Artykuł metodologiczny

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/67559

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  , 
1IIPROSAM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3IQUIBIM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez tasiemce jest kluczowe dla umożliwienia komunikacji komórkowej nie tylko między pasożytami, ale także z tkankami gospodarza. W szczególności małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) działają jako nanonośniki przenoszące naturalne antygeny, które mają kluczowe znaczenie dla immunomodulacji gospodarza i przetrwania pasożytów. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół izolacji sEV z kultur Echinococcus granulosus w stadium larwalnym i przeanalizowano ich wychwyt przez komórki dendrytyczne uzyskane z mysiego szpiku kostnego, które nabywają adhezję i zdolność prezentacji antygenu w trakcie dojrzewania po tygodniu hodowli in vitro. Niniejszy artykuł zawiera wyczerpujące informacje na temat generowania, oczyszczania i kwantyfikacji sEV za pomocą ultrawirowania wraz z równoległymi analizami dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ponadto przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący izolowania i hodowli komórek szpiku kostnego myszy oraz stymulowania ich różnicowania w komórki dendrytyczne za pomocą Flt3L. Te komórki dendrytyczne mogą prezentować antygeny naiwnym limfocytom T, modulując w ten sposób rodzaj odpowiedzi immunologicznej in vivo. W związku z tym proponuje się alternatywne protokoły, w tym mikroskopię konfokalną i analizę cytometrii przepływowej, w celu sprawdzenia nabytego fenotypu dojrzewania komórek dendrytycznych wcześniej narażonych na pasożytnicze sEV. Na koniec warto zauważyć, że opisany protokół może być stosowany w całości lub w poszczególnych częściach do przeprowadzenia hodowli pasożytów in vitro, wyizolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wygenerowania hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego oraz przeprowadzenia testów wychwytu tych komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Echinococcus granulosus to pasożytniczy robak pasożytniczy odzwierzęcy, odpowiedzialny za długotrwałą infekcję znaną jako bąblowica torbielowata1. U żywicieli pośrednich, takich jak zwierzęta gospodarskie i ludzie, zakażenie pasożytem atakuje przede wszystkim wątrobę i płuca, gdzie stadium larwalne rozwija się jako wypełnione płynem torbiele lub metatastle zawierające protoskopety (sama larwa). Podobnie jak wszystkie tasiemce, pasożyt ten nie ma zarówno układu trawiennego, jak i wydalniczego, a zatem wyewoluował aktywne endocytarne i egzocytarne procesy komórkowe regulujące pobieranie i wydalanie metabolitów, a także uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych2,3. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to cząsteczki otoczone dwuwarstwami lipidowymi, wydzielane przez pozornie wszystkie typy komórek. W szczególności małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV), definiowane jako EV mniejsze niż 200 nm, niezależnie od ich pochodzenia biogenezy4, mogą działać jako międzykomórkowe mediatory odpornościowe. Funkcja ta jest szczególnie istotna w przypadku pasożytów, które polegają na immunomodulacji gospodarza, aby zapewnić sobie przetrwanie3. Manipulacja immunologiczna osiąga się poprzez wychwyt sEV przez komórki dendrytyczne gospodarza, jedyne komórki zdolne do aktywacji naiwnych limfocytów T in vivo i zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, która doprowadzi do przewlekłego zakażenia przez te pasożytnicze robaki. Komórki dendrytyczne, profesjonalne komórki wrodzonego układu odpornościowego prezentujące antygen, przetwarzają i ładują peptydy antygenowe do głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i klasy II (MHC I i MHC II) i wystawiają je na swoich błonach w celu wyłącznego naiwnego pobudzania limfocytów T (odpowiednio limfocyty T CD8 + i CD4 +)5. Następujące komórki dendrytyczne indukują ich dojrzewanie poprzez indukcję ekspresji markerów kostymulujących CD80/CD86 i CD40 oraz MHC-II i migrują z tkanek obwodowych do wtórnych narządów limfatycznych po rozpoznaniu obcych antygenów, ładując je do wyłącznego naiwnego primingu limfocytów T6. Tak więc ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie komunikacji pasożyt-gospodarz robaka pasożytniczego w realistyczny sposób, analizując pakowanie i dostarczanie składników pasożytniczych w postaci sEV, które po dotarciu do komórek odpornościowych gospodarza wpływają na rozwój infekcji i postęp przewlekłej choroby pasożytniczej.

Zajęcie się analizą interfejsu helminth-host poprzez badanie sEVs ma kilka zalet. Po pierwsze, powłoka, zewnętrzna powłoka płazińców, jest strukturą podwójnej błony, która stanowi główny punkt przejścia między pasożytem a jego żywicielem, umożliwiając łatwe generowanie lub przenikanie sEV z tej struktury7. Po drugie, sEV są silnie naładowane antygenami białkowymi ze wszystkich etapów cyklu życiowego pasożyta, co stanowi naturalny sposób, w jaki układ odpornościowy gospodarza pobiera próbki antygenów podczas infekcji robakami8,9. Ze względu na ich biologiczną produkcję, łatwość oczyszczania (bez konieczności rozbijania tkanek lub frakcjonowania białek) oraz bezpośrednią interakcję z komórkami gospodarza, robaki pasożytnicze umożliwiają rozwój eksperymentów in vitro w celu symulacji warunków interakcji pasożyt-gospodarz in vivo. Wreszcie, sEV reprezentują możliwość posiadania struktur pasożytniczych, które mogą być fagocytozowane lub internalizowane przez komórki gospodarza, pokonując niemożność zrobienia tego w przypadku całych pasożytów, szczególnie w przypadku otorbionych robaków.

Biorąc pod uwagę wymienione zalety oraz fakt, że robaczyce są powszechnymi i zazwyczaj przewlekłymi chorobami, w których pasożyty przypuszczalnie manipulują układem odpornościowym gospodarza jako strategią przetrwania, izolacja EV pochodzących od pasożytów i ich badanie w interakcji z komórkami dendrytycznymi stanowi cenny framework do zbadania tej immunomodulacji10. W tym sensie opisano, że internalizacja EV od robaków, w tym nicieni i platyhelminthów, takich jak Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi i E. granulosus, indukuje dojrzewanie i aktywację komórek dendrytycznych9,11,12,13,14,15.

