Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67538

⸱

12 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje protokół mechanicznej charakterystyki żywych sferoidów w macierzy 3D za pomocą mikrospektroskopii Brillouina. Ta całkowicie optyczna metoda umożliwia wizualizację sferoidów o rozdzielczości mikroskalowej oraz ilościowych właściwościach mechanicznych. To podejście ma znaczenie dla fenotypowania mechanicznego; na przykład określanie stanów patologicznych kulistych nowotworów w mikrośrodowisku 3D.

Streszczenie

Spektroskopia Brillouina, rozwijająca się technika zyskująca duże zainteresowanie w naukach biomedycznych, pozwala badaczom zbierać informacje związane z mechaniką i strukturą poprzez badanie właściwości lepkoelastycznych i architektonicznych preparatów w sposób nieniszczący, bezkontaktowy. Podejście to ocenia właściwości mechaniczne próbek 3D poprzez pomiar interakcji światła widzialnego z termicznie indukowanymi falami/fononami. Informacje, które dostarcza spektroskopia Brillouina, mają potencjał do oceny biofizyki in vivo oraz potencjalnej diagnozy patologii chorób. Znaczącą zaletą spektroskopii Brillouina jest możliwość oceny mechaniki mikroskalowej wewnątrz próbki biologicznej; inne konwencjonalne techniki, które pozwalają osiągnąć tę rozdzielczość, takie jak mikroskopia sił atomowych, mogą badać próbki tylko w 2D, ponieważ wymagają bezpośredniego kontaktu. Praca ta opisuje zastosowanie mikrospektroskopii Brillouina do badania biomechaniki żywych sferoidów osadzonych w trójwymiarowej macierzy hydrożelowej. Otoczenie sferoidów komórkowych w mikrośrodowisku 3D tworzy system sferoidalny, który wiernie odtwarza interfejs między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową in vivo. W naszym protokole opisujemy przygotowanie próbek sferoidów oraz pomiary widm Brillouina za pomocą sekwencyjnego obrazowania fluorescencyjnego. Dodatkowo omawiamy procedury analizy danych spektralnych oraz szczegóły techniczne dotyczące systemu optycznego.

Wprowadzenie

Hodowla komórek w modelach 3D jest korzystna w porównaniu z typowymi metodami hodowli komórek 2D, ponieważ lepiej odtwarza struktury tkankowe i interakcje między komórkami występujące in vivo. Sferoidy to trójwymiarowe agregaty komórkowe, które ułatwiają złożone interakcje między komórkami; Te interakcje są zaburzone w komórkach hodowanych jako monowarstwa na plastiku hodowlanym tkankowym. Sferoidy mogą być hodowane na rusztowaniu naśladującym mikrośrodowisko, z którego pochodzi komórka. Na przykład hydrożele są popularnym biomateriałem wykorzystywanym do hodowli komórek/sferoidów, ponieważ umożliwiają precyzyjną kontrolę parametrów takich jak sztywność, rozkładalność, rozmiar porów oraz włączenie czynników wzrostu1 (Rysunek 1A). Sygnały mechaniczne często poprzedzają zmiany biochemiczne w patologiach chorób, takich jak rak i włóknienie 2,3, dlatego uzyskanie biomechanicznego podpisu w klinicznie istotnych modelach 3D choroby jest kluczowe dla opracowywania interwencji diagnostycznych mających na celu poinformowanie praktyki terapeutycznej oraz zrozumienie leżącej u podstaw patofizjologii4.

