Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i identyfikacja mikrojąder z ludzkich limfocytów krwi obwodowej

DOI:

10.3791/67564

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 2Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę ekstrakcji i oczyszczania mikrojąder z ludzkich limfocytów za pomocą wirowania w gradicynacji gęstości sacharozy. Stanowi ona eksperymentalną podstawę do badania składu i funkcji mikrojąder.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrojądro (MN) to nieprawidłowa struktura jądrowa, która tworzy się w komórkach, szczególnie w szpiku kostnym lub komórkach krwi, gdy są wystawione na zewnętrzne uszkodzenia, takie jak promieniowanie, z powodu nierozwiązanych uszkodzeń DNA lub błędów mitotycznych. Po utworzeniu MN mogą aktywnie przyczyniać się do różnych procesów rakotwórczych, w tym sygnalizacji zapalnej i chromosomalnych rearanżacji genetycznych. MN zawierają jądrowe DNA, histony, fragmenty nukleoprotein i inne aktywne białka, które są ściśle związane z ich funkcjami. Badanie powstawania i składników MN ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w napędzaniu procesów rakotwórczych. Ekstrakcja i oczyszczanie MN mają zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia tych celów badawczych. Jednak niestabilność błony jądrowej MN i jej podatność na pękanie sprawiają, że procesy te są technicznie trudne. Obecnie tylko kilka badań wykazało zastosowanie wirowania w gradionym gradimencie gęstości do separacji MN. Niniejsze badanie podsumowuje i upraszcza procesy separacji i oczyszczania MN. Ludzkie limfocyty krwi obwodowej wystawione na promieniowanie wyizolowano, a MN oddzielono i oczyszczono za pomocą sacharozy o różnych stężeniach w dwuetapowym procesie. Integralność i czystość MN zostały zweryfikowane, zapewniając jasną i praktyczną demonstrację procedury eksperymentalnej dla badaczy badających przyczyny i funkcje MN.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrojądro (MN) to subkomórkowa struktura w cytoplazmie, która zawiera jądrowe DNA, histony i fragmenty nukleoprotein, otoczone strukturami błonowymi1,2. MN jest całkowicie oddzielony od głównego jądra i zazwyczaj pojawia się w jego pobliżu w owalnym lub okrągłym kształcie, o rozmiarze od 1/16 do 1/3 średnicy głównego jądra. Powstawanie MN jest przede wszystkim związane z acentrycznymi fragmentami chromosomów, błędną segregacją chromosomów, dicentrycznym pękaniem chromosomów, niestabilnością chromosomów i agregacją podwójnych minut (DBs)3. MN rzadko występują w zdrowych komórkach i są głównie spowodowane ekspozycją na egzogenne genotoksyny, które prowadzą do uszkodzenia DNA lub błędów mitotycznych4,5. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są znaczącym czynnikiem przyczyniającym się do powstawania MN, a narażenie ludzi na promieniowanie jonizujące (IR) wzrosło wraz z postępem w zastosowaniach klinicznych i technologicznych6,7. Ekspozycja na podczerwień indukuje pęknięcia jednoniciowe (SSB) i dwuniciowe (DSB) w DNA komórkowym, co może skutkować śmiercią komórki lub apoptozą8,9,10. MN to fragmenty chromosomów, całe chromosomy lub chromatydy powstałe w wyniku nienaprawionej lub niedopasowanej naprawy DSB. Służą one jako krytyczne wskaźniki stopnia uszkodzeń spowodowanych przez IR7,11,12. Kompleksowe zrozumienie składników zawartych w MN jest niezbędne do złagodzenia skutków ubocznych radioterapii i zminimalizowania narażenia społeczeństwa na niepożądane promieniowanie6,13. Jednak białka i kwasy nukleinowe zawarte w MN pozostają do tej pory niew pełni scharakteryzowane.

