Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67556

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Grzyby infekują ludzi, gdy zarodniki środowiskowe są wdychane do płuc. Płuco jest niejednorodnym narządem. Przewodzące drogi oddechowe, w tym oskrzela i oskrzeliki, rozgałęziają się aż do zakończenia w pęcherzykowej przestrzeni powietrznej, w której zachodzi wymiana gazowa. Infekcje wywodzące się z oskrzelików lub pęcherzyków płucnych wywołują wyraźne reakcje gospodarza i objawy chorobowe. Dlatego dokładne zrozumienie, gdzie zarodniki naturalnie lokalizują się w płucach, szczególnie wkrótce po zakażeniu, rozszerza możliwości badania interakcji gospodarz-patogen. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy analizę in situ płuc myszy zakażonych artrokonadią Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Konwencjonalne metody konserwacji histologicznej polegają na płynnym napełnianiu dróg oddechowych roztworem utrwalającym, który przemieszcza naturalne położenie zasysanych cząstek grzybów, wypychając zarodniki z proksymalnych oskrzelików do końcowych przestrzeni powietrznych.

Na odwrót, ta metoda napełniania powietrzem z utrwalaniem perfuzji naczyń krwionośnych zachowuje fizjologiczne położenie zarodników grzybów w oskrzelikach. Ponadto opisujemy proste podejście do kriokonserwacji, osadzania i obrazowania próbek płuc. Udostępniamy również wysokoprzepustowe techniki obliczeniowe za pośrednictwem programu QuPath o otwartym kodzie źródłowym do analizy przestrzennego rozmieszczenia zarodników grzybów w płucach. Przedstawiona tutaj metoda jest prosta i szybka, wymaga minimalnego sprzętu do wykonania i można ją łatwo dostosować do stosowania z wieloma modelami infekcji grzybiczych dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Ludzie mogą wdychać do miliardów zarodników dziennie z różnych grzybów środowiskowych1. Aby zrozumieć naszą barierę obronną przed tymi wdychanymi zarodnikami, musimy docenić dokładne środowiska mikroanatomiczne, w których te zarodniki lądują w drogach oddechowych i miąższu płuc. Skład komórkowy dróg oddechowych (tj. komórek nabłonkowych) znacząco zmienia się wzdłuż tchawicy, oskrzeli, oskrzelików i pęcherzyków płucnych. Każdy z tych odrębnych regionów składa się z różnych typów komórek o dyskretnych funkcjach, które korzystają z arsenału obron, aby zapobiec infekcji patologicznej.

Dokładna lokalizacja odkładania się zarodników grzybów płucnych może różnić się między światłami dróg oddechowych oskrzelików wyściełanych nabłonkiem walcowatym, przewodami pęcherzykowymi lub pęcherzykami płucnymi2. Większość istotnych klinicznie gatunków grzybów wytwarza zarodniki o średnicy od 1 μm do 10 μm3. Odkładanie się tych cząsteczek zarodników w płucach zależy od kilku czynników, takich jak aerodynamika, gęstość, ładunek elektryczny i siły foretyczne, które mogą wpływać na mechanizm sedymentacji po inhalacji4. Ogólnie rzecz biorąc, duże cząstki (> 6 μm) osadzają się w górnych drogach oddechowych, średnie cząstki (2-6 μm) mogą osadzać się w mniejszych drogach oddechowych, a małe cząstki (<2 μm) docierają do obszaru pęcherzykowego5. Donoszono, że zarodniki Aspergillus (2-3 μm) docierają do przestrzeni pęcherzykowych, ale kliniczne raporty patologiczne wskazują również na znaczne obciążenie chorobami oskrzeli i oskrzelików6. Coraz częściej rozpoznaje się również wewnątrzoskrzelowe infekcje grzybicze Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum i Zygomycetes ze względu na rosnącą popularność elastycznej bronchoskopii7. Ostatnie postępy w obrazowaniu mikroskopowym zakażeń Aspergillus u myszy ujawniły również, że bardziej proksymalne przestrzenie powietrzne, takie jak oskrzela i oskrzeliki, mogą być najbardziej obciążone patologiczną proliferacją grzybów8. Badania nad reakcją gospodarza na infekcje grzybicze płuc wykazały, że zarówno komórki nabłonka oskrzelików, jak i komórki nabłonka pęcherzyków płucnych odgrywają ważną rolę jako strażnicy odporności, więc wyjaśnienie dokładnych miejsc odkładania się zarodników i interakcji nabłonkowej będzie miało kluczowe znaczenie dla przyszłych prac2,9,10.