Mikroskopia Brillouina (BM) to technika obrazowania, która pozwala mierzyć właściwości mechaniczne materiałów biologicznych w płaszczyznach 2D 5,6,7. BM ma kilka kluczowych zalet w porównaniu z innymi, częściej stosowanymi metodami, takimi jak mikroskopia sił atomowych (AFM) i elastografia. Jest dobrze udokumentowane, że AFM może osiągać wysoką rozdzielczość mechaniczną czasoprzestrzenną oraz że elastografia może badać mechanikę wewnątrz próbek 8,9. BM nie wymaga bezpośredniego kontaktu z badanym materiałem, co czyni go idealną techniką w porównaniu z AFM dla próbek/komórek trudno dostępnych, takich jak sferoidy w hydrożelach. Kolejną kluczową zaletą BM jest brak konieczności oznaczania próbek i możliwość zapewnienia rozdzielczości na poziomie mikroskalowym wewnątrz próbek biologicznych, czego powszechnie stosowane metody elastografii nie są w stanie osiągnąć7; Bardziej zaawansowane techniki elastografii optycznej mogą pracować z rozdzielczościąmikroskali 10. Należy zauważyć, że precyzyjna efektywna rozdzielczość w obrazowaniu Brillouina heterogenicznych próbek biologicznych nie jest trywialna do określenia. Po pierwsze, dla danej długości fali oświetlenia zależy to od właściwości optycznych opisujących rozmiar ogniskowej (apertura numeryczna, NA, obiektywu obiektywu i nieprzezroczystość próbki). Dodatkowo, dokładność pomiaru właściwości mechanicznych próbki oraz kształt widma Brillouina zależy od właściwości akustycznych materiału (długość fali fononowej i długość propagacji)11,12. Zjawiskiem leżącym u podstaw spektroskopii Brillouina jest rozpraszanie Brillouina, gdzie padające monochromatyczne światło laserowe oddziałuje z spontanicznymi, termicznie indukowanymi fononami akustycznymi w ośrodku biologicznym. Skutkuje to rozpraszaniem nieelastycznym światła i (przesunięcie częstotliwości Brillouina, BFS) na Rysunku 1B, które zazwyczaj jest rzędu kilku GHz, a w zależności od tego, czy foton traci lub zyskuje energię, w widmie rozproszonego światła wykrywa się odpowiednio szczyty Brillouina Stokesa i anty-Stokesa. Dzięki zależności od lokalnej prędkości dźwięku w ośrodku, BFS jest powiązany z modułem sprężystego podłużnego, który z kolei jest empirycznie skorelowany z modułem Younga 7,13; należy jednak zachować ostrożność przy porównywaniu tych modułów, ponieważ (i) nie są one bezpośrednio ze sobą powiązane, (ii) moduł Younga zwykle mieści się w zakresie Pa-kPa dla próbek biologicznych i miękkiej materii, podczas gdy moduł podłużny uzyskany od Brillouina mieści się w zakresie GPa, a (iii) należy brać pod uwagę parametry takie jak zmiany współczynnika załamania i gęstość materiału7. Szerokość linii Brillouina (na rysunku 1B) to kolejna miara uzyskana z BM. Jest ona powiązana z modułem strat podłużnych, co daje wgląd w lepkość próbki; Te właściwości można skorelować z lepkoelastycznością14. W ten sposób BM pozwala ocenić właściwości lepko-sprężyste, gdzie większy BFS oznacza sztywniejszy materiał, a większa szerokość linii oznacza materiał bardziej lepki (Rysunek 1B). Należy zauważyć, że rozpraszanie sprężyste (Rayleigha), w którym fotony nie ulega przesunięciu częstotliwości, ma znacznie większe prawdopodobieństwo wystąpienia w porównaniu do rozpraszania Brillouina. Dlatego spektrometry Brillouina muszą być wyposażone w tłumienie sygnału Rayleigha.

BM był wykorzystywany do charakteryzowania właściwości mechanicznych różnych tkanek, biomateriałów oraz modeli hodowli komórek 3D. Na przykład BM został wykorzystany do rozróżnienia czerniaka od otaczającej zdrowej tkanki, wykazując, że tkanka nienowotworowa była znacząco bardziej miękka niż czerniak15. Rad i in. wykazali, że zwiększenie stężenia polimerów w hydrożelach skutkowało wzrostem BFS i szerokości linii. Przy najniższych stężeniach polimerów hydrożele z komórkami wykazywały większe spadki przesunięcia częstotliwości Brillouina w ciągu siedmiu dni w porównaniu do pustych hydrożeli, co miało być wynikiem komórkowej remodelacji hydrogelu. Nie zaobserwowano tego przy stężeniu polimeru 10%, co podkreślało możliwy brak żywotności komórek stwierdzonych w tych hydrożelach16.