MN są uważane za wynik indukcji różnego rodzaju uszkodzeń DNA. Ich mechanizmy replikacji i zdolności naprawcze DNA są upośledzone, co prowadzi do rozległych uszkodzeń DNA w krótkim czasie3,14,15. MN są również ważnymi wskaźnikami niestabilności chromosomowej, która jest stale obecna w komórkach przedrakowych3,14,16,17,18,19. MN od dawna są używane jako biomarkery genotoksyczności, ryzyka nowotworu i stopnia nowotworu3,20,21. Po utworzeniu, MN mogą aktywnie napędzać liczne procesy rakotwórcze, w tym sygnalizację zapalną22,23i chromosomalne genetyczne przegrupowanie24,25,26. Na przykład MN inicjują kaskadę zapalną, rekrutując cykliczną syntazę GMP-AMP (cGAS) receptora rozpoznawania wzorców wirusowych (PRR) z cytoplazmy4,22,23,27. Inne białka, które mogą być obecne w MN, to egzonukleazy28, mechanizmy transkrypcyjne4 i kofaktory translacyjne. Nie jest jasne, czy MN składają unikalny, stronniczy profil białkowy z biblioteki białek cytoplazmatycznych, czy też biernie pozyskują białka o wysokiej obfitości z jądra i cytoplazmy podczas ich powstawania. Poza pojedynczymi białkami, takimi jak cGAS, zakres, w jakim określone środowiska wpływają na ogólny skład MN, nie jest jeszcze określony. Wiedza na temat całego krajobrazu mikrojąder jest ograniczona, ponieważ nie ma publicznie dostępnych zestawów danych do eksploracji. Dlatego pilnie potrzebna jest ekstrakcja kompletnych i oczyszczonych MN w celu dogłębnej i kompleksowej analizy ich składników.

Jednym z powodów opóźnionej replikacji DNA w MN może być stres replikacyjny spowodowany brakiem enzymów i kofaktorów wymaganych do syntezy i naprawy DNA. Niedobór ten może wynikać z wadliwego montażu otoczki jądrowej MN, co prowadzi do braku jądrowego kompleksu porowego20. W związku z tym MN nie są w stanie importować kluczowych białek niezbędnych do utrzymania integralności błony jądrowej i stabilności genomu2,29,30,31. Niekompletna błona jądrowa MN jest podatna na pękanie, co sprawia, że ekstrakcja MN jest bardzo trudna.

Obecnie, MN są głównie ekstrahowane za pomocą wirowania w gradionym gradimencie gęstości sacharozy27,32,33i oczyszczane za pomocą cytometrii przepływowej34. W niniejszej pracy podsumowano i uproszczono proces separacji i oczyszczania MN. Limfocyty krwi obwodowej od ludzi narażonych na promieniowanie wyizolowano, a MN oczyszczono dwukrotnie przy użyciu sacharozy o różnych stężeniach. Integralność i czystość MN zostały zweryfikowane, zapewniając naukowcom praktyczną i intuicyjną demonstrację eksperymentalną do badania przyczyn i funkcji MN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z udziałem próbek ludzkiej krwi obwodowej zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Przemysłu Jądrowego 416 w Chinach (Przegląd 2020 [nr 48]), a wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały osoby z poważnymi chorobami przewlekłymi, takimi jak nowotwory, dna moczanowa lub choroby krwi, a także osoby narażone na działanie substancji radioaktywnych lub genotoksycznych w swoim zawodzie. W tym badaniu pobrano 10 ml krwi obwodowej od zdrowego 28-letniego mężczyzny do probówki do pobierania krwi zawierającej heparynę sodową jako antykoagulant. Próbkę napromieniowano in vitro 60promieniami γ Co w temperaturze 37 °C przy użyciu urządzenia do pomiaru energii kinetycznej gamma powietrze. Dawkę napromieniania ustalono na 4,0 Gy, przy natężeniu dawki 0,6350 Gy/min. Po napromieniowaniu próbkę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, inokulowano do pożywki RPMI-1640 i hodowano w temperaturze 37 °C przez 60 godzin. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mikrojądra i jądra

  1. Dodać cytochalazynę B do pożywki z krwinkami obwodowymi, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 μg/ml. Inkubować mieszaninę przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Cytochalazyna B jest inhibitorem polimeryzacji aktyny, który ułatwia skuteczne oddzielanie mikrojąder od jądra przed lizą komórki35.
  2. Odwirować krwinki w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Zawiesić komórki krwi w 10 ml 0,01 M PBS wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C.

