Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 marca 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy przygotowanie filtratu kulturowego Mtb (CF), który jest pożywką do wzrostu bakterii, która składa się z białek wydzielanych przez bakterie. Mtb wydziela białka modulujące sygnalizację gospodarza i odpowiedź immunologiczną, które mają kluczowe znaczenie dla patogenezy. Przygotowane CF są analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu zidentyfikowania wszystkich czynników wydzielniczych.

Streszczenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wydziela wiele białek do gospodarza, aby modulować różne procesy komórkowe, takie jak sygnalizacja gospodarza, odpowiedź immunologiczna, apoptoza, itp., aby zwiększyć przeżywalność. Chociaż funkcja kilku czynników wydzielniczych została wyjaśniona, wiele z nich nie zostało jeszcze scharakteryzowanych. W związku z tym badanie białka wydzielniczego Mtb jest istotnym obszarem badań. Mtb wydziela białka do przestrzeni pozacytoplazmatycznej za pomocą trzech różnych systemów wydzielania: ogólnego, podwójnego argininy i wyspecjalizowanego systemu wydzielania typu VII. Konieczne jest przygotowanie sekretomu, aby zidentyfikować nowe cząsteczki wydzielnicze i funkcjonalnie scharakteryzować znane czynniki. W tym miejscu przedstawiamy metodę przygotowania sekretomu i próbki do spektrometrii mas. Preparat sekretomu wymaga najwyższej staranności, aby uniknąć zanieczyszczenia białek cytozolowych, które można monitorować poprzez sondowanie przeciwciałami przeciwko dobrze scharakteryzowanym białkom błonowym, wydzielniczym i cytozolowym. Tak przygotowany filtrat hodowlany może być wykorzystany do różnych celów, w tym do badania właściwości immunomodulacji gospodarza.

Wprowadzenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), jeden z najbardziej śmiercionośnych patogenów na świecie, zaraża zdrowe osoby poprzez aerozole przenoszone przez zakażoną osobę podczas kichania lub kaszlu1. Po dostaniu się do płuc jest pochłaniany przez makrofagi pęcherzykowe i przejmuje kontrolę nad układem odpornościowym gospodarza, aby przetrwać. Wśród różnych mechanizmów modulujących gospodarza, które Mtb ma dla przeżycia, jednym z nich są wydzielnicze czynniki wirulencji. Białka wydzielane do pożywki hodowlanej przez pałeczki podczas ich wzrostu są określane jako białka filtratu kulturowego (CF)2. Te białka filtratu kulturowego pomagają bakteriom przetrwać w trudnych warunkach wewnątrz komórek gospodarza. Mtb jest wyposażony w trzy różne rodzaje systemów wydzielania: wyspecjalizowany system sekrecji typu VII (T7SS), ogólny system wydzielania Sec (system Sec) i system wydzielania podwójnej argininy (system Tat). T7SS jest najbardziej ekskluzywnym systemem wydzielania u promieniowców, w przeciwieństwie do typu I-VI u bakterii Gram-ujemnych3. Wydzielanie niesfałdowanego białka przez błonę jest głównie zaangażowane w system Sec, a białka są rozpoznawane przez N-końcową sekwencję sygnałową4,5. Pofałdowane lub częściowo pofałdowane białka są transportowane przez system Tat, identyfikowany przez N-końcową sekwencję sygnałową z motywem podwójnej argininy6,7. To, w jaki sposób system Sec i Tat reguluje wydzielanie białek, nie zostało jeszcze ustalone.

Niektóre znane białka filtratu kulturowego w Mtb, które pomagają przetrwać atak oksydacyjny gospodarza po infekcji, to enzymy takie jak KatG i SodA8,9, niezbędne do degradacji reaktywnych form tlenu. Ponadto CFP10-ESAT6, heterodimeryczny kompleks białkowy, odgrywa istotną rolę w regulacji odpowiedzi cytokin, ucieczki bakterii, produkcji ROS itp.10. Locus RD1 bierze udział w modulowaniu układu wydzielania typu VII, który obejmuje wydzielanie CFP10-ESAT6, a genetyczna delecja CPF10-esat6 zagraża przeżywalności bakterii w modelach infekcji ex vivo i in vivo. Mycobacterium bovis (Mycobacterium bovis) Szczep szczepionki BCG nie posiada locus RD1 odpowiedzialnego za wydzielanie czynników wirulencji i dlatego może być stosowany jako żywa atenuowana szczepionka11. Różne niezbadane procesy komórkowe ściśle regulują proces wydzielania. Białka filtratu hodowlanego zawierają czynniki wspomagające resuscytację (RpF), które pomagają bakteriom odrosnąć ze stanu utajonego. Czynniki wspomagające resuscytację (Rpfs) to enzymy hydrolizujące peptydoglikany, o których wiadomo, że odgrywają rolę w stanie spoczynku. Mtb koduje pięć genów podobnych do rpf (rpf A-E), które pomagają bakteriom odrastać ze stanu spoczynku samodzielnie lub poprzez interakcję z innymi białkami12. Rpfs znajdują się w filtracie kultur bakteryjnych i wiadomo, że biorą udział w zjadliwości Mtb i odporności gospodarza13,14. Szeroko badane geny rpf rpfE i rpfB wykazują odporność ochronną in vitro13 i wzmacniają odpowiedź immunologiczną in vivo. W związku z tym rpfE i rpfB mogą być stosowane jako kandydaci na szczepionki Mtb.

