Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chirurgiczne usunięcie złożonego narządu czuciowego w wysoce regeneracyjnych ctenoforach

887 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67546

⸱

8 sierpnia 2025

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, New Jersey Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy prosty protokół usuwania statocysty i związanych z nią tkanek w ctenoforze Mnemiopsis leidyi, który jest podatny na obrazowanie na żywo.

Streszczenie

Ctenofor Mnemiopsis leidyi to klasyczny zwierzęcy model regeneracji całego ciała. Zwiększona podatność na manipulacje wieloma technikami laboratoryjnymi i ich filogenetyczne umiejscowienie jako prawdopodobnej grupy siostrzanej pozostałych Metazoa doprowadziło do niedawnego odnowienia zainteresowania naukowców pracą z ctenoforami. Mogą zregenerować każdy brakujący narząd lub typ komórki, w tym pełną regenerację całego ciała z fragmentu tak małego jak ~15% ciała, w ciągu kilku dni. Podobnie jak większość ctenoforów, M. leidyi mają nieudolnie zlokalizowany, wyczuwający grawitację narząd, który łączy bodźce sensoryczne z wyjściem motorycznym, aby kontrolować pozycję i orientację ciała. Protokół ten demonstruje chirurgiczne usunięcie kompleksu narządów brzusznych (AO) i powiązanych struktur u M. leidyi wraz z metodami hodowli, obsługi i montażu odpowiednimi do zobrazowania procesów gojenia i regeneracji ran, które zachodzą w ciągu kolejnych godzin do dni. Te proste techniki można w szerokim zakresie dostosować do różnych paradygmatów eksperymentalnych i kontekstów laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Ctenofory, znane również jako galaretki grzebieniowe, są kosmopolityczne dla środowiska morskiego Ziemi i mogą być głównymi graczami w ekosystemach, szczególnie jako część sieci pokarmowej. Ctenofor Mnemiopsis leidyi jest historycznym i coraz bardziej popularnym zwierzęcym modelem regeneracji całego ciała 1,2. Ich zdolność do regeneracji brakujących narządów lub typów komórek pojawia się pod koniec embriogenezy i utrzymuje się przez całe życie postembrionalne 3,4 (~0,1 do >1,000 mm wielkości ciała). Są również przezroczyste przez całe życie i są podatne na różne techniki obrazowania na żywo i stałe. Ostatni wspólny przodek wszystkich ctenoforów miał wiele typów komórek i złożonych narządów; większość zachowanych ctenoforów posiada większość z nich na co najmniej jednym etapie życia: nieudolny narząd wyczuwający grawitację (historycznie nazywany narządem wierzchołkowym, a tutaj nazywany narządem brzusznym, AO), wyspecjalizowane struktury lokomotoryczne złożone z wysoce zorganizowanych makrorzęsek, które biją w skoordynowany sposób (rzędy grzebienia), chowane macki żywieniowe i fotocyty, które bioluminescenują w odpowiedzi na szkodliwe bodźce (ryc. 1).

Pomimo ich licznych typów komórek i złożonych, zależnych od kontekstu zachowań, solidny zbiór danych genomicznych potwierdza umiejscowienie ctenoforów jako prawdopodobnej grupy siostrzanej dla wszystkich innych żyjących zwierząt 5,6,7,8. Duże różnice w komórkowych i funkcjonalnych podstawach układu nerwowego ctenoforu w porównaniu z innymi zwierzętami posiadającymi układ nerwowy (parzydełkowca i parzydełkowce) sugerują hipotezę, że układ nerwowy ctenoforu ma niezależne pochodzenie; Pozostaje to jednak niepewne 9,10,11,12.

Kompleks narządów zmysłów aboralnych obejmuje statocystę, która obejmuje wiele typów komórek, w tym wiele typów domniemanych komórek neurosensorycznych 13,14,15,16,17,18 i jest stale utrzymywana w niemanipulowanych ctenoforach. Komórki mechanosensoryczne mają duże wiązki rzęskowe, które są odchylane przez statolit składający się z biomineralizowanych komórek (zwanych litocytami) w celu wykrycia grawitacji. Dwa "pola polarne", które zawierają domniemane struktury czuciowe o nieznanejfunkcji14 i prawdopodobne komórki fotosensoryczne16, sąsiadują ze statocystą.