2. Izolacja limfocytów

  1. Dodać 15 ml roztworu do separacji limfocytów ludzkich do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż zawieszone krwinki obwodowe na wierzchu roztworu rozdzielającego.
  2. Odwirować probówkę o sile 400 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po odwirowaniu komórki krwi w probówce rozdzielą się na cztery odrębne warstwy od góry do dołu: pierwsza warstwa to warstwa osocza (płytki krwi), druga warstwa to pierścieniowa mlecznobiała warstwa limfocytów, trzecia warstwa to przezroczysta warstwa płynu separacyjnego, a czwarta warstwa to warstwa czerwonych krwinek.
  3. Ostrożnie przenieś drugą warstwę (limfocyty) do oddzielnej probówki wirówkowej. Dodać PBS (0,01 M) w ilości trzykrotnej objętości przenoszonych komórek, dobrze wymieszać i odwirować przy 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.

3. Liza limfocytów

  1. Umieść osad komórkowy zebrany w stożkowej probówce na lodzie.
  2. Dodać 6 ml zimnego buforu do lizy (Tabela 1, Plik Uzupełniający 1) i ponownie zawiesić osad komórek w buforze do lizy.
    UWAGA: Bufor do lizy należy uzupełnić składnikami wymienionymi w Tabeli 2, Plik Uzupełniający 1, bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przenieść lizat komórkowy do szklanego homogenizatora.
  4. Delikatnie użyj luźnego mielenia, aby ręcznie homogenizować próbkę, przesuwając homogenizator w górę iw dół 10 razy.
  5. Przenieść homogenizowany lizat komórkowy z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać delikatnie i utrzymywać próbkę na lodzie.

4. Początkowa izolacja MN za pomocą gradientu gęstości sacharozy

  1. Zmieszać 5 ml lizatu komórkowego z równą objętością 1,8 M buforu sacharozy (Tabela 3, Plik Uzupełniający 1), aby uzyskać stosunek lizatu do buforu sacharozy 1:1.
    UWAGA: Bufor sacharozy o pojemności 1,8 M należy uzupełnić składnikami wymienionymi w Tabeli 4, Plik Uzupełniający 1, bezpośrednio przed użyciem.
  2. Przygotować gradient gęstości sacharozy: Dodać 15 ml 1,6 M buforu sacharozy (Tabela 5, Plik Uzupełniający 1) na dno stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powoli dodawać 20 ml 1,8 M buforu sacharozy (Tabela 3, Plik Uzupełniający 1) na wierzch 1,6 M buforu sacharozy.
    UWAGA: Zarówno 1,6 M bufor sacharozy, jak i 1,8 M bufor sacharozy powinny być uzupełnione odpowiednio o składniki wymienione w Tabeli 4, Plik Uzupełniający 1, bezpośrednio przed użyciem. Aby dodać sacharozy, przyłóż końcówkę pipety do górnej wewnętrznej strony stożkowej probówki i powoli pipetuj roztwór.
  3. Powoli odpipetować 10 ml mieszaniny [Lizat 1:1 1,8 M bufor sacharozy] na wierzch dwuwarstwowego gradientu gęstości sacharozy.
    UWAGA: Dodaj warstwy powoli, aby upewnić się, że środkowa warstwa buforowa 1,8 M nie miesza się z dolną warstwą buforową 1,6 M, a górna mieszanina 1:1 komórek lizowanych i buforu sacharozy 1,8 M nie miesza się z warstwą buforową 1,8 M.
  4. Odwirować probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem o stężeniu 1000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po odwirowaniu ciecz rozdzieli się na trzy warstwy: górna warstwa zawiera około 3 ml szczątków komórkowych, środkowa warstwa zawiera około 3 ml mikrojąder (MN), dolna warstwa zawiera około 39 ml jąder.
  5. Usunąć górne 3 ml cieczy w pobliżu powierzchni i zebrać 3 ml nieoczyszczonych mikrojąder ze środkowej warstwy dla drugiego gradientu gęstości sacharozy.