Odwracalna fosforylacja15 to modyfikacja potranslacyjna, która zmienia różne procesy komórkowe, homeostazę komórki, podział komórki, itp. Na przykład fosforylacja CFP10 odgrywa ważną rolę regulacyjną, gdzie zarówno fosfoablacyjne, jak i mimetyczne mutanty CFP10 nie przywracają obserwowanego fenotypu w szczepie delecyjnym CFP10-ESAT616. Z drugiej strony SecA2 jest białkiem wydzielniczym biorącym udział w uszkadzaniu DNA komórki gospodarza17. Sekretom mutanta SecA2 jest wystarczający do zmiany odpowiedzi immunologicznej gospodarza i kaskady sygnalizacyjnej18,19. W związku z tym niezbędne i ekscytujące jest zbadanie sekretomu H37Rv i mutantów Mtb, w których geny białek wydzielniczych są usuwane (dane niepublikowane), aby uzyskać wgląd w to, jak wpływają one na immunomodulację i przeżycie gospodarza.

Ten raport skupia się na trzech aspektach: etapach związanych z przygotowaniem filtratu z kultur Mtb, przetwarzaniu próbek do spektrometrii mas oraz przeprowadzaniu eksperymentów ex vivo z filtratami hodowlanymi w celu zbadania funkcji immunomodulacyjnych. Wcześniejsze badania wykazały identyfikację białek filtratu kulturowego za pomocą elektroforezy żelowej 2D, a następnie analizy spektrometrii mas8. Za pomocą spektrometrii mas zidentyfikowano białka filtratu z wrażliwych na leki i opornych szczepów, aby uzyskać wgląd w zmiany sekretomu i zidentyfikować czynniki wirulencji, które mogą odgrywać rolę w oporności na leki20. Wcześniej badaliśmy sekretom i fosfosekretom Mtb za pomocą spektrometrii mas16. Techniki takie jak elektroforeza żelowa 2D są niskoprzepustowe i nie są wykorzystywane do badania globalnych zmian w proteomie lub sekretomie. Białka filtratu kulturowego różnią się od szczepów bakteryjnych, etapów wzrostu komórek, a nawet w różnych warunkach stresowych. W zależności od różnych sytuacji, zmiana w pulach białek wydzielniczych wewnątrz komórek umożliwiłaby całościowe zbadanie całego sekretomu i dostarczyłaby więcej informacji na temat bakteryjnego systemu wydzielania dla interwencji terapeutycznych. Jeszcze bardziej atrakcyjne byłoby przyjrzenie się sekretomowi w szczepach nokautów lub depleencji systemów wydzielniczych, aby uzyskać dalszy wgląd w szlaki i cele każdej ścieżki wydzielniczej. Traktowanie komórek białkami filtratu hodowlanego zamiast bakterii zmienia poziom cytokin i innych czynników immunomodulujących17. Za pomocą badania sekretomu można zidentyfikować nowe czynniki wirulencji i ich rolę w zjadliwości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Tutaj używamy patogennego szczepu laboratoryjnego H37Rv Mtb. Należy wykonać czynności wymagane do wyhodowania kultury bakteryjnej i wyizolować supernatant kultury w Laboratorium Bezpieczeństwa Biologicznego poziomu 3 (BSL-3). Od odrodzenia kultury do przygotowania filtracji stosuje się instalację BSL-3.