Badanie dynamiki patogenezy proksymalnych dróg oddechowych jest trudne, ponieważ standardowe techniki unieruchamiania płuc i przygotowania sekcji mogą przemieścić zarodniki z tych proksymalnych pozycji w drogach oddechowych wyściełanych nabłonkiem i popchnąć je w kierunku dystalnych końcowych obszarów pęcherzyków płucnych. Zwykle 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu stosuje się do nadmuchania płuc i szybkiego wystawienia całego płuca na działanie utrwalacza. Przygotowując płuca do kriosekcji, niektóre grupy podają do płuc związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby poprawić wydajność kriosekcji11. Praktyki te są przydatne we właściwym kontekście, ale zostały odkryte przez nasze laboratorium i inne grupy, aby przemieszczać zarodniki i cząstki z lokalizacji proksymalnych, zakłócając w ten sposób interpretacje typów komórek narażonych na działanie zarodników i późniejszej odpowiedzi gospodarza12.

Aby dokładnie ustalić mikroanatomiczną lokalizację wdychanych zarodników grzybów, opracowaliśmy szybką, mało wymagającą metodę zachowania lokalizacji zarodników grzybów w drogach oddechowych myszy. Zaadaptowaliśmy metodę perfuzji naczyniowej z mysim powietrzem od Thomasa i in. (2021), w której zmniejszyliśmy ilość sprzętu, czasu i umiejętności technicznych wymaganych do osiągnięcia zadowalającego wyniku13. Z opisanej tutaj metody zaobserwowaliśmy, że artrokonidia Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (o wielkości 3-5 μm) gromadzą się bardziej proksymalnie niż wcześniej pokazano, a mianowicie w dystalnych oskrzelikach i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie w końcowych pęcherzykach płucnych. Informacje te mogą ukierunkować pytania biologiczne dotyczące krytycznych typów komórek związanych z tymi regionami płuc i ich wpływu na wczesne reakcje na wdychane zarodniki grzybów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody opisane w niniejszym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Znakowanie zarodników fluorescencją wewnątrzkomórkową

  1. Zbarwić 1 x 106 zarodników carboksyfluoresceiną z estrem sukcynymidowym (CFSE), barwnikiem Cell Tracker Orange lub Cell Tracker Red (lub wybranym barwnikiem wewnątrzkomórkowym) w stężeniu 5 µM przez 30 min w temperaturze 30 °C, następnie przemyć PBS i odwirować zarodniki przy 12 000 x g. Powtórzyć to przemywanie raz.
  2. Przygotować inokulum zarodników o odpowiednim stężeniu, tak aby 25 µL zawierało odpowiednią dawkę zarodników dla jednej myszy.

2. Inokulacja myszy zarodnikami poprzez aspiracyjną inhalację przy znieczuleniu izofluranem

UWAGA: Izofluran jest lotnym środkiem anestezjologicznym i musi być stosowany w wentylowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego lub dygestorium.

  1. Aby przygotować słoik do ekspozycji na izofluran, włóż złożoną serwetkę do słoika Nalgene o pojemności 1 L z nakrętką, a na serwetce umieść plastikowy okrągły krata, który posłuży jako platforma dla myszy. Dodaj 2 mL izofluranu na serwetkę, zamknij słoik i odczekaj 1-2 min, aż gaz wyrówna stężenie w naczyniu.