5. Wtórne oczyszczanie MN za pomocą gradientu gęstości sacharozy

  1. Przygotuj gradient gęstości sacharozy:
    1. Dodać 3 ml 1,8 M buforu sacharozy (Tabela 3, Plik Uzupełniający 1) na dno stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Dodać 3 ml 1,5 M buforu sacharozy (Tabela 6, plik uzupełniający 1) na wierzch 1,8 M buforu sacharozy.
    3. Na koniec dodać 3 ml 1,4 M buforu sacharozy (Tabela 7, plik uzupełniający 1) na wierzch 1,5 M buforu sacharozy.
      UWAGA: Przyłóż końcówkę pipety do górnej wewnętrznej strony stożkowej rurki i powoli pipetuj roztwór.
  2. Powoli odpipetować 3 ml środkowej warstwy z drugiego gradientu gęstości sacharozy na wierzch trójwarstwowego gradientu gęstości sacharozy.
    UWAGA: Dodawaj warstwy powoli, aby uniknąć mieszania.
  3. Odwirować probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem przy 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po odwirowaniu górna warstwa będzie zawierała 1-4 ml oczyszczonych mikrojąder (MN), a dolna warstwa będzie zawierała głównie 8 ml jąder.
  4. Zachowaj górne 1-4 ml oczyszczonych mikrojąder do późniejszego wykorzystania.