Eksperymentalne badania zdolności regeneracyjnych M. leidyi objęły najmniejsze zwierzęta na etapie przejścia od zarodka do wyklucia (~100 μm) do wolno żyjących makroskopowych dorosłych osobników (>2 cm). M. leidyi o średnicy ciała ~1 mm są wystarczająco duże, aby umożliwić ręczną manipulację chirurgiczną bez specjalnych narzędzi, takich jak mikromanipulatory, ale są wystarczająco małe, aby można je było zamontować na standardowym szkiełku mikroskopowym w celu obrazowania za pomocą obiektywów o dużej mocy. Protokół ten demonstruje chirurgiczne usunięcie narządu czucia jamy ustnej i związanych z nim struktur, wraz z metodami hodowli i obrazowania odpowiednimi do udokumentowania procesów gojenia się i regeneracji ran, które zachodzą w ciągu kolejnych godzin do dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj narzędzia i materiały

  1. Za pomocą standardowego palnika Bunsena ręcznie wyciągnij szklane igły do wycinki ze szklanych mikropipet kapilarnych. W przypadku zwierząt o wzroście powyżej 1 mm należy używać kalibrowanych mikropipet sodowo-wapiennych przeznaczonych do pracy z cieczami.
    UWAGA: Rozmiar 100 μl działa dobrze w całym zakresie ogniskowych 0,5-3 mm.
    1. Ustaw ostry niebieski stożek płomienia w palniku Bunsena.
    2. Przytrzymaj środkowy punkt szklanej pipety w płomieniu, aż zmięknie na tyle, aby poruszać się pod delikatnym naciskiem.
    3. Zdejmij pipetę z płomienia i natychmiast rozsuń obie strony, aby utworzyć krótką, mocną igłę.
      UWAGA: Szklana igła może zostać ponownie stopiona, jeśli zadowalający wynik nie został uzyskany za pierwszym razem, a złamane igły mogą zostać zachowane i ponownie wyciągnięte. Na rysunku 2 przedstawiono przykłady użytecznych i bezużytecznych igieł wyciąganych tą metodą.
      ALTERNATYWA: Igły 26 G 1/2 cala również działają dobrze, szczególnie na większym końcu zakresu ogniskowych.
  2. Przygotuj sterylną wodę morską, przepuszczając naturalną lub sztuczną wodę morską przez filtr 0,22 μm.
  3. Utwórz pipety pomiarowe.
    1. Za pomocą ostrych nożyczek lub żyletki wytnij plastikową pipetę transferową, aby uzyskać otwór o wewnętrznej średnicy preferowanego rozmiaru. Należy przygotować co najmniej jedną pipetę dla górnej części żądanego zakresu i jedną dla dolnej części żądanego zakresu. Rysunek 3 przedstawia przykładowy zestaw pipet pomiarowych.
      UWAGA: Te pipety działają dobrze do ~8 mm. Możliwe jest również oszacowanie rozmiaru za pomocą mikrometru lub narzędzi pomiarowych na podstawie zdjęć.

2. Przygotuj zwierzęta do eksperymentu

  1. Wybierz morfologicznie normalne osobniki o pożądanej wielkości i stadium.
    UWAGA: Uważamy, że zwierzęta o średnicy ~0,5-3 mm są optymalne do montażu na zjeżdżalniach. Sprawdź, czy zwierzęta nie mieszczą się w pipecie o najniższym rozmiarze, ale wygodnie mieszczą się w pipecie o najwyższym rozmiarze.
  2. Głodzić zwierzęta doświadczalne przez 8-16 godzin.
    UWAGA: Podczas gdy M. leidyi są optycznie przezroczyste i nie są wysoce autofluorescencyjne, pokarm krążący w ich układzie pokarmowym jest na ogół nieprzezroczysty i często autofluorescencyjny.