Inkubacja hodowli komórkowych, szczelny pojemnik, zestaw laboratoryjny, obserwacja wzrostu tkanek, sterylne środowisko.
Rycina 1: Aparatura do metody otwartej kropli izofluranu w celu inokulacji sporami. Na dnie słoika z zakrętką o pojemności 1 L umieszcza się złożoną serwetkę, a następnie wkłada okrągłą plastikową siatkę, która służy jako platforma dla myszy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przed podaniem znieczulenia myszy, przygotuj pipetę z 25 µL inokulum. Umieść mysz w pojemniku z izofluranem i przechyl go, aby monitorować utratę odruchu prostowania, w którym mysz traci przytomność i znajduje się w pozycji odwróconej. Zazwyczaj zajmuje to około 10 s.
  2. Monitoruj częstotliwość oddychania (RR), aż zwolni ona do stałego poziomu 50-80 oddechów na minutę (bpm), co stanowi około 50% spoczynkowej RR. Zazwyczaj zajmuje to kolejne 10 s. W tym momencie wyjmij mysz z pojemnika z izofluranem.
    UWAGA: Jest to wysokie stężenie izofluranu, które spowoduje szybką indukcję znieczulenia, dlatego mysz musi być bardzo uważnie monitorowana. Istnieje ryzyko śmiertelnego przedawkowania izofluranu, ponieważ jego stężenie może być zmienne, a krzywa dawka-odpowiedź dla izofluranu jest bardzo stroma. Jeśli częstotliwość oddychania spadnie poniżej 50 bpm i/lub stanie się nieregularna, wyjmij mysz z izofluranu, pozwól jej dojść do siebie przez 3-5 min i spróbuj ponownie (maksymalnie dwie powtórzone próby).
  3. Potwierdź głębokość znieczulenia brakiem reakcji na uciśnięcie palca u stopy. Następnie ułóż mysz w pozycji grzbietowej w jednej dłoni i pozwól jej wykonać 3-5 regularnych, gwałtownych wdechów o rosnącej częstotliwości (zaczynając od 50-60 bpm) i sile. Gdy to się rozpocznie, umieść końcówkę pipety w tylnej części gardła myszy i podaj inokulum podczas wdechu.
    UWAGA: Te gwałtowne wdechy przez pysk powodują gwałtowne opadanie głowy w dół ze względu na zaangażowanie dodatkowych mięśni oddechowych. Gdy pipeta jest wprowadzana podczas tych wdechów, pysk powinien otwierać się przy każdym z nich. Jeśli pysk się nie otwiera, mysz jest niewystarczająco znieczulona i prawdopodobnie nie wciągnie zawartości z gardła. Pipeta powinna uciskać język, spychając go w stronę dna i przodu pyska, aby zapobiec połknięciu inokulum. Gdy pipeta znajduje się w pysku, a mysz jest odpowiednio znieczulona, mysz będzie otwierać pysk przy każdym gwałtownym wdechu.
  4. Trzymając mysz dłonią i kciukiem, wyczuj trzeszczenie w tylnych i przednich częściach klatki piersiowej myszy, aby potwierdzić inhalację inokulum.

3. Eutanazja myszy

  1. Wstrzyknij myszy do jam ciała (dozownie: doprzewnęcznie) koktajl składający się z 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny na 10 min przed planowanym momentem uboju.
  2. Odczekaj 10 min po wstrzyknięciu, aż mysz wejdzie w chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, co należy potwierdzić brakiem reakcji na uciśnięcie palca u nogi.

4. Perfuzja płuc przy użyciu PBS i formaliny

  1. Spryskaj znieczuloną mysz 70% etanolem. Za pomocą nożyczek nacinaj i odsuwaj skórę myszy, aby odsłonić otrzewną z każdej strony. Przesuń skórę z górnej połowy ciała myszy w kierunku głowy, wyciągając przedramiona ze skóry.
  2. Przetnij błonę otrzewną na wysokości mostka oraz wzdłuż dolnej krawędzi klatki piersiowej, odsłaniając otrzewną. Przesuń wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę. Za pomocą nożyczek ostrożnie przebij przeponę w miejscu oddalonym od miąższu płuc, aby uniknąć perforacji samych płuc.
    UWAGA: Przypadkowe przebicie płuc uniemożliwi późniejsze napowietrzenie.
  3. Po przebiciu przepony powietrze dostanie się do klatki piersiowej, powodując zapadnięcie się płuc. Przetnij klatkę piersiową po lewej stronie, aby odsłonić serce. Wstrzyknij 5-10 mL PBS do prawej komory za pomocą igły 30 G z prędkością 1 mL na 5 s (aby uniknąć uszkodzenia naczyń), co spowoduje szybkie pobielenie płuc.
    OSTROŻNIE: Formalina jest niebezpieczną, lotną substancją, z którą należy pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego z wyciągiem lub pod dygestorium.
  4. Po zakończeniu wyjmij igłę i użyj nowej igły, aby wstrzyknąć 5 mL 10% neutralnie buforowanej formaliny (NBF) do prawej komory z taką samą prędkością.