6. Identyfikacja MN

  1. Pobrać nieoczyszczony roztwór mikrojądrowy (otrzymany w kroku 4) i oczyszczony roztwór mikrojądrowy (otrzymany w kroku 5) i przygotować rozmazy komórkowe na szkiełku.
  2. Dodać 4% roztwór paraformaldehydu, aby utrwalić próbkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.
  3. Umyj szkiełka PBS (0,01 M) dwukrotnie, po 3 minuty na pranie.
  4. Dodaj 0,1% Triton X-100, aby przepuszczalność komórek w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Zablokuj komórki w 5% BSA przy RT na 30 min.
  6. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko anty-γ-H2AX (rozcieńczone w 5% BSA, 1:200) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  7. Umyj szkiełka PBS (0,01 M) dwukrotnie, po 5 minut na mycie.
  8. Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczone w 5% BSA, 1:500) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
  9. Dodać roztwór barwnika DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  10. Umyj szkiełka PBS (0,01 M) dwukrotnie, po 3 minuty na pranie.
  11. Nałóż roztwór uszczelniający na prowadnicę, aby ją uszczelnić.
  12. Obserwuj fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym (powiększenie: 400×, automatyczne ustawianie ostrości i automatyczna ekspozycja) i policz mikrojądra za pomocą płytki do liczenia komórek.
    UWAGA: 4% paraformaldehydu, 0,1% Triton X-100 i 5% BSA rozcieńcza się PBS (0,01 M). γ-H2AX (Gamma H2AX) to ufosforylowana forma białka histonu H2AX, powstająca w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. W jądrze fosforylacja histonu H2AX jest skoncentrowana w określonych regionach, więc fluorescencja anty-γ-H2AX może wydawać się nierówna. Fosforylacja histonu H2AX jest skoncentrowana w mikrojądrze, co skutkuje ogólnie jaśniejszą fluorescencją z wyraźnymi plamami36. DAPI to barwnik fluorescencyjny, który silnie wiąże się z DNA i jest często stosowany w mikroskopii fluorescencyjnej. Ponieważ mikrojądra zawierają uszkodzone DNA i fragmenty histonów, mogą być barwione przeciwciałami fluorescencyjnymi anty-γ-H2AX i DAPI. Fluorescencja wskaże liczbę, rozmiar i kompletność mikrojąder, pomagając odróżnić je od jąder i ocenić skuteczność oczyszczania32.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po ekspozycji na promieniowanie, ludzka krew obwodowa była inkubowana z RPMI-1640 przez 60 godzin, a następnie dodano cytochalazynę B do przygotowania mikrojądrowego (MN). Limfocyty wyizolowano za pomocą roztworu do separacji limfocytów, a następnie poddano lizie za pomocą specjalnie skonfigurowanego lizatu komórkowego i delikatnej homogenizacji w homogenizatorze szklanym. Homogenat zmieszano w stosunku 1:1 z 1,8 M buforem sacharozy. Nieoczyszczone mikrojądra otrzymano po pierwszym odwirowaniu w gradionym gradimencie gęs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W metodzie tej do izolacji i oczyszczania mikrojąder (MN) wykorzystano napromieniowane ludzkie limfocyty krwi obwodowej. Wiele wcześniejszych badań opisywało szczegółowe etapy lizy komórek i pierwotnej separacji MN 4,32,33,34. Roztwór do lizy komórek zazwyczaj zawiera 0,1% NP-40, który rozrywa błonę komórkową, jednocześnie wywierając minimalny wpływ na błonę jądrową, zachowując w ten sposób int...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie rysunki zostały stworzone przez autorów za pośrednictwem biura WPS. Praca ta była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Chengdu Medical College (CYZ19-38) oraz Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2024NSFSC0592).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15  ml rurka stożkowaThermo339650
4% roztwór paraformaldehyduBeyotimeP0099
50  mL rurka stożkowaThermo339652
Przeciwciało anty-γ-H2AXBiossbsm-52163R
Albumina surowicy bydlęcejBeyotimeST023
Chlorek wapniaBiosharpBS249
Cytochalazyna BMacklin14930-96-2
Roztwór do barwienia DAPIBiossS0001
Ditiothreitol ( DTT)CoolaberCD4941
EDTABiosharpBS107Kwas etylenodiaminowy
Mikroskop fluorescencyjnyHomogenizator NikonTi2-U
YbscienceYB101103-1 (20 mL)
Wirówka pozioma o kontrolowanej temperaturzeThermoSorvall ST1R plusPrędkość hamowania jest ustawiona na "5"
Roztwór do separacji ludzkich limfocytówBeyotimeC0025
Octan magnezuMacklinM833330
NP-40CoolaberSL932010% roztwór
Roztwór buforu fosforanowego (PBS)HyCloneSH30256.01B
Inhibitory proteazyKoktajl CoolaberSL1086(100&razy;)
Przeciwciałowtórne BiossBs-0295GKozia IgG Anty-Królicza H& L/FITC
SpermidynaCoolaberCS10431
SpermineCoolaberCS10441
SacharozaCoolaberCS10581
Tris-HClBiosharpBS157
Triton X-100BeyotimeP0096
kwasu tetraoctowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  2. Liu, S., Kwon, M., Mannino, N. Nuclear envelope assembly defects link mitotic errors to chromothripsis. Nature. 561, 551-555 (2018).
  3. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus assay: The state of art, and future directions. Int J Mol Sci. 21 (4), 1534(2020).
  4. MacDonald, K. M., et al. Antecedent chromatin organization determines cGAS recruitment to ruptured micronuclei. Nat. Commun. 14, 556(2023).