1. Inokulacja kultury Mtb

  1. Przygotowanie obszaru roboczego w BSL-3
    1. Włącz światło UV w szafie bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed użyciem. Wyczyść komorę bezpieczeństwa biologicznego 75% etanolem przed i po użyciu. Zużyte materiały należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na odpady zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Przygotowanie pierwotnych i wtórnych kultur Mtb H37Rv
    1. Pobrać bulion glicerolowy z temperatury -80 °C i rozmrozić go w temperaturze pokojowej. Użyj czterech niezależnych stad dla biologicznych czworaczków.
    2. Pobrać 10 ml pożywki 7H9 (Tabela 1) zawierającej 10% ADC (9 ml pożywki 7H9 i 1 ml ADC) do 100 ml autoklalawowanej kolby stożkowej z nakrętką.
      UWAGA: 7H9 + ADC: 7H9 to pożywka bogata w składniki odżywcze otrzymywana komercyjnie, do której dodajemy ADC (ADC: Albumina, Dekstroza i Katalaza; Tabela 2). Do uprawy kultury można używać zarówno ADC, jak i OADC. Kolby stożkowe zapewniają większe napowietrzenie kultury; Jednak do hodowli komórek bakteryjnych można również użyć kolby do hodowli tkankowej.
    3. Zaszczep cały zapas glicerolu w pożywce, aby ożywić kulturę, która staje się kulturą pierwotną. Weźuprawę 600 ~ 0,8 Mtb do produkcji zapasów glicerolu. Wymieszać 15% glicerolu i rosnącą kulturę Mtb w kriowiale i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Inkubować kolby hodowlane w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubatora przez 3-4 dni przy prędkości 100 obr./min.
    5. W 5dniu zmierzyć absorbancję przy 600 nm (A600). Gdy kultury osiągną A600 ~ 0,8-1, użyj kultury do zaszczepienia kultury wtórnej w A600 ~ 0,2 w 100 ml pożywki 7H9 + 10% ADC w kolbie o pojemności 500 ml. Wykonaj te same kroki dla replikacji.
      1. Zmierz A600 w kulturze podstawowej. Jeśli A600 wynosi ~ 0,8, osadzać kulturę przez odwirowanie przy 2100 x g przez 10 minut. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 5 ml pożywki 7H9 + 10% ADC i zmierz A600. Oblicz, ile inokulum zostanie dodane do 100 ml kultury wtórnej A600 ~ 0,2. Na przykład, jeśli używany jest A600 ~ 4, to 5 ml tej kultury należy dodać do 100 ml świeżej kultury wtórnej 7H9 + 10% ADC A600 ~ 0,2.
    6. Hoduj je w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubatora z prędkością 100 obr./min przez 2-3 dni do OD A600 ~ 0,8.
    7. Pobrać 10 μl za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę filtrującą i umieścić kulturę na płytce agarowej LB, która nie zawiera antybiotyków w kapturze bakteryjnym. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin, aby uwidocznić skażenie bakteryjne (jeśli występuje). Wyrzuć kultury i wżyw nowe kultury z eksperymentu, jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zanieczyszczenie bakteryjne.
  3. Rozwój bakterii w pożywkach Saautona
    1. W A600 ~ 0,8 zaszczepij bakterie w A600 ~ 0,2 w 100 ml pożywki Saautona w kolbie o pojemności 500 ml (Tabela 3) i rosnąć przez 3-4 dni po osiągnięciu OD ~ 0,8.
    2. Użyj kultur wyhodowanych do A600 ~ 0,8 w pożywce Saautona (podstawowa kultura Sautona) do inokulacji kultur, które mają być użyte do przygotowania filtratu kulturowego.
      UWAGA: 7H9 + ADC to pożywka bogata w składniki odżywcze, która zawiera albuminę. Albumina nie może być stosowana w analizie sekretomu, ponieważ albumina może maskować białka filtratu hodowli. W związku z tym pożywka Saautona jest używana do przygotowania filtratu hodowlanego. Pożywkę Saautona przygotowuje się poprzez rozpuszczenie składników wymienionych w tabeli 3.