Najważniejsze dla niniejszego badania jest to, że BM został wykorzystany do badania właściwości mechanicznych sferoidów17, 18, 19, 20. W szczególności wpływ lokalnego mikrośrodowiska na mechanikę sferoid można wykryć za pomocą BM20. W porównaniu do sferoidów guzowych hodowanych w podatnych hydrożelach, sferoidy hodowane w sztywnych hydrożelach wykazywały wyższy BFS, co wskazuje na zwiększony moduł sprężystości20. Przestrzenne zmienności właściwości mechanicznych wewnątrz sferoidy można również scharakteryzować za pomocą BM. Na przykład stwierdzono, że BFS w guzach sferoidalnych wzrasta w kierunku rdzenia sferoidalnego20,21. Ponadto spadek BFS koreluje ze zwiększoną inwazyjnością kulistych guzów20. BM był wykorzystywany do badania mechanicznych zmian sferoidów nowotworowych w odpowiedzi na wstrząs osmotyczny22. W badaniu obserwowano wzrost sferoidów przez 5 dni, co wykazało, że początkowe mechaniczne różnice między nowotworem a zdrowymi sferoidami obserwowane przy BM zanikały z czasem. Inne badanie wykazało wzrost BFS sferoidu po 7 dniach, co przypisywano wzrostowi rozmiaru sferoidy i liczbie komórek16.

Ponadto przeprowadzono badania multimodalne z wykorzystaniem mikroskopii Brillouina wraz z AFM i reologią, aby zbadać właściwości mechaniczne komórek i hydrożeli 16,23,24. Rad i in. wykorzystali reologię do kontekstualizacji trendów mierzonych przez BM, wykazując silną dodatnią korelację między modułem podłużnym a modułem ścinania magazynowania względem stężenia hydrożeli16 w polimerach. Mikroskopia Brillouina oraz mikroreologia pęsety optycznej zostały wykorzystane do pomiaru mechaniki komórek nowotworowych hodowanych w hydrożelach 3D23. W tym badaniu stwierdzono zmniejszoną mechaniczną heterogeniczność komórek w sferoidach w porównaniu do pojedynczych komórek zawieszonych w hydrożelach.

W niniejszej pracy szczegółowo opisano protokół badania właściwości mechanicznych żywych sferoidów osadzonych w hydrożelach za pomocą komercyjnego mikroskopu Brillouina (Rysunek 1). Berghaus i in. opisali protokół opisujący kroki budowy spektrometru Brillouina o wysokiej rozdzielczości oraz metodę jego kalibracji z użyciem materiałów referencyjnych25. Ponadto protokół Shi i in. opisuje wykorzystanie mikroskopii Brillouina do monitorowania zmian właściwości mechanicznych tkanki embrionalnej26. Używamy sferoidów komórek macierzystych mezenchymalnych (MSC) w hydrożelach poli(etyleno-glikolowych) PEG) i maleimidu, aby naśladować niszę szpiku kostnego i badać właściwości mechaniczne tego środowiska. Ten model 3D ma potencjał do ujawnienia mechanicznego charakteru chorób szpiku kostnego, w tym białaczki, szpiczaka mnogiego oraz wtórnego raka kości. Protokół ten jest więc bezpośrednio przenoszony na modele 3D innych chorób, gdzie zaburzenia mechanobiologii mogą odgrywać ważną rolę w patologii. Szczegółowo opisano przygotowanie sferoidów i hydrożelu, obrazowanie fluorescencyjne oraz mikroskopię Brillouina. Omówione są zalecane procedury, możliwe wady oraz potencjalne ulepszenia tej techniki. Szczegółowy opis konfiguracji eksperymentalnej przedstawiono na rysunku S1 oraz w sekcji Materiały uzupełniające i metody związane z przygotowaniem eksperymentalnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek 2D

UWAGA: W miarę możliwości należy zadbać, aby cała hodowla komórek była wykonywana w środowisku sterylnym, używając standardowego laminarnego kapturu do hodowli tkankowej, aby uniknąć skażenia. W obecnym protokole zastosowano MSC, ale do tworzenia sferoidów można wykorzystać inne typy komórek, w zależności od konkretnych celów badania.

  1. Hoduj MSC w pożywce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), o wystarczającej objętości, by pokryć komórki, zawierającej 4,5 g/L D-glukozy, + L-Glutaminę uzupełnioną o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 100 μM pirotrowęgliana sodu, 1% nieistotnych aminokwasów (NEAA), 1% penicylinę i streptomycynę. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
  2. Komórki przejściowe z konfluencją 70-80%, inkubując z 0,05% trypsyną etylendiaminetetraoctową (EDTA) (objętość trypsyny powinna stanowić 1/3 objętości DMEM) przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5%CO2 , aby odłączyć komórki od płytki. Aby zatrzymać reakcję, dodaj podłoże hodowlane zawierające FBS (przynajmniej w ilości dodanych trypsyny). Policz komórki za pomocą hematometru.

