Method Article

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

DOI:

10.3791/67556

⸱

December 13th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzyby infekują ludzi, gdy zarodniki środowiskowe są wdychane do płuc. Płuco jest niejednorodnym narządem. Przewodzące drogi oddechowe, w tym oskrzela i oskrzeliki, rozgałęziają się aż do zakończenia w pęcherzykowej przestrzeni powietrznej, w której zachodzi wymiana gazowa. Infekcje wywodzące się z oskrzelików lub pęcherzyków płucnych wywołują wyraźne reakcje gospodarza i objawy chorobowe. Dlatego dokładne zrozumienie, gdzie zarodniki naturalnie lokalizują się w płucach, szczególnie wkrótce po zakażeniu, rozszerza możliwości badania interakcji gospodarz-patogen. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy analizę in situ płuc myszy zakażonych artrokonadią Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Konwencjonalne metody konserwacji histologicznej polegają na płynnym napełnianiu dróg oddechowych roztworem utrwalającym, który przemieszcza naturalne położenie zasysanych cząstek grzybów, wypychając zarodniki z proksymalnych oskrzelików do końcowych przestrzeni powietrznych.

Na odwrót, ta metoda napełniania powietrzem z utrwalaniem perfuzji naczyń krwionośnych zachowuje fizjologiczne położenie zarodników grzybów w oskrzelikach. Ponadto opisujemy proste podejście do kriokonserwacji, osadzania i obrazowania próbek płuc. Udostępniamy również wysokoprzepustowe techniki obliczeniowe za pośrednictwem programu QuPath o otwartym kodzie źródłowym do analizy przestrzennego rozmieszczenia zarodników grzybów w płucach. Przedstawiona tutaj metoda jest prosta i szybka, wymaga minimalnego sprzętu do wykonania i można ją łatwo dostosować do stosowania z wieloma modelami infekcji grzybiczych dróg oddechowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzie mogą wdychać do miliardów zarodników dziennie z różnych grzybów środowiskowych1. Aby zrozumieć naszą barierę obronną przed tymi wdychanymi zarodnikami, musimy docenić dokładne środowiska mikroanatomiczne, w których te zarodniki lądują w drogach oddechowych i miąższu płuc. Skład komórkowy dróg oddechowych (tj. komórek nabłonkowych) znacząco zmienia się wzdłuż tchawicy, oskrzeli, oskrzelików i pęcherzyków płucnych. Każdy z tych odrębnych regionów składa się z różnych typów komórek o dyskretnych funkcjach, które korzystają z arsenału obron, aby zapobiec infekcji patologicznej.

Dokładna lokalizacja odkładania się zarodników grzybów płucnych może różnić się między światłami dróg oddechowych oskrzelików wyściełanych nabłonkiem walcowatym, przewodami pęcherzykowymi lub pęcherzykami płucnymi2. Większość istotnych klinicznie gatunków grzybów wytwarza zarodniki o średnicy od 1 μm do 10 μm3. Odkładanie się tych cząsteczek zarodników w płucach zależy od kilku czynników, takich jak aerodynamika, gęstość, ładunek elektryczny i siły foretyczne, które mogą wpływać na mechanizm sedymentacji po inhalacji4. Ogólnie rzecz biorąc, duże cząstki (> 6 μm) osadzają się w górnych drogach oddechowych, średnie cząstki (2-6 μm) mogą osadzać się w mniejszych drogach oddechowych, a małe cząstki (<2 μm) docierają do obszaru pęcherzykowego5. Donoszono, że zarodniki Aspergillus (2-3 μm) docierają do przestrzeni pęcherzykowych, ale kliniczne raporty patologiczne wskazują również na znaczne obciążenie chorobami oskrzeli i oskrzelików6. Coraz częściej rozpoznaje się również wewnątrzoskrzelowe infekcje grzybicze Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum i Zygomycetes ze względu na rosnącą popularność elastycznej bronchoskopii7. Ostatnie postępy w obrazowaniu mikroskopowym zakażeń Aspergillus u myszy ujawniły również, że bardziej proksymalne przestrzenie powietrzne, takie jak oskrzela i oskrzeliki, mogą być najbardziej obciążone patologiczną proliferacją grzybów8. Badania nad reakcją gospodarza na infekcje grzybicze płuc wykazały, że zarówno komórki nabłonka oskrzelików, jak i komórki nabłonka pęcherzyków płucnych odgrywają ważną rolę jako strażnicy odporności, więc wyjaśnienie dokładnych miejsc odkładania się zarodników i interakcji nabłonkowej będzie miało kluczowe znaczenie dla przyszłych prac2,9,10.