Izolacja EV pochodzących od robaków nie tylko umożliwia badanie interakcji immunologicznych, potencjalnie prowadząc do opracowania szczepionek ochronnych lub środków immunoterapeutycznych dla chorób alergicznych lub autoimmunologicznych, ale także ułatwia eksplorację innych interakcji i funkcji biologicznych8,16,17. W tym kontekście, EV, które odgrywają rolę w naturalnej historii infekcji pasożytniczych, mogą być wykorzystane do badania rozwoju pasożytów i interakcji z określonymi komórkami gospodarza. Co więcej, mogą mieć potencjalne zastosowanie jako wczesne lub różnicowe biomarkery do diagnozowania chorób pasożytniczych, monitorowania odpowiedzi terapeutycznych oraz przyczyniania się do kontroli i leczenia zakażeń pasożytniczych17,18.

Ponadto, jak wcześniej wykazano, stadium larwalne E. granulosus jest podatne na zmiany w stężeniu cytozolowego wapnia, co oprócz odgrywania roli w żywotności pasożyta, kontroluje również wskaźnik egzocytozy19,20. W tym kontekście, wiedząc, że wewnątrzkomórkowe podniesienie poziomu wapnia zwiększa uwalnianie EV, stosowanie wewnątrzkomórkowego wzmacniacza wapnia jako loperamidu może być kluczową strategią zwiększania liczby EV. Podejście to jest szczególnie interesujące w przypadku systemów komórkowych, które wymagają dużych populacji do wygenerowania odpowiedniej ilości pojazdów elektrycznych do analizy ładunku i funkcjonalnej11,21,22. Obecny protokół (Rysunek 1) szczegółowo opisuje metody uzyskiwania czystych kultur w stadium larwalnym E. granulosus oraz warunki, które zwiększają produkcję sEV. Opisano również przebieg izolacji i charakterystyki tych pęcherzyków, a także ich wychwyt przez mysie komórki dendrytyczne, co jest niezbędnym krokiem we wstępnym badaniu modulacji układu odpornościowego gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały ocenione i zatwierdzone przez Komitet Doświadczalny ds. Zwierząt Wydziału Nauk Ścisłych i Przyrodniczych, Mar del Plata (numery zezwoleń: RD544-2020; Płyta RD624-625-2021; RD80-2022). W tym protokole myszy zostały poddane eutanazji, zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" opublikowanym przez NIH oraz wytycznymi National Health Service and Food Quality (SENASA).

1. Uprawa w stadium larwalnym Echinococcus

UWAGA: Wszystkie procedury zostały wykonane w warunkach aseptycznych.