2. Przygotowanie białek filtratu kulturowego Mtb

  1. Odwirowanie dla supernatantu hodowli
    1. Użyj podstawowej kultury Sautona do zaszczepienia 300 ml wtórnej kultury Saautona w A600 ~ 0,2. Uprawiaj kultury do OD A600 wynosi ~0,4-0,5. Używaj aktywnie rosnących kultur wczesnej fazy logarytmicznej, aby uniknąć zanieczyszczenia martwymi komórkami.
      1. Zmierz OD kultury wtórnej. Jeśli OD osiągnie A600 ~ 0,8, osadzaj kulturę przez odwirowanie przy 2,100 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki Saautona i ponownie pobrać OD. Oblicz, ile inokulum zostanie dodane do 300 ml kultury 0,2 OD z zmierzonego OD. Na przykład, jeśli OD wynosi 8, 7,5 ml tej kultury należy dodać do 300 ml świeżej pożywki Saautona o zawartości 0,2 OD.
        UWAGA: Trzymaj się wspomnianego OD, aby zmniejszyć lizę komórek i zanieczyszczenie GroEL. GroEL jest chaperonem i ulega konstytutywnej ekspresji w komórkach bakteryjnych. Część piśmiennictwa wykazała obecność GroEL w filtratach hodowlanych z powodu stresu podczas wzrostu. Tutaj używamy pożywki Saautona do przygotowania filtratu hodowlanego, który zapewnia komórkom łagodny stres; w związku z tym GroEL może być obecny w przesączu hodowlanym. Dodatkowo, jeśli OD hodowli jest większy niż 1, nastąpiłaby liza komórek, prowadząca do zanieczyszczenia GroEL w filtracie hodowlanym.
    2. Osad 300 ml kultur hodowlanych w 6, 50 ml probówkach o pojemności 2,100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (Rysunek 1A).
    3. Pobrać 45 ml supernatantu, pozostawiając nietknięte osady, za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do nowej probówki w każdym przypadku. Trzymaj osad na bok do przygotowania lizatu pełnokomórkowego (WCL).
    4. Powtórzyć wirowanie przy 2,100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać 40 ml supernatantu (pozostawiając 5 ml kultury nietknięte) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do nowej probówki i powtórzyć etap wirowania.
    5. Pobrać 35 ml supernatantu do świeżej probówki i przefiltrować supernatant hodowli za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przefiltruj do świeżej probówki, aby wyeliminować chorobotwórcze zanieczyszczenie bakteryjne. Z 300 ml kultury odzyskuje się 210 ml filtratu hodowlanego na kontrpróbę.
      UWAGA: Filtr, który został tutaj użyty do filtrowania filtratu hodowlanego, to sterylny filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 μm (typ SY25PL-S).
    6. Po przefiltrowaniu przesączu kulturowego należy zaszczepić 1 ml podwielokrotności przefiltrowanego filtratu kulturowego na płytce agarowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 4 tygodnie, aby zapewnić obecność innych chorobotwórczych zanieczyszczeń bakteryjnych w przesączu hodowli. Weź 1 ml porcji z lizatu pełnokomórkowego (WCL) i postępuj zgodnie z tymi samymi środkami bezpieczeństwa.
    7. Przetrzyj probówki z próbkami 75% etanolem i wyjmij je z BSL-3 przez pudełko przepustowe.
  2. Przygotowanie lizatu pełnokomórkowego (WCL)