2. Przygotowanie do sferoidów

UWAGA: W miarę możliwości należy zadbać, aby cała hodowla komórek była wykonywana w środowisku sterylnym, używając standardowego laminarnego kapturu do hodowli tkankowej, aby uniknąć skażenia. W tym badaniu mikrodołki zostały użyte do stworzenia sferoidów MSC. Płyty te składają się z 24 odwiertów, z których każda zawiera 1200 mikroodwiertów o średnicy 400 μm. Pozwala to na przygotowanie dużej liczby sferoidów (Rysunek 2).

  1. Aby przygotować płytkę mikrodołową, należy wstępnie objąć dołki, dodając do każdej dołki 500 μL roztworu antyadherencyjnego. Płyta wirówkowa o pojemności 1 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem przy powiększeniu 20x sprawdź, czy nie występują pęcherzyki powietrza. Jeśli są, powtórz etap wirowania. Usuń płyn antyadhezijny.
  2. Aby przemyć płytkę, dodaj 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i aspiruj. Powtórz to dwa razy, aby upewnić się, że roztwór do płukania został całkowicie usunięty.
  3. Określ liczbę komórek na sferoidę oraz liczbę sferoidów na żel. To zależy od indywidualnych pytań badawczych. Na przykład użyliśmy 100 komórek na sferoidę i 100 sferoidów na żel. Dlatego do tego protokołu potrzebna była tylko jedna studnia płytki mikrodołkowa, ponieważ tworzy to łącznie 1200 sferoidów. Aby obliczyć liczbę komórek potrzebnych do jednego dołu, wykonaliśmy następujące obliczenia: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej zawierającej 1,2 x 105 ogniw. Wiruj zawiesinę ogniwową w 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuń supernatant.
  4. Ponownie zawiesz komórki w 1 mL DMEM (+4,5 g/L D-glukozy, + L-Glutaminy) uzupełnionej o 100 μM pirociany sodu, 1% NEAA, 1% penicyliny i streptomycyny. Dodaj 1 mL zawiesiny komórkowej do jednej z dołków płytki mikrodołków i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby równomiernie rozprowadzić komórki w całym dołku. Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Wiruj płytę w 100 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Na tym etapie nie dodajemy FBS do mediów. Ma to zapobiec przyczepianiu się komórek do plastiku z hodowli tkankowej.
  5. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone i zapadły się na dno mikrodołków. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Obserwuj formowanie sferoidów 24 godziny później.
    UWAGA: Sferoidy mogą pozostawać na płycie do 48 godzin, w zależności od typu komórki i pożądanej zwartości sferoidu.
  6. Aby zebrać sferoidy z płyty, najpierw powoli i delikatnie usuń podłoże hodowlane, starając się nie zakłócać sferoidów. Aby zapobiec przyklejaniu się kulistych do wyroć, powłokaj końcówki pipety i rurki za pomocą PBS z 1% FBS. Aby zapobiec zaklinowaniu się sferoidów w końcówkach pipety, tnij końcówkę, aby poszerzyć otwór. Na tych etapach można stosować maksymalne wskazówki regeneracyjne jako dodatkowy środek zapobiegający utracie sferoidów. Dodaj 500 μL PBS do każdej dołki płytki mikrodołka i pipetuj w górę i w dół, aby usunąć sferoidy. Zbierz PBS z zawieszonymi kulkami w rurce (Rysunek 2).
  7. Obserwuj płytkę pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu i powtarzaj ten krok, aż większość kul zostanie pomyślnie usunięta.
  8. Aby policzyć liczbę sferoidów w zawieszeniu, należy przenieść 50 μL z zawieszenia do studni płyty 96-dołkowej. Policz liczbę sferoidów w 50 μL. Aby ułatwić liczenie, można narysować krzyżyk na dnie studni za pomocą markera permanentnego. Oblicz liczbę sferoidów za pomocą równania (1):
    figure-protocol-1

3. Przygotowanie hydrożeli PEG

UWAGA: W miarę możliwości należy zadbać, aby cała hodowla komórek była wykonywana w środowisku sterylnym, używając standardowego laminarnego kapturu do hodowli tkankowej, aby uniknąć skażenia. W tym badaniu zastosowano hydrożele PEG-maleimidu, ale można też stosować inne typy. Hydrożele PEG-maleimid powstały w reakcji dodawania tiol-Michael27. Użyte crosslinkery stanowiły mieszaninę peptydu PEG-dithiolu i proteazowo-degradowalnego, otoczoną dwoma resztami cysteinowymi (peptyd VPM, GCRDVPMSMRGGDRCG). Żele w niniejszym badaniu wykorzystywały 70% peptydu PEG-dithiol oraz 30% degradowalnego peptydu VPM.