  5. Abdisalaam, S., Mukherjee, S., Bhattacharya, S. NBS1-CtIP–mediated DNA end resection suppresses cGAS binding to micronuclei. Nucleic Acids Res. 50, 2681-2699 (2022).
  6. Li, L., Kim, H. S., Kwon, S. W. Inhibitory effects of saeu-jeot extract on NLRP3 inflammasome activation and radiation-induced micronucleus formation. Food Sci Nutr. 10 (6), 1921-1927 (2022).
  7. Qian, Q. Z., Cao, X., Ke,, Shen, F. H. Effects of ionising radiation on micronucleus formation and chromosomal aberrations in Chinese radiation workers. Radiat Prot Dosimetry. 168 (2), 197-203 (2016).
  8. Rzeszowska-Wolny, J., Przybyszewski, W. M., Widel, M. Ionizing radiation-induced bystander effects, potential targets for modulation of radiotherapy. Eur J Pharmacol. 625 (1-3), 156-164 (2009).
  9. Zuo, Y. H., Dang, X. H., Zhang, H. F. Genomic instability induced by ionizing radiation in human hepatocytes. J Toxicol Environ Health A. 75 (12), 700-706 (2012).
  10. Eken, A., Aydin, A., Erdem, O. Cytogenetic analysis of peripheral blood lymphocytes of hospital staff occupationally exposed to low doses of ionizing radiation. Toxicol Ind Health. 26 (5), 273-280 (2010).
  11. Gutierrez-Enriquez, S., Ramon, Y. C. T., Alonso, C. Ionizing radiation or mitomycin-induced micronuclei in lymphocytes of BRCA1 or BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res Treat. 127 (3), 611-622 (2011).
  12. Brzozowska, K., et al. Effect of temperature during irradiation on the level of micronuclei in human peripheral blood lymphocytes exposed to X-rays and neutrons. Int J Radiat Biol. 85 (10), 891-899 (2009).
  13. Yamini, K., Gopal, V. Natural radioprotective agents against ionizing radiation-an overview. Int J PharmTech Res. 2 (2), 1421-1426 (2010).
  14. Terradas, M., Martín, M., Genescà, A. Impaired nuclear functions in micronuclei results in genome instability and chromothripsis. Arch Toxicol. 90, 2657-2667 (2016).
  15. Crasta, K., Ganem, N. J., Dagher, R. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482, 53-58 (2012).
  16. Fenech, M., Morley, A. Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat Res. 147, 29-36 (1985).
  17. Kirsch-Volders, M., Bonassi, S., Knasmueller, S. Commentary: Critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 759, 49-58 (2014).
  18. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  19. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc. 2, 1084-1104 (2007).
  20. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay evolution into a more comprehensive method to measure chromosomal instability. Genes (Basel). 11 (10), 1203(2020).
  21. Kwon, M., Leibowitz, M. L., Lee, J. H. Small but mighty: The causes and consequences of micronucleus rupture. Exp Mol Med. 52 (11), 1777-1786 (2020).
  22. Harding, S. M., et al. Mitotic progression following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature. 548, 466-470 (2017).
  23. Mackenzie, K. J., et al. cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature. 548, 461-465 (2017).
  24. Tang, S., Stokasimov, E., Cui, Y. Breakage of cytoplasmic chromosomes by pathological DNA base excision repair. Nature. 606, 930-936 (2022).
  25. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  26. Umbreit, N. T., Zhang, C. Z. Z., Lynch, L. D. Mechanisms generating cancer genome complexity from a single cell division error. Science. 368, eaba0712(2020).
  27. Li, Q. J., Wu, P., Du, Q. J. cGAS-STING, an important signaling pathway in diseases and their therapy. Med Comm. 5 (4), e511(2024).
  28. Mohr, L., Toufektchan, E., von Morgen, P. ER-directed TREX1 limits cGAS activation at micronuclei. Mol Cell. 81, 724-738.e9 (2021).
  29. Okamoto, A., Utani, K., Shimizu, N. DNA replication occurs in all lamina positive micronuclei, but never in lamina negative micronuclei. Mutagenesis. 27, 323-327 (2012).
  30. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  31. Guo, X., Dai, X., Wu, X. Understanding the birth of rupture-prone and irreparable micronuclei. Chromosoma. 129 (3-4), 181-200 (2020).
  32. MacDonald, K. M., et al. The proteomic landscape of genotoxic stress-induced micronuclei. Molecular Cell. 84 (7), 1377-1391.e6 (2024).
  33. Agustinus, A. S., Al-Rawi, D., Dameracharla, B. Epigenetic dysregulation from chromosomal transit in micronuclei. Nature. 619 (7968), 176-183 (2023).
  34. Toufektchan, E., Maciejowski, J. Purification of micronuclei from cultured cells by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (1), 100378(2021).
  35. Shimizu, N., Kanda, T., Wahl, G. M. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 12, 65(1996).
  36. Samur, B. M., et al. Assessment of extracorporeal photopheresis related cell damage. Transfus Apher Sci. 61 (6), 103472(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja mikroj draidentyfikacja mikroj draludzkie limfocytywirowanie w gradiencie g sto cibufor sacharozowyintegralno b ony j drowejnara enie na promieniowaniereorganizacja chromosomowaprocesy kancerogenne
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły