Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Artykuł metodologiczny
Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Grzyby infekują ludzi, gdy zarodniki środowiskowe są wdychane do płuc. Płuco jest niejednorodnym narządem. Przewodzące drogi oddechowe, w tym oskrzela i oskrzeliki, rozgałęziają się aż do zakończenia w pęcherzykowej przestrzeni powietrznej, w której zachodzi wymiana gazowa. Infekcje wywodzące się z oskrzelików lub pęcherzyków płucnych wywołują wyraźne reakcje gospodarza i objawy chorobowe. Dlatego dokładne zrozumienie, gdzie zarodniki naturalnie lokalizują się w płucach, szczególnie wkrótce po zakażeniu, rozszerza możliwości badania interakcji gospodarz-patogen. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy analizę in situ płuc myszy zakażonych artrokonadią Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Konwencjonalne metody konserwacji histologicznej polegają na płynnym napełnianiu dróg oddechowych roztworem utrwalającym, który przemieszcza naturalne położenie zasysanych cząstek grzybów, wypychając zarodniki z proksymalnych oskrzelików do końcowych przestrzeni powietrznych.
Na odwrót, ta metoda napełniania powietrzem z utrwalaniem perfuzji naczyń krwionośnych zachowuje fizjologiczne położenie zarodników grzybów w oskrzelikach. Ponadto opisujemy proste podejście do kriokonserwacji, osadzania i obrazowania próbek płuc. Udostępniamy również wysokoprzepustowe techniki obliczeniowe za pośrednictwem programu QuPath o otwartym kodzie źródłowym do analizy przestrzennego rozmieszczenia zarodników grzybów w płucach. Przedstawiona tutaj metoda jest prosta i szybka, wymaga minimalnego sprzętu do wykonania i można ją łatwo dostosować do stosowania z wieloma modelami infekcji grzybiczych dróg oddechowych.
Wprowadzenie
Ludzie mogą wdychać do miliardów zarodników dziennie z różnych grzybów środowiskowych1. Aby zrozumieć naszą barierę obronną przed tymi wdychanymi zarodnikami, musimy docenić dokładne środowiska mikroanatomiczne, w których te zarodniki lądują w drogach oddechowych i miąższu płuc. Skład komórkowy dróg oddechowych (tj. komórek nabłonkowych) znacząco zmienia się wzdłuż tchawicy, oskrzeli, oskrzelików i pęcherzyków płucnych. Każdy z tych odrębnych regionów składa się z różnych typów komórek o dyskretnych funkcjach, które korzystają z arsenału obron, aby zapobiec infekcji patologicznej.
Dokładna lokalizacja odkładania się zarodników grzybów płucnych może różnić się między światłami dróg oddechowych oskrzelików wyściełanych nabłonkiem walcowatym, przewodami pęcherzykowymi lub pęcherzykami płucnymi2. Większość istotnych klinicznie gatunków grzybów wytwarza zarodniki o średnicy od 1 μm do 10 μm3. Odkładanie się tych cząsteczek zarodników w płucach zależy od kilku czynników, takich jak aerodynamika, gęstość, ładunek elektryczny i siły foretyczne, które mogą wpływać na mechanizm sedymentacji po inhalacji4. Ogólnie rzecz biorąc, duże cząstki (> 6 μm) osadzają się w górnych drogach oddechowych, średnie cząstki (2-6 μm) mogą osadzać się w mniejszych drogach oddechowych, a małe cząstki (<2 μm) docierają do obszaru pęcherzykowego5. Donoszono, że zarodniki Aspergillus (2-3 μm) docierają do przestrzeni pęcherzykowych, ale kliniczne raporty patologiczne wskazują również na znaczne obciążenie chorobami oskrzeli i oskrzelików6. Coraz częściej rozpoznaje się również wewnątrzoskrzelowe infekcje grzybicze Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum i Zygomycetes ze względu na rosnącą popularność elastycznej bronchoskopii7. Ostatnie postępy w obrazowaniu mikroskopowym zakażeń Aspergillus u myszy ujawniły również, że bardziej proksymalne przestrzenie powietrzne, takie jak oskrzela i oskrzeliki, mogą być najbardziej obciążone patologiczną proliferacją grzybów8. Badania nad reakcją gospodarza na infekcje grzybicze płuc wykazały, że zarówno komórki nabłonka oskrzelików, jak i komórki nabłonka pęcherzyków płucnych odgrywają ważną rolę jako strażnicy odporności, więc wyjaśnienie dokładnych miejsc odkładania się zarodników i interakcji nabłonkowej będzie miało kluczowe znaczenie dla przyszłych prac2,9,10.