  1. Przygotuj roztwór zapasowy 200 mg/mL peptydu VPM i dodaj 2,4 μL peptydu na żel. Przygotuj roztwór PEG-dithiolu o stężeniu 200 mg/mL i dodaj 5,6 μL na żel.
  2. Przed wymieszaniem z krzyżowymi linkami ponownie zawiesij sferoidy w PBS (rysunek 2). Zmieszaj zawieszenie sferoidalne z PEG-dithiolem (5,6 μL na żel) i VPM (2,4 μL na żel). To rozwiązanie nazywa się Rozwiązaniem B.
    UWAGA: W tym protokole dodawano 100 sferoidów na żel.
  3. Przygotuj roztwór PEG-Maleimide o stężeniu 250 mg/ml. Dodaj 50 μg fibronektyny na żel. Wymieszaj roztwór PEG-Maleimid i fibronektynę; nazywa się to roztworem A. Roztwór Pipety A (40,3 μL dla żeli 100 μL) na dnie płytki do hodowli tkankowej z 12 dołkami. Dodaj roztwór B (59,7 μL dla żeli 100 μL) o stosunku molowym 1:1 maleimid:tiol, aby zapewnić pełne sieciowanie; Upewnij się, że żelowanie następuje natychmiast. Ostateczna objętość hydrożeli wynosi 100 μL.
  4. Inkubuj żele przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5%CO2 , aby umożliwić żelacje. Dodaj do studni kompletne podłoże hodowlane (DMEM uzupełnione o 10% FBS, 100 μM piropirianianu sodu, 1% NEAA oraz 1% penicyliny i paciorkowca) do studni, zapewniając całkowite zanurzenie żelu (Rysunek 2). Inkubuj żel w temperaturze 37 °C i 5%CO2 , aż będzie gotowy do pomiarów pod mikroskopem Brillouina.
    UWAGA: Czas trwania hodowli sferoidów w hydrożelach przed pomiarami Brillouina będzie zależał od typu komórki i pytania badawczego. Na przykład w tym badaniu sferoidy są zazwyczaj hodowane w hydrożelach przez maksymalnie 7 dni, podczas których są monitorowane mikroskopią Brillouina. Charakterystyka była właściwości viskoelastyczna hydrożeli z lub bez enkapsulacji sferoidalnej, które nie wykazują istotnego wpływu sferoidów na mechanikę żelu (rysunek S2).

4. Barwienie fluorescencyjne i obrazowanie sferoidów w hydrożelach

UWAGA: W tym badaniu jądra komórkowe i filamenty aktyny tworzące cytoszkielet zostały fluorescencyjnie barwione i zobrazowane przed pomiarami Brillouina.

  1. Aby barwić aktynę, dodaj żywą barwę aktynową do mediów kulturowych w rozcieńczeniu 1:500 3 godziny przed obrazowaniem. Trzymaj próbkę z dala od światła, owijając ją folią. Inkubuj żel w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
  2. Aby zabarwić jądra, dodaj 2 krople/ml żywej barwy jądrowej do podłoża hodowlanego wokół żelu 40 minut przed obrazowaniem. Zwróć próbki do inkubatora.
  3. Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne tak szybko, jak to możliwe po zakończeniu czasu inkubacji barwienia. Sprawdź, czy wybrana jest odpowiednia ścieżka optyczna (naświetlająca kamerę mikroskopową) oraz prawidłowa pozycja koła filtra. Przyciemnić światła w pokoju i uchwycić tło. Włącz źródło światła diodą LED i wybierz długość fali w zależności od protokołu barwienia (tutaj użyto 385 nm dla jąder i 621 nm dla obrazowania aktyny). Zrób zdjęcia fluorescencyjne sferoidów z powiększeniem 20x za pomocą preferowanego oprogramowania. Wyłącz źródło LED, gdy skończysz.

