Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste pochodzące z pępowiny (UC-MSC) wykazują niską immunogenność i silne działanie immunomodulujące w leczeniu różnych chorób. Ludzkie UC-MSC to niejednorodna populacja składająca się z trzech głównych subpopulacji o różnych kształtach komórek, tempie proliferacji, zdolnościach różnicowania i funkcjach regulacji immunologicznej. Wcześniej stwierdzono, że BAMBIo wysokimMFGE8 UC-MSC, pierwsza podgrupa pomyślnie wyizolowana z UC-MSC, nie łagodzi toczniowego zapalenia nerek. W związku z tym funkcja i mechanizm leżący u podstaw tej podgrupy w terapii chorób MSC pozostaje nieznany. Konieczne jest wyizolowanie i dalsze zbadanie BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 UC-MSC pod względem ich fenotypu, metabolizmu i funkcji, aby w pełni zrozumieć naturę tej podgrupy MSC. W tym protokole opisujemy szczegółową metodę izolowania subpopulacji owysokiej zawartości MFGE8 BAMBI od ludzkich UC-MSC. Subpopulacja UC-MSC jest znakowana dwoma markerami powierzchniowymi, BAMBI i MFGE8, za pomocą sortowania metodą cytometrii przepływowej. Wyizolowane komórki są hodowane i weryfikowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Specyficzne geny ulegające ekspresjiw UC-MSCo wysokim poziomieMFGE8 BAMBI są identyfikowane za pomocą RT-qPCR. Protokół ten zapewnia wysoce wydajne i czyste sortowanie komórek i opisuje profile markerów UC-MSCo wysokiej MFGE8BAMBI.
Wprowadzenie
Ludzkie mezenchymalne komórki zrębowe/macierzyste (MSC) są somatycznymi progenitorami zdolnymi do różnicowania się w osteocyty, adipocyty, chondrocyty i inne typy komórek1. MSCs zostały po raz pierwszy wyizolowane ze szpiku kostnego i są powszechnie pozyskiwane z pępowiny, tkanki tłuszczowej i innych tkanek2. Ponieważ UC-MSC są łatwo dostępne i wykazują niską immunogenność i działanie immunosupresyjne, są szeroko stosowane w badaniach klinicznych w leczeniu różnych chorób3,4,5. Chociaż terapia MSC wykazuje obiecujący potencjał w leczeniu chorób, efekty terapeutyczne są niespójne u różnych osób6. Jednak przyczyna niestabilności terapii MSC jest nadal niejasna.
Fluktuacje molekularne, morfologia, zdolność różnicowania i funkcja terapeutyczna składają się na heterogeniczność MSC. Niektóre badania postulowały również, że MSC stanowią subpopulacje o różnych funkcjach7,8 i badały heterogeniczność MSC za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq)9,10. Wyniki ujawniły, że ludzkie UC-MSC mają odrębne subpopulacje o specyficznych cechach transkryptomicznych, podczas gdy niewiele badań z powodzeniem wyizolowało tak zwane subpopulacje MSC. Wcześniej przeprowadziliśmy sekcję ludzkich UC-MSC na trzy podgrupy zgodnie z ich sygnaturami za pomocą scRNA-seq i analizy bioinformatycznej, w której subpopulacja BAMBIo wysokimMFGE8i UC-MSC została dodatkowo oczyszczona i przetestowana funkcjonalnie11. Jednak ta podgrupa nie złagodziła toczniowego zapalenia nerek. W związku z tym konieczne jest przetestowanie efektów terapeutycznych MSCso wysokimpoziomie MFGE8 BAMBI w innych zaburzeniach, aby zrozumieć ich autentyczne funkcje.
Ten protokół opisuje metody izolowania podgrupy BAMBIo wysokimMFGE8 od ludzkich UC-MSC poprzez aktywowane fluorescencją sortowanie komórek (FACS) za pomocą cytometrii przepływowej oraz charakterystykę podgrupy BAMBIo wysokimMFGE8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1989 roku i zatwierdzone przez Komitet Etyki w Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School (numer zatwierdzenia: 202019701). Ludzkie pępowiny zostały pozyskane od zdrowych matek w Szpitalu Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School po naturalnym porodzie, które wyraziły świadomą zgodę na ich wykorzystanie w tej pracy. Pierwotne UC-MSC zostały wyizolowane z ludzkiej pępowiny, jak wcześniej informowano11.