Badanie dynamiki patogenezy proksymalnych dróg oddechowych jest trudne, ponieważ standardowe techniki unieruchamiania płuc i przygotowania sekcji mogą przemieścić zarodniki z tych proksymalnych pozycji w drogach oddechowych wyściełanych nabłonkiem i popchnąć je w kierunku dystalnych końcowych obszarów pęcherzyków płucnych. Zwykle 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu stosuje się do nadmuchania płuc i szybkiego wystawienia całego płuca na działanie utrwalacza. Przygotowując płuca do kriosekcji, niektóre grupy podają do płuc związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby poprawić wydajność kriosekcji11. Praktyki te są przydatne we właściwym kontekście, ale zostały odkryte przez nasze laboratorium i inne grupy, aby przemieszczać zarodniki i cząstki z lokalizacji proksymalnych, zakłócając w ten sposób interpretacje typów komórek narażonych na działanie zarodników i późniejszej odpowiedzi gospodarza12.
Aby dokładnie ustalić mikroanatomiczną lokalizację wdychanych zarodników grzybów, opracowaliśmy szybką, mało wymagającą metodę zachowania lokalizacji zarodników grzybów w drogach oddechowych myszy. Zaadaptowaliśmy metodę perfuzji naczyniowej z mysim powietrzem od Thomasa i in. (2021), w której zmniejszyliśmy ilość sprzętu, czasu i umiejętności technicznych wymaganych do osiągnięcia zadowalającego wyniku13. Z opisanej tutaj metody zaobserwowaliśmy, że artrokonidia Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (o wielkości 3-5 μm) gromadzą się bardziej proksymalnie niż wcześniej pokazano, a mianowicie w dystalnych oskrzelikach i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie w końcowych pęcherzykach płucnych. Informacje te mogą ukierunkować pytania biologiczne dotyczące krytycznych typów komórek związanych z tymi regionami płuc i ich wpływu na wczesne reakcje na wdychane zarodniki grzybów.
Protokół
Wszystkie metody opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Znakowanie zarodników fluorescencją wewnątrzkomórkową
- Zbarwić 1 x 106 zarodników carboksyfluoresceiną z estrem sukcynymidowym (CFSE), barwnikiem Cell Tracker Orange lub Cell Tracker Red (lub wybranym barwnikiem wewnątrzkomórkowym) w stężeniu 5 µM przez 30 min w temperaturze 30 °C, następnie przemyć PBS i odwirować zarodniki przy 12 000 x g. Powtórzyć to przemywanie raz.
- Przygotować inokulum zarodników o odpowiednim stężeniu, tak aby 25 µL zawierało odpowiednią dawkę zarodników dla jednej myszy.
2. Inokulacja myszy zarodnikami poprzez aspiracyjną inhalację przy znieczuleniu izofluranem
UWAGA: Izofluran jest lotnym środkiem anestezjologicznym i musi być stosowany w wentylowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego lub dygestorium.
- Aby przygotować słoik do ekspozycji na izofluran, włóż złożoną serwetkę do słoika Nalgene o pojemności 1 L z nakrętką, a na serwetce umieść plastikowy okrągły krata, który posłuży jako platforma dla myszy. Dodaj 2 mL izofluranu na serwetkę, zamknij słoik i odczekaj 1-2 min, aż gaz wyrówna stężenie w naczyniu.
Rycina 1: Aparatura do metody otwartej kropli izofluranu w celu inokulacji sporami. Na dnie słoika z zakrętką o pojemności 1 L umieszcza się złożoną serwetkę, a następnie wkłada okrągłą plastikową siatkę, która służy jako platforma dla myszy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przed podaniem znieczulenia myszy, przygotuj pipetę z 25 µL inokulum. Umieść mysz w pojemniku z izofluranem i przechyl go, aby monitorować utratę odruchu prostowania, w którym mysz traci przytomność i znajduje się w pozycji odwróconej. Zazwyczaj zajmuje to około 10 s.
- Monitoruj częstotliwość oddychania (RR), aż zwolni ona do stałego poziomu 50-80 oddechów na minutę (bpm), co stanowi około 50% spoczynkowej RR. Zazwyczaj zajmuje to kolejne 10 s. W tym momencie wyjmij mysz z pojemnika z izofluranem.
UWAGA: Jest to wysokie stężenie izofluranu, które spowoduje szybką indukcję znieczulenia, dlatego mysz musi być bardzo uważnie monitorowana. Istnieje ryzyko śmiertelnego przedawkowania izofluranu, ponieważ jego stężenie może być zmienne, a krzywa dawka-odpowiedź dla izofluranu jest bardzo stroma. Jeśli częstotliwość oddychania spadnie poniżej 50 bpm i/lub stanie się nieregularna, wyjmij mysz z izofluranu, pozwól jej dojść do siebie przez 3-5 min i spróbuj ponownie (maksymalnie dwie powtórzone próby). - Potwierdź głębokość znieczulenia brakiem reakcji na uciśnięcie palca u stopy. Następnie ułóż mysz w pozycji grzbietowej w jednej dłoni i pozwól jej wykonać 3-5 regularnych, gwałtownych wdechów o rosnącej częstotliwości (zaczynając od 50-60 bpm) i sile. Gdy to się rozpocznie, umieść końcówkę pipety w tylnej części gardła myszy i podaj inokulum podczas wdechu.