5. Napowietrzanie perfundowanego płuca

  1. Usunąć przednią połowę klatki piersiowej. Aby odsłonić tchawicę, przeciąć górne żebra i obojczyki po prawej i lewej stronie szyi. Należy uważać, aby nie przeciąć tkanek w pobliżu linii środkowej, gdzie znajduje się tchawica. Za pomocą pincety uchwycić pozostałe górne żebra i obojczyki na linii środkowej szyi i pociągnąć je ku górze, aż tchawica zostanie odsłonięta.
  2. Przygotować nić chirurgiczną o długości 10 cm, przeciągnąć ją pod tchawicą i zawiązać luźny węzeł na dolnym końcu odsłoniętego odcinka tchawicy. Przygotować strzykawkę 1 mL z powietrzem i kaniulą 18 G. Używając igły 18 G, wykonać otwór w tchawicy na górnym końcu odsłoniętego obszaru.
  3. Wprowadzić kaniulę do otworu, dbając o to, aby przylegała ona ściśle, co zapobiegnie ucieczce powietrza. Powoli wstrzyknąć 1 mL powietrza do płuc w czasie 10 s, obserwując nadmuchanie wszystkich płatów płuc. Pełne nadmuchanie powoduje, że płuca lekko oplatają serce i wypełniają objętość, którą zajmują przy nieprzepuncturowanej przeponie.
  4. Zaciągnąć węzeł wokół tchawicy i usunąć kaniulę. Przytrzymać tchawicę i za pomocątępych nożyczek usunąć płuca z organizmu myszy, uważając, aby ich nie przebić.

6. Fixacja przez imersję i odwadnianie

  1. Umieść płuca na górnej krawędzi probówki stożkowej o pojemności 50 mL wypełnionej 20 mL 10% NBF. Pozostaw nici chirurgiczne poza probówką, zakręć korek i odwróć probówkę tak, aby płuca były zawieszone do góry nogami w 20 mL NBF. Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 24-48 h.
  2. Przepłucz płuca w PBS, a następnie umieść w 30% roztworze sacharozy w PBS (w/v) na 72-96 h w temperaturze 4 °C w celu odwodnienia płuc w przygotowaniu do krioterapii. Wyjmij płuca z sacharozy, umieść je w formie do kriotomii z medium OCT (optimal cutting temperature) i zamroź preparat w temperaturze -80 °C.

7. Kriotomia

  1. Przed przystąpieniem do krojenia wyrównać temperaturę preparatów w blokach OCT do -20 °C w kriostacie przez 1 h. Wykonać skrawki o grubości 20-100 µm.
    UWAGA: Napowietrzenie może prowadzić do zwiększonej kruchości preparatu, a krojenie przy większej grubości może zapobiec pękaniu tkanki podczas sekcjonowania.
  2. Zebrać skrawki na szkiełka przedmiotowe i pozostawić do wyschnięcia na 30 min do 1 h, aby zapewnić przyleganie tkanki do szkiełka.
    UWAGA: Na tym etapie szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Przygotowanie i blokowanie szkiełek

  1. Umieść preparaty na szkiełkach w kąpieli z PBS (w szalce lub słoiku Coplina) na 30 min w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć OCT ze szkiełek.
    UWAGA: Grubsze przekroje (40-100 µm) mogą nie przylegać do szkiełek szklanych tak dobrze jak cieńsze przekroje, dlatego najlepiej trzymać je płasko i pionowo w szalce, zamiast kłaść je na boku w słoiku Coplina.
  2. Wysusz szkiełka po tym, jak OCT rozpuści się i oddzieli od tkanki. Użyj chusteczki, aby osuszyć nadmiar kropel z obwodu szkiełka wokół próbki tkanki.
  3. Użyj hydrofobowego pisaka Pap pen, aby narysować obrys wokół próbki, i pozostaw do wyschnięcia na 5 min.
  4. Przygotuj bufor blokujący składający się z bezzwierzęcego roztworu blokującego z 0,3% Tween-20 i Fc Block w proporcji 1:100 w ilości 300 µL na szkiełko.
    UWAGA: W przypadku celów wewnątrzkomórkowych można zastosować 1% Tween-20. Objętość 300 µL jest zazwyczaj wystarczająca, jednak objętość niezbędna do całkowitego przykrycia tkanki zależy od rozmiaru obrysu wykonanego markerem hydrofobowym. Od tego momentu tkanka nie może wyschnąć.
  5. Pozostaw roztwór blokujący na szkiełkach na 1 h w RT.