    1. Zawiesić osad w 1 ml 1x PBSG zawierającego fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), 1x koktajl inhibitorów proteazy i przenieść lizat do 2 ml probówek do ubijania koralików z nakrętką zawierającą 1/3 objętości 0,1 mm kulek cyrkonowych.
      UWAGA: 1x PBSG składa się z 1x PBS + 5% glicerolu. Przyjmij stosunek masy granulek do bufora wynoszący 1:3.
    2. Lizować próbki przez ubijanie ich w mini ubijaku do kulek: 1 minuta ubijania kulek, a następnie 2 minuty inkubacji na lodzie. Powtórz to 8 razy.
    3. Odwirować probówki o masie 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w świeżej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać go na lodzie.
    4. Powtórz etap wirowania. Przepuścić supernatant przez filtr strzykawkowy 0,2 μm w celu wyeliminowania chorobotwórczego zanieczyszczenia bakteryjnego.
      UWAGA: Filtr stosowany tutaj do filtrowania filtratu hodowlanego to sterylny filtr strzykawkowy 0,22 mm (typ SY25PL-S).
    5. Przetrzyj próbki 75% etanolem i wyjmij je z BSL-3 przez pudełko przepustowe. Sprawdź stężenia lizatów za pomocą zestawu testowego BCA, jak wspomniano poniżej. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.
  3. Zagęścić białka filtratu kulturowego za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących.
    1. Skoncentrować 210 ml białek filtratu kulturowego Mtb za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących. Użyj probówek odśrodkowego zespołu filtrującego 3 kDa 15 ml (centrikonów), aby zagęścić filtrat kulturowy w ~ 1 ml (Rysunek 1A). Rurki odśrodkowego zespołu filtrującego o masie 3 kDa zatrzymują białka o tej samej wielkości lub większej niż 3 kDa.
    2. Dodać około 15 ml każdej kontrpróby filtratu hodowlanego do jednej probówki wirówkowej i wirować przy 2 100 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić przepływ zgodnie z normami i powtórzyć krok 2.3.2 dla 15x–16x, aż do uzyskania 210 ml koncentratu filtratu hodowli do ~1 ml.
    4. Podwielokrotność 100 μl skoncentrowanej kultury przesączyć białka do dziesięciu probówek mikrowirówek o niskim poziomie wiązania białek i oszacować stężenie białka za pomocą zestawu BCA.
  4. Oznaczanie skoncentrowanych białek
    1. Oszacuj stężenie białka w odniesieniu do BSA jako wzorca. Użyć 1 μg, 2 μg, 3 μg i 4 μg BSA w objętości 25 μl w dwóch powtórzeniach. Jeśli próbka była nierozcieńczona, do oszacowania należy użyć 5-krotnie rozcieńczonej (w PBS) próbki o objętości 25 μl w dwóch egzemplarzach. Oceny wykonywane są w 96 płytkach dołkowych. Użyć próby kontrolnej bez próbki (ślepa próba) zawierającej 25 μl PBS.
    2. Dodać 175 μl zmieszanego odczynnika zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Zmierz odczyty przy długości fali 562 nm za pomocą czytnika ELISA. Odejmij wartości od wartości ślepych, aby uzyskać wartości dla BSA i próbek.
    3. Dopasuj krzywą wzorcową do krzywej regresji liniowej i oszacuj próbki w odniesieniu do wzorca. Postępuj zgodnie z zestawem BCA, aby uzyskać instrukcję szacowania białka.

