMEM.
    6. Po inkubacji powoli pipetować mieszankę transfekcyjną DNA: PEI na płytki o średnicy 10 cm, uważając, aby nie odłączyć komórek.
      UWAGA: PEI jest powszechnie stosowanym odczynnikiem do transfekcji, ale jego stężenie musi być starannie zoptymalizowane, aby zrównoważyć skuteczność transfekcji i cytotoksyczność. Pomimo wyższego kosztu Lipofectamine 3000 (odczynnik do transfekcji), wykazała ona wyższą skuteczność transfekcji i niższą cytotoksyczność w porównaniu z PEI w niektórych liniach komórkowych, co prowadzi do poprawy produkcji wirusa. Elektroporacja to kolejna alternatywa, która wykorzystuje impulsy elektryczne do wprowadzania kwasów nukleinowych do komórek. Chociaż jest skuteczny, wymaga specjalistycznego sprzętu i może być bardziej pracochłonny.
    7. Hodować komórki przez 18 godzin, a następnie ostrożnie zastąpić pożywkę do transfekcji świeżą 10 ml pożywki DMEM Complete zawierającej 25 μM chlorochiny.
    8. Po 72 godzinach od transfekcji zebrać pożywkę zawierającą cząstkę wirusa. Wyjąć komórki 293T z opakowania, odwirowując przy 500 x g przez 5 min.
    9. Zebrać supernatant i przefiltrować go przez filtr polieterosulfonowy (PES) 0,45 μm. Wirusowego supernatantu należy używać bezpośrednio.
      UWAGA: Supernatant wirusa powinien być podzielony na porcje i zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C, aby uniknąć utraty miana.
  2. Infekcja lentiwirusowa komórek docelowych
    1. Wysiew 2 × 106 komórek docelowych BEAS-2B na dwóch 6 cm płytkach i wzrost w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc. Podczas transdukcji upewnij się, że komórki BEAS-2B są w około 70% zlewne.
    2. Ostrożnie usuń starą pożywkę i dodaj odpowiednie 0,5 ml KRAS lub wektorowych cząstek lentiwirusowych wraz z 3 ml świeżej, kompletnej pożywki RPMI-1640 odpowiednio na dwie płytki.
    3. Hodować komórki w temperaturze 37 °C przez 18-20 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Zastąp starą pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa 3,5 ml świeżej, wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej. Po 72 godzinach transdukcji zebrać komórki do następującego testu.
      UWAGA: Jeśli całonocna inkubacja z wirusem powoduje toksyczność, czas inkubacji można skrócić do 4 godzin. Aby osiągnąć równowagę między wydajnością transdukcji a zdrowiem komórek, należy rozważyć następujące strategie: (1) Zoptymalizuj liczbę infekcji; (2) Używaj wysokiej jakości preparatów wirusowych; (3) Wykorzystanie polikacji (takich jak polibren) w celu poprawy wydajności, co pozwala na stosowanie niższych mian wirusów i zmniejszenie potencjalnej toksyczności; (4) W przypadku badań długoterminowych należy rozważyć użycie indukowalnych systemów ekspresji do czasowej kontroli ekspresji transgenu, zmniejszając obciążenie komórek i minimalizując potencjalną toksyczność.

2. Weryfikacja uszkodzeń DNA pochodzących z KRAS (G12D) i tworzenia pętli R

  1. Potwierdź ekspresję genów i uszkodzenie DNA za pomocą testu WB
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z płytek.
    2. Delikatnie umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki lub zanieczyszczenia.
    3. Dodaj niewielką objętość 1x PBS, aby komórki były wilgotne podczas procesu skrobania.
    4. Użyj skrobaka do komórek, trzymając go pod kątem, i delikatnie zeskrob komórki z powierzchni w jednolitym kierunku.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, który może uszkodzić ogniwa.
    5. Przechylić płytkę i za pomocą pipety zebrać zawiesinę komórek do probówki i obracać komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
    6. Przygotować 1x bufor RIPA rozcieńczając 2x bufor RIPA (patrz Tabela 1) i dodać koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy bezpośrednio przed użyciem.