Badanie dynamiki patogenezy proksymalnych dróg oddechowych jest trudne, ponieważ standardowe techniki unieruchamiania płuc i przygotowania sekcji mogą przemieścić zarodniki z tych proksymalnych pozycji w drogach oddechowych wyściełanych nabłonkiem i popchnąć je w kierunku dystalnych końcowych obszarów pęcherzyków płucnych. Zwykle 10% formaliny lub 4% paraformaldehydu stosuje się do nadmuchania płuc i szybkiego wystawienia całego płuca na działanie utrwalacza. Przygotowując płuca do kriosekcji, niektóre grupy podają do płuc związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby poprawić wydajność kriosekcji11. Praktyki te są przydatne we właściwym kontekście, ale zostały odkryte przez nasze laboratorium i inne grupy, aby przemieszczać zarodniki i cząstki z lokalizacji proksymalnych, zakłócając w ten sposób interpretacje typów komórek narażonych na działanie zarodników i późniejszej odpowiedzi gospodarza12.

Aby dokładnie ustalić mikroanatomiczną lokalizację wdychanych zarodników grzybów, opracowaliśmy szybką, mało wymagającą metodę zachowania lokalizacji zarodników grzybów w drogach oddechowych myszy. Zaadaptowaliśmy metodę perfuzji naczyniowej z mysim powietrzem od Thomasa i in. (2021), w której zmniejszyliśmy ilość sprzętu, czasu i umiejętności technicznych wymaganych do osiągnięcia zadowalającego wyniku13. Z opisanej tutaj metody zaobserwowaliśmy, że artrokonidia Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (o wielkości 3-5 μm) gromadzą się bardziej proksymalnie niż wcześniej pokazano, a mianowicie w dystalnych oskrzelikach i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie w końcowych pęcherzykach płucnych. Informacje te mogą ukierunkować pytania biologiczne dotyczące krytycznych typów komórek związanych z tymi regionami płuc i ich wpływu na wczesne reakcje na wdychane zarodniki grzybów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) z Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Oznacz zarodniki fluorescencją wewnątrzkomórkową

  1. Zabarwić 1 x 106 zarodników w estrze sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), Cell Tracker Orange lub Cell Tracker Red (lub wybranym barwniku wewnątrzkomórkowym) w temperaturze 5 μM przez 30 minut w temperaturze 30 °C, a następnie przemyć PBS i odwirować zarodniki w temperaturze 12 000 x g. Powtórz to pranie raz.
  2. Przygotować inokulum przetrwalnikowe o odpowiednim stężeniu, tak aby 25 μl zawierało odpowiednią dawkę zarodników dla jednej myszy.

2. Zaszczepianie myszy zarodnikami poprzez inhalację aspiracyjną przy użyciu znieczulenia izofluranem

UWAGA: Izofluran jest lotnym środkiem znieczulającym i musi być stosowany w kanałowej komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie.

  1. Aby przygotować słoik z ekspozycją na izofluran, umieść złożoną serwetkę w zakręcanym słoiku Nalgene o pojemności 1 litra i umieść plastikowe kółko z siatki na serwetce jako platformę dla myszy. Dodaj 2 ml izofluranu do serwetki, zamknij słoik i odczekaj 1-2 minuty, aż gaz zrównoważy się w pojemniku.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Aparatura do inokulacji zarodników metodą izofluranu metodą open drop. Złożoną serwetkę umieszcza się na dnie zakręcanego słoika o pojemności 1 l, a następnie wkłada się okrągłą plastikową siatkę, która działa jako platforma dla myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przed wystawieniem myszy na działanie znieczulenia należy przygotować pipetę z 25 μl inokulum. Umieść mysz w pojemniku z izofluranem i przechyl pojemnik, aby monitorować utratę odruchu prostowania, w którym mysz straciła przytomność i jest odwrócona do góry nogami. Zwykle trwa to około 10 sekund.
  2. Monitoruj częstość oddechów (RR), aż zwolni do stałych 50-80 oddechów na minutę (bpm), czyli około 50% spoczynkowego RR. Zwykle zajmuje to kolejne 10 sekund. W tym momencie wyjmij mysz ze słoika z izofluranem.
    UWAGA: Jest to wysokie stężenie izofluranu, które spowoduje szybką indukcję znieczulenia, a mysz musi być bardzo ściśle monitorowana. Śmiertelne przedawkowanie izofluranu stanowi ryzyko, ponieważ stężenie izofluranu może być zmienne, a krzywa dawka-odpowiedź na izofluran jest bardzo stroma. Jeśli częstość oddechów spadnie poniżej 50 uderzeń na minutę i/lub jest nieregularna, odłącz mysz od izofluranu, pozwól jej dojść do siebie przez 3-5 minut i spróbuj ponownie (maksymalnie dwie powtórzone próby).
  3. Potwierdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Następnie ustaw mysz w pozycji leżącej w jednej ręce i pozwól myszy na wykonanie 3-5 regularnych oddechów z rosnącym tempem (zaczynając od 50-60 uderzeń na minutę) i wigorem. Gdy to się zacznie, umieść końcówkę pipety w tylnej części jamy ustnej i gardła myszy i uwolnij inokulum podczas inhalacji.
    UWAGA: Te westchnienia przez usta wstrząsają głową gorzej z powodu rekrutacji mięśni dodatkowych do oddychania. Kiedy pipeta jest wkładana podczas tych westchnień, usta powinny otwierać się przy każdym wdechu. Jeśli usta się nie otwierają, mysz jest niedostatecznie znieczulona i prawdopodobnie nie będzie wdychać treści z jamy ustnej i gardła. Pipeta powinna uciskać język, popychając go w kierunku dołu i przodu jamy ustnej, aby zapobiec połknięciu inokulum. Gdy pipeta znajdzie się w ustach, a mysz jest odpowiednio znieczulona, mysz otworzy usta przy każdym zaczerpnięciu.
  4. Trzymając dłoń i kciuk za mysz, wyczuj trzaski na tylnej i przedniej stronie klatki piersiowej myszy, aby potwierdzić wdychanie inlokulum.