3. Potwierdzenie hodowli białek filtratu przy użyciu różnych markerów

  1. Wykrywanie białek za pomocą barwienia Coomassie
    1. Aby potwierdzić obecność białek w filtracie hodowlanym, należy pobrać 30 μg białka i rozpuścić w 10% elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z 10% siarczanem sodu (SDS-PAGE; Tabela 4).
      UWAGA: Postępuj zgodnie z opisem w tabeli, aby buforować roztwory do barwienia i odbarwiania SDS-PAGE, Coomassie.
    2. Dodać 20 ml roztworu barwiącego Coomassie (Tabela 5) do żelu i inkubować przez 30 minut na bujakach w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór barwiący.
    3. Dodać 30 ml roztworu odbarwiającego (Tabela 6) do żelu i inkubować przez 30 minut na kołysce w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór odbarwiający i dodaj świeży roztwór odbarwiający. Powtarzaj, aż żel zostanie odpowiednio odbarwiony.
    4. Sprawdź smugę białka na iluminatorze trans (Rysunek 1B). Ponieważ białko filtratu hodowlanego zawiera kilka białek, po odbarwieniu w żelu można zobaczyć smugę prążków białkowych (Rysunek 1B).
  2. Potwierdzenie Western blot dla wydzielanego markera białkowego
    1. Użyj przeciwciała wydzielanego białka, aby sprawdzić obecność wydzielanego białka w filtracie hodowlanym. Ag85B (ab43019) jest dobrze znanym białkiem wydzielanym przez Mtb w filtracie hodowlanym i jest obecny w cytozolu; przeciwciało Ag85B (stężenie 5 mg/ml) (rozcieńczenie 1:5000 w 5% BSA) stosuje się jako kontrolę pozytywną wydzielanego białka.
    2. Załadować WCL białkami filtratu hodowlanego, aby rozróżnić frakcje cytozolowe/błonowe i wydzielane frakcje białkowe. Ag85B jest cytozolowy i wydzielany, więc powinien być obecny w obu frakcjach; z drugiej strony, wiadomo, że PknB jest zlokalizowany w błonie i nie jest obecny w filtracie hodowlanym.
    3. Określ stężenie białek w WCL/filtracie hodowlanym za pomocą zestawu BCA. Zmieszać 30 μg WCL/filtratu hodowlanego z buforem 2x-lamelli w objętości 30 ml (Tabela 7). Rozpuścić próbki w 10% SDS-PAGE dla PknB i 12% SDS-PAGE dla Ag85B, aż czoło barwnika dotrze do dna za pomocą buforu żelowego SDS (Tabela 8). Nie pozwól, aby czoło barwnika spływało z żelu.
      UWAGA: Rozmiar Ag85B wynosi ~35 kDa, więc używane jest 12 % SDS-PAGE.
    4. Wyciąć membranę nitrocelulozową o wymiarach 9 cm x 6 cm 0,2 μm w celu przeniesienia (tabela 9) białka z żelu na membranę. Skonfiguruj transfer za pomocą kasety transferowej, mocząc kasety, podkładki piankowe, bibułę, żel i membranę w 1x lodowatym buforze transferowym.
    5. Umieść podkładkę piankową po jednej stronie kasety, następnie umieść bibułę, umieść żel, nałóż membranę nitrocelulozową na żel, ponownie umieść bibułę, a na koniec umieść kolejną podkładkę piankową i zamknij uchwyt kasety. Umieść uchwyt kasety w zbiorniku transferowym tak, aby strona membrany była skierowana w stronę anody, a strona żelowa była skierowana w stronę katody.
    6. Podłącz przewód katodowy i anodowy do zbiornika, aby zamknąć konfigurację i ustaw ją na prąd 120 mA na 120 minut. Rozpocznij transfer w chłodni.
    7. Po zakończeniu przenoszenia umieść membranę w małym plastikowym pudełku. Zablokuj membranę za pomocą 10 ml 5% roztworu BSA wykonanego z 1x PBST20, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na kołysce.
    8. Usunąć roztwór blokujący, dodać 5-10 ml przeciwciała pierwszorzędowego, które jest przeciwciałem anty-mysim Ag85B (1:5 000 rozcieńczeń w 5% roztworze BSA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w rockerze. Przechowywać przeciwciało w temperaturze -20 °C i użyć ponownie do 3 razy.
    9. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe, dodaj 5-10 ml 1x PBST20 i myj membranę przez 8 minut w temperaturze pokojowej przez energiczne potrząsanie. Usuń pierwsze pranie, dodaj ponownie 5-10 ml 1x PBST20 i umyj. Powtórz to 2x.
    10. Dodaj 5-10 ml 1x PBST20 zawierającego przeciwciało drugorzędowe, które jest przeciwciałem sprzężonym z mysią peroksydazą redoks końską (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000) i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce.
    11. Przemyć membranę za przeciwciałem drugorzędowym zgodnie z krokiem 3.2.9. Dodaj równą ilość substratu HRP i wzmacniacza, aby rozwinąć membranę pod chemiluminometrem (Rysunek 1C).
      UWAGA: Aby potwierdzić brak zanieczyszczenia białkiem cytozolowym, zbadaliśmy Western blot za pomocą przeciwciała anty-PknB (Figura 1C). Przeciwciało wyhodowano w Narodowym Instytucie Immunologii, ośrodku dla zwierząt, przeciwko oczyszczonej domenie pozacytoplazmatycznej PknB. Prążek PknB można zaobserwować w WCL, a nie w przesączach hodowlanych, a PknB jest wyłącznie cytozolowy i związany z błoną i nie powinien być obecny w przesączu hodowlanym.