1. Kultura i identyfikacja UC-MSC przed izolacją
- Gdy MSCs osiągną 70-80% konfluencji (P0), przemyj komórki raz PBS i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 9 ml kompletnej pożywki, aby zneutralizować trypsynę, przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 300 × g przez 5 minut, aby zebrać komórki. Odrzucić supernatant i dodać odpowiednią kompletną pożywkę w celu ponownego zawieszenia komórek. Przenieść komórki z każdej płytki do trzech kolb T75 (P1) i hodować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po przejściu UC-MSCs 2x poprzez trypsynizację, w P3, zbierz komórki, wykonując te same czynności, które opisano w kroku 1.1. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w buforze barwiącym FACS (1x PBS zawierający 2% FBS) i policz je. Dodać bufor barwiący FACS do końcowego stężenia 5-10 × 106 komórek/ml i utrzymywać zawiesinę komórek na lodzie.
- Rozprowadzić 100 μl na probówkę tej zawiesiny komórek do różnych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać kontrole izotypu i przeciwciała FACS przeciwko CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 i HLA-DR (wszystkie w stosunku 1:200) do komórek w temperaturze 4 °C przez 30 min.
- Przemyć komórki 2x buforem barwiącym FACS i odwirować w stężeniu 300 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osady w 200 μl buforu barwiącego FACS do analizy cytometrii przepływowej w celu identyfikacji markerów MSC.
2. Izolacja BAMBIo wysokim MFGE8 UC-MSC za pomocą cytometrii przepływowej
- Hodowla UC-MSC do gęstości około 5-10 × 106 komórek podczas izolowania BAMBIo wysokiejMFGE8UC-MSC. Oddziel komórki za pomocą 0,5 mM EDTA przez 5 minut, aż zaczną mieć okrągłą morfologię, dodaj całe podłoże, aby przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odpipetuj zawiesinę komórkową kilka razy w górę iw dół, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową. Użyć 10 μl zawiesiny komórek, aby policzyć komórki i obliczyć całkowitą liczbę pobranych komórek. Odwirować stożkową probówkę z zawiesiną komórek o masie 300 × g przez 5 minut w celu zebrania komórek.
- Zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki do końcowego stężenia 5-10 × 106 komórek/ml i utrzymać zawiesinę komórkową na lodzie.
- Podzielić komórki na cztery probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (tylko ślepe komórki; Komórki znakowane BAMBI; Komórki znakowane MFGE8; i zarówno komórki znakowane BAMBI, jak i MFGE8).
- Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich stężeniach (MFGE8 i BAMBI, oba w stosunku 1:100) do probówek, wymieszać i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Umyj oznaczone komórki raz 1x PBS i odwiruj w 300×g przez 5 minut. Wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki, dodać sprzężone fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe (kozie przeciwciała anty-królicze IgG H&L Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647, wszystkie w stosunku 1: 1,000) do komórek, wymieszać i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.
- Umyj oznaczone komórki raz 1x PBS, jak opisano w kroku 2.5. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl kompletnej pożywki, przefiltrować przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm w celu wyeliminowania grudek i zanieczyszczeń, a następnie przenieść filtrat do probówki o pojemności 15 ml w celu sortowania metodą cytometrii przepływowej.
- Uruchom probówkę ze ślepą krwią bez dodawania przeciwciała (kontrola ujemna) i dostosuj rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC), aby zabramować skalę populacji ujemnej za pomocą barwienia przeciwciałami.
- Uruchom pojedyncze probówki komórkowe znakowane przeciwciałami (tj. MFGE8 + kozia anty-królicza IgG H&L Alexa Fluor 488 lub BAMBI + kozia anty-królicza IgG H&L Alexa Fluor 647) jako kontrolę bramkowania, aby określić, gdzie zaczyna się dodatniość na wykresie.
- Uruchom eksperymentalną probówkę (probówki) z próbkami, aby posortować i zebrać populację komórek owysokiej zawartościMFGE8 BAMBI.
- Posortowane MSC BAMBIo wysokiejMFGE8 należy umieścić na płytce 24-dołkowej i hodować komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Gdy posortowane MSC BAMBIo wysokiejMFGE8 rosły przez dwa pasaże, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek, należy rozdzielić komórki i przeprowadzić analizę po sortowaniu, aby zapewnić czystość posortowanych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w krokach 2.1-2.9. Alternatywnie, zbadaj czystość posortowanych komórek za pomocą konwencjonalnej immunofluorescencji przeciwko ludzkiej ekspresji BAMBI i MFGE8, jeśli liczba pobranych komórek jest zbyt mała.