3. Eutanazja myszy

  1. Wstrzyknąć myszu dootrzewnowo koktajl składający się z 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny na 10 minut przed punktem ofiarowania.
  2. Odczekaj 10 minut po wstrzyknięciu, aż mysz wejdzie w chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, co potwierdza brak reakcji na uszczypnięcie palca.

4. Perfuzja płuc za pomocą PBS i formaliny

  1. Spryskaj znieczuloną mysz 70% etanolem. Użyj nożyczek, aby odciąć skórę myszy i rozsunąć skórę, aby odsłonić otrzewną ze wszystkich stron. Przeciągnij skórę z górnej połowy myszy nad jej głowę, wyciągając ramiona ze skóry.
  2. Przeciąć błonę otrzewną przy mostku i wzdłuż dolnej części klatki piersiowej, odsłaniając otrzewną. Przesunąć wątrobę niżej, odsłaniając przeponę. Użyj nożyczek, aby ostrożnie nakłuć przeponę z dala od miąższu płuca, aby uniknąć przebicia w samych płucach.
    UWAGA: Nieumyślne przebicie płuc uniemożliwi późniejsze napompowanie powietrza.
  3. Po przebiciu przepony powietrze dostaje się do klatki piersiowej, zapadając płuca. Przetnij klatkę piersiową po lewej stronie, aby odsłonić serce. Wstrzyknąć 5-10 ml PBS do prawej komory za pomocą igły 30 G w ilości 1 ml na 5 s (aby uniknąć uszkodzenia naczyń), szybko wybielając płuca.
    UWAGA: Formalina jest niebezpieczną substancją lotną, z którą należy obchodzić się w kanałowej komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie wyciągowym.
  4. Po zakończeniu wyjmij igłę i użyj nowej igły, aby wstrzyknąć 5 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny (NBF) do prawej komory w tym samym tempie.

5. Napompowanie powietrza w płucach z perfuzją

  1. Usuń przednią połowę klatki piersiowej. Aby odsłonić tchawicę, odetnij górne żebra i obojczyki po prawej i lewej stronie szyi. Uważaj, aby nie ciąć w pobliżu linii środkowej, gdzie będzie leżeć tchawica. Za pomocą kleszczy zapnij pozostałe górne żebra i obojczyki na linii środkowej szyi i ciągnij wyżej, aż tchawica zostanie odsłonięta.
  2. Przygotuj nić do szycia o długości 10 cm, przeciągnij ją pod tchawicę i wstępnie zawiąż luźny węzeł na dolnym końcu odsłoniętej tchawicy. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z powietrzem z cewnikiem 18 G. Użyj igły 18 G, aby zrobić otwór w tchawicy na górnym końcu odsłoniętego obszaru.
  3. Umieść cewnik w tym otworze, zapewniając stosunkowo ciasne dopasowanie, aby zapobiec ucieczce powietrza. Powoli wstrzykiwaj 1 ml powietrza do płuc w ciągu 10 sekund, obserwując napompowanie płuc we wszystkich płatach. Pełne napompowanie powoduje, że płuca lekko owijają się wokół serca i wypełniają objętość, którą zajmują w nienakłutej przeponie.
  4. Mocno zaciśnij węzeł wokół tchawicy i wyjmij cewnik. Przytrzymaj tchawicę i użyj nożyczek, aby usunąć płuca z myszy, uważając, aby nie przebić płuca.