    7. Poddać lizie osad komórkowy za pomocą wstępnie schłodzonego buforu RIPA (1x) i inkubować przez 30 minut na lodzie. Usuń zanieczyszczenia, odwirowując przy 15 000 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
    8. Dodać 4 x bufor ładujący próbkę dodecylosiarczanu sodu (SDS) do supernatantu i denaturować białka przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Najpierw należy oddzielić 40 μg białka od każdej próbki w 12,5% żelu do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE), a następnie przenieść go do membran nitrocelulozowych o wielkości 0,2 μm (patrz tabela materiałów).
    9. Po zakończeniu transferu należy zablokować błony buforem blokującym (5% beztłuszczowego mleka w soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającej 0,1% Tween 20 [TBST; Tabela 1]) przez 1 h.
    10. Krótko przepłukać błonę TBST, a następnie inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko znacznikowi FLAG (rozcieńczenie 1:2500 w PBST) i γH2AX (rozcieńczenie 1:1000 w PBST) (patrz tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C.
    11. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć membranę TBST 3 razy, za każdym razem przez 10 minut.
    12. Zanurzyć błony w rozcieńczonych przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP) (1:5 000 w buforze TBST zawierającym 5% mleka beztłuszczowego) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    13. Umyć membranę TBST 3 razy, za każdym razem przez 10 min.
    14. Wizualizacja poziomów białka za pomocą odczynników o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (patrz tabela materiałów).
  2. Wykrywanie pętli R przez Dot blot25
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z płytek.
    2. Delikatnie umyj komórki 1x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki lub zanieczyszczenia.
    3. Dodaj niewielką objętość 1x PBS, aby komórki były wilgotne podczas procesu skrobania.
    4. Użyj skrobaka do komórek, trzymając go pod kątem, i delikatnie zeskrob komórki z powierzchni w jednolitym kierunku.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, który może uszkodzić ogniwa.
    5. Przechylić płytkę i za pomocą pipety zebrać zawiesinę komórek do probówki i obracać komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
    6. Lizuj 2 × 106 komórek za pomocą 300 μl lodowatego buforu do lizy komórek (patrz Tabela 1). Inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Osad zawiera jądra.
    7. Użyj końcówki z szerokim otworem, aby ponownie zawiesić każdą granulkę z 300 μl wstępnie schłodzonego buforu do lizy jądrowej (patrz Tabela 1).
    8. Dodać 3 μl 20 mg/ml proteinazy K (patrz tabela materiałów) do każdej próbki i wytrawiać przez 3-5 godzin w temperaturze 55 °C.
    9. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (patrz Tabela 1) do każdej probówki i dokładnie wymieszać.
    10. Dodać 400 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1 pH 8,0) do każdej probówki. Po energicznym wirowaniu odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić DNA od pozostałej zawartości komórek.
    11. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do nowych probówek.
    12. Wytrącić DNA, dodając do próbki 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości wstępnie schłodzonego 100% etanolu. Dokładnie wymieszać i inkubować przez 4 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Dodanie glikogenu (patrz tabela materiałów) do próbki może zwiększyć odzysk DNA z wytrącania etanolu. Końcowe stężenie glikogenu wynosi około 0,05-1 μg/μL.
    13. Osadzać DNA przez odwirowywanie w stężeniu 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
    14. Przepłukać granulat 1 ml lodowatego 70% etanolu i ponownie odwirować przez 5-15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    15. Ostrożnie wyrzucić supernatant, aby uniknąć naruszenia osadu DNA.
    16. Suszyć na powietrzu granulki DNA przez 5-10 minut.
    17. Rozpuścić osad DNA, dodając 50 μl wstępnie podgrzanego buforu TE (pH 8,0) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Zmierzyć stężenie DNA w każdej próbce.
    18. Przygotować rozcieńczenia DNA do pożądanych stężeń w buforze TE (od 5 ng / μL do 200 ng / μL). Równomiernie nanieść 20 μl każdej próbki na dodatnio naładowaną membranę nylonową za pomocą aparatu do kropek.
      UWAGA: Aby wykryć pętle R za pomocą testu kropkowego, zaleca się zastosowanie około 500 ng genomowego DNA na kropkę. Wykazano, że ilość ta zapewnia wystarczającą czułość do wykrywania hybryd RNA-DNA podczas stosowania przeciwciała monoklonalnego S9.6, które specyficznie wiąże się z tymi strukturami.