5. Mikroskopia Brillouina sferoidów

  1. Włączanie urządzeń i emisja laserowa
    1. Włącz urządzenia: komputer, spektrometr, kamery mikroskopowe, mikroskop, wentylator chłodzący laserem oraz emisję lasera, włączając klucz w kontrolerze. Upewnij się, że jest to wykonane 15 minut przed optymalizacją spektrometru, aby upewnić się, że laser się poddał termalizacji. Sprawdź, czy emitowana moc lasera jest zgodna z oczekiwaniami za pomocą miernika mocy (100 mW w naszym eksperymencie).
  2. Włącz aplikację do kontroli temperatury (patrz Tabela materiałów) i sprawdź, czy temperatura etalon jest zoptymalizowana, mierząc moc wiązki po etalonie. Jeśli jest ona znacznie niższa niż oczekiwano (po uwzględnieniu zastosowanego filtra gęstości optycznej (OD), zmień temperaturę docelową o 1 °C i obserwuj, czy z czasem wzrasta moc. Jeśli nastąpi spadek, odwróć kierunek zmiany. Gdy moc jest bliska oczekiwaniom, dostrajaj się stopniowo (0,1 °C), aż osiągniesz maksimum.
  3. Ustawianie ogniska obiektywu obiektywu wewnątrz akrylowej kostki
    UWAGA: Tłumienie rozpraszania sprężystego i sprzężenia z "pump killer" ze spektrometrem jest optymalizowane przy użyciu próbki sztywnego, jednorodnego materiału referencyjnego przed każdym eksperymentem. W tym badaniu użyto kostki akrylowej.
  4. Otwórz oprogramowanie SpectraLok i poczekaj, aż wszystkie urządzenia zostaną wykryte. Po lewej stronie głównego okna (Rysunek 3) wybierz kamerę spektrometryczną.
    1. Zamontuj akrylową kostkę na uchwyt na próbkę mikroskopu tak, że przezroczysta strona będzie skierowana do obiektywu. Opuść obiektyw tak bardzo, jak to możliwe, i wycentruj kostkę pod nią. Upewnij się, że ścieżka optyczna w mikroskopie jest dobrana tak, aby kamera spektrometru była naświetlona (ustaw selektor portu obrotowego na L).
      UWAGA: W naszym układzie port L jest podłączony do krążącego konfokalnie, a R do portu kamery mikroskopowej.
    2. W oknie SpectraLok Camera ustaw czas ekspozycji sensora na 500 ms, a wzmocnienie programowe na 100. Ustawienie wzmocnienia programowego tylko zwiększa kontrast w celach wizualizacyjnych.
  5. Odblokuj migawkę laserową.
    UWAGA: Ponieważ emisja laserowa jest włączona, uważaj, aby nigdy nie umieszczać głowy lub oczu w ścieżce wiązki laserowej.
    1. Naciśnij capture i przesuń obiektyw w górę. Nastąpi znaczny wzrost intensywności sygnału, a pojawi się wzór nasycony (Rysunek 4A). Jest to spowodowane silnym odbiciem światła laserowego na styku powietrze-akrylowa kostka. Przesuwając soczewkę wyżej, natężenie sygnału maleje, a piki Brillouina stają się widoczne. Kontynuuj przestawianie soczewki obiektywu, aż intensywność pików Brillouina będzie stała (Rysunek 4B). Odpowiada to punktowi ogniskowemu znajdującemu się całkowicie wewnątrz akrylowej kostki.
  6. Optymalizacja ciśnienia etalonów w celu minimalizacji resztkowego światła rozproszonego sprężyście
    UWAGA: Celem poniższych kroków jest stłumienie sprężyście rozproszonego sygnału Rayleigha tak, aby do kamery spektrometru docierał tylko przesunięte o przesuniętej częstotliwości światło Brillouina.
  7. W oprogramowaniu SpectraLok otwórz okno sterowania Pump Killer (PK) (Rysunek 5).
  8. Przybliż jeden z najjaśniejszych rzędów Brillouina i dostosuj pozycję siłownika ciśnienia w krokach po 100 μm, klikając rel ruchu, aby zminimalizować szczytową intensywność Rayleigha. Jeśli sygnał Rayleigha rośnie, odwróć kierunek zmiany, klikając wstecz. Następnie precyzyjnie dostosowujemy ciśnienie w etalonach co 10 μm.
    UWAGA: W kostce akrylowej światło Rayleigha można całkowicie stłumić; Może to nie mieć miejsca w przypadku niejednorodnej próbki biologicznej.
  9. Optymalizacja nakładki pasków w celu "rozpakowania" danych widmowych
    UWAGA: Poniższa procedura zapewnia, że współrzędne pikselowe (x, y) matrycy kamery są odpowiednio odwzorowane na długość fali za pomocą zastosowania tabeli wyszukiwania LUT.
  10. W oknie kamery przybliż jedno z zamówień Brillouina.