6. Utrwalenie i odwodnienie przez zanurzenie

  1. Umieść płuca na górnej krawędzi stożkowej rurki o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml 10% NBF. Trzymaj nici szwu na zewnątrz stożka, przykręć nasadkę i odwróć stożkową tak, aby płuca były zawieszone do góry nogami w 20 ml NBF. Umieść go w temperaturze 4 °C na 24-48 godzin.
  2. Przepłukać płuca w PBS, a następnie umieścić w 30% roztworze sacharozy-PBS (w/v) na 72-96 godzin w temperaturze 4 °C w celu odwodnienia płuc w ramach przygotowań do kriokonserwacji. Usunąć płuca z sacharozy, umieścić płuca w kriofordzie z podłożem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C.

7. Kriosekcja

  1. Zrównoważyć próbki w krioblokach OCT do temperatury -20 °C kriostatu przez 1 godzinę przed sekcją. Ciąć bloki o grubości 20-100 μm.
    UWAGA: Nadmuchiwanie powietrzem może prowadzić do zwiększonej kruchości próbki, a cięcie o zwiększonej grubości może zapobiec pękaniu tkanki podczas cięcia.
  2. Zebrać skrawki na szkiełkach i pozostawić do wyschnięcia na 30 minut do 1 godziny, aby zapewnić przyleganie tkanek do szkiełka.
    UWAGA: Na tym etapie zjeżdżalnie mogą odbywać się w temperaturze -80 °C.

8. Przygotowanie i blokowanie slajdów

  1. Umieść szkiełka w kąpieli PBS (w naczyniu lub słoiku Coplin) na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć OCT ze szkiełek.
    UWAGA: Grubsze sekcje (40-100 μm) mogą nie przylegać do szkiełek tak dobrze, jak cieńsze sekcje, dlatego najlepiej trzymać je płasko i pionowo w naczyniu, a nie umieszczać na boku w słoiku z kopliny.
  2. Wysuszyć szkiełka po rozpuszczeniu OCT z dala od tkanki. Użyj chusteczki, aby wysuszyć nadmiar kropelek z obwodu szkiełka wokół próbki tkanki.
  3. Użyj hydrofobowego pisaka Pap, aby narysować obwód wokół próbki i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
  4. Przygotować bufor blokujący z roztworu blokującego wolnego od zwierząt z 0,3% Tween-20 i blokiem 1:100 Fc w 300 ml na szkiełko.
    UWAGA: W przypadku celów wewnątrzkomórkowych można zastosować 1% Tween-20. Objętość 300 μl jest zwykle wystarczająca, ale objętość niezbędna do pełnego pokrycia tkanki zależy od wielkości obwodu markera hydrofobowego. Od tego momentu tkanka nie powinna wysychać.
  5. Roztwór blokujący pozostawić na szkiełkach na 1 godzinę w temperaturze RT.

9. Barwienie immunologiczne

  1. Umyj szkiełko, odpipetując płyn i dodając 300-500 μl PBS. Powtórz pranie raz.
  2. Przygotować pierwszorzędowe szczurze przeciwciało anty-mysie EpCAM (klon G8.8) (marker nabłonka dróg oddechowych) przeciwko AlexaFluor-647 w wolnym od zwierząt roztworze blokera z 0,33% Tween-20 (lub 1% dla celów wewnątrzkomórkowych). Dodać 300 μl na szkiełko tego roztworu i zabarwić przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przeciwciała należy testować empirycznie pod kątem stężenia, czasu i temperatury barwienia. Cienkie skrawki (8-20 μm) barwi się przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a grubsze (20-100 μm) w temperaturze 4 °C przez noc przy użyciu rozcieńczeń 1:100 dla większości przeciwciał. Jeśli używasz niesprzężonych przeciwciał, przemyj 2x (jak wyżej) i nałóż drugorzędowe przeciwciało fluorescencyjne na empirycznie określony czas i temperaturę. Ogólnie rzecz biorąc, wtórne barwienie przeciwciał wykonuje się w RT przez 1 godzinę w rozcieńczeniu 1:1000.
  3. Usunąć roztwór przeciwciał z próbki i przemyć szkiełko 300 ml PBS przez 5 minut. Powtórzyć to płukanie raz. Wysuszyć szkiełka, usuwając nadmiar płynu z próbki i otaczającego szkła.
  4. Dodaj jedną kroplę miękkiego nośnika montażowego RT (np. szkła SlowFade) do każdego kawałka chusteczki. Uważaj, aby uniknąć bąbelków, pozwalając butelce osiąść do góry nogami i powoli upuszczając każdą kroplę na chusteczki. Umieść szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości, aby wystawało poza obwód próbki i markera hydrofobowego.

10. Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Użyj wielokanałowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zeskanować całe odcinki płuc w bezstronny sposób, używając obiektywu o rozdzielczości wystarczającej do rozdzielenia pojedynczych zarodników i komórek gospodarza (np. Zeiss Axioscan 7 przy użyciu obiektywu olejowego 20x z NA = 0,8 lub podobnym).
    UWAGA: Upewnij się, że moc lasera i wzmocnienie napięcia PMT są ustawione tak, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu obiektu w tle określony za pomocą kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
  2. Zbierz wystarczającą ilość kafelków obrazu, aby uchwycić cały płat płuc (np. ~200 płytek o wymiarach 400 μm x 400 μm). Użyj oprogramowania mikroskopowego (np. Zeiss ZEN 3.7 lub podobnego), aby wyeksportować scalony obraz płytki do dalszej obróbki.

11. Analiza przestrzenna za pomocą QuPath

  1. W QuPath, darmowym oprogramowaniu typu open source14, utwórz plik projektu i dodaj do niego obrazy fluorescencyjne.
  2. Sklasyfikuj piksele EpCAM+ jako nabłonek, klikając w górnym menu opcję Klasyfikuj, a następnie Klasyfikacja pikseli > Utwórz proger. Wybierz rozdzielczość, kanał, sigma wygładzania i wartość progową, która najlepiej identyfikuje region docelowy. Zapisz klasyfikator pod unikatową nazwą, a następnie wybierz pozycję Utwórz obiekty.
  3. W nowym oknie Utwórz obiekty wybierz opcję Nowy typ obiektu jako Adnotacja. W przypadku nabłonka płuc ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na 100 mm2. Nie ma potrzeby wybierania opcji Podziel obiekty w tym miejscu. Po wybraniu przycisku OK zostaną utworzone adnotacje, które można modyfikować wzrokiem za pomocą narzędzia Pędzel w lewym górnym obszarze.
  4. Aby sklasyfikować zarodniki, powtórz kroki od 11.3 do 11.4, używając kanału, w którym zarodniki zostały schwytane, i utwórz nowy typ obiektu Wykrywanie, a nie Adnotacja. Ustaw minimalny rozmiar obiektu i minimalny rozmiar otworu na 0 mm2, a następnie wybierz opcję Podziel obiekty.
  5. Aby przeprowadzić analizę przestrzenną zarodników, wybierz w górnym menu opcję Analizuj > Analiza przestrzenna > Oblicz odległość ze znakiem do adnotacji 2D. Odległości do nabłonka EpCAM+ zostaną obliczone dla każdego wykrytego zarodnika. Eksportuj je za pomocą opcji Zmierz > Eksportuj pomiary w górnym menu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda ostatecznie tworzy immunofluorescencyjne obrazy płuc myszy za pomocą fizjologicznego nadmuchiwania powietrza, aby pozostawić drogi oddechowe nienaruszone. Co ważne, wiele punktów kontrolnych po drodze potwierdzi, że elementy protokołu zostały wykonane pomyślnie. Podczas inokulacji ważne jest, aby potwierdzić, że inokulum zostało zassane poprzez wyczucie "trzasków" na tylnej ścianie klatki piersiowej myszy, które wskazują, że płyn dostał się do dróg oddechowych. Jeśli nie ma uczucia trzasków, możliwe, że mysz połknęła inokulum. Perfuzja płuc myszy za pomocą PBS powinna spowodować białe plamki na płucach, a następnie całkowite wybielenie całego płuca (Rysunek 2A). Jeśli wybielanie jest niepełne, późniejsza perfuzja formaliny nie dotrze do wszystkich obszarów miąższu płuc (Ryc. 2B). Podczas napełniania płuc powietrzem płuca powinny powoli się rozszerzać, aż osiągną fizjologiczne rozmiary. Po zawiązaniu szwu tchawicy w celu zabezpieczenia powietrza wewnątrz płuc, płuca nie powinny się kurczyć. Jeśli tak, prawdopodobnie płuco zostało przebite podczas zabiegu.