    19. Unieruchomić DNA poprzez usieciowanie DNA z membraną nylonową (patrz Tabela materiałów) za pomocą ustawienia "Auto Crosslinker" sieciownika UV (1,200 μJ x 100) (patrz Tabela materiałów).
    20. Zanurzyć membrany w buforze blokującym (patrz Tabela 1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie krótko przepłucz membrany TBST.
    21. Przez noc inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4°C. Rozcieńczenie S9.6 wynosi 1:1,000 w TBST zawierającym 5% BSA.
    22. Usunąć przeciwciało pierwotne i przemyć 3 razy TBST, za każdym razem przez 10 minut.
    23. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w 5% BSA w TBST w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    24. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i przemyć 3 razy TBST, za każdym razem przez 10 minut.
    25. Wizualizacja poziomów pętli R za pomocą odczynników ECL (Enhanced Chemiluminescence) Patrz tabela materiałów).

3. Test PLA

  1. Przygotowanie komórek
    UWAGA: Transdukcja komórek onkogenem KRAS G12D prowadzi do wzrostu TRC, o czym świadczy dodatni sygnał PLA. Metoda ta skutecznie odróżnia TRC napędzane przez onkogen od poziomów tła bez konieczności selekcji antybiotyków. Jednak wdrożenie selekcji antybiotyków po transdukcji może wzmocnić ogólny sygnał poprzez wzbogacenie populacji pomyślnie transdukowanych komórek, poprawiając w ten sposób czułość i swoistość testu.
    1. Umieść szkła nakrywkowe o średnicy 12 mm w każdym dołku płytki 12-dołkowej.
    2. Wysiewaj komórki zakażone lentiwirusem do tych studzienek 24 godziny po zakażeniu i utrzymuj komórki na szkłach nakrywkowych w 500 μl kompletnej pożywki RPMI-1640 w temperaturze 37 °C z 5% CO2.
    3. Optymalny) Jeżeli plan eksperymentalny obejmuje dobór antybiotyków w celu wzbogacenia w celu pomyślnego przetransdukowania komórek, na tym etapie należy dodać odpowiedni antybiotyk do pożywki hodowlanej.
    4. Monitoruj komórki, aby upewnić się, że osiągają około 60% zbiegu 48-72 godziny po zakażeniu.
    5. Ostrożnie usuń RPMI-1640 i wstępnie wyekstrahuj komórki zimnym 0,5% NP-40 przez 4 minuty na lodzie.
    6. Dodać 500 μl buforu utrwalającego (patrz Tabela 1) bezpośrednio, aby utrwalić komórki na 15 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Zaleca się, aby nie myć komórek przed etapem utrwalania, ponieważ może to spowodować ich oderwanie się od powierzchni, na której rosną, zwłaszcza jeśli linia komórkowa jest wrażliwa na oderwanie; Dlatego często preferowane jest bezpośrednie dodawanie roztworu utrwalającego.
    7. Zatrzymaj reakcję, usuwając bufor utrwalający i ostrożnie myjąc komórki 1x PBS 3 razy.
    8. Odessać PBS i dodać do komórek 500 μl wstępnie schłodzonego 100% metanolu.
    9. Przepuszczalność komórek przez inkubację w temperaturze -20 °C przez 15-30 min.
    10. Blokuj komórki z roztworem blokowym Duolink przez 1 godzinę w RT.
  2. Barwienie przeciwciałami
    1. Rozcieńczyć mysi anty-RNAPII 8WG16 (1:500) i króliczy anty-PCNA(D3H8P) (1:500) w buforze do rozcieńczania przeciwciał Duolink. Inkubować komórki z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej.
      UWAGA: Wykonaj protokół PLA, używając tylko jednego z podstawowych przeciwciał (anty-RNAPII lub anty-PCNA), pomijając drugie. Pomaga to zidentyfikować wszelkie sygnały tła wynikające z niespecyficznych interakcji poszczególnych przeciwciał lub sond PLA.
    2. Delikatnie usuń przeciwciała pierwszorzędowe ze szkiełek za pomocą niestrzępiącego się arkusza makulatury, nie dotykając komórek. Następnie umyj komórki 3 razy 1x PBS.