  11. Naciśnij s, aby zwizualizować paski, na których LUT jest nakładany na obraz aparatu (rysunek 6A). Otwórz okno Ustawienia i naciśnij szybką kalibrację , aby ponownie obliczyć optymalny poziomy przesunięcie pasków. Jeśli matryca jest nasycona, skrniejsz czas naświetlania przed tym krokiem.
    1. W oknie kamery sprawdź, czy fioletowe pasy dobrze nałożone są na centralny obszar szczytów Brillouina (Rysunek 6B).
  12. Optymalizacja sprzężenia spektrometru PK
  13. Regulacja osi soczewek kolimatora pozwala zmaksymalizować efektywność sprzężenia światła z PK ze spektrometrem.
  14. Otwórz okno spektrum i kliknij odwijanie , aby pobrać widmo (rysunek 7).
  15. Otwórz okno sterowania PK . Przy przyrostach 0,0005° iteracyjnie dostosowujemy osie kolimatora 1 i 2, aby zmaksymalizować sygnał Brillouina. W razie potrzeby można dodatkowo zoptymalizować kontrolę ciśnienia etalon. W jednorodnej kostce akrylowej sygnał Rayleigha może być całkowicie stłumiony (rysunek 7A). Chociaż dokładne pomiary Brillouina z pewnym resztkowym sygnałem Rayleigha są możliwe (rysunek 7B), w przypadku słabego tłumienia (rysunek 7C) światło rozproszone sprężyście zasłania sygnał Brillouina.
  16. Sprawdź, czy uzyskany sygnał Brillouina jest porównywalny z amplitudą odniesienia. Na przykład w naszym systemie, przy ekspozycji 500 ms i przy OD 0,3, szczytowa amplituda intensywności Brillouina wynosi około 3000 liczeń. Aby zapisać zmiany parametrów PK do pliku konfiguracyjnego, w oknie PK kliknij odśwież wszystko i zapisz wszystko. Co więcej, w głównym oknie naciśnij zapisz w sekcji File I/O .
  17. Przechodzenie na oprogramowanie skanujące i weryfikacja, że parametry są nadal zoptymalizowane
  18. Zamknij SpectraLok i otwórz oprogramowanie skanujące. W obecnym protokole zastosowano oprogramowanie oparte na LabVIEW, które jest szczegółowo opisane na Rysunku S3. Aby ustawić geometrię skanowania, ten własnościowy interfejs użytkownika (UI) służy do sterowania etapem tłumaczenia Prior XY-Z; jednak można stosować inne metody.
    1. Zamontuj szklaną szalkę Petriego z próbką hydrogelowo-sferoidalną zamiast akrylowej kostki (Rysunek 8). Aby zapobiec odwodnieniu żelu, inkubator ustawia się na 37 °C i wilgotność względną 95%. Zdejmij pokrywkę z szalki Petriego i dodaj medium, aby zanurzyć żel. Na górze żelu dodaj pokrywkę, aby zapobiec przesuwaniu się żelu.
    2. Zlokalizuj sferoid. Gdy wiązka lasera jest zablokowana, przełącz ścieżkę optyczną mikroskopu na okular. Włącz białe światło. Za pomocą joysticka ręcznie steruj etapem próbki, zlokalizuj i skup na sferoidze.
    3. Uzyskaj obraz w jasnym polu sferoidalnej. Reguluj jasność oświetlenia, obracając kierownicę. Ustaw ścieżkę optyczną na R, co pozwala naświetlić kamerę mikroskopową. Czas naświetlania można dostosować w zależności od potrzeb, aby uzyskać obraz o wysokim kontraście (czyli 50 ms).
    4. Sprawdź, czy parametry spektrometru i rozwijania są nadal zoptymalizowane. Ustaw port mikroskopu na L i przechwyć tło z laserem zablokowanym. Odblokuj laser, przekręcając kierownicę, aby strzelać. Na podstawie pożądanego stosunku sygnału do szumu wybierz czas naświetlania. Czas naświetlania typowy dla tych pomiarów wynosi 200-500 ms.
    5. Jeśli od kalibracji początkowej minęło trochę czasu (czyli kilka godzin) lub wystąpiło zakłócenie mechaniczne układu, ustawienie ciśnienia etalon lub sprzężenie spektrometru PK może nie być już optymalne. Powtórz kroki 5.3-5.5, aby ponownie zoptymalizować wspomniane rzeczy, jeśli to konieczne.
    6. Spośród nieowiniętych opcji wybierz linię Brillouin Peak Fiting. Dostosuj wartość progową do około połowy intensywności szczytów Brillouina. Pomiń szczyty Brillouina o amplitudzie poniżej tego progu. Skoryguj długość fali lasera zgodnie ze wszystkimi zidentyfikowanymi parami pików Brillouina.
  19. Ustawianie wielowymiarowej geometrii skanowania
  20. Wybierz geometrię skanu rastrowego, regulując szerokość regionu skanowania i rozmiar kroku.
    UWAGA: Dla sferoidów o rozmiarze około 70 μm, do skanu o niskiej rozdzielczości zazwyczaj używamy obszaru skanowania 150 μm × 150 μm oraz kroku 10 μm. Daje to mapę 2D o niskiej rozdzielczości w około 3,4 minuty.