  1. E. granulosus protoscoleces obtencja
    1. Za pomocą igły 21 G i strzykawki o pojemności 10 ml odessać część płynu bąblowcowego z płuc lub wątroby zakażonego bydła, aby zmniejszyć turgor torbieli (Rysunek 2A).
      UWAGA: Zakażone płuca i wątroby pochodzą od bydła przeznaczonego do rutynowego uboju w rzeźni. Muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C i przetwarzane w ciągu 24 godzin od uboju.
    2. Otwórz torbiel nożyczkami i usuń warstwy laminarne i zarodkowe z torbieli za pomocą kleszczy. Umieść je na sterylnej szalce Petriego, razem z pozostałym płynem bąblowcowym (Rysunek 2B,C).
      UWAGA: W tym momencie zaleca się obserwację szalki Petriego pod odwróconym mikroskopem w celu oceny jakości protoskopów i kapsułek lęgowych. Unikaj gromadzenia materiału biologicznego z torbieli z zapadniętymi ponad 50% protoskopecji, które są identyfikowane przez ich skurczoną somę, ciemniejszy kolor i zdezorganizowane rostellum z utratą haczyków.
    3. Przemyć warstwy sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) uzupełnionym antybiotykami (100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml gentamycyny 100 μg/ml) w celu usunięcia protoskopecji><. UWAGA: Wszystkie mycia będą wykonywane przy użyciu PBS uzupełnionego antybiotykami.
    4. Przenieść zawiesinę protoskolaksu do sterylnej szklanej probówki Khana za pomocą pipety Pasteura.
    5. Umyć protoskopety uzupełnionym PBS w temperaturze 4 °C za pomocą pipety Pasteura w celu usunięcia martwych pasożytów. Zawiesinę należy energicznie zawiesić w celu rozbicia kapsułek czerwiowych, ułatwiając uwalnianie protoskoleksu. Pozwól protoskopom osiąść na 1–2 minuty na dnie probówki; następnie odrzucić supernatant zawierający martwe protoskopeleki.
      UWAGA: Ze względu na różnicę w gęstości, żywe protoskopole osiadają szybciej niż martwe pasożyty.
    6. Powtarzaj proces mycia, aż wszystkie martwe i pływające protoskopole zostaną usunięte.
      UWAGA: Martwe pasożyty są usuwane, gdy wszystkie osiadają w tym samym tempie.
    7. Określić żywotność protoskopecji za pomocą testu wykluczenia metylenu.
      1. Ponownie zawiesić umyte protoskopolety za pomocą pipety i umieścić kroplę na szkiełku. Dodaj kroplę 0,1 mg/ml błękitu metylenowego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Odczekaj 2–3 minuty i obserwuj pod mikroskopem.
      2. Policz całkowitą liczbę żywych (niezabarwionych) i martwych (zabarwionych na niebiesko) protoskopecji i oblicz procent żywotnych protoskopecji (rysunek 2D i wstawka).
        UWAGA: Żywotność protoskopecji powinna wynosić około 98% przed założeniem kultur. Czas barwienia nie powinien przekraczać 10 minut, ponieważ dłuższy czas barwienia może spowodować zabarwienie żywych pasożytów.
  2. E. granulosus metacestodes obtencja
    1. Wytworzyć eksperymentalną wtórną chorobę bąblowców przez dootrzewnowe zakażenie samic myszy CF1 (masa ciała 25 ± 5 g) z 1500 protoskopekami (co odpowiada 10 μl granulki protocolex) zawieszonymi w 0,5 ml uzupełnionego PBS (Rysunek 2E).
      UWAGA: Zaleca się utrzymywanie protoskopecji w PBS uzupełnionym antybiotykami w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub w hodowli przez 3–5 dni przed zakażeniem.
    2. Metatastle rozwijają się w ciągu 4-6 miesięcy po zakażeniu (Ryc. 2F). W tym okresie zwierzęta należy trzymać w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (temperatura 20 ± 1 °C, 12-godzinny cykl światła/ciemności oraz woda i pokarm dostarczane ad libitum). Gdy torbiele się rozwiną, znieczulij myszy za pomocą ketaminy-ksylazyny (50 mg / kg / mysz -5 mg / kg / mysz) i poddaj je eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Oczyść brzuszną powierzchnię myszy 70% alkoholem i chirurgicznie otwórz jamę otrzewnej, aby usunąć rozwinięte metatastu za pomocą nożyczek i kleszczy.
    4. Przenieść masy metacestodes na sterylną szalkę Petriego.
      UWAGA: Masy metacestody składają się z wielu torbieli wewnętrznych otoczonych tkanką łączną.
    5. Uwolnij torbiele z mas metacestody, ostrożnie usuwając tkankę łączną pokrywającą metatastle za pomocą kleszczy, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Ten krok zapewnia, że pasożyty są wolne od tkanki gospodarza.
    6. Otrzymane metacestody przemyć uzupełnionym PBS w temperaturze 4 °C (Rysunek 2G).
  3. Uprawa E. granulosus protoscoleces i metacestodes
    1. Przygotuj pożywkę hodowlaną w następujący sposób: Dodaj 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml gentamycyny, 4 mg/ml glukozy, 50 mM buforu Hepes o pH 7,5 i pożywkę 199, aby osiągnąć pożądaną objętość końcową i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.
    2. Przenieś 5 ml przygotowanej pożywki hodowlanej do każdej probówki Leightona (Rysunek 2H–I).
    3. Dodać pasożyty do pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 dni bez zmiany pożywki. Inkubuj probówki Leightona pod kątem 15°, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie materiału biologicznego na płaskiej powierzchni. Maksymalizuje to narażenie pasożytów na pożywkę hodowlaną, jednocześnie zapobiegając kontaktowi z gumowym korkiem.
      UWAGA: Dodaj 9 000–10 000 protoskopecji lub 50 metacestod (o średnicach od 5 mm do 15 mm rozmieszczonych jako 10 torbieli na probówkę).
    4. Opcjonalnie dodać 20 μM loperamidu (stężenie subletalne) rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku przez 16–24 godziny do pożywki do hodowli pasożytów, aby zwiększyć poziom cytozolowego wapnia i zwiększyć uwalnianie EV w stadium larwalnym E. granulosus.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zwiększa produkcję EV, leczenie pasożyta związkami wpływającymi na homeostazę wapnia zwiększy uwalnianie EV.

2. Oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

  1. Zebrać pożywkę do hodowli pasożytów z każdej probówki Leightona i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Pożywkę hodowlaną można przechowywać przez 24 godziny przed pierwszym odwirowaniem przy minimalnym wpływie na stężenie lub rozkład wielkości pęcherzyków. Protoskopety można trzykrotnie przemyć buforem PBS, zebrać i przechowywać w temperaturze -20 °C w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  2. Odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety.
    UWAGA: Ten krok usuwa martwe protoskopele. Po każdym etapie wirowania upewnij się, że co najmniej 0,5 cm supernatantu pozostało nad osadem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  3. Odwirować supernatant o stężeniu 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść go do nowych probówek o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
    UWAGA: Ten krok usuwa większe resztki komórek.
  4. Wirować przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia mniejszych resztek komórek.
  5. Przenieść supernatant do probówki odpowiedniej dla wirnika ultrawirówki za pomocą pipety. Zaznacz jedną stronę każdej probówki markerem przed umieszczeniem jej w wirniku ultrawirówki. Następnie umieść rurkę w wirniku zaznaczoną stroną do góry.
    UWAGA: Znak służy jako punkt odniesienia do lokalizacji osadu po ultrawirowaniu. Rurki muszą być wypełnione w trzech czwartych i dokładnie wyważone; dlatego w razie potrzeby dodaj PBS. Jeżeli objętość supernatantu przekracza pojemność pojedynczej probówki, należy podzielić próbki na wiele probówek i połączyć je podczas ponownego zawieszania.
  6. Wirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i szybko odlewać supernatant. Pozostawić probówkę do góry nogami przez 1 minutę. Na tym etapie osad może nie być widoczny.
    UWAGA: Współczynnik k dla zastosowanego wirnika wynosi 103.
  7. Przemyć osad co najmniej 3 ml PBS w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Zawiesić osad, pipetując wielokrotnie w górę i w dół od górnej strony probówki do dołu na wszystkich powierzchniach probówki, ale głównie po zaznaczonej stronie, po której spodziewana jest granulka.
    UWAGA: W stosownych przypadkach zawiesiny osadu otrzymanego z tego samego supernatantu należy umieścić w jednej probówce.
  8. Wirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i szybko odlewać supernatant. Pozostawić probówkę do góry nogami przez 1 minutę
    UWAGA: Współczynnik k dla zastosowanego wirnika wynosi 103.
  9. Zawiesić osad w 30 μl PBS zgodnie z procesem opisanym w kroku 2.7.
    UWAGA: W tym momencie zaleca się zmierzenie całkowitego stężenia białka w zawieszonym osadzie w celu oszacowania ilości wydzielanych sEV. Stężenie białka można oznaczyć, mierząc absorbancję przy 280 nm za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  10. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml. Zamrozić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Aby zachować integralność pęcherzyków do dalszych zastosowań, należy zamrozić zawieszony osad tak szybko, jak to możliwe i unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Charakterystyka izolowanych pęcherzyków