    3. Przygotować sondy PLA (lub przeciwciało drugorzędowe) zgodnie z następującą procedurą (patrz Tabela 2), a następnie wymieszać i odstawić na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Dodać mieszaninę przeciwciał drugorzędowych do szkiełek i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Podwiązanie i amplifikacja
    1. Wyrzucić mieszaninę przeciwciał wtórnych i przemyć szkiełka dwukrotnie 1x buforem A każdy przez 5 minut.
    2. Przygotować mieszaninę do podwiązania zgodnie z następującą procedurą (patrz Tabela 2).
    3. Na każde szkiełko nakrywkowe nanieść 15 μl mieszanki do podwiązaniań i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w komorze wilgotnościowej.
    4. Umyj szkiełka dwukrotnie 1x buforem A każdy przez 2 minuty.
    5. Przygotuj mieszaninę amplifikacyjną zgodnie z następującą procedurą (patrz Tabela 2).
    6. Na każde szkiełko nanieść 15 μl mieszanki amplifikacyjnej i inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej. Wyrzuć Amplifikację Mix i myj dwukrotnie 1x buforem B przez 10 minut.
    7. Umyj szkiełka jednorazowo buforem B 0,01x przez 1 min.
    8. Odessać bufor B i zamontować suwaki w medium montażowym Duolink In Situ z DAPI.
  4. Analiza obrazu i określenie progu:
    1. Określ ilościowo liczbę ognisk PLA za pomocą ImageJ. Oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu może pomóc w obiektywnym określeniu ilościowym sygnałów PLA. Jako próg należy wybrać próg 3 lub więcej ognisk PLA na jądro, ponieważ mniej niż 1% komórek kontrolnych nabywa 3 ogniska PLA w niezakłóconych warunkach.
      UWAGA: Ponieważ próg jest określany eksperymentalnie poprzez analizę wielu próbek i kontroli w celu uwzględnienia zmienności, spójne ustawienia obrazowania (np. czas ekspozycji, wzmocnienie) muszą być zachowane we wszystkich próbkach, aby zapewnić porównywalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

γH2AX służy jako biomarker uszkodzeń DNA. Nadekspresja KRAS (G12D) upośledza stabilność genomiczną w tych komórkach, co potwierdza zwiększony sygnał γH2AX w analizie Western blot (Rycina 2A). Ponadto wzmocniony sygnał w teście dot blot dla S9.6 w komórkach wykazujących ekspresję KRAS (G12D) w porównaniu z kontrolami wektorowymi (Rycina 2B) wskazuje, że ekspresja onkogennego KRAS prowadzi do akumulacji aberracyjnych pętli R (R-loops), co może przyczyniać się do p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Maszyneria transkrypcyjna RNAPII może stanowić przeszkodę w progresji widełek replikacyjnych DNA26,27, promując TRC i uszkodzenia DNA, szczególnie w komórkach rakowych28,29. Rozszyfrowanie białek, które regulują TRC i zrozumienie szczegółowych mechanizmów może pomóc nam zrozumieć, w jaki sposób zachodzą te szkodliwe zdarzenia i pokierować rozwojem nowych podejść terapeutycznych w przyszłości. Dlatego, aby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze Uniwersytetu Południowych Chin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przejrzystość Western Podłoże ECLBio-Rad1705061
Duolink Odczynniki do wykrywania in situ Przeciwciało GreenSigmaDUO92014
FLAGPrzeciwciało MilliporeF7425
gamma H2AXSygnalizacja komórkowa25955
Glikogen, klasa biologii molekularnejThermoFisherR0561
Obraz JNIHhttps://imagej.net/ij/
membrany nitrocelulozowe Amersham10600004
Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała PCNA13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.G Addgene 12259
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRThermoFisherEO0491
psPAX2Addgene 12260
Przeciwciało RNAPIISCBTsc-56767
Przeciwciało S9.6Motyw aktywny65683
Środki sieciujące UVFisher ScientificFB-UVXL-1000

Bibliografia

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 553-563 (2016).
  3. Hamperl, S., Cimprich, K. A. Conflict resolution in the genome: how transcription and replication make it work. Cell. 167 (6), 1455-1467 (2016).
  4. Merrikh, H., Zhang, Y., Grossman, A. D., Wang, J. D. Replication-transcription conflicts in bacteria. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 449-458 (2012).