UWAGA: Te gwałtowne wdechy przez pysk powodują gwałtowne opadanie głowy w dół ze względu na zaangażowanie dodatkowych mięśni oddechowych. Gdy pipeta jest wprowadzana podczas tych wdechów, pysk powinien otwierać się przy każdym z nich. Jeśli pysk się nie otwiera, mysz jest niewystarczająco znieczulona i prawdopodobnie nie wciągnie zawartości z gardła. Pipeta powinna uciskać język, spychając go w stronę dna i przodu pyska, aby zapobiec połknięciu inokulum. Gdy pipeta znajduje się w pysku, a mysz jest odpowiednio znieczulona, mysz będzie otwierać pysk przy każdym gwałtownym wdechu. - Trzymając mysz dłonią i kciukiem, wyczuj trzeszczenie w tylnych i przednich częściach klatki piersiowej myszy, aby potwierdzić inhalację inokulum.
3. Eutanazja myszy
- Wstrzyknij myszy do jam ciała (dozownie: doprzewnęcznie) koktajl składający się z 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny na 10 min przed planowanym momentem uboju.
- Odczekaj 10 min po wstrzyknięciu, aż mysz wejdzie w chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, co należy potwierdzić brakiem reakcji na uciśnięcie palca u nogi.
4. Perfuzja płuc przy użyciu PBS i formaliny
- Spryskaj znieczuloną mysz 70% etanolem. Za pomocą nożyczek nacinaj i odsuwaj skórę myszy, aby odsłonić otrzewną z każdej strony. Przesuń skórę z górnej połowy ciała myszy w kierunku głowy, wyciągając przedramiona ze skóry.
- Przetnij błonę otrzewną na wysokości mostka oraz wzdłuż dolnej krawędzi klatki piersiowej, odsłaniając otrzewną. Przesuń wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę. Za pomocą nożyczek ostrożnie przebij przeponę w miejscu oddalonym od miąższu płuc, aby uniknąć perforacji samych płuc.
UWAGA: Przypadkowe przebicie płuc uniemożliwi późniejsze napowietrzenie. - Po przebiciu przepony powietrze dostanie się do klatki piersiowej, powodując zapadnięcie się płuc. Przetnij klatkę piersiową po lewej stronie, aby odsłonić serce. Wstrzyknij 5-10 mL PBS do prawej komory za pomocą igły 30 G z prędkością 1 mL na 5 s (aby uniknąć uszkodzenia naczyń), co spowoduje szybkie pobielenie płuc.
OSTROŻNIE: Formalina jest niebezpieczną, lotną substancją, z którą należy pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego z wyciągiem lub pod dygestorium. - Po zakończeniu wyjmij igłę i użyj nowej igły, aby wstrzyknąć 5 mL 10% neutralnie buforowanej formaliny (NBF) do prawej komory z taką samą prędkością.
5. Napowietrzanie perfundowanego płuca
- Usunąć przednią połowę klatki piersiowej. Aby odsłonić tchawicę, przeciąć górne żebra i obojczyki po prawej i lewej stronie szyi. Należy uważać, aby nie przeciąć tkanek w pobliżu linii środkowej, gdzie znajduje się tchawica. Za pomocą pincety uchwycić pozostałe górne żebra i obojczyki na linii środkowej szyi i pociągnąć je ku górze, aż tchawica zostanie odsłonięta.
- Przygotować nić chirurgiczną o długości 10 cm, przeciągnąć ją pod tchawicą i zawiązać luźny węzeł na dolnym końcu odsłoniętego odcinka tchawicy. Przygotować strzykawkę 1 mL z powietrzem i kaniulą 18 G. Używając igły 18 G, wykonać otwór w tchawicy na górnym końcu odsłoniętego obszaru.
- Wprowadzić kaniulę do otworu, dbając o to, aby przylegała ona ściśle, co zapobiegnie ucieczce powietrza. Powoli wstrzyknąć 1 mL powietrza do płuc w czasie 10 s, obserwując nadmuchanie wszystkich płatów płuc. Pełne nadmuchanie powoduje, że płuca lekko oplatają serce i wypełniają objętość, którą zajmują przy nieprzepuncturowanej przeponie.
- Zaciągnąć węzeł wokół tchawicy i usunąć kaniulę. Przytrzymać tchawicę i za pomocątępych nożyczek usunąć płuca z organizmu myszy, uważając, aby ich nie przebić.
6. Fixacja przez imersję i odwadnianie
- Umieść płuca na górnej krawędzi probówki stożkowej o pojemności 50 mL wypełnionej 20 mL 10% NBF. Pozostaw nici chirurgiczne poza probówką, zakręć korek i odwróć probówkę tak, aby płuca były zawieszone do góry nogami w 20 mL NBF. Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 24-48 h.