  1. Wyznaczanie wielkości EV za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    UWAGA: Dynamiczne rozpraszanie światła jest niezawodną i czułą metodą oceny wielkości (na podstawie promienia hydrodynamicznego, Rh) i kształtu nanocząstek w złożonych płynach, niezależnie od ich rodzaju. Pomiary potencjału DLS i zeta wykonano przy użyciu monochromatycznej wiązki laserowej He-Ne o długości fali 633 nm. Jeżeli analiza nie jest możliwa w dniu pobierania próbek, próbki można zamrozić we wstępnie przefiltrowanym buforze przed przechowywaniem.
    1. Rozmrozić próbki i przechowywać je na lodzie do czasu wykonania pomiarów.
      UWAGA: Zamrożenie próbek może mieć wpływ na rozkład cząstek i integralność sEV. Dlatego należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one prowadzić do spadku sygnału LS przy zmniejszonych wysokościach pików.
    2. Przefiltrować próbki wodne używane do DLS przez filtr o wielkości porów 0,2 μm.
      UWAGA: W eksperymentach LS konieczne jest filtrowanie wszystkich roztworów, i próbek wodnych w celu usunięcia dużych cząstek i pyłu, które mogą zakłócać pomiary.
    3. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10 do 1:50 we wstępnie przefiltrowanym PBS.
    4. Mieszaj próbki przez delikatne odwrócenie przed każdym pomiarem, aby zapobiec sedymentacji, ponieważ intensywność LS może się zmniejszyć z powodu dłuższego czasu przetwarzania próbki.
    5. Dodaj 1 ml próbki do czystej kuwety, umieszczając nieoszronioną stronę na ścieżce lasera po lewej stronie instrumentu. Zamknij pokrywę i odczekaj 2–3 minuty na wyrównanie przed pomiarem próbki.
    6. Zmierz rozmiar pod względem promienia hydrodynamicznego (Rh) przed wykonaniem pomiaru potencjału zeta. Rejestrować pomiary przy pojedynczym kącie rozproszenia (θ = 90° do 150°) w temperaturze 25 °C ± 1 °C.
    7. Kliknij Panel sterowania, aby sprawdzić odczyty i rozpocząć akwizycję danych.
      UWAGA: Na podstawie średnich wartości Rh i ocenianych rozkładów wielkości dla sEV należy zaobserwować pik między 30 nm a 200 nm (Rysunek 3). Piki poniżej 15 nm w Rh przypisuje się kwasom nukleinowym i białkom w zawiesinie. Zazwyczaj rozkłady wielkości są obliczane na podstawie średniego promienia hydrodynamicznego. Można jednak również podać średnią Z (średnia wielkość cząstek w próbce), wskaźnik polidyspersyjności (PDI, który określa niejednorodność wielkości próbki) oraz zależność kątową natężenia światła rozproszonego.
  2. Oznaczanie struktury i wielkości cząstek metodą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    UWAGA: Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową z ujemnym zabarwieniem, aby ocenić rozmiar, strukturę i czystość sEV, używając standardowego protokołu, który obejmuje utrwalanie, odwadnianie, zatapianie żywicy i kontrastowanie dla preparatów sEV z pełnym mocowaniem.
    1. Rozmrozić skoncentrowane próbki sEV z kroku 2.10 i przechowywać je na lodzie.
    2. Zamocuj sEV w probówkach o pojemności 1,5 ml. Ostrożnie nanieść 5–10 μl 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7) na ~5 μl osadu próbki sEV (wymagane stężenie sEV ≈ 1 x 108–1 x 109 mL-1) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: sEV mogą być przechowywane przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przed dalszym przetwarzaniem. Dlatego, jeśli do analizy TEM wymagane są zewnętrzne usługi techniczne, należy wysłać stałe próbki sEV schłodzone w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    3. Umieść 5 μl zawieszonych peletów na siatkach miedzianych EM o oczkach 300 z powłoką węglową Formvar. Przygotować dwie lub trzy siatki dla każdej próbki.
    4. Pozostawić próbkę do adsorpcji przez 20 minut w suchym środowisku i usunąć nadmiar próbki z siatki za pomocą bibuły filtracyjnej.
    5. Umieść 100 μl kropli PBS na arkuszu folii. Za pomocą czystych kleszczy przenieś siatki (zaadsorbowaną próbką do dołu) do kropli PBS w celu umycia.
    6. Osuszyć przeciwną stronę zaadsorbowanej próbki, upewniając się, że strona próbki kratek nie wyschnie podczas żadnego z poniższych etapów.
      UWAGA: We wszystkich kolejnych krokach umieść krople odczynników na płaskiej folii i przenieś siatki do kropli za pomocą kleszczy.
    7. Przenieś siatki do kropli 50 μl 1% aldehydu glutarowego na 5 minut.
    8. Umyj kratki 100 μl kropli wody destylowanej i odstaw na 3 minuty. Powtórz dziewięć razy, w sumie dziesięć prań.
    9. Porównaj siatki próbek z kroplą 50 μl 1% w/v roztworu octanu uranu o pH 7 przez 1 minutę.
    10. Skontrastuj i osadź siatki w mieszaninie 100 μl 4% octanu uranylu i 900 μl 2% metylocelulozy.
    11. Susz siatki na powietrzu przez 5–10 minut, gdy pozostają w pętli, i obserwuj je pod mikroskopem elektronowym pod napięciem 80–100 kV z rozdzielczością 0,2 nm i powiększeniem 100 000x.
    12. Kratki należy przechowywać w suchych pojemnikach do przechowywania w celu długotrwałego przechowywania.

4. Wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego

UWAGA: Ta procedura powinna być wykonywana na młodych myszach, które charakteryzują się solidnym układem krwiotwórczym z aktywnymi zdolnościami do proliferacji i różnicowania. W przeciwieństwie do tego, starsze myszy wykazują spadek funkcji krwiotwórczej, zmniejszone rezerwy komórek macierzystych, zmienione interakcje niszowe i bardziej rozwinięty rezerwuar pamięci, który ma kluczowe znaczenie dla długotrwałej odporności i odpowiedzi na patogeny lub zmiany związane z wiekiem, takie jak immunosenescencja.

  1. Poddaj eutanazji 5-8 tygodniową samicę myszy CF-1 zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi, minimalizując cierpienie zwierząt.
  2. Spryskaj mysz etanolem przed umieszczeniem jej w kapturze do hodowli tkankowych.
    UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać w sterylnych warunkach.
  3. Umieść mysz na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych wykonaj pionowe nacięcie w kształcie litery "T" nad cewką moczową i rozciągnij je poziomo do górnej części kończyn dolnych, uważając, aby nie złamać otrzewnej ani nie przebić żadnych narządów, zwłaszcza jelita.
  4. Oddziel skórę wzdłuż obu tylnych kończyn, aby odsłonić kości nóg i tkanki za pomocą kleszczy. Rękami usuń skórę każdej nogi, popychając ją od kostki w kierunku brzucha, ciągnąc skórę na przeciwną stronę. Obie nogi będą wtedy wolne od skóry.
    UWAGA: Wyrzuć ciało myszy do worka na pozostałości patogenów.
  5. Za pomocą nożyczek i kleszczy ostrożnie usuń kość udową i piszczelową, unikając złamania. Przymocuj czubek każdej kości za pomocą kleszczy i przetnij ścięgna, aby usunąć powięź mięśniową wokół kości. Całkowite oczyszczenie tkanki mięśniowej za pomocą papierowych serwetek.
  6. Po usunięciu każdej kości umieść ją w sterylnej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 2 ml kompletnego podłoża przygotowanego z pożywką RPMI uzupełnioną 5% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 10 μg/ml gentamycyny w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, a następnie dwukrotnie umyć kości 70% etanolem przez 5 minut.
  7. Przenieś kości na sterylną szalkę Petriego.
  8. Odetnij dwie nasady kości za pomocą ostrych nożyczek preparujących, aby uzyskać dostęp do komórek szpiku kostnego.
  9. Ostrożnie przepłukać komórki szpiku kostnego z każdej z czterech kości na sterylną szalkę Petriego za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 20 ml zawierającej kompletne podłoże. Kości staną się bardziej przezroczyste w miarę ekstrakcji szpiku kostnego.
    UWAGA: Objętość 20 ml kompletnej pożywki powinna być wystarczająca do wymycia komórek szpiku kostnego z dwóch kości udowych i piszczelowych.
  10. Delikatnie homogenizować pożywkę z eluowanym szpikiem przez pipetowanie w celu usunięcia tkanki łącznej kości i grudek komórek. Następnie przenieś próbkę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przepuszczając komórki przez sterylne sitko do komórek polipropylenowych o wielkości 70 μm w celu usunięcia resztek tkanki łącznej i kości.
  11. Odwirować komórki przy 450 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad pozostaje przyklejony do ścianki probówki.
  12. Inkubować komórki przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie ponownie zawiesić je w 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC). Zneutralizować bufor do lizy, dodając 3 ml kompletnej pożywki.
  13. Odwirować komórki w temperaturze 450 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml kompletnej pożywki.
  14. Przepuść zawiesinę komórkową przez sterylne sitko do komórek polipropylenowych o wielkości 70 μm do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia agregatów komórkowych z lizowanych erytrocytów.
  15. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  16. Dodać 300 ng/ml rekombinowanego mysiego liganda 3 kinazy tyrozynowej związanej z Fms (Flt3L) do pożywki hodowlanej.
  17. Umieść komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml na płytce wielodołkowej.
  18. Inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2,
    UWAGA: Unikaj potrząsania komórkami podczas różnicowania i wzrostu, aby zapobiec spontanicznemu dojrzewaniu.
  19. W dniu 3 usuń 1 ml pożywki z każdej studzienki (unikając zakłócenia komórek) i zastąp ją 1 ml wstępnie podgrzanej, świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej 150 ng / ml rekombinowanego mysiego Flt3L.

5. Interakcja między komórkami dendrytycznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego a pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi E. granulosus