  5. Kotsantis, P., Petermann, E., Boulton, S. J. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: Jigsaw falling into place. Cancer Discov. 8 (5), 537-555 (2018).
  6. Gnan, S., Liu, Y., Spagnuolo, M., Chen, C. -L. The impact of transcription-mediated replication stress on genome instability and human disease. Genome Instab Dis. 1, 207-234 (2020).
  7. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 8518-8528 (2013).
  8. Stein, G. S., Stein, J. L., Van Wijnen, A. J., Lian, J. B. Transcriptional control of cell cycle progression: the histone gene is a paradigm for the G1/S phase and proliferation/differentiation transitions. Cell Biol Int. 20 (1), 41-49 (1996).
  9. Helmrich, A., Ballarino, M., Tora, L. Collisions between replication and transcription complexes cause common fragile site instability at the longest human genes. Mol Cell. 44 (6), 6966-6977 (2011).
  10. Lang, K. S., et al. Replication-transcription conflicts generate R-loops that orchestrate bacterial stress survival and pathogenesis. Cell. 170 (4), 787-799 (2017).
  11. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  12. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. EMBO J. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  13. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Mechanisms of transcription-replication collisions in bacteria. Mol Cell Biol. 25 (3), 888-895 (2005).
  14. Chen, Y. H., et al. Transcription shapes DNA replication initiation and termination in human cells. Nat Struct. Mol Biol. 26 (1), 167-177 (2019).
  15. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 110208(2016).
  16. Guilbaud, G., Murat, P., Wilkes, H. S., Lerner, L. K., Sale, J. E., Krude, T. Determination of human DNA replication origin position and efficiency reveals principles of initiation zone organisation. Nucleic Acids Res. 50 (13), 7436-7450 (2022).
  17. Langley, A. R., Gräf, S., Smith, J. C., Krude, T. Genome-wide identification and characterisation of human DNA replication origins by initiation site sequencing (ini-seq). Nucleic Acids Res. 44 (21), 10230-10247 (2016).
  18. Besnard, E., et al. Unraveling cell type-specific and reprogrammable human replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 837-844 (2012).
  19. Zhao, P. A., Sasaki, T., Gilbert, D. M. High-resolution Repli-Seq defines the temporal choreography of initiation, elongation and termination of replication in mammalian cells. Genome Biol. 21 (1), 176(2020).
  20. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  21. St Germain, C. P., Zhao, H., Sinha, V., Sanz, L. A., Chédin, F., Barlow, J. H. Genomic patterns of transcription-replication interactions in mouse primary B cells. Nucleic Acids Res. 50 (4), 2051-2073 (2022).
  22. Edwards, D. S., et al. BRD4 prevents R-Loop formation and transcription-replication conflicts by ensuring efficient transcription elongation. Cell Rep. 32 (12), 108166(2020).
  23. Meng, F., et al. Base-excision repair pathway regulates transcription-replication conflicts in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep. 43 (10), 114820(2024).
  24. Pirona, A. C., Oktriani, R., Boettcher, M., Hoheisel, J. D. Process for an efficient lentiviral cell transduction. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa005(2020).
  25. Ramirez, P., Crouch, R. J., Cheung, V. G., Grunseich, C. R-Loop analysis by dot-blot. J Vis Exp. 167, e62069(2021).
  26. Gómez-González, B., Aguilera, A. Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes Dev. 33 (15-16), 1008-1026 (2019).
  27. Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V., Macek, B., Popov, N. RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nat Commun. 14 (1), 5147(2023).
  28. Zardoni, L., et al. Elongating RNA polymerase II and RNA:DNA hybrids hinder fork progression and gene expression at sites of head-on replication-transcription collisions. Nucleic Acids Res. 49 (22), 12769-12784 (2021).
  29. Xiao, Y., et al. Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing. Nat Methods. 21, 247-258 (2024).
  30. Tang, J., et al. Enhancing transcription-replication conflict targets ecDNA-positive cancers. Nature. 635, 210-218 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Niestabilno genomupolimeraza RNA IIprzeciwcia o PCNAmikroskopia fluorescencyjnareplikacja DNAamplifikacja PCRstabilno genomu nowotworowegodetekcja endogennych TRC
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.