4. Przygotowanie próbek do spektrometrii mas

  1. Przeprowadź trawienie białka w roztworze za pomocą trypsyny.
    1. Weź 100 μg białka filtratu hodowlanego, dodaj 6 razy więcej lodowatego acetonu i utrzymuj w temperaturze -20 °C przez noc.
      UWAGA: Użyj wyrobów szklanych, aby przygotować wszystkie odczynniki do próbki spektrometrii mas. Używaj probówek do mikrowirówek o niskiej zawartości białka i końcówek wiążących o niskiej zawartości białka. Nie używaj tworzyw sztucznych, aby uniknąć zanieczyszczenia polimerem podczas analizy spektrometrii mas.
    2. Wytrącić białka przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Odrzucić supernatant.
    3. Przemyć osad 500 μl acetonu, osad w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Usuń resztki acetonu za pomocą koncentratora próżniowego.
    4. Dodać 20 μl 8 M mocznika rozpuszczonego w 25 mM wodorowęglanu amonu (2 M bulion przygotowany w wodzie o czystości MS). Próbki należy zawirować i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 60 μl 25 mM wodorowęglanu amonu rozcieńczyć 8 M mocznika w 2 M. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dodać 4 μl TCEP (10 mM stężenia końcowego w 25 mM wodorowęglanu amonu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wytrząsając przy 1 800 x g.
    6. Dodać 4 μl IAA (25 mM końcowe stężenie w 25 mM wodorowęglanu amonu) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, wstrząsając w ciemności przy 1,800 g. Dodać 110 μl 25 mM wodorowęglanu amonu.
    7. Dodaj trypsynę (1:20; Trypsyna: białko w μg) do roztworu i utrzymuj go w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 300 obr./min, do nocnego trawienia (Rysunek 2). Zatrzymaj reakcję trawienia, dodając 10% TFA (kwas trifluorooctowy). Szybko odkurz próbki całkowicie do wyschnięcia.
  2. Odsalanie próbki
    1. Do strawionych peptydów dodać 100 μl 5% ACN + 0,1% TFA. Wirować przez 30 minut przy 1 500 obr./min w temperaturze pokojowej.
    2. Wirować przy 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pobrać supernatant (peptyd) bez dotykania osadu do świeżych probówek do mikrowirówek i przystąpić do odsalania. Przygotuj wszystkie roztwory myjące i elucyjne przed etapem odsalania.
    3. Zrównoważyć końcówkę kolumny C-18 ze 100 μl 100% ACN + 0,1% TFA, pipetując roztwór i powtarzając proces 5x.
    4. Dodać 100 μL 50% ACN + 0,1% TFA i powtórzyć proces 5x. Dodać 100 μL 5% ACN + 0,1% TFA i powtórzyć proces 5x.
    5. Pozwolić, aby peptyd związał się w końcówce kolumny C-18, pipetując 30 razy. Utrzymuj roztwór w temperaturze -20 °C do czasu, aż próbka zostanie przetworzona do spektrometrii mas. Teraz peptyd jest związany z kolumną C-18.
    6. Przemyć kolumnę C-18 100 μl wody klasy MS + 0,1% TFA przez pipetowanie i powtórzyć proces 5x.
    7. Przepłukać kolumnę C-18 100 μl 5% ACN + 0,1% TFA przez pipetowanie i powtórzyć proces 5x. Odeluj peptydy z kolumny C-18 w 100 μl 50% ACN + 0,1% TFA, pipetując 30x (Rysunek 2).
      UWAGA: Po elucji końcówka kolumny C-18 może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia spektrometrii mas.
    8. Całkowicie odkurzyć wymyty peptyd i przechowywać go w temperaturze -20 °C, aż próbka zostanie przekazana do spektrometrii mas.
  3. Wstrzyknięcie próbek peptydów do spektrometrii mas.
    1. Dodać 20 μl roztworu A (dostarczonego przez urządzenie do spektrometrii mas) do wysuszonych próbek peptydów. Wirować próbki przez 30 minut i odwirowywać przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wstrzyknąć 20 μl próbki do maszyny do spektrometrii mas na 90-minutowy przebieg gradientu.

5. Analiza danych dla wydzielanych białek obecnych w filtracie hodowlanym

  1. Identyfikacja białek
    1. Analizuj próbki proteomiczne za pomocą kwadrupolowego spektrometru masowego. Wyślij zapytanie do uzyskanych widm w bazie danych Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Ustaw tolerancje masy prekursora i fragmentu na 10 ppm i 0,5 Da. Ustaw enzym na trypsynę z maksymalną pominiętą wartością rozszczepienia wynoszącą dwa.
    3. Użyj oprogramowania proteomu z sekwestrem jako algorytmem wyszukiwania z karbamidometylacją cysteiny jako ustaloną modyfikacją.
    4. Zidentyfikuj wszystkie dopasowania widma peptydów (PSM) przy 1% wskaźniku fałszywych odkryć. Zastosuj ustawienia domyślne dla wszystkich innych parametrów.
    5. Zmapuj surowe pliki spektrometrii mas sekwencji peptydowej z identyfikatorem UniProt odpowiednich białek Mtb. Wymień wszystkie białka Mtb, ich identyfikatory Uniprot i klasyfikację funkcjonalną za pomocą bazy danych Mycobrowser.
    6. W celu dalszej analizy należy zmapować identyfikatory UniProt zidentyfikowanych białek do ich odpowiedniego numeru Rv. Zdeponuj dane sekretomu spektrometrii mas w konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem partnera PRIDE.