- Przepłucz płuca w PBS, a następnie umieść w 30% roztworze sacharozy w PBS (w/v) na 72-96 h w temperaturze 4 °C w celu odwodnienia płuc w przygotowaniu do krioterapii. Wyjmij płuca z sacharozy, umieść je w formie do kriotomii z medium OCT (optimal cutting temperature) i zamroź preparat w temperaturze -80 °C.
7. Kriotomia
- Przed przystąpieniem do krojenia wyrównać temperaturę preparatów w blokach OCT do -20 °C w kriostacie przez 1 h. Wykonać skrawki o grubości 20-100 µm.
UWAGA: Napowietrzenie może prowadzić do zwiększonej kruchości preparatu, a krojenie przy większej grubości może zapobiec pękaniu tkanki podczas sekcjonowania. - Zebrać skrawki na szkiełka przedmiotowe i pozostawić do wyschnięcia na 30 min do 1 h, aby zapewnić przyleganie tkanki do szkiełka.
UWAGA: Na tym etapie szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C.
8. Przygotowanie i blokowanie szkiełek
- Umieść preparaty na szkiełkach w kąpieli z PBS (w szalce lub słoiku Coplina) na 30 min w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć OCT ze szkiełek.
UWAGA: Grubsze przekroje (40-100 µm) mogą nie przylegać do szkiełek szklanych tak dobrze jak cieńsze przekroje, dlatego najlepiej trzymać je płasko i pionowo w szalce, zamiast kłaść je na boku w słoiku Coplina. - Wysusz szkiełka po tym, jak OCT rozpuści się i oddzieli od tkanki. Użyj chusteczki, aby osuszyć nadmiar kropel z obwodu szkiełka wokół próbki tkanki.
- Użyj hydrofobowego pisaka Pap pen, aby narysować obrys wokół próbki, i pozostaw do wyschnięcia na 5 min.
- Przygotuj bufor blokujący składający się z bezzwierzęcego roztworu blokującego z 0,3% Tween-20 i Fc Block w proporcji 1:100 w ilości 300 µL na szkiełko.
UWAGA: W przypadku celów wewnątrzkomórkowych można zastosować 1% Tween-20. Objętość 300 µL jest zazwyczaj wystarczająca, jednak objętość niezbędna do całkowitego przykrycia tkanki zależy od rozmiaru obrysu wykonanego markerem hydrofobowym. Od tego momentu tkanka nie może wyschnąć. - Pozostaw roztwór blokujący na szkiełkach na 1 h w RT.
9. Immunobarwienie
- Przemyj preparat, odpipetowując ciecz i dodając 300-500 µL PBS. Powtórz płukanie raz.
- Przygotuj przeciwciało pierwotne szczura anty-mysie EpCAM (klon G8.8) koniugowane z AlexaFluor-647 (marker nabłonka dróg oddechowych) w bezzwierzęcym roztworze blokującym z 0,33% Tween-20 (lub 1% dla celów wewnątrzkomórkowych). Dodaj 300 µL tego roztworu na każdy preparat i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Stężenie, czas i temperaturę barwienia przeciwciał należy dobrać empirycznie. Cienkie skrawki (8-20 µm) barwi się przez 30 min w 37 °C, a grubsze skrawki (20-100 µm) przez noc w 4 °C, stosując dla większości przeciwciał rozcieńczenia 1:100. W przypadku stosowania przeciwciał niekoniugowanych, przemyj preparat 2x (jak wyżej) i zastosuj wtórne przeciwciało fluorescencyjne w empirycznie określonym czasie i temperaturze. Zazwyczaj barwienie przeciwciałami wtórnymi przeprowadza się w RT przez 1 h przy rozcieńczeniu 1:1000. - Usuń roztwór przeciwciał z preparatu i przemyj go 300 mL PBS przez 5 min. Powtórz to płukanie raz. Osusz preparaty, usuwając cały nadmiar cieczy z próbki oraz z otaczającego szkła.
- Dodaj jedną kroplę miękkiego medium montażowego RT (np. SlowFade Glass) do każdego fragmentu tkanki. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, pozwól butelce ustabilizować się w pozycji odwróconej i powoli naniesie krople na tkanki. Nałóż odpowiedniej wielkości szkiełko nakrywkowe tak, aby wystawało poza próbkę i obrys hydrofobowego markera.
10. Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
- Użyć wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego do bezstronnego skanowania całych przekrojów płuc, wykorzystując obiektyw o rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia poszczególnych zarodników i komórek gospodarza (np. Zeiss Axioscan 7 z obiektywem olejowym 20x o NA = 0.8 lub podobnym).