3. Charakterystyka wysokich MSCs BAMBI MFGE8
- Hoduj posortowane MSCsBAMBI o wysokiej MFGE8na 12-dołkowej płytce, zbadaj ich morfologię komórek pod mikroskopem i porównaj je z morfologią niesortowanych MSCs.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, komórki BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 rosną szybciej niż niesortowane UC-MSC. - Gdy komórki są w około 90% zlewające się na 12-dołkowej płytce, odessać pożywkę do hodowli komórek, przemyć komórki raz 1x PBS i dodać 500 μl odczynnika do ekstrakcji RNA do komórek. Powoli potrząsaj płytką w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
- Odpipetować mieszaninę i przenieść ją do probówki wolnej od RNaz i DNaz. Dodać 100 μl chloroformu, zakryć probówkę i energicznie wstrząsać mieszaniną, wirując przez 15 sekund. Następnie pozostaw probówkę w pozycji RT na 3 minuty.
- Odwirować probówkę przez 15 minut w temperaturze 11 000 × g i temperaturze 4 °C.
- Przenieść około 200 μl górnej warstwy wodnej do nowej probówki. Dodać taką samą objętość izopropanolu i kilkakrotnie dokładnie pipetować w górę iw dół. Następnie pozostaw mieszaninę w temperaturze RT na 10 minut.
- Wirować przez 15 minut w temperaturze 11 000 × g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
- Dodaj 500 μl 75% etanolu do granulki w probówce i delikatnie odwróć probówkę kilka razy.
- Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 6 000 × g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powtórzyć wirowanie raz przez 10 s przy 6 000 × g, ostrożnie odessać pozostały płyn za pomocą pipety i wysuszyć probówkę w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 10 μl wody wolnej od RNaz, aby rozpuścić osad RNA i zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zsyntetyzować pierwszą nić cDNA z maksymalnie 1 μg całkowitego RNA.
- Użyj zestawu qPCR do wykrywania i ilościowego określania ekspresji genów, zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Sekwencje użytych starterów DNA są wymienione w Tabeli 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia profile ekspresji markerów powierzchniowych komórek ludzkich UC-MSCs. Hodowane MSC wykazują silną dodatnią ekspresję CD44, CD73, CD90 oraz CD105 i ujemną ekspresję CD14, CD34, CD45, CD79 oraz HLA-DR. MSC o fenotypie BAMBIhighMFGE8high zostały wyizolowane z hodowanych ludzkich UC-MSCs, a ich ekspresja BAMBI i MFGE8 została ponownie przeanalizowana metodą cytometrii przepływowej po ekspansji przez 3-4 pasaże (Rysunek 2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje, w jaki sposób wyizolować i wzbogacić subpopulację BAMBIo wysokiejzawartości MFGE8 od ludzkich UC-MSC. Metoda ta jest istotna dla dalszych badań nad morfologią, wzrostem i funkcją tej podgrupy MSC. Niektóre kroki są niezbędne do pomyślnej izolacji i wysokiej wydajności komórek BAMBIo wysokiej zawartościMFGE8.