3. Wykonuj cięcia

  1. Użyć pipety do przenoszenia szerszej niż rozmiar ciała zwierzęcia doświadczalnego, aby przenieść ją do polistyrenowego naczynia o średnicy 35 mm zawierającego sterylną wodę morską.
  2. Wizualizuj próbkę za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Przetoczyć jedno zwierzę na stronę przełyku (ryc. 1). Ten widok daje najłatwiejszy dostęp do usunięcia narządu brzusznego. Skoncentruj się na narządzie brzusznym.
    UWAGA: Najbardziej użyteczne powiększenie może się różnić w zależności od wielkości zwierzęcia i preferencji użytkownika. Generalnie dobrze sprawdza się powiększenie 12-20x.
  3. Delikatnie przytrzymaj zwierzę w miejscu za pomocą jednej szklanej igły, używając ręki niedominującej.
  4. Używając ręki dominującej, wbij końcówkę igły nieco poniżej narządu brzusznego. Wejdź ukośnie, aby wykonać jedno cięcie od jednej widocznej krawędzi narządu brzusznego poniżej jego podstawy. Wyjąć igłę i wykonać drugie nacięcie, aby usunąć kawałek tkanki w kształcie klina zawierający wszystkie struktury narządu brzusznego (patrz ryc. 4, górny panel). Dokładnie zbadaj zwierzę i wyciętą tkankę, aby upewnić się, że operacja się powiodła.
  5. Użyj tej samej pipety transferowej, aby przenieść świeżo pokrojone zwierzę do świeżego naczynia zawierającego sterylną wodę morską.
    UWAGA: Rana szybko się zamknie, więc w zależności od celów eksperymentalnych (np. dla wielu synchronicznie regenerujących się próbek lub do zobrazowania wczesnych etapów gojenia i regeneracji), należy szybko przejść do generowania kilku próbek. Użyj timera, aby ograniczyć czas operacji, aby utrzymać kohorty regenerujących się zwierząt bliżej siebie.

4. Sprawdź, czy cięcia są prawidłowe

UWAGA: Nawet dokładne sprawdzenie pod mikroskopem preparacyjnym czasami może przeoczyć błędy chirurgiczne.

  1. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami montażu, aby tymczasowo zamontować każdą osobę po operacji na szklanym szkiełku, aby sprawdzić pod mikroskopem złożonym z DIC, czy wszystkie zamierzone struktury zostały prawidłowo usunięte. Wykonaj tę kontrolę, nawet jeśli w tej chwili nie przeprowadzasz dalszego obrazowania.
    UWAGA: Doskonałe zdolności lecznicze ctenoforów dobrze nadają się do eksperymentów ze szczepieniem; zawsze usuwamy wycięte narządy brzuszne z naczynia hodowlanego, aby zapobiec możliwości, że przecięte boki usuniętego AO i reszta zwierzęcia, z którego został usunięty, mogą się sklejać i łączyć.
    Jeśli nie przechodzisz bezpośrednio do obrazowania długotrwałego, nie uszczelniaj szkiełka. Ułatwi to szybki powrót do zdrowia i powrót do kultury tego doświadczalnego zwierzęcia. Zaleca się sprawdzenie dokładności chirurgicznej w dużym powiększeniu. W szczególności statolith może zostać wybity z kopuły bez ukończenia operacji.

5. Obrazowanie na żywo

  1. Montażu
    1. Standardowe szklane szkiełko mikroskopowe należy potraktować środkiem silanizującym, takim jak środek hydrofobowy do obróbki szkła, i pozostawić do całkowitego wyschnięcia.
    2. Przenieść jedno zwierzę pooperacyjne na przygotowane szkiełko za pomocą pipety do przenoszenia. Upewnij się, że woda spływa wraz ze zwierzęciem w środku.
    3. Umieść niewielką ilość plasteliny (~1,5 mg) na każdym rogu szkła nakrywkowego, aby uformować "stopy", które posłużą jako przekładka do odciągnięcia szkła nakrywkowego od zwierzęcia.
    4. Delikatnie połóż nakrycie, glinianą do dołu, na wierzchu zwierzęcia. Trzymając każdy róg szkła nakrywkowego, obróć zwierzę do pozycji do obrazowania. Dociśnij, aby lekko ścisnąć zwierzę, przytrzymując je na miejscu. Zmień położenie próbki tak bardzo, jak to konieczne, aby uzyskać zadowalający widok.
    5. W przypadku obrazowania dłuższego niż ~30 minut, nałóż cienką warstwę wazeliny na każdą krawędź szkła nakrywkowego, aby zapobiec wysuszeniu próbki.
      UWAGA: M. leidyi zamontowany w ten sposób można łatwo odzyskać do dalszej hodowli lub innych testów. Jednak zwierzęta na ogół uwalniają się i zmieniają pozycję w ciągu 1-2 godzin, więc ciągłe przechwytywanie poklatkowe dłuższe niż 2 godziny wymagałoby innego podejścia do obrazowania.