UWAGA: Należy upewnić się, że moc lasera oraz wzmocnienie napięcia PMT są ustawione tak, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu celu względem tła określonego za pomocą kontroli FMO (fluorescence minus one). - Zebrać wystarczającą liczbę kafelków obrazu, aby objąć cały płat płuca (np. ~200 kafelków o rozmiarze 400 μm x 400 μm). Użyć oprogramowania mikroskopowego (np. Zeiss ZEN 3.7 lub podobnego), aby wyeksportować scalony obraz z kafelków do dalszej analizy.
11. Analiza przestrzenna za pomocą programu QuPath
- W programie QuPath, darmowym oprogramowaniu open-source14, utwórz plik projektu i dodaj do niego obrazy fluorescencyjne.
- Zaklasyfikuj piksele EpCAM+ jako nabłonek, klikając w górnym menu opcję Classify, a następnie Pixel classification > Create Thresholder. Wybierz rozdzielczość, kanał, wartość wygładzania sigma oraz wartość progu, które najlepiej identyfikują docelowy obszar. Zapisz klasyfikator pod unikalną nazwą i wybierz Create Objects.
- W nowym oknie Create objects wybierz New object type jako Annotation. Dla nabłonka płuc ustaw minimalny rozmiar obiektu (minimum object size) oraz minimalny rozmiar otworu (minimum hole size) na 100 mm2. W tym kroku nie ma potrzeby wybierania opcji Split Objects. Po wybraniu OK zostaną utworzone adnotacje, które można modyfikować ręcznie za pomocą narzędzia Brush znajdującego się w lewym górnym obszarze.
- Aby zaklasyfikować zarodniki, powtórz kroki 11.3-11.4, używając kanału, w którym zarejestrowano zarodniki, i ustaw nowy typ obiektu na Detection zamiast Annotation. Ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na 0 mm2 oraz wybierz Split Objects.
- Aby przeprowadzić analizę przestrzenną zarodników, wybierz w górnym menu opcję Analyze > Spatial Analysis > Calculate signed distance to annotations 2D. Dla każdego wykrytego zarodnika zostaną obliczone odległości do nabłonka EpCAM+. Wyeksportuj te dane za pomocą opcji w górnym menu Measure > Export Measurements.
Wyniki
Metoda ta pozwala w końcowym etapie na uzyskanie obrazów immunofluorescencyjnych płuc myszy przy zastosowaniu fizjologicznego nadmuchania powietrzem, aby nie zakłócać struktury dróg oddechowych. Co istotne, na poszczególnych etapach przewidziano punkty kontrolne, które potwierdzą prawidłowe wykonanie poszczególnych elementów protokołu. Podczas inokulacji należy potwierdzić, że szczepionka została zassana, wyczuwając „trzaski” na tylnej ścianie klatki piersiowej myszy, co wskazuje na przedostanie się cieczy do dróg oddechowych. Brak odczuwalnych trzasków może oznaczać, że mysz połknęła szczepionkę. Perfuzja płuc myszy PBS powinna doprowadzić do pojawienia się białych plamek na płucach, a następnie do całkowitego wybielenia całego organu (Rycina 2A). W przypadku niepełnego wybielenia, następująca po nim perfuzja formaliną nie dotrze do wszystkich obszarów miąższu płucnego (Rycina 2B). Podczas nadmuchiwania płuc powietrzem powinny one powoli zwiększać swoją objętość, aż osiągną rozmiar fizjologiczny. Po zawiązaniu szwu tchawicy w celu zatrzymania powietrza w płucach, ich objętość nie powinna ulec zmniejszeniu. Jeśli tak się stanie, prawdopodobnie doszło do przebicia płuca podczas procedury.
Tutaj przedstawiamy reprezentatywne obrazy przekrojów z oznakowanymi zarodnikami Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (kolor zielony) oraz nabłonkiem kolumnowym oskrzelików EpCAM+ (kolor magenta) w płucach napowietrzonych oraz płucach wypełnionych ciekłym formaliną (Rysunek 3A,B odpowiednio). Zarodniki te gromadzą się głównie w obrębie dystalnych oskrzelików oraz w przestrzeniach pęcherzykowych bezpośrednio sąsiadujących z tymi oskrzelikami, prawdopodobnie w przewodach pęcherzykowych. Napowietrzone płuca perfundowane utrwalaczem zawierają zarodniki, które pojawiają się częściej w obrębie oskrzelików i gromadzą się bliżej nich (Rysunek 3A), w przeciwieństwie do utrwalacza w formie ciekłej, gdzie zarodniki wydają się nieco bardziej rozproszone względem nabłonka oskrzelikowego (Rysunek 3B). Za pomocą analizy przestrzennej w programie QuPath zmierzyliśmy odległość poszczególnych zarodników do najbliższego nabłonka oskrzelikowego EpCAM+, aby określić stopień rozproszenia zarodników z dala od oskrzelika w stronę bardziej dystalnych przestrzeni pęcherzykowych. Wykazujemy, że wypełnienie cieczą rozprasza zarodniki dalej od oskrzelików w porównaniu z fizjologicznym napowietrzeniem (Rysunek 4A,B). Perfuzja naczyniowa z napowietrzaniem zachowuje naturalne rozmieszczenie tych zarodników w dystalnych oskrzelikach i zapobiega ich sztucznemu rozproszeniu do bardziej dystalnych przestrzeni pęcherzykowych, które następuje podczas intratrachealnej instylacji utrwalacza.