6. Traktowanie H37Rv białkiem filtratu hodowlanego w celu sprawdzenia zmiany w sygnalizacji gospodarza

  1. Izolacja makrofagów otrzewnowych od myszy.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z odniesieniem21, aby wyizolować makrofagi otrzewnowe, wysiewać komórki i infekcję.
      Wstrzyknij myszom Balb/c (w wieku 4-6 tygodni) 1 ml 4% tioglikolanu i wyizoluj makrofagi otrzewnowe z otrzewnej myszy w 4 dniu infekcji21 (Rysunek 3).
    2. Zbierz komórki makrofagów, wstrzykując 1x PBS do otrzewnej myszy. Odwirować komórki przy 1,800 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i dodać 5 ml pożywki 1640-RPMI uzupełnionej 10% FBS (surowica bydlęca; kompletna pożywka) i 1x pen-strep (antybiotyki).
    3. Wysiewać 3 x 105 komórek na basenie na 24-dołkowych płytkach i inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia zmień pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę, a komórki będą gotowe do infekcji lub leczenia białkami filtratu hodowlanego.  
  2. Leczenie makrofagów otrzewnowych białkami filtratu hodowlanego
    1. Przenieś komórki makrofagów do BSL-3 i trzymaj je w inkubatorze. Potraktuj komórki 1 mg/ml białek filtratu hodowlanego (Rysunek 3). Zbierz komórki w różnych punktach czasowych po 4 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach obróbki filtratem po hodowli.
      1. Wyizolowane komórki makrofagów należy rozsiać na 24-dołkowych płytkach w trzech egzemplarzach w każdym punkcie czasowym. Poddać komórki działaniu 1 mg/ml białek filtratu hodowlanego i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C w obecności CO2 . Zbierz komórki w trzech punktach czasowych, 4 godziny, 24 godziny i 48 godzin po zabiegu.
      2. Potraktuj komórki i) buforem 2x-lamello, aby wytworzyć lizaty komórek makrofagów i sprawdzić różne markery komórek gospodarza, wykonując Western blotting oraz ii) różnymi do testów immunologicznych dostarczonych przez producentów wraz z zestawami.
    2. Przygotuj lizaty komórkowe gospodarza i sprawdź różne markery, profilowanie cytokin komórek gospodarza i różne ekspresje białek szlaku sygnałowego na komórkach makrofagów poddanych działaniu filtratu hodowlanego.
      UWAGA: Jeśli laboratorium ma mutanta zastępczego genu białka szlaku wydzielniczego, filtraty hodowlane przygotowane z Mtb H37Rv i mutanta Mtb można wykorzystać do oceny ich wpływu na parametry immunomodulacyjne gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym protokole zaprezentowano izolację białek z filtratu hodowli Mycobacteria (Rysunek 1A). Następnie białka z filtratu hodowli sprawdzono pod kątem różnych markerów, aby potwierdzić izolację filtratu. Zgodnie z opisem w protokole, przeprowadzono barwienie Coomassie w celu sprawdzenia ilości naniesionego białka. W frakcji WCL (ostatnia ścieżka, Rysunek 1B) można zaobserwować rozmazany prążek białkowy, podczas gdy w ścieżkach CF (filtrat hodowli)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z kluczowych obszarów badawczych jest zrozumienie patogenezy Mtb oraz opracowanie skutecznej diagnostyki i szczepionek22,23. Izolacja białek filtratu hodowlanego z pożywek hodowlanych Mtb jest procesem, który umożliwia identyfikację czynników wirulencji wydzielanych przez patogen. Badanie roli białek wydzielniczych w modulowaniu patogenezy Mtb dostarcza informacji mechanistycznych, a także może dostarczyć kandydatów do interwencj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m Filtry strzykawkowemdiSYPL0601MNXX204
0,2 i mikro; m Membrana nitrocelulozowaAmersham10600001
37% HClMerckH1758
AcetonEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonytrylSigma-Aldrich34851-2L
AkrylamidBIORAD1610107
AlbuminaBio Basic KanadaNr kat.:AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Biowęglan amonuSigma-Aldrich09830-500G
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678-100G
anty-Ag85BAbcamAB43019
anty-mysie przeciwciało wtórne skoniugowane HRPThermo Fischer62-6520
AsparaginaSigma-AldrichA0884-500G
bis-akryloamidSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18kolumna Thermo FischerSEM SS18V
Katalaza Sigma-AldrichC1345
Kwas cytrynowySigma-AldrichC0759-500G
DekstrozaSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Średni potok 7H9 bulion   Fisher Scientific271310
Cytrynian żelazowo-amonowy(III)Sigma-AldrichF5879-100G
Kwas mrówkowy 98-100%MerckZ0823704246
Lodowaty kwas octowy 100%MerckCD0C700160
GlicynaSigma-AldrichG8898-1KG
GlicynaSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescencyjny substrat HRPMerckWBKLS0500
JodoacetamidAmershamRPN6302V
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
Kwas oleinowySigmaNr kat.:O1008
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (eksperymenty proteomiczne - sekwencjonowanie peptydów, identyfikacja i kwantyfikacja białek)Thermo Fischer Scientific
Chlorek soduSigmaNr kat.:S3014
Chlorek soduSigma-AldrichS7773-1KG
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
danych białek UniProt
MocznikMP Bio194857
Baza

Bibliografia

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Białka wydzielniczeukłady wydzielniczespektrometria masstężenie białekbakteryjne czynniki wirulencjiimmunomodulacja gospodarzawirowanie
Przygotowanie filtratu z hodowli Mycobacterium tuberculosis w celu zrozumienia patogenezy gruźlicy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.