  1. Barwienie błony pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
    1. Rozmrozić sEV zapisane w kroku 2.10 i przechowywać je na lodzie.
    2. Zawiesić 10 μl oczyszczonych sEV w 10 μl nośnika do etykietowania (rozcieńczalnik C).
    3. Dodać 20 μl 2x roztworu barwnika PKH26, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μM. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety i inkubować przez 35 minut w temperaturze 37°C w ciemności.
      UWAGA: 2x roztwór barwnika PKH26 (4 μM) należy przygotować bezpośrednio przed barwieniem poprzez dodanie 0,5 μl roztworu barwnika etanolowego PKH26 do 125 μl rozcieńczalnika C.
    4. Podczas inkubacji delikatnie mieszać co 3–5 minut, aby zapewnić jednorodne barwienie.
    5. Dodać 40 μl BSA 1% i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać proces barwienia.
    6. Przemyć sEV 1 ml PBS i odwirować w temperaturze 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, aby usunąć nadmiar barwnika.
      UWAGA: Współczynnik k dla wirnika wynosi 103.
    7. Zawiesić osad w 90 μl PBS zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.7.
  2. Stymulacja mysich komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych E. granulosus
    1. Pobrać komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC) z płytki hodowlanej i przenieść je do probówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Obchodź się ostrożnie, aby uniknąć spontanicznego dojrzewania komórek.
    2. Odwirować pożywkę o sile 450 x g przez 5 minut, aby ogrywać komórki.
      UWAGA: Supernatanty z wirowania należy zarezerwować w celu ponownego nawarstwienia komórek w kolejnych etapach analizy cytometrii przepływowej.
    3. Zawiesić BMDC w 30 μl niebarwionych sEV z kroku 2.10 w przypadku analizy metodą cytometrii przepływowej lub w 90 μl barwionych sEV zawierających PBS z kroku 5.1.7 w przypadku mikroskopii konfokalnej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 . Delikatnie mieszać próbkę co 10 minut.
      UWAGA: Aby zapewnić skuteczny kontakt między BMDC i sEV, pierwsze 30 minut inkubacji należy wykonać w minimalnej objętości przy użyciu probówek o pojemności 1,5 ml.
    4. W przypadku mikroskopii konfokalnej przenieś komórki na szkiełko nakrywkowe ze szkła Alcian (średnica 12 mm) umieszczonego na 24-dołkowej płytce. Inkubować przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze o stężeniu 5 % CO2,
      UWAGA: Zabieg Alcian-blue nadaje dodatni ładunek szkiełku nakrywkowemu, ułatwiając przyleganie ujemnie naładowanych błon plazmatycznych BMDC.
      1. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe, zanurz je w przefiltrowanym barwniku 1% Alcian blue 8 GX i podgrzej w kuchence mikrofalowej przez 1–2 minuty bez gotowania. Inkubuj je w gorącym roztworze przez 10 minut, mieszając co 2 do 3 minut.
      2. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe dejonizowaną wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar błękitu alcijskiego i wysusz je na ręcznikach papierowych. Na koniec należy autoklawować szkiełka nakrywkowe i przechowywać je w sterylnych warunkach do czasu użycia.
    5. Do celów analizy metodą cytometrii przepływowej przenieść BMDCs-sEV z powrotem do tej samej studzienki, z której zostały zebrane (patrz etap 5.2.1), dodać zarezerwowane supernatanty z kroku 5.2.2 i inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2,
      UWAGA: Pozostaw około 500 μl pożywki w studzience, aby zapobiec wysuszeniu pozostałych komórek po pobraniu.
    6. Stosować kontrole dodatnie i ujemne do oceny dojrzewania BMDC. Stymuluj komórki 100 ng/ml lipopolisacharydu (LPS) przez 18 godzin jako kontrolę pozytywną. W celu ujemnej kontroli endocytozy należy inkubować BMDC z sEV w temperaturze 4 °C. Uwzględnij również niestymulowaną kontrolę komórek dendrytycznych.
  3. Mikroskopia konfokalna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych E. granulosus wychwyconych i zinternalizowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego.
    1. Po zakończeniu okresu inkubacji opisanego w kroku 5.2.4 należy odessać PBS i wyrzucić go ze szkiełka nakrywkowego.
    2. Utrwalić BMDC, dodając 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Upewnij się, że objętość utrzymuje napięcie powierzchniowe na szkiełku nakrywkowym.
    3. Odessać i wyrzucić PFA, a następnie trzykrotnie umyć szkiełko nakrywkowe PBS-BSA 2%.
    4. Dodać 100 μl PBS zawierającego przeciwciało anty-MHC klasy II-FITC rozcieńczone w stosunku 1:100 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Odessać i wyrzucić roztwór przeciwciała, a następnie trzykrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe PBS-BSA 2%.
    6. Dodać 100 μl 50 ng/ml DAPI i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w mokrej komorze w celu przeciwdziałania barwieniu jąder.
    7. Odessać i wyrzucić roztwór barwnika, a następnie trzykrotnie przemyć szkiełko nakrywkowe PBS-BSA 2 %.
    8. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą zakrzywionych szczypiec punktowych i osusz je na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu.
    9. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym skierowanym w dół za pomocą podłoża montażowego składającego się z alkoholu poliwinylowego i glicerolu. Pozostawić do wyschnięcia na 2 godziny w temperaturze 37 °C lub na noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
    10. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe kleszkami.
    11. Obserwuj zamontowane próbki pod mikroskopem konfokalnym za pomocą 60-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju o długości fali wzbudzenia/emisji 485/538 nm dla FITC, 358/461 nm dla DAPPI i 551/567 nm dla PKH26.
  4. Ocena fenotypowa komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego stymulowanych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Po okresie inkubacji opisanym w kroku 5.2.5 należy zebrać BMDC, kilkakrotnie przepłukując pożywkę pipetą w górę i w dół.
    2. Zebrać BMDC zawierające podłoże i umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    3. Wirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
      UWAGA: Opcjonalnie, aby przeanalizować wydzielanie cytokin, usuń supernatanty za pomocą pipety, przenieś je do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do dalszych testów immunoenzymatycznych (ELISA).