Rycina 2: Wskaźnik skuteczności perfuzji płuc. (A) Płuca poddane skutecznej perfuzji będą całkowicie białe. (B) Płuca niecałkowicie przepłukane będą miać różowy kolor lub wygląd cętkowany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy rozkładu zarodników w płucach napowietrzonych i perfundowanych formaliną w porównaniu z płucami napompowanymi formaliną. Wewnątrzkomórkowe fluorescencyjne zarodniki (zielone) są rozmieszczone w bliższej bliskości do nabłonka oskrzelików EpCAM+ (magenta) w (A) płucach napowietrzonych niż w (B) płucach napompowanych formaliną. Obrazy uzyskano z przekrojów o głębokości 1,2 mm od tylnej powierzchni lewych płatów myszy z każdej grupy badawczej przy użyciu wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 20x, a następnie połączono kafelki za pomocą oprogramowania do mikroskopii. Pasek skali = 800 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Porównanie odległości zarodników (mm) od nabłonka oskrzelikowego w płucach traktowanych zarodnikami i nadmuchiwanych powietrzem oraz formaliną. Pobrano, przetworzono i obrazowano płuca od 3 myszy z grupy zabiegowej 1,5 h po inokulacji 1 x 106 artrokonidiów Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ . Od każdego osobnika pobrano cztery przekroje w odległościach 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm i 2,0 mm od tylnej powierzchni lewego płata, które następnie zabarwiono i obrazowano przy użyciu wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego. Wszystkie zarodniki z każdej grupy wykryto i poddano analizie przestrzennej w programie QuPath w celu określenia (A) odległości do najbliższego kolumnowego nabłonka oskrzelikowego EpCAM+, a (B) medianę i 95% przedziały ufności przedstawiono w mikrometrach. Zarodniki po nadmuchiwaniu powietrzem, n = 11 673. Zarodniki po nadmuchiwaniu cieczą, n = 9 837. Ze względu na brak rozkładu normalnego przeprowadzono test t Manna-Whitneya, p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
Opracowaliśmy linię inhalacji zarodników i analizy przestrzennego osadzania się wdychanych zarodników. Rurociąg ten dostarcza cennych informacji w celu określenia odpowiednich obszarów zrębu płuc dotkniętych wdychaniem artrokonidii Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Zaobserwowaliśmy, że zarodniki Coccidioides i obojętne cząstki o podobnej wielkości (dane nie pokazane) gromadzą się w dystalnych obszarach oskrzelików i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie są w pełni rozproszone w świetle pęcherzyków płucnych. Model ten wymaga stosunkowo niskiego poziomu sprzętu i umiejętności technicznych do produkcji kriosekcji do immunofluorescencji (lub innych dalszych etapów, takich jak immunohistochemia [IHC]), które utrzymują fizjologiczną integralność treści dróg oddechowych przy jednoczesnym zachowaniu naturalnej morfologii płuc. Bez nadmuchiwania powietrza zapadanie się pęcherzyków płucnych zniekształca naturalną architekturę miąższu płuc otaczającego oskrzeliki13,15. Utrata objętości powietrza w płucach podczas przetwarzania histologicznego została wskazana jako "poważny problem" we wspólnym oficjalnym oświadczeniu badawczym Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej i Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego w zakresie określania standardów ilościowej oceny struktury płuc16. Ponadto dotchawicze wkraplanie utrwalacza może zakłócić charakter i lokalizację proksymalnych składników molekularnych i komórkowych dróg oddechowych, takich jak mucyny, środki powierzchniowo czynne i rzęski dróg oddechowych 17,18,19. Opisana tutaj metoda w wystarczającym stopniu zachowuje zarówno objętość powietrza w płucach, jak i składniki molekularne i komórkowe wzdłuż dróg oddechowych, które oddziałują z wdychanymi zarodnikami grzybów.