Tutaj pokazujemy reprezentatywne obrazy sekcji z oznaczonymi zarodnikami Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (zielonymi) i kolumnowym nabłonkiem oskrzelików EpCAM+ (magenta) zarówno w płucach napompowanych powietrzem, jak i formaliną (Rysunek 3A,B odpowiednio). Zarodniki te gromadzą się głównie w dystalnych oskrzelikach i w przestrzeniach pęcherzyków płucnych bezpośrednio przylegających do tych dystalnych oskrzelików, prawdopodobnie w przewodach pęcherzykowych. Napompowane powietrzem płuca perfundowane utrwalaczem zawierają zarodniki, które pojawiają się częściej w oskrzelikach i skupiają się bliżej oskrzelików (Ryc. 3A), a nie płynny utrwalacz, gdzie zarodniki wydają się nieco bardziej rozproszone z nabłonka oskrzelików (Ryc. 3B). Poprzez analizę przestrzenną QuPath mierzymy odległość poszczególnych zarodników do najbliższego nabłonka oskrzelików EpCAM+, aby wskazać poziom dyspersji zarodników z dala od oskrzelików i do bardziej dystalnych przestrzeni pęcherzyków płucnych. Pokazujemy, że płynna inflacja rozprasza zarodniki dalej od oskrzelików w porównaniu z fizjologicznym napompowaniem powietrza (Rysunek 4A, B). Perfuzja naczyniowa z nadmuchiwaniem powietrza zachowuje naturalne położenie tych zarodników w dystalnych oskrzelikach i zapobiega sztucznemu rozpraszaniu tych zarodników do bardziej dystalnych przestrzeni pęcherzyków płucnych poprzez wkraplanie utrwalające dotchawiczo.

figure-results-1
Rysunek 2: Wskazanie powodzenia perfuzji płuc. (A) Pomyślnie wykonane perfuzje płuc będą całkowicie białe. (B) Niecałkowicie perfundowane płuca będą wyglądały na różowe lub cętkowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy rozkładu zarodników w płucach napompowanych powietrzem i wypełnionych formaliną płucach w porównaniu z płucami napompowanymi formaliną. Wewnątrzkomórkowe zarodniki fluorescencyjne (zielone) są rozmieszczone w bliższej odległości od nabłonka oskrzelików EpCAM+ (magenta) w (A) napompowanych powietrzem płucach niż w (B) płucach napompowanych formaliną. Obrazy uzyskano z odcinków o głębokości 1,2 mm od tylnej powierzchni lewych płatów myszy w każdej grupie leczonej na wielokanałowym mikroskopie fluorescencyjnym przy 20-krotnym powiększeniu, a płytki zszyto za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Podziałka = 800 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Porównanie odległości zarodników (mm) do nabłonka oskrzelików między płucami napompowanymi powietrzem i napompowanymi formaliną. Płuca od 3 myszy na grupę badaną zebrano, przetworzono i obrazowano przez 1,5 godziny po inokulacji 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ artrokonidii. Cztery sekcje na mysz pobrano w odległości 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm i 2,0 mm od tylnej powierzchni lewego płata, wybarwiono i zobrazowano pod wielokanałowym mikroskopem fluorescencyjnym. Wszystkie zarodniki z każdej grupy zostały wykryte i przeanalizowane przestrzennie w QuPath w celu określenia (A) odległości do najbliższego kolumnowego nabłonka oskrzelików EpCAM+ oraz (B) mediana i 95% przedziały ufności są wyświetlane w jednostkach mikrometrów. Zarodniki nadmuchiwania powietrza, n = 11 673. Zarodniki napompowania cieczy, n = 9,837. Test t Manna-Whitneya wykonano z powodu braku normalności, a p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy linię inhalacji zarodników i analizy przestrzennego osadzania się wdychanych zarodników. Rurociąg ten dostarcza cennych informacji w celu określenia odpowiednich obszarów zrębu płuc dotkniętych wdychaniem artrokonidii Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ. Zaobserwowaliśmy, że zarodniki Coccidioides i obojętne cząstki o podobnej wielkości (dane nie pokazane) gromadzą się w dystalnych obszarach oskrzelików i połączeniach oskrzelowo-pęcherzykowych, a nie są w pełni rozproszone w świetle pęcherzyków płucnych. Model ten wymaga stosunkowo niskiego poziomu sprzętu i umiejętności technicznych do produkcji kriosekcji do immunofluorescencji (lub innych dalszych etapów, takich jak immunohistochemia [IHC]), które utrzymują fizjologiczną integralność treści dróg oddechowych przy jednoczesnym zachowaniu naturalnej morfologii płuc. Bez nadmuchiwania powietrza zapadanie się pęcherzyków płucnych zniekształca naturalną architekturę miąższu płuc otaczającego oskrzeliki13,15. Utrata objętości powietrza w płucach podczas przetwarzania histologicznego została wskazana jako "poważny problem" we wspólnym oficjalnym oświadczeniu badawczym Amerykańskiego Towarzystwa Klatki Piersiowej i Europejskiego Towarzystwa Chorób Układu Oddechowego w zakresie określania standardów ilościowej oceny struktury płuc16. Ponadto dotchawicze wkraplanie utrwalacza może zakłócić charakter i lokalizację proksymalnych składników molekularnych i komórkowych dróg oddechowych, takich jak mucyny, środki powierzchniowo czynne i rzęski dróg oddechowych 17,18,19. Opisana tutaj metoda w wystarczającym stopniu zachowuje zarówno objętość powietrza w płucach, jak i składniki molekularne i komórkowe wzdłuż dróg oddechowych, które oddziałują z wdychanymi zarodnikami grzybów.