    4. Zawiesić BMDC w 100 μl PBS zawierającego izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), allofikocyjaninę (APC) lub mAb sprzężone z fikoerytryną skierowane do CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC klasy I i MHC klasy II i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    5. Przemyć BMDC PBS i odwirować w temperaturze 450 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zawiesić BMDC w 500 μl 1% PFA w celu ich utrwalenia i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu nabycia w cytometrze przepływowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat blokowy podsumowujący główne kroki do utrzymania czystych kultur w stadium larwalnym E. granulosus, izolację i charakterystykę sEV oraz ich absorpcję przez mysie komórki dendrytyczne są pokazane w Rysunek 1. Aby osiągnąć wysoką produkcję sEV z protoskopecji i metatastu E. granulosus, zastosowano metodę hodowli in vitro wcześniej opracowaną w laboratorium, aby zmaksymalizować przeżywalność i homeostazę metaboliczną badanego pasożyta (Ryc....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg pracy protokołu dla hodowli pasożytów, izolowania sEV pochodzących od pasożytów, różnicowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego i analizy wychwytu sEV przez te komórki przedstawiono na rycinie 1. Celem było szczegółowe opisanie każdej sekcji protokołu, która może być realizowana w całości lub oddzielnie, ze szczególnym uwzględnieniem głównych kwestii gwarantujących wdrożenie metodyki. Analiza populacji EV uzyskanych z kompletnych organizmów pasożytniczych ma konkretny wpływ ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy uznają Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentyna) i Lic. Leonardo Sechi i Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentyna) za pomoc techniczną w zakresie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i dynamicznego rozpraszania światła. Dziękujemy również firmie Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón i dr Gonzalo Caló za zastosowanie ultrawirówki w INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentyna. Autorzy z wdzięcznością dziękują Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentyna) i Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentyna) za współpracę w ocenie dobrostanu myszy oraz Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez i Med. Vet L. Netti za ich wkład w uzyskanie materiału pasożytniczego. Prace te, w tym koszty eksperymentów, odczynników i sprzętu, zostały wsparte przez PICT 2020 nr 1651 finansowany przez ANPCyT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 1,5 mlHensoN14059
Płytka 24-dołkowa JetBiofilCAP011024Polistyren, płaskie dno, sterylna
płytka 6-dołkowa   Henso Medical Co., Sp. z o.o.N14221Płaskie dno, materiał PS, sterylne
sitko do komórek polipropylenowych 70 mmBiologix Group Limited15-1070Sterylny
barwnik Alcian blue 8 GX Santa Cruzsc-214517B
Automatyczny inkubator CO2NuarireUN-5100E/G DH
Albumina surowicy bydlęcejLaboratorium Wienera1443151
Przeciwciało monoklonalne CD11c-PECy5    100 &mikro; geBioscience15-0114-82klon (N418)
CD40 Przeciwciało monoklonalne-FITC 100 i mikro; geBioscience11-0402-82klon (HM40-3)
CD80 Przeciwciało monoklonalne-APC 100 i mikro; geBioscience17-0801-82klon (16-10A-1)
CD86 Przeciwciało monoklonalne-FITC  100 &mikro; geBioscience11-0862-82klon (GL-1)
WirówkaThermo ScientificIEC CL31R Wielobiegowy
mikroskop konfokalnyNikonNikon Mikroskop konfokalny C1
Rurki stożkowe 15 ml o średnicy 17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimetylosulfotlenek Anedra6646
Surowica bydlęca płodowa 500 mlSigma-Aldrich   
System cytometrii przepływowejBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Komórka kapilarna Zeta składana Malvern PanalyticalDTS1070
Sól siarczanu gentamycynySigmaG1264
Roztwór aldehydu glutarowegoFluka49630
HepesGibco11344041
Igła podskórna  21 G x 1"25/8WeigaoSterylna
igła podskórna  25 G x 5/8"Weigaosterylny
Mikroskop odwrócony Fluo diod LED LeicaDMIL 
KetaminaHolliday
Lipopolisacharyd  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS z bakterii Gram-ujemnych E. coli K12 . TLR2/4 Agoniści
Chlorowodorek loperamiduSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Błękit metylenowyAnedra6337
MHC klasy I (H2kb) Przeciwciało monoklonalne-PE 100 i mikro; geBioscience12-5958-82klon (AF6-88.5.5.3)
MHC klasa II (IA/IE) Przeciwciało monoklonalne-FITC  100 &mikro; geBioscience11-5321-82klon (M5/114.15.2)
MikroskopOlympusCX31
Mysz rekombinowana mysia Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydAgar ScientificR1018
Sól sodowa penicyliny GSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Jednozasadowyzegardo buforowania fosforanów Bufor do lizy soli fizjologicznej (PBS)
RBC 100 mlRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Kakodylan sodu   Sigma-AldrichC0250
Chlorek soduAnedra7647-14-5Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny) rocznieBiopack1639.07Do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
Sól siarczanu streptomycynySigmaS9137
10 mlBremaSterylne
grubościenne rurki poliwęglanoweBeckman Coulter13 x 55 mm, pojemność nominalna 4 mL
Transmisyjny mikroskop elektronowyJeolJEOL JSM 100CX II
UltrawirówkaBeckmanOptima LE-80k Wirnik 90 Ti
KsylazynaRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600Do wykonywania dynamicznych pomiarów rozpraszania światła i potencjału zeta
12352207 fosforanu potasu Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wen, H., et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-e00118 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167-184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. M. Helminth extracellular vesicles: Interactions with the host immune system. Mol Immunol. 137, 124-133 (2021).
  4. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  5. Cresswell, P. Antigen processing and presentation. Immunol Rev. 207, 5-7 (2005).
  6. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nat Rev Immunol. 23 (4), 236-250 (2023).
  7. Bennett, A. P. S., de la Torre-Escudero, E., Oliver, N. A. M., Huson, K. M., Robinson, M. W. The cellular and molecular origins of extracellular vesicles released by the helminth pathogen Fasciola hepatica. Int J Parasitol. 50 (9), 671-683 (2020).
  8. Drurey, C., Coakley, G., Maizels, R. M. Extracellular vesicles: new targets for vaccines against helminth parasites. Int J Parasitol. 50 (9), 623-633 (2020).
  9. Nicolao, M. C., et al. Characterization of protein cargo of Echinococcus granulosus extracellular vesicles in drug response and its influence on immune response. Parasit Vectors. 16 (1), 255(2023).
  10. Sánchez-López, C. M., Trelis, M., Bernal, D., Marcilla, A. Overview of the interaction of helminth extracellular vesicles with the host and their potential functions and biological applications. Mol Immunol. 134, 228-235 (2021).
  11. Nicolao, M. C., Rodriguez, R. C., Cumino, A. C. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 13 (1), e0007032(2019).
  12. Kuipers, M. E., et al. DC-SIGN mediated internalisation of glycosylated extracellular vesicles from Schistosoma mansoni increases activation of monocyte-derived dendritic cells. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1753420(2020).