Mikroskopia immunofluorescencyjna stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki przestrzennej składników płuc i jest dobrze oceniane20,21. Nie ma ograniczeń co do celów, które można wybarwić za pomocą immunofluorescencji tych odcinków, z wyjątkiem tego, że przeciwciała z epitopami wrażliwymi na wiązanie formaliny mogą nie wiązać swoich celów w zadowalający sposób. W przypadku stosowania nowego przeciwciała najlepiej jest przygotować kontrolę fluorescencji minus jeden (FMO), aby określić, czy przeciwciało generuje jakikolwiek sygnał powyżej tła. W przypadku stosowania przeciwciała drugorzędowego należy użyć grupy leczonej bez przeciwciała pierwszorzędowego, aby kontrolować wiązanie przeciwciała drugorzędowego poza celem. Pierwszorzędowe sprzężone przeciwciała monoklonalne są bardzo specyficzne, więc barwienie w wyższych temperaturach (37 °C) przez krótszy czas (30 minut) jest powszechne i na ogół wiąże się specyficznie z ich celem. Z drugiej strony, niesprzężone przeciwciała poliklonalne są bardziej czułe na wykrywanie antygenów, ale mniej specyficzne, więc dłuższe inkubacje (~16 godzin) w niższych temperaturach (4 °C) optymalizują stosunek sygnału do szumu. Wszystkie przeciwciała będą wymagały empirycznej optymalizacji.
Model analizy przestrzennej zastosowany w tym badaniu do lokalizacji zarodników mierzy odległość poszczególnych zarodników do najbliższego nabłonka oskrzelików. Wymaga to odpowiedniej identyfikacji nabłonka oskrzelików na podstawie jego wysokiego sygnału EpCAM i morfologicznie odrębnego wyglądu jako nabłonka walcowatego wyściełającego struktury przypominające rurkę. EpCAM może być również wyrażany na niższych poziomach przez nabłonek pęcherzyków płucnych, dlatego ważne jest, aby progować sygnał EpCAM w QuPath, aby ograniczyć zdefiniowane adnotacje do morfologicznie potwierdzonych obszarów oskrzelików. Ponieważ oskrzeliki mają anatomiczny minimalny rozmiar, możemy ograniczyć definicję tych obszarów w QuPath do minimalnej powierzchni 100 mm2, jak podano w kroku 11.3. Pozwoli to wykluczyć izolowane komórki lub artefakty o wysokiej ekspresji EpCAM w przestrzeniach pęcherzykowych, takie jak komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II, z adnotacji QuPath. Te kroki pozwalają nam zdefiniować wyłącznie nabłonek oskrzelików jako adnotacje QuPath i określić bliskość zarodników do tego zdefiniowanego nabłonka oskrzelików.
Opisany tutaj model infekcji wykorzystuje znieczulenie izofluranem do wywołania reakcji oddechu ustnego u myszy w celu aspiracji zarodników grzybów. Metoda izofluranu w postaci otwartej kropli została opracowana jako szybka, niskozasobowa technika wywoływania krótkotrwałego znieczulenia u myszy 9,22,23. Ta metoda wymaga pewnej praktyki, aby działać konsekwentnie. Czas pod narkozą musi być wystarczająco długi, aby znieczulić mysz w wystarczającym stopniu do zasysania treści gardłowej. Jeśli mysz nie jest wystarczająco znieczulona, może połknąć inokulum zamiast go zasysać. Objaw wystarczającego znieczulenia jest osiągany, gdy mysz wydaje regularne sapanie doustne o rosnącym wigorze w tempie około 50-60 oddechów / min. Głowa myszy leżącej na wznak powinna poruszać się do przodu z każdym oddechem. Niewystarczające znieczulenie może być określone przez brak oddechu lub jakikolwiek ruch wąsów, języka lub kończyn. Najlepszą praktyką jest wciskanie języka końcówką pipety podczas podawania inokulum, aby zapobiec połknięciu. Przedawkowanie izofluranu może prowadzić do śmierci myszy i należy mu zapobiec. Dobrą zasadą, aby temu zapobiec, jest usunięcie myszy z izofluranu po tym samym czasie, jaki jest potrzebny do utraty przez mysz odruchu prostowania. Na przykład, jeśli mysz potrzebuje 10 s, aby stracić odruch prostowania, usuń mysz po dodatkowych 10 sekundach. Ponieważ gaz izofluran ulatnia się w trakcie leczenia wieloma myszami, ten czas może się wydłużyć. W naszych rękach możemy leczyć 6-8 myszy bez dodawania większej ilości izofluranu.
Istnieją pewne ograniczenia dotyczące składników tego protokołu. Procedura inokulacji wykorzystuje zarodniki zawieszone w 25 μl płynnej pożywki PBS, która jest mniej fizjologiczna niż inokulacja zarodników w aerozolu. Otwartym pytaniem pozostaje, czy użycie zasysanego płynu zmienia lokalizację zarodników/cząstek w porównaniu z innymi metodami inokulacji, takimi jak wdychanie zarodników unoszących się w powietrzu. Jednak inhalacja w aerozolu wymaga znacznych inwestycji w zasoby i ma inne ograniczenia (ograniczona wielkość inokulum, zmienna ekspozycja, ryzyko zawodowe), które mogą nie być optymalne w zależności od charakteru badania i środowiska laboratoryjnego. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że podczas kriosekcji może wystąpić kruchość tkanek, która może być spowodowana obecnością powietrza w tkance lub zmniejszoną skutecznością mocowania naczyniowego w porównaniu z mocowaniem dotchawiczym. Tę kruchość kriosekcji można przezwyciężyć, wycinając grubsze odcinki o grubości 60-100 μm i stosując mikroskopię konfokalną do obrazowania dwuwymiarowych (2D) płaszczyzn w tkance.
