Ten protokół przedstawia metodę ekstrakcji i oczyszczania mikrojąder z ludzkich limfocytów za pomocą wirowania w gradicynacji gęstości sacharozy. Stanowi ona eksperymentalną podstawę do badania składu i funkcji mikrojąder.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja i identyfikacja mikrojąder z ludzkich limfocytów krwi obwodowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikrojądro (MN) to nieprawidłowa struktura jądrowa, która tworzy się w komórkach, szczególnie w szpiku kostnym lub komórkach krwi, gdy są wystawione na zewnętrzne uszkodzenia, takie jak promieniowanie, z powodu nierozwiązanych uszkodzeń DNA lub błędów mitotycznych. Po utworzeniu MN mogą aktywnie przyczyniać się do różnych procesów rakotwórczych, w tym sygnalizacji zapalnej i chromosomalnych rearanżacji genetycznych. MN zawierają jądrowe DNA, histony, fragmenty nukleoprotein i inne aktywne białka, które są ściśle związane z ich funkcjami. Badanie powstawania i składników MN ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w napędzaniu procesów rakotwórczych. Ekstrakcja i oczyszczanie MN mają zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia tych celów badawczych. Jednak niestabilność błony jądrowej MN i jej podatność na pękanie sprawiają, że procesy te są technicznie trudne. Obecnie tylko kilka badań wykazało zastosowanie wirowania w gradionym gradimencie gęstości do separacji MN. Niniejsze badanie podsumowuje i upraszcza procesy separacji i oczyszczania MN. Ludzkie limfocyty krwi obwodowej wystawione na promieniowanie wyizolowano, a MN oddzielono i oczyszczono za pomocą sacharozy o różnych stężeniach w dwuetapowym procesie. Integralność i czystość MN zostały zweryfikowane, zapewniając jasną i praktyczną demonstrację procedury eksperymentalnej dla badaczy badających przyczyny i funkcje MN.
Wprowadzenie
Mikrojądro (MN) to subkomórkowa struktura w cytoplazmie, która zawiera jądrowe DNA, histony i fragmenty nukleoprotein, otoczone strukturami błonowymi1,2. MN jest całkowicie oddzielony od głównego jądra i zazwyczaj pojawia się w jego pobliżu w owalnym lub okrągłym kształcie, o rozmiarze od 1/16 do 1/3 średnicy głównego jądra. Powstawanie MN jest przede wszystkim związane z acentrycznymi fragmentami chromosomów, błędną segregacją chromosomów, dicentrycznym pękaniem chromosomów, niestabilnością chromosomów i agregacją podwójnych minut (DBs)3. MN rzadko występują w zdrowych komórkach i są g....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z udziałem próbek ludzkiej krwi obwodowej zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Przemysłu Jądrowego 416 w Chinach (Przegląd 2020 [nr 48]), a wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały osoby z poważnymi chorobami przewlekłymi, takimi jak nowotwory, dna moczanowa lub choroby krwi, a także osoby narażone na działanie substancji radioaktywnych lub genotoksycznych w swoim zawodzie. W tym badaniu pobrano 10 ml krwi obwodowej od zdrowego 28-letniego mężczyzny do probówki do pobierania krwi zawierającej heparynę sodową jako an....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po ekspozycji na promieniowanie krew obwodową człowieka inkubowano w pośrodku RPMI-1640 przez 60 h, a następnie dodano cytochalasynę B w celu przygotowania mikrojąder (MN). Limfocyty wyizolowano przy użyciu roztworu do separacji limfocytów, po czym przeprowadzono lizę za pomocą specjalnie przygotowanego lizatu komórkowego i delikatną homogenizację w homogenizatorze szklanym. Homogenat zmieszano w stosunku 1:1 z buforem sacharozowym 1,8 M. Nieoczyszczone mikrojądra uzyskano po pierwszej wirowaniu w gradiencie gęstości sac.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W metodzie tej do izolacji i oczyszczania mikrojąder (MN) wykorzystano napromieniowane ludzkie limfocyty krwi obwodowej. Wiele wcześniejszych badań opisywało szczegółowe etapy lizy komórek i pierwotnej separacji MN 4,32,33,34. Roztwór do lizy komórek zazwyczaj zawiera 0,1% NP-40, który rozrywa błonę komórkową, jednocześnie wywierając minimalny wpływ na błonę jądrową, zachowując w ten sposób int.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Wszystkie rysunki zostały stworzone przez autorów za pośrednictwem biura WPS. Praca ta była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Chengdu Medical College (CYZ19-38) oraz Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2024NSFSC0592).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml rurka stożkowa | Thermo | 339650 | |
| 4% roztwór paraformaldehydu | Beyotime | P0099 | |
| 50 mL rurka stożkowa | Thermo | 339652 | |
| Przeciwciało anty-γ-H2AX | Bioss | bsm-52163R | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Beyotime | ST023 | |
| Chlorek wapnia | Biosharp | BS249 | |
| Cytochalazyna B | Macklin | 14930-96-2 | |
| Roztwór do barwienia DAPI | Bioss | S0001 | |
| Ditiothreitol ( DTT) | Coolaber | CD4941 | |
| EDTA | Biosharp | BS107 | Kwas etylenodiaminowy |
| Mikroskop fluorescencyjny | Homogenizator Nikon | Ti2-U | |
| Ybscience | YB101103-1 (20 mL) | ||
| Wirówka pozioma o kontrolowanej temperaturze | Thermo | Sorvall ST1R plus | Prędkość hamowania jest ustawiona na "5" |
| Roztwór do separacji ludzkich limfocytów | Beyotime | C0025 | |
| Octan magnezu | Macklin | M833330 | |
| NP-40 | Coolaber | SL9320 | 10% roztwór |
| Roztwór buforu fosforanowego (PBS) | HyClone | SH30256.01B | |
| Inhibitory proteazy | Koktajl Coolaber | SL1086 | (100&razy;) |
| Przeciwciało | wtórne Bioss | Bs-0295G | Kozia IgG Anty-Królicza H& L/FITC |
| Spermidyna | Coolaber | CS10431 | |
| Spermine | Coolaber | CS10441 | |
| Sacharoza | Coolaber | CS10581 | |
| Tris-HCl | Biosharp | BS157 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 |
Bibliografia
- Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
- Liu, S., Kwon, M., Mannino, N. Nuclear envelope assembly defects link mitotic errors to chromothripsis. Nature. 561, 551-555 (2....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