    1. Rozpocznij skan.
  21. Wyłączanie systemu Brillouina
    1. Zamknij oprogramowanie i wyłącz komputer. Wyłącz emisję lasera za pomocą na kontrolerze. Zostaw kółko migawki w pozycji zablokowanej . Wyłącz chłodzenie wentylatora laserowego. Wyłącz kamery mikroskopowe i spektrometrowe. Na koniec wyłącz mikroskop.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pliki uzyskane po skanowaniu obejmują spektra, parametry dopasowania skanu (.csv), parametry i analizę skanu, mapy BFS i szerokości linii, obraz jasnego pola z wyróżnionym obszarem zainteresowania skanem oraz zrzut ekranu okna UI. Dla każdego punktu wielowymiarowego skanu Brillouina uzyskiwana jest wartość BFS. Na Rysunku 9 pokazano przykładowe skanowanie o wysokiej rozdzielczości obok obrazu jasnego pola oraz obrazy fluorescencji pokazujące filamenty i jądra aktyny. Należy zauważyć, że w na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ustanowiliśmy protokół wykorzystania mikroskopii Brillouina do biomechanicznego obrazowania sferoidów osadzonych w hydrożelach z rozdzielczością na mikroskalę. Hydrogel można odróżnić od żywego sferoidu różnicami w uzyskanych wartościach BFS. W reprezentatywnych wynikach użyliśmy sferoidów MSC oraz hydrożeli PEG-maleimidowych; Jednak protokół ten jest szeroko stosowany do innych typów komórek (np. linii komórek nowotworowych). Komórki w tym badaniu zostały sfotografowane na żywo i w odpowiednim mikrośrodowisku 3D, co pok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zauważają, że T. Allen i G. Wardle są pracownikami LightMachinery, firmy produkującej i sprzedającej spektrometr Brillouina używany w tym badaniu. Firma może skorzystać z publikacji tego dzieła. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Autorzy podkreślają wsparcie finansowe uzyskane z grantu MechanoMeds fazy 2, UKRI/EPSRC, numer grantu EP/X033554/1 na wsparcie rozwoju tej metody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-ramiona PEG-Maleimide (20 kDa)Kreatywne PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Tablice AggreWell 400STEMCELL Technologies34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Etalon rozmieszczony w powietrzuLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Roztwór antyadherencyjny do płukaniaSTEMCELL Technologies7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Inkubator Górnej LiniiOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Laser Cobolt Flamenco-100 660 nmHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Krążenie konfokalneLightMachineryHF-13311Nie ma
D-LEDi System oświetlenia fluorescencyjnego NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Moduł EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronektyna (człowiek)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Spektrometr HyperFine BrillouinaLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B Sześcian filtrów poczwórnych pasmNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Etap tłumaczenia zmotoryzowanego  Wcześniejsze naukoweH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ Live ReadyProbes™ odczynnik (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Cel, S Plan Fluor 20X NA 0.45, powietrzeNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
Kamera CMOS ORCA-FusionHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-dithiol, 2 kDaKreatywne PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS camera Teledyne Vision Solutions01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-aktyna SpirochromCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppOprogramowanie do regulacji temperatury
Peptyd VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptNie maNie ma
Mikroskop Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Bibliografia

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mechanika sferoid wtr jwymiarowa macierz hydro elowamechanika kom rkowanieinwazyjna biomechanikaobrazowanie fluorescencyjneprzesuni cie Brillouinaprzygotowanie sferoid wanaliza danych widmowych
Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.