Wierzymy, że prostota i zdolność adaptacji tej metody umożliwi innym grupom znalezienie użyteczności z wybranymi przez siebie wziewnymi patogenami i interesującymi ich reakcjami gospodarza.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Fundusze i wsparcie zostały pozyskane dzięki grantowi NIH K22 AI153678-01 i Rutgers School of Graduate Studies. Dziękujemy Fawadowi Yousufzai i Luke'owi Fritzky'emu z Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core za ich pracę i wiedzę specjalistyczną w zakresie uzyskiwania obrazów immunofluorescencyjnych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 18 G, 1 1/2 igły (305185) | Fisher | 305185 | |
| 1 L Słoik z nakrętką (Nalgene) | Fisher Scientific | 11-823-33 | |
| Niesterylne strzykawki Air-Tite luzem 10 ml Luer Lock | Fisher | 14-817-175 | |
| AnaSed Injection (sterylny roztwór ksylazyny) | Akorn | 59399-110-20 | |
| Bloker i rozcieńczalnik bez zwierząt, RTU | Vector | SP-5035-100 | |
| BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Cewnik z cewnikiem BD Vialon Materiał 18 G x 1,88 | cala BD | 381547 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block™) | BD | 553142 | |
| CellTracker Pomarańczowy CMRA Barwnik | Fisher Scientific | NC0873640 | |
| CFSE | Labviva | 75003 | |
| Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ | BEI Resources | NR-166 | |
| Corning 70 mikronów sitka | VWR | 10054-456 | |
| EpCAM AlexaFluor647 przeciwciało monoklonalne | Biolegend | 118211 | |
| Exel International Igły HYpodermic 30 G x 1/2" | Labviva | EN3012 | |
| Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku (1 ml, Leur Slip) | Fisher | 14-955-462 | |
| Monohydrat glukozy | Azer Scientific | ES17530-500G | |
| Smar wysokopróżniowy | VWR | 59344-055 | |
| Hoechst 33342 Roztwór 20 mM (5 ml) | ThermoFischer | 62249 | |
| Isoflurane USP | Covetrus | 29405 | |
| Chlorowodorek ketaminy | Dechra | 1000001250 | |
| KIMWIPES Delikatne wycieraczki do zadań (4,4'' x 8,4") | VWR | 21905-026 | |
| Nożyczki dla niemowląt Lexer | FST | 14078-10 | |
| Kleszczyki Micro-Adson | FST | 11018-12 | |
| Neutralna buforowana formalina (10%) (Azer Scientific) | Fisher | 22-026-350 | |
| Kolby do hodowli tkankowych Nunc EasYFask, T75, nasadki filtrujące | VWR | 15708-134 | |
| PBS | VWR | 45000-446 | |
| Peel-A-Way formy do zatapiania | Sigma | E6032-1CS | |
| QuPath 0.5.1 Oprogramowanie | Open-source | https://qupath.github.io/ | |
| Silk Suture rozmiar nici 3/0 | FST | 18020-30 | |
| SlidesMicro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Miękki zestaw mocujący zapobiegający blaknięciu szkła SlowFade (2 ml) | ThermoFischer | S36917 | |
| Sacharoza | Sigma | S0389-500G | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| Tween 20 | ThermoFischer | J20605. | |
| Vector Laboratories ImmEDGE Hydrofobowy długopis barierowy Zestaw 2 okularów | Fisher Scientific | NC9545623 | |
| VWR Micro Cover Glasses, prostokątne (24 mm x 40 mm #1.5) | VWR | 48393-230 | |
| Biała plastikowa siatka druciana | MAPORCH | 789862904922 | |
| Ekstrakt drożdżowy | Fisher | BP9727-500 | |
| Zeiss AxioScan 7 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html | wielokanałowy mikroskop fluorescencyjny |
| Oprogramowanie ZEN 3.7 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html | oprogramowanie do mikroskopii |
Bibliografia
- American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
- Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
- Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
- Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
- Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
- Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
- Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
- Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
- Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
- Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
- Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
- Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
- Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
- Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
- Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
- Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
- Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Obrazowanie płuc mysichlokalizacja zarodników grzybówdynamika przestrzenna dróg oddechowychutrwalanie poprzez nadmuchanie powietrzemutrwalanie poprzez perfuzję naczyniowątechnika kriokonserwacjimikroskopia fluorescencyjnaanaliza w programie QuPathbarwienie przeciwciałem przeciwko EpCAMgrzybiczna infekcja układu oddechowego