9. Immunobarwienie

  1. Przemyj preparat, odpipetowując ciecz i dodając 300-500 µL PBS. Powtórz płukanie raz.
  2. Przygotuj przeciwciało pierwotne szczura anty-mysie EpCAM (klon G8.8) koniugowane z AlexaFluor-647 (marker nabłonka dróg oddechowych) w bezzwierzęcym roztworze blokującym z 0,33% Tween-20 (lub 1% dla celów wewnątrzkomórkowych). Dodaj 300 µL tego roztworu na każdy preparat i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Stężenie, czas i temperaturę barwienia przeciwciał należy dobrać empirycznie. Cienkie skrawki (8-20 µm) barwi się przez 30 min w 37 °C, a grubsze skrawki (20-100 µm) przez noc w 4 °C, stosując dla większości przeciwciał rozcieńczenia 1:100. W przypadku stosowania przeciwciał niekoniugowanych, przemyj preparat 2x (jak wyżej) i zastosuj wtórne przeciwciało fluorescencyjne w empirycznie określonym czasie i temperaturze. Zazwyczaj barwienie przeciwciałami wtórnymi przeprowadza się w RT przez 1 h przy rozcieńczeniu 1:1000.
  3. Usuń roztwór przeciwciał z preparatu i przemyj go 300 mL PBS przez 5 min. Powtórz to płukanie raz. Osusz preparaty, usuwając cały nadmiar cieczy z próbki oraz z otaczającego szkła.
  4. Dodaj jedną kroplę miękkiego medium montażowego RT (np. SlowFade Glass) do każdego fragmentu tkanki. Aby uniknąć pęcherzyków powietrza, pozwól butelce ustabilizować się w pozycji odwróconej i powoli naniesie krople na tkanki. Nałóż odpowiedniej wielkości szkiełko nakrywkowe tak, aby wystawało poza próbkę i obrys hydrofobowego markera.

10. Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Użyć wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego do bezstronnego skanowania całych przekrojów płuc, wykorzystując obiektyw o rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia poszczególnych zarodników i komórek gospodarza (np. Zeiss Axioscan 7 z obiektywem olejowym 20x o NA = 0.8 lub podobnym).
    UWAGA: Należy upewnić się, że moc lasera oraz wzmocnienie napięcia PMT są ustawione tak, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu celu względem tła określonego za pomocą kontroli FMO (fluorescence minus one).
  2. Zebrać wystarczającą liczbę kafelków obrazu, aby objąć cały płat płuca (np. ~200 kafelków o rozmiarze 400 μm x 400 μm). Użyć oprogramowania mikroskopowego (np. Zeiss ZEN 3.7 lub podobnego), aby wyeksportować scalony obraz z kafelków do dalszej analizy.

11. Analiza przestrzenna za pomocą programu QuPath

  1. W programie QuPath, darmowym oprogramowaniu open-source14, utwórz plik projektu i dodaj do niego obrazy fluorescencyjne.
  2. Zaklasyfikuj piksele EpCAM+ jako nabłonek, klikając w górnym menu opcję Classify, a następnie Pixel classification > Create Thresholder. Wybierz rozdzielczość, kanał, wartość wygładzania sigma oraz wartość progu, które najlepiej identyfikują docelowy obszar. Zapisz klasyfikator pod unikalną nazwą i wybierz Create Objects.
  3. W nowym oknie Create objects wybierz New object type jako Annotation. Dla nabłonka płuc ustaw minimalny rozmiar obiektu (minimum object size) oraz minimalny rozmiar otworu (minimum hole size) na 100 mm2. W tym kroku nie ma potrzeby wybierania opcji Split Objects. Po wybraniu OK zostaną utworzone adnotacje, które można modyfikować ręcznie za pomocą narzędzia Brush znajdującego się w lewym górnym obszarze.
  4. Aby zaklasyfikować zarodniki, powtórz kroki 11.3-11.4, używając kanału, w którym zarejestrowano zarodniki, i ustaw nowy typ obiektu na Detection zamiast Annotation. Ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na 0 mm2 oraz wybierz Split Objects.
  5. Aby przeprowadzić analizę przestrzenną zarodników, wybierz w górnym menu opcję Analyze > Spatial Analysis > Calculate signed distance to annotations 2D. Dla każdego wykrytego zarodnika zostaną obliczone odległości do nabłonka EpCAM+. Wyeksportuj te dane za pomocą opcji w górnym menu Measure > Export Measurements.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metoda ta pozwala w końcowym etapie na uzyskanie obrazów immunofluorescencyjnych płuc myszy przy zastosowaniu fizjologicznego nadmuchania powietrzem, aby nie zakłócać struktury dróg oddechowych. Co istotne, na poszczególnych etapach przewidziano punkty kontrolne, które potwierdzą prawidłowe wykonanie poszczególnych elementów protokołu. Podczas inokulacji należy potwierdzić, że szczepionka została zassana, wyczuwając „trzaski” na tylnej ścianie klatki piersiowej myszy, co wskazuje na przedostanie się cieczy do dróg oddech...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy linię inhalacji zarodników i analizy przestrzennego osadzania się wdychanych zarodników. Rurociąg ten dostarcza cennych informacji w celu określenia odpowiednich obszarów zrębu płuc dotkniętych wdychaniem artrokonidii Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Zaobserwowaliśmy, że zarodniki Coccidioides i obojętne cząstki o podobnej wielkości (dane nie pokazane) gromadzą się w dystalnych obszarach oskrzelików i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie są w pełni rozproszone w świetle pęc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Fundusze i wsparcie zostały pozyskane dzięki grantowi NIH K22 AI153678-01 i Rutgers School of Graduate Studies. Dziękujemy Fawadowi Yousufzai i Luke'owi Fritzky'emu z Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core za ich pracę i wiedzę specjalistyczną w zakresie uzyskiwania obrazów immunofluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 G, 1 1/2 igły (305185)Fisher305185
1 L  Słoik z nakrętką  (Nalgene)Fisher Scientific11-823-33
Niesterylne strzykawki Air-Tite luzem 10 ml Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Injection (sterylny roztwór ksylazyny)Akorn59399-110-20
Bloker i rozcieńczalnik bez zwierząt, RTUVectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Cewnik z cewnikiem BD Vialon Materiał 18 G x 1,88cala BD381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block™)BD553142
CellTracker Pomarańczowy CMRA BarwnikFisher ScientificNC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ  BEI ResourcesNR-166
Corning 70 mikronów sitkaVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 przeciwciało monoklonalneBiolegend118211
Exel International Igły HYpodermic 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku (1 ml, Leur Slip)Fisher14-955-462
Monohydrat glukozyAzer Scientific ES17530-500G
Smar wysokopróżniowyVWR59344-055
Hoechst 33342 Roztwór 20 mM (5 ml)ThermoFischer62249
Isoflurane USPCovetrus29405
Chlorowodorek ketaminyDechra1000001250
KIMWIPES Delikatne wycieraczki do zadań (4,4'' x 8,4")VWR21905-026
Nożyczki dla niemowląt LexerFST14078-10
Kleszczyki Micro-AdsonFST11018-12
Neutralna buforowana formalina (10%) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Kolby do hodowli tkankowych Nunc EasYFask, T75, nasadki filtrująceVWR15708-134
PBSVWR45000-446
Peel-A-Way formy do zatapianiaSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 OprogramowanieOpen-sourcehttps://qupath.github.io/
Silk Suture rozmiar nici 3/0FST18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus VWR48311-703
Miękki zestaw mocujący zapobiegający blaknięciu szkła SlowFade (2 ml)ThermoFischerS36917
SacharozaSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrofobowy długopis barierowy Zestaw 2 okularówFisher ScientificNC9545623
VWR Micro Cover Glasses, prostokątne (24 mm x 40 mm #1.5)VWR48393-230
Biała plastikowa siatka drucianaMAPORCH789862904922
Ekstrakt drożdżowyFisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlwielokanałowy mikroskop fluorescencyjny
Oprogramowanie ZEN 3.7Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmloprogramowanie do mikroskopii
AP

Bibliografia

  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie płuc mysichlokalizacja zarodników grzybówdynamika przestrzenna dróg oddechowychutrwalanie poprzez nadmuchanie powietrzemutrwalanie poprzez perfuzję naczyniowątechnika kriokonserwacjimikroskopia fluorescencyjnaanaliza w programie QuPathbarwienie przeciwciałem przeciwko EpCAMgrzybiczna infekcja układu oddechowego
Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.