Mikroskopia immunofluorescencyjna stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki przestrzennej składników płuc i jest dobrze oceniane20,21. Nie ma ograniczeń co do celów, które można wybarwić za pomocą immunofluorescencji tych odcinków, z wyjątkiem tego, że przeciwciała z epitopami wrażliwymi na wiązanie formaliny mogą nie wiązać swoich celów w zadowalający sposób. W przypadku stosowania nowego przeciwciała najlepiej jest przygotować kontrolę fluorescencji minus jeden (FMO), aby określić, czy przeciwciało generuje jakikolwiek sygnał powyżej tła. W przypadku stosowania przeciwciała drugorzędowego należy użyć grupy leczonej bez przeciwciała pierwszorzędowego, aby kontrolować wiązanie przeciwciała drugorzędowego poza celem. Pierwszorzędowe sprzężone przeciwciała monoklonalne są bardzo specyficzne, więc barwienie w wyższych temperaturach (37 °C) przez krótszy czas (30 minut) jest powszechne i na ogół wiąże się specyficznie z ich celem. Z drugiej strony, niesprzężone przeciwciała poliklonalne są bardziej czułe na wykrywanie antygenów, ale mniej specyficzne, więc dłuższe inkubacje (~16 godzin) w niższych temperaturach (4 °C) optymalizują stosunek sygnału do szumu. Wszystkie przeciwciała będą wymagały empirycznej optymalizacji.

Model analizy przestrzennej zastosowany w tym badaniu do lokalizacji zarodników mierzy odległość poszczególnych zarodników do najbliższego nabłonka oskrzelików. Wymaga to odpowiedniej identyfikacji nabłonka oskrzelików na podstawie jego wysokiego sygnału EpCAM i morfologicznie odrębnego wyglądu jako nabłonka walcowatego wyściełającego struktury przypominające rurkę. EpCAM może być również wyrażany na niższych poziomach przez nabłonek pęcherzyków płucnych, dlatego ważne jest, aby progować sygnał EpCAM w QuPath, aby ograniczyć zdefiniowane adnotacje do morfologicznie potwierdzonych obszarów oskrzelików. Ponieważ oskrzeliki mają anatomiczny minimalny rozmiar, możemy ograniczyć definicję tych obszarów w QuPath do minimalnej powierzchni 100 mm2, jak podano w kroku 11.3. Pozwoli to wykluczyć izolowane komórki lub artefakty o wysokiej ekspresji EpCAM w przestrzeniach pęcherzykowych, takie jak komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II, z adnotacji QuPath. Te kroki pozwalają nam zdefiniować wyłącznie nabłonek oskrzelików jako adnotacje QuPath i określić bliskość zarodników do tego zdefiniowanego nabłonka oskrzelików.

Opisany tutaj model infekcji wykorzystuje znieczulenie izofluranem do wywołania reakcji oddechu ustnego u myszy w celu aspiracji zarodników grzybów. Metoda izofluranu w postaci otwartej kropli została opracowana jako szybka, niskozasobowa technika wywoływania krótkotrwałego znieczulenia u myszy 9,22,23. Ta metoda wymaga pewnej praktyki, aby działać konsekwentnie. Czas pod narkozą musi być wystarczająco długi, aby znieczulić mysz w wystarczającym stopniu do zasysania treści gardłowej. Jeśli mysz nie jest wystarczająco znieczulona, może połknąć inokulum zamiast go zasysać. Objaw wystarczającego znieczulenia jest osiągany, gdy mysz wydaje regularne sapanie doustne o rosnącym wigorze w tempie około 50-60 oddechów / min. Głowa myszy leżącej na wznak powinna poruszać się do przodu z każdym oddechem. Niewystarczające znieczulenie może być określone przez brak oddechu lub jakikolwiek ruch wąsów, języka lub kończyn. Najlepszą praktyką jest wciskanie języka końcówką pipety podczas podawania inokulum, aby zapobiec połknięciu. Przedawkowanie izofluranu może prowadzić do śmierci myszy i należy mu zapobiec. Dobrą zasadą, aby temu zapobiec, jest usunięcie myszy z izofluranu po tym samym czasie, jaki jest potrzebny do utraty przez mysz odruchu prostowania. Na przykład, jeśli mysz potrzebuje 10 s, aby stracić odruch prostowania, usuń mysz po dodatkowych 10 sekundach. Ponieważ gaz izofluran ulatnia się w trakcie leczenia wieloma myszami, ten czas może się wydłużyć. W naszych rękach możemy leczyć 6-8 myszy bez dodawania większej ilości izofluranu.

Istnieją pewne ograniczenia dotyczące składników tego protokołu. Procedura inokulacji wykorzystuje zarodniki zawieszone w 25 μl płynnej pożywki PBS, która jest mniej fizjologiczna niż inokulacja zarodników w aerozolu. Otwartym pytaniem pozostaje, czy użycie zasysanego płynu zmienia lokalizację zarodników/cząstek w porównaniu z innymi metodami inokulacji, takimi jak wdychanie zarodników unoszących się w powietrzu. Jednak inhalacja w aerozolu wymaga znacznych inwestycji w zasoby i ma inne ograniczenia (ograniczona wielkość inokulum, zmienna ekspozycja, ryzyko zawodowe), które mogą nie być optymalne w zależności od charakteru badania i środowiska laboratoryjnego. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że podczas kriosekcji może wystąpić kruchość tkanek, która może być spowodowana obecnością powietrza w tkance lub zmniejszoną skutecznością mocowania naczyniowego w porównaniu z mocowaniem dotchawiczym. Tę kruchość kriosekcji można przezwyciężyć, wycinając grubsze odcinki o grubości 60-100 μm i stosując mikroskopię konfokalną do obrazowania dwuwymiarowych (2D) płaszczyzn w tkance.

Wierzymy, że prostota i zdolność adaptacji tej metody umożliwi innym grupom znalezienie użyteczności z wybranymi przez siebie wziewnymi patogenami i interesującymi ich reakcjami gospodarza.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundusze i wsparcie zostały pozyskane dzięki grantowi NIH K22 AI153678-01 i Rutgers School of Graduate Studies. Dziękujemy Fawadowi Yousufzai i Luke'owi Fritzky'emu z Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core za ich pracę i wiedzę specjalistyczną w zakresie uzyskiwania obrazów immunofluorescencyjnych.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 G, 1 1/2 igły (305185)Fisher305185
1 L  Słoik z nakrętką  (Nalgene)Fisher Scientific11-823-33
Niesterylne strzykawki Air-Tite luzem 10 ml Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Injection (sterylny roztwór ksylazyny)Akorn59399-110-20
Bloker i rozcieńczalnik bez zwierząt, RTUVectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Cewnik z cewnikiem BD Vialon Materiał 18 G x 1,88cala BD381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block™)BD553142
CellTracker Pomarańczowy CMRA BarwnikFisher ScientificNC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ  BEI ResourcesNR-166
Corning 70 mikronów sitkaVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 przeciwciało monoklonalneBiolegend118211
Exel International Igły HYpodermic 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku (1 ml, Leur Slip)Fisher14-955-462
Monohydrat glukozyAzer Scientific ES17530-500G
Smar wysokopróżniowyVWR59344-055
Hoechst 33342 Roztwór 20 mM (5 ml)ThermoFischer62249
Isoflurane USPCovetrus29405
Chlorowodorek ketaminyDechra1000001250
KIMWIPES Delikatne wycieraczki do zadań (4,4'' x 8,4")VWR21905-026
Nożyczki dla niemowląt LexerFST14078-10
Kleszczyki Micro-AdsonFST11018-12
Neutralna buforowana formalina (10%) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Kolby do hodowli tkankowych Nunc EasYFask, T75, nasadki filtrująceVWR15708-134
PBSVWR45000-446
Peel-A-Way formy do zatapianiaSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 OprogramowanieOpen-sourcehttps://qupath.github.io/
Silk Suture rozmiar nici 3/0FST18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus VWR48311-703
Miękki zestaw mocujący zapobiegający blaknięciu szkła SlowFade (2 ml)ThermoFischerS36917
SacharozaSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrofobowy długopis barierowy Zestaw 2 okularówFisher ScientificNC9545623
VWR Micro Cover Glasses, prostokątne (24 mm x 40 mm #1.5)VWR48393-230
Biała plastikowa siatka drucianaMAPORCH789862904922
Ekstrakt drożdżowyFisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlwielokanałowy mikroskop fluorescencyjny
Oprogramowanie ZEN 3.7Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmloprogramowanie do mikroskopii
AP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Murine Lung ImagingFungal Spore LocalizationAirway Spatial DynamicsAir Inflation FixationVascular Perfusion FixationCryopreservation TechniqueFluorescent MicroscopyQuPath AnalysisEpCAM Antibody StainingRespiratory Fungal Infection

Related Articles