Po pierwsze, najbardziej krytycznym aspektem technicznym do rozważenia jest zastosowanie odpowiedniego rozwiązania do dyso...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82271843).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do mikrowirówki 0,6 ml | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| 1,5 ml | Beijing Labgic Technology | MCT-001-150 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm | Beijing Labgic Technology | 12311 | |
| 12-dołkowa płytka | Beijing Labgic Technology | 11210 | |
| 15 ml probówka wirówkowa | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00115 | |
| 24-dołkowa rurka | Beijing Labgic Technology | 11310 | |
| 50 ml | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 ml Rury okrągłodenne | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ m sitko komórkowe | Falcon | 352350 | Rozcieńczenie: 1:1000 |
| APC anty-ludzki CD79a (Ig&alfa;) Przeciwciało | BioLegend | 333505 | 581 Rozcieńczenie: 1:200 |
| APC/cyjanina7 przeciwciało anty-ludzkie CD73 (ekto-5'-nukleotydaza) | BioLegend | 344022 | G46-6 Rozcieńczenie: 1:200 |
| APC-Cy7 Mysie IgG1, κ Kontrola izotypu | BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| Przeciwciało BAMBI | Bioss | bs-12418R | |
| Brilliant Violet 510 przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD44 | BioLegend | 103044 | 5E10 Rozcieńczenie: 1:200 |
| Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Przeciwciało Isotype Ctrl | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| Przeciwciało monoklonalne CD105 (Endoglin) APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Rozcieńczenie: 1:200 |
| Szkiełka komory do liczenia komórek | Szanghaj Wirówka QIUJING | XB-K-25 | |
| Pekin BAIYANG | BY-320C | ||
| ChamQ Uniwersalny SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Chloroform | XILONG Scientific | 13700908 | |
| DMEM/F-12 (1:1) zasadowy (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| EDTA (0,5 M), pH 8,0, Invitrogen AM9260G bez rnaz | Rozcieńczenie: 1:1000 | ||
| Etanol | XILONG Scientific | 12803405 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Mysz Anti-Human CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Rozcieńczenie: 1:200 |
| FITC Mysz anty-ludzka CD45 | BD Bioscience | 555482 | AD2 Rozcieńczenie: 1:200 |
| FITC Mysz anty-ludzka HLA-DR | BD Bioscience | 555811 SN6 Rozcieńczenie: 1:200 | |
| Cytometr przepływowy | BD Bioscience | FACSAria&handel; III Sorter komórekAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| Kozia IgG Przeciw Myszom H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Rozcieńczenie: 1:200 |
| Kozia IgG Anty-Królicza H& L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Rozcieńczenie: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix do qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| Mikroskopy odwrócone | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Alkohol izopropylowy | XILONG Scientific | 12802505 | |
| MFGE8 | Biorbyt | orb388429 | Rozcieńczenie: 1:100 |
| Mikrowirówka | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypu APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| Mysz IgG1 kappa Kontrola izotypu FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| Mysz IgG2b kappa Kontrola izotypu FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Szanghaj) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Mysz anty-ludzka CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (kontrola izotypu) Rozcieńczenie: 1:200 |
| PE-Cy5 Mysia IgG1 κ Kontrola izotypu | BD Bioscience | 550618 | |
| Penicylina-Streptomycyna 100x | Cytiva | SV30010 | Rozcieńczenie: 1:100 |
| System PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific | Q6 | |
| QIAGEN | 129112 | RNaz | |
| Thermo Fisher Scientific | NanoDrop One (840-317400) | ||
| Sterylne końcówki do mikropipet | Beijing Labgic Technology | Rozcieńczenie: 1:100 | |
| Kolba do hodowli komórkowych T75 | Beijing Labgic Technology | 13212A | |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems firmy Thermo Fisher Scientific | Veriti | |
| Tri odczynnik | Sigma Aldrich | T9424 | |
| Roztwór Typsin-EDTA | Bio-Channel Biotechnology | BC-CE-005 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Bibliografia
- Liechty, K. W., et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med. 6 (11), 1282-1286 (2000).
- Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. J Hematol Oncol. 14 (1), 24(2021).
- Xie, Z., et al. Tnf-alpha-mediated m(6)a modification of elmo1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis. Nat Commun. 12 (1), 5373(2021).
- Mcguire, J. J., et al. Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 723(2021).
- Yuan, X., et al. Mesenchymal stem cell therapy induces flt3l and cd1c(+) dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients. Nat Commun. 10 (1), 2498(2019).
- Wang, D., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus: A multicenter clinical study. Arthritis Res Ther. 16 (2), R79(2014).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Wang, Z., et al. Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity. Clin Transl Med. 11 (12), e650(2021).
- Chen, P., et al. Single-cell and spatial transcriptomics decodes wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells heterogeneity and a subpopulation with wound repair signatures. Adv Sci (Weinh). 10 (4), e2204786(2023).
- Chen, H., et al. Dissecting heterogeneity reveals a unique bambi(high) mfge8(high) subpopulation of human uc-mscs. Adv Sci (Weinh). 10 (1), e2202510(2022).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of fas receptor and fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).
- Avinash, K., Malaippan, S., Dooraiswamy, J. N. Methods of isolation and characterization of stem cells from different regions of oral cavity using markers: A systematic review. Int J Stem Cells. 10 (1), 12-20 (2017).
- Galvao, I., et al. Rock inhibition drives resolution of acute inflammation by enhancing neutrophil apoptosis. Cells. 8 (9), 964(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