  13. Murphy, A., et al. Fasciola hepatica extracellular vesicles isolated from excretory-secretory products using a gravity flow method modulate dendritic cell phenotype and activity. PLoS Negl Trop Dis. 14 (9), e0008626(2020).
  14. Ricciardi, A., et al. Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway. PLoS Negl Trop Dis. 15 (1), e0008884(2021).
  15. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  16. Brezgin, S., et al. Basic guide for approaching drug delivery with extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 25 (19), 10401(2024).
  17. Pinheiro, A. A., et al. Potential of extracellular vesicles in the pathogenesis, diagnosis, and therapy for parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 13 (8), e12496(2024).
  18. Barnadas-Carceller, B., Del Portillo, H. A., Fernandez-Becerra, C. Extracellular vesicles as biomarkers in parasitic disease diagnosis. Curr Top Membr. 94, 187-223 (2024).
  19. Nicolao, M. C., Denegri, G. M., Carcamo, J. G., Cumino, A. C. P-glycoprotein expression and pharmacological modulation in larval stages of Echinococcus granulosus. Parasitol Int. 63 (1), 1-8 (2014).
  20. Nicolao, M. C., Cumino, A. C. Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages. Acta Trop. 146, 141-151 (2015).
  21. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem. 278 (22), 20083-20090 (2003).
  22. Ambattu, L. A., et al. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism. Commun Biol. 3 (1), 553(2020).
  23. White, R., et al. Special considerations for studies of extracellular vesicles from parasitic helminths: A community-led roadmap to increase rigour and reproducibility. J Extracell Vesicles. 12 (1), e12298(2023).
  24. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Hernandez, S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 degrees C and +37 degrees C. Z Parasitenkd. 72 (2), 273-278 (1986).
  25. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Jiménez, A., Criado, A., de Armas, C. In vitro effects of levamisole and ivermectin against Echinococcus granulosus protoscoleces. Int J Parasitol. 19 (8), 945-947 (1989).
  26. Al-Lamki, R. S., Bradley, J. R., Pober, J. S. Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology. Front Med. 4, 148(2017).
  27. Rodriguez-Caabeiro, F., Casado, N. Evidence of in vitro germinal layer development in Echinococcus granulosus cysts. Parasitol Res. 74 (6), 558-562 (1988).
  28. Loos, J. A., Cumino, A. C. In vitro anti-echinococcal and metabolic effects of metformin involve activation of AMP-activated protein kinase in larval stages of Echinococcus granulosus. PLoS One. 10 (5), e0126009(2015).
  29. Erwin, N., Serafim, M. F., He, M. Enhancing the cellular production of extracellular vesicles for developing therapeutic applications. Phar. Res. 40 (4), 833-853 (2023).
  30. Sako, Y., et al. Identification of a novel small molecule that enhances the release of extracellular vesicles with immunostimulatory potency via induction of calcium influx. ACS Chem Biol. 18 (4), 982-993 (2023).
  31. He, L. P., Mears, D., Atwater, I., Rojas, E., Cleemann, L. Loperamide mobilizes intracellular Ca2+ stores in insulin-secreting HIT-T15 cells. Br J Pharmacol. 139 (2), 351-361 (2003).
  32. Dalton, J. P., Skelly, P., Halton, D. W. Role of the tegument and gut in nutrient uptake by parasitic platyhelminths. Can J Zool. 82 (2), 211-232 (2004).
  33. Dos Santos, G. B., et al. Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite. Int J Parasitol. 46 (13-14), 843-856 (2016).
  34. Siles-Lucas, M., et al. Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts. Vet Parasitol. 236, 22-22 (2017).
  35. Yang, J., et al. Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of 110 K EVs on sheep PBMCs. Front Immunol. 12, 602717(2021).
  36. Khosravi, M., et al. Characterisation of extracellular vesicles isolated from hydatid cyst fluid and evaluation of immunomodulatory effects on human monocytes. J Cell Mol Med. 27 (17), 2614-2625 (2023).
  37. Sotillo, J., et al. The protein and microRNA cargo of extracellular vesicles from parasitic helminths–current status and research priorities. Int J Parasitol. 50 (9), 635-645 (2020).
  38. Kuipers, M. E., et al. Optimized protocol for the isolation of extracellular vesicles from the parasitic worm Schistosoma mansoni with improved purity, concentration, and yield. J Immunol Res. 2022 (1), 5473763(2022).
  39. Fernandez-Becerra, C., et al. Guidelines for the purification and characterization of extracellular vesicles of parasites. J Extracell Biol. 2 (10), e117(2023).
  40. Chaiyadet, S., et al. Silencing of Opisthorchis viverrini tetraspanin gene expression results in reduced secretion of extracellular vesicles. Front Cell Infect Microbiol. 12, 827521(2022).
  41. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  42. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. Int J Mol Sci. 18 (6), 1153(2017).
  43. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7 (17), 7055-7066 (2015).
  44. Vucetic, A., Filho, A., Dong, G., Olivier, M. Isolation of extracellular vesicles from Leishmania spp. Methods Mol Biol. , 555-574 (2020).
  45. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: Addressing some analytical challenges in the submicron size range. J Colloid Interface Sci. 588, 401-417 (2021).
  46. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  47. Trombetta, E. S., Mellman, I. The cell biological basis of antigen presentation in vitro and in vivo. Ann Rev Immunol. 23 (1), 975-1028 (2005).
  48. Hammer, G. E., Ma, A. Molecular control of state dendritic cell maturation and immuno homeostasis. Ann Rev Immunol. 31 (1), 743-791 (2013).
  49. Weigel, B. J., et al. Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood. 100 (12), 4169-4176 (2002).
  50. March, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60, 3239-3246 (2000).
  51. Heath, W. R., et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol Rev. 199 (1), 9-26 (2004).
  52. Naik, S., et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8− dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 174 (11), 6592-6597 (2005).
  53. Sauter, M., et al. Protocol to isolate and analyze mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDC). STAR Protoc. 3 (3), 101664(2022).
  54. Helft, J., et al. GM-CSF mouse bone marrow cultures comprise a heterogeneous population of CD11c(+) MHCII(+) macrophages and dendritic cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  55. Borup, A., et al. Comparison of separation methods for immunomodulatory extracellular vesicles from helminths. J Extracell Biol. 1 (5), e41(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja p cherzyk w zewn trzkom rkowychultrawirowaniekom rki szpiku kostnegocytometria przep ywowamikroskopia konfokalnadynamiczne rozpraszanie wiat aprezentacja antygenu

Powiązane artykuły