6. Hodowla

  1. Warunki hodowli cydippid
    1. Hodowla zwierząt zmanipulowanych chirurgicznie i grupa kontrolna w przefiltrowanej naturalnej lub sztucznej wodzie morskiej o temperaturze zbliżonej do pokojowej. Użyj inkubatora ustawionego na 20-22 °C, aby zapewnić spójne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

stadium cydippidów M. leidyi zazwyczaj całkowite zamknięcie rany w ciągu ok. 20 min po urazie (Rycina 4 i Rysunek 5), podczas gdy pełna regeneracja organu może trwać od 1 do 3 dni. Termin ten wykazuje pewną zmienność biologiczną, lecz proces ten niemal zawsze kończy się do 72 h po operacji (Rycina 6).

Chirurgiczne usunięcie komórek i mezoglei z kompleksu organu aboralnego oraz pobliskich tkanek, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podobne eksperymenty można było przeprowadzić na dowolnej wielkości M. leidyi; Morogeneza narządu kończy się równocześnie z początkiem zdolności regeneracyjnych4. Zwierzęta mogą być zbierane ze środowiska naturalnego19 lub hodowane w laboratorium20,21. Jeśli pożądany jest określony rozmiar ciała, zwierzęta mogą zostać dopuszczone do tarła, a potomstwo podniesione do pożądanego rozmiaru. Rozmiar korpusu możn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy z wdzięcznością dziękują Jowcie Józefowi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m Filtr strzykawkowy SFCAThermo/Nalgene723-2520Stwórz sterylną wodę morską
Polistyrenowa szalka Petriego 35 mmSokół/Corning351008wykonywać cięcia; Kultura małych zwierząt
Jednorazowa strzykawka typu luer-lock 60 mlZaopatrzenie BHBH60LLStwórz sterylną wodę morską
Kalibrowane pipety szklane, 100 μ LDrummond2-000-100Wykonywanie cięć
Okulary nakrywkowe, #1.5, kwadrat 18 mmFirma VWR16004-326Uchwyt do obrazowania
CtenoforyOkazy z Zatoki Perskiejżywe zwierzęta
Prowadnice wpuszczane ze szkła dwukomorowego, 1,3 mmFirma VWR470200-930Uchwyt do obrazowania
szklane szkiełka mikroskopoweFirma VWR16004-398Uchwyt do obrazowania
Błyskawiczna sól morska oceanicznaNatychmiastowy oceanPożywka do hodowli zwierząt
mini linijkaTeda Pella13623Zmierz plastikowe pipety
modelina (plastelina)Pepy PlastilinaUchwyt do obrazowania
wazelinaWazelinaUchwyt do obrazowania
Plastikowe pipety transferowe (różne rozmiary)Cole'a-Parmera06226-13, 06226-12, 06226-01Przemieszczaj małe zwierzęta
Powłoka szkła Rain-XDeszcz-Xsilanizowane szkiełka mikroskopowe
linijkaWestcott powiedział:10564Zmierz plastikowe pipety
nożyczkiOXOWytnij plastikowe pipety

Bibliografia

  1. Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
  2. Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
  3. Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
  4. Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
  5. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  6. Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
  7. Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
  8. Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
  9. Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
  10. Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
  11. Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
  12. Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
  13. Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
  14. Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
  15. Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
  16. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
  17. Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
  18. Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
  19. Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
  20. Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
  21. Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
  22. Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
  23. Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
  24. Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
  25. Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
  26. Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
  27. Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja ctenoforówusunięcie organu aboralnegoMnemiopsis leidyichirurgia organów sensorycznychregeneracja całego ciałagojenie ranstereomikroskoptechnika szklanej igłymontaż zwierzęciaregeneracja tkanek
Chirurgiczne usunięcie złożonego narządu czuciowego w wysoce regeneracyjnych ctenoforach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.