Method Article

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

DOI:

10.3791/67565

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantacja płuc jest kluczowym sposobem leczenia dla pacjentów ze schyłkowymi chorobami płuc, takimi jak idiopatyczne zwłóknienie płuc, ale wyzwania, takie jak niedobór dawców i powikłania po przeszczepie, utrzymują się. Bioinżynieryjne płuca, integrujące specyficzne dla pacjenta komórki w pozbawione komórek rusztowania zwierzęce, stanowią obiecującą alternatywę. Pomimo postępów w wykorzystaniu bioinżynieryjnych płuc w modelach zwierzęcych, funkcjonalność i struktura pozostają niedojrzałe. Protokół ten rozwiązuje krytyczną barierę w bioinżynierii narządów: potrzebę opłacalnej platformy eksperymentalnej. Używając modeli mysich zamiast większych zwierząt, takich jak szczury czy świnie, naukowcy mogą znacznie zmniejszyć zasoby wymagane do każdego eksperymentu, przyspieszając postęp badań.

Protokół przedstawia szczegółową procedurę bioinżynierii płuc przy użyciu bloków płuco-serce myszy i ludzkich komórek pierwotnych, koncentrując się na strategii izolacji bloku płuco-serce myszy, decelularyzacji, ustawieniu bioreaktora, hodowli narządów opartej na perfuzji oraz ortotopowym przeszczepie bioinżynieryjnych płuc. Ta platforma w skali myszy nie tylko zmniejsza koszty eksperymentalne, ale także zapewnia realne ramy do optymalizacji typów i liczby komórek do recelularyzacji, testowania różnych typów komórek przy użyciu metod histologicznych i molekularnych oraz zapewnienia przepływu krwi po przeszczepie. Metoda ta ma potencjał do szerokich zastosowań, w tym do badania interakcji komórkowych w warunkach trójwymiarowej hodowli, interakcji komórka-matryca oraz modelowania nowotworów ex vivo, przyczyniając się w ten sposób do rozwoju w dziedzinie bioinżynierii narządów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep płuc okazał się decydującym lekarstwem dla pacjentów cierpiących na schyłkową fazę choroby płuc1 takich jak idiopatyczne zwłóknienie płuc, gdzie leczenie farmakologiczne jest nieskuteczne w celu powstrzymania pogorszenia funkcji oddechowych. Każdego roku na listę oczekujących dołącza więcej kwalifikujących się pacjentów; Jednak liczba dawców narządów od zmarłych dawców nie nadąża za rosnącą liczbą oczekujących pacjentów2,3. Nawet po poddaniu się przeszczepowi płuc wiele problemów pogorszyłoby funkcję przeszczepionych płuc, w tym dysfunkcja narządów pierwotnych, reaktywny zespół allogeniczny i infekcje, które znacznie obniżają 5-letnie przeżycie biorców przeszczepu płuc4.

Istnieje kilka opcji, aby przeciwdziałać obecnym problemom w transplantacji narządów, w tym wykorzystanie marginalnych dawców5, odzyskiwanie płuc dawcy w systemie perfuzji płuc ex vivo6, oraz ksenotransplantacja przy użyciu edytowanych genów świń7. Te alternatywy mogą poszerzyć pulę narządów dawców; Jednak żaden z nich nie jest w stanie całkowicie rozwiązać problemu niedoboru, immunogenności i niejednorodności funkcjonalnej narządów dawcy.

Jest to dalekie od rzeczywistości, ale sztuczne organy bioinżynieryjne, w których komórki specyficzne dla pacjenta są zintegrowane z bezkomórkowym rusztowaniem organów zwierzęcych, są fascynującym potencjalnym źródłem przeszczepów organów stałych8. Od 2010 roku zgłoszono kilka pionierskich badań, które wykazały potencjalną użyteczność bioinżynieryjnych płuc9,10. W tych badaniach płuca szczurów lub świń zostały pozbawione komórek za pomocą detergentów, komórki zwierzęce lub ludzkie zostały wstrzyknięte z tchawicy lub układu naczyniowego płuc w celu regeneracji tkanki płucnej w bioreaktorze opartym na perfuzji, a niektóre z nich zostały przeszczepione ortotopowo do jamy klatki piersiowej zwierząt11,12,13,14,15. Jednak funkcja i struktura bioinżynieryjnych płuc były przedwczesne, prawdopodobnie z powodu niewystarczającej liczby komórek hodowanych w bioreaktorze lub mniej zintegrowanych połączeń międzykomórkowych.

Jedną przeszkodą w rozwoju badań nad bioinżynierią narządów jest brak platformy eksperymentalnej na małą skalę. Podczas gdy szczury lub świnie są powszechnie używanymi zwierzętami w tej dziedzinie, wymagają >108 komórek płuc na płuco16, co jest bardzo kosztowne dla laboratoriów akademickich. Gdyby myszy były dostępne do badań nad bioinżynierią narządów, moglibyśmy radykalnie obniżyć koszty każdego eksperymentu i przyspieszyć program badawczy. Chociaż istnieją różnice anatomiczne między płucami myszy i człowieka17, podstawowa architektura płuc jest podobna u wszystkich ssaków18. Dlatego wyniki eksperymentów w skali myszy można zastosować do większych zwierząt, po prostu mnożąc liczbę w zależności od wielkości ciała.

Ten protokół ma na celu opisanie szczegółowej procedury eksperymentalnej bioinżynierii płuc przy użyciu bloków płuco-serca myszy i ludzkich komórek pierwotnych19. W tym badaniu przyjęliśmy wcześniej zgłoszony i szeroko stosowany protokół decelularyzacji płuc myszy20,21,22. Wyzwaniem w bioinżynierii płuc jest recelularyzacja pozbawionego komórek naczyń włosowatych naczyń włosowatych20; Dlatego w tym protokole zostaną wykorzystane ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty były zgodne z Regulaminem Eksperymentów na Zwierzętach i Powiązanych Działań na Uniwersytecie Tohoku (15edycja), opublikowanym przez Uniwersytet Tohoku23. Badanie to zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Tohoku (#2020AcA-041-01).

1. Przygotowanie materiałów do decelularyzacji

  1. Przygotowanie roztworów decelularyzacyjnych (format 1 000 ml w szklanej butelce o pojemności 1 l, którą można sterylizować w autoklawie)
    1. Sterylna woda dejonizowana (DI): Dodaj 1,000 ml wody destylowanej lub destylowanej do szklanych butelek o pojemności 1 litra, które można sterylizować w autoklawie. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    2. Triton X-100: Dodaj 1 ml Triton X-100 do 1 000 ml sterylnej wody DI w autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 1 l. (Opcjonalnie) Dodać 10 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (stężenie końcowe, 500 jednostek/ml penicyliny i 500 μg/ml streptomycyny).
      UWAGA: Nie sterylizować w autoklawie.
    3. Deoksycholan sodu: Dodaj 20 g deoksycholanu sodu w proszku do 1,000 ml sterylnej wody DI w autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 1 l. Zamknij nakrętkę i odwróć butelkę, aby rozpuścić proszek. (Opcjonalnie) Dodać 10 ml roztworu penicyliny i streptomycyny.
      UWAGA: Nie sterylizować w autoklawie.
    4. 1 M NaCl: Dodaj 58,44 g NaCl do 1,000 ml wody destylowanej lub destylowanej w autoklawowalnej szklanej butelce o pojemności 1 l. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    5. Roztwór podstawowy DNazy I: Rozcieńczyć w stężeniu 10 mg/ml w pożywce A.
      1. Podłoże A: Przygotować 5 mM CaCl2 (5 mg CaCl2 w 9 ml sterylnej wody DI) i rozcieńczyć 1:10 sterylną wodą DI.
    6. Roztwór roboczy DNazy I: Dodać 33 μl roztworu podstawowego DNazy I do 10 ml pożywki B.
      1. Podłoże B: Przygotować 10x Medium B (155 mgMgSO4 + 220 mg CaCl2 w 100 ml sterylnej wody DI) i rozcieńczyć 1:10 sterylną wodą DI.
  2. Przygotowanie cewników do tętnicy płucnej (PA) i tchawicy (procedura sterylna)
    1. Przeciąć cewnik PA (cewnik do żyły szyjnej szczura) na długość około 15 mm.
    2. Przesuń kołnierz do końca cewnika.
    3. Włóż złącze cewnika do cewnika PA i podłącz go do wstrzykiwacza. Przygotowane cewniki PA są przedstawione w Rysunek 1A.
    4. Cewnik PA należy przechowywać w 70% etanolu do czasu użycia.
    5. Przeciąć cewnik dożylny 20 G na długości około 15 mm. Jest on używany do cewnika dotchawiczego.
  3. Chirurgia myszy w celu pobrania bloku płuco-serce
    1. Poddaj eutanazji samca myszy (C57BL/6, waga > 28 g) za pomocą przedawkowania dwutlenku węgla lub izofluranu.
    2. Umieść mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym i napraw kończyny. Sterylizować, rozpylając 70% etanolu na powierzchnię klatki piersiowej i brzucha.
    3. Otwórz jamę brzuszną w linii środkowej do szyi nożyczkami ze stali nierdzewnej i rozłup mostek nożyczkami. Wyciąć przeponę ze ściany klatki piersiowej, przeciąć brzuszną ścianę klatki piersiowej, aby całkowicie odsłonić jamy klatki piersiowej i usunąć grasicę. Podwiązać żyłę główną dolną i prawą żyłę główną górną jedwabiem 4-0, aby zapobiec niedomykalności PBS w kroku 1.3.5, zwiększając w ten sposób wypłukiwanie krwi w naczyniach płucnych.
    4. Przetnij aortę brzuszną nożyczkami ze stali nierdzewnej w celu drenażu. Jeśli aorta brzuszna jest niedostrzegalna, całkowicie odetnij żyłę główną dolną i aortę brzuszną.
    5. Wstrzyknąć 3 ml sterylnego PBS z prawej komory za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml z igłą 27 G, nakłuwając ścianę prawej komory.
    6. Zapętl główny PA jedwabiem 4-0 za pomocą kleszczy Dumont.
      UWAGA: Główny PA i aorta wstępująca mogą być ze sobą zapętlone.
    7. Otwórz okienko 2 mm pod zaworami PA, przecinając ścianę prawej komory nożyczkami sprężynowymi.
    8. Wprowadzić cewnik PA przez okienko i zabezpieczyć wcześniej zapętlony jedwab 4-0 (Rysunek 1B).
      UWAGA: Podczas tej procedury należy unikać dotykania PA, ponieważ może to spowodować uszkodzenie ściany PA. Główny PA i aorta wstępująca mogą być podwiązane i zabezpieczone razem.
    9. Wstrzyknąć powoli 2 ml PBS przez cewnik PA za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml. Upewnij się, że oba płuca nieznacznie rozszerzają się podczas wstrzykiwania PBS.
    10. Kankaneluj tchawicę za pomocą cewnika dotchawiczego i zawiąż na miejscu jedwabnym szwem 4-0 (Rysunek 1C).
    11. Powoli wstrzyknąć 2 ml powietrza przez cewnik dotchawiczy za pomocą pustej sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml i trzymać ją przez 10 sekund. Upewnij się, że nie ma wycieku powietrza z płuc.
    12. Usunąć serce i płuco en bloc. Chwyć tchawicę kleszczami Dumonta i cewnikiem tchawicy w środku, przetnij przełyk szyjny i wypreparuj go z kręgów. Przeciąć obustronne żyły podobojczykowe i tętnice. Na koniec przetnij przełyk i żyłę główną na poziomie przepony.
      UWAGA: Nie dotykaj powierzchni płuc żadnymi instrumentami. Każdy lekki dotyk może spowodować wyciek powietrza.
  4. Decelularyzacja płuc myszy (procedura 3-dniowa)
    UWAGA: Wszystkie procedury opisane w sekcji 1.4 powinny być wykonywane w czystej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Dzień 1
      1. Przenieść wycięty blok płucoserca-serca na plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 cm i inkubować bloki płuco-serce w sterylnej wodzie demineralizowanej przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      2. Wstrzyknąć 2 ml sterylnej wody DI przez cewnik tchawicy 3x i 2 ml sterylnej wody przez cewnik PA za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml. Zrób przerwę po każdym wstrzyknięciu, aby płyn wydostał się na zewnątrz, gdy płuca się cofają (Rysunek 1C).
        UWAGA: Wstrzyknąć wodę o sile około 0,5 ml/s.
      3. Wstrzyknąć 2 ml 0,1% roztworu Triton X-100 do cewnika dotchawiczego i 2 ml do cewnika PA.
      4. Umieścić blok płucoserca na szalce Petriego i inkubować statycznie w roztworze Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dzień 2
      1. Usunąć roztwór Triton X-100 z płuc sterylną wodą demineralizowaną, jak opisano w kroku 1.4.1.2.
      2. Wstrzyknąć 2 ml 2% roztworu deoksycholanu sodu do cewnika dotchawiczego i 2 ml do cewnika PA. Inkubować w roztworze deoksycholanu przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Dzień 3
      1. Usunąć roztwór deoksycholanu sodu z płuc sterylną wodą demineralizowaną, jak opisano w kroku 1.4.1.2.
      2. Wstrzyknąć 2 ml 1 M roztworu NaCl do cewnika dotchawiczego i 2 ml do cewnika PA. Inkubować w roztworze NaCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      3. Usunąć z roztworu NaCl sterylną wodą demineralizowaną, jak opisano w kroku 1.4.1.2.
      4. Wstrzyknąć 2 ml roztworu roboczego DNAzy I do cewnika dotchawiczego i 2 ml do cewnika PA. Inkubować w roztworze roboczym DNazy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      5. Usunąć roztwór DNazy z płuc zgodnie z opisem w kroku 1.4.1.2, ale z jałowym PBS. Upewnij się, że płuca są białe i przezroczyste na krawędzi po zabiegu decelularyzacji.
        UWAGA: W miarę postępu procedury decelularyzacji płuca stają się bardziej kruche. Zawsze należy obchodzić się z blokiem płuco-serce z ostrożnością i unikać dotykania powierzchni płuc. Po decelularyzacji bloki płuco-serce mogą być przechowywane w PBS/antybiotykach w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.

2. Hodowla pierwotnych komórek ludzkich

  1. Wymieszać pożywkę Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) i zestaw Bullet Kit zawierający płodową surowicę bydlęcą (stężenie końcowe, 2%), hydrokortyzon (stężenie końcowe, 0,2 μg/ml), ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (stężenie końcowe, 4 ng/ml), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (2 ng/ml), R3-insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (stężenie końcowe, 5 ng/ml), kwas askorbinowy (stężenie końcowe, 75 μg/ml), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (stężenie końcowe, 10 ng/ml), gentamycyna/amfoterycyna-1000 (stężenie końcowe, gentamycyna: 30 μg/ml, amfoterycyna: 15 ng/ml) i heparyna (stężenie końcowe, 1 ng/ml).
  2. Rozmrozić 2 × 106 ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w zamrożonych fiolkach w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
  3. Wymieszać komórki z EGM2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 × g przez 5 minut.
  4. Policz komórki i posadź je w subkulturze o odpowiedniej gęstości komórek (zalecane 2,0 x 104 komórki/cm2). Rozpocząć od płytek 6-dołkowych, a następnie przenieść do kolb T75.
  5. Przeprowadzaj komórki, aż do uzyskania wymaganej liczby komórek.
    UWAGA: Aby uzyskać pełne pokrycie naczyń płucnych za pomocą HUVEC, wymagane będą 3 × 107 HUVEC19.

3. Konfiguracja bioreaktora i hodowla narządów perfuzyjnych

  1. Przygotowanie komory narządowej i zbiornika komórkowego
    1. Wytnij otwory w silikonowym korku za pomocą świdra korkowego, jak pokazano na Rysunek 2A. Rozmiary otworów to 5 mm (i, ii i iii) oraz 7 mm (iv i v). Każdy numer dołka (i-v) w Rysunek 2A odpowiada numerom otworów w Rysunek 2B.
    2. Przełóż rurkę pompy przez silikonowy korek, jak pokazano w Rysunek 2B.
    3. Wytnij 5 mm otwór w silikonowej przegrodzie otwartej nakrętki za pomocą świdra korkowego. Włóż rurkę utwardzaną platyną L/S 14 do otworu (Rysunek 2B, C).
    4. Autoklawuj powyższe materiały, w tym silikonowy korek z rurką, szklany kanister, zakrętkę GL-45 z rurką, szklaną butelkę o pojemności 250 ml do sterylizacji w autoklawie oraz rurkę L/S 14 z łącznikami do przynęty (rurka B i rurka C w Rysunek 3A) przez 20 minut w temperaturze 121 °C. Wybierz odpowiednie złączki przynęty, aby rurki B i C tworzyły pętlę.
      UWAGA: Szklany kanister służy jako komora organowa, a szklana butelka o pojemności 250 ml służy jako zbiornik na komórki.
  2. Montaż obwodu bioreaktora opartego na perfuzji
    UWAGA: Poniższe procedury należy wykonywać na czystej ławce.
    1. Dodaj 70 ml pożywki hodowlanej do szklanego pojemnika, a następnie umieść silikonowy korek na szklanym pojemniku.
    2. Zamontuj silikonowy korek, szklany kanister, nakrętkę GL-45 z rurką, szklaną butelkę o pojemności 250 ml do sterylizacji w autoklawie oraz rurkę L/S 14 z łącznikami przynęty za pomocą trójdrożnych kurków, jak opisano w Rysunek 3A. Wprowadzić igłę 20 G w silikonową przegrodę nakrętki GL-45.
    3. Napełnij pożywkę w rurkach A, B i C strzykawką o pojemności 10 ml podłączoną do zaworów odcinających i) i iii) (~ 3-5 ml pożywki będzie potrzebne do napełnienia 1 m rurki). Powtórzyć wstrzykiwanie i pobieranie pożywki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przez trójdrożny zawór odcinający, aby upewnić się, że wewnątrz rurki nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Przymocuj cewnik PA zdecelularizowanego bloku płuco-serce za pomocą złączki przynęty podłączonej do rurki C. Unikaj pęcherzyków powietrza w cewniku lub drengu.
    5. Zebrać i ponownie zawiesić HUVEC w gęstości 0,5-1 × 106 komórek/ml w EGM2. Dodaj zawiesinę komórek z kroku 2.5 do zbiornika komórek.
      UWAGA: Zawiesinę komórek zaleca się przygotować między etapami 3.2.4 i 3.2.5. Umieść mieszadło w zbiorniku komórkowym.
  3. Wstrzykiwanie grawitacyjne komórek śródbłonka
    1. Umieść zbiornik komórkowy zawierający HUVEC na mieszadle magnetycznym. Upewnij się, że dno zbiornika komórkowego znajduje się 30 cm powyżej komory narządu (Rysunek 2D i Rysunek 3A).
    2. Włącz mieszadło magnetyczne z prędkością około 120 obr./min.
    3. Otwórz zawór odcinający i) i ii), aby zawiesina komórkowa mogła zostać wstrzyknięta do rusztowania bezkomórkowego przez rurkę A, rurkę C i cewnik PA.
      UWAGA: Podczas wstrzykiwania 3 × 107 komórek o gęstości komórek 1 × 106 komórek/ml, objętość zawiesiny komórek powinna wynosić 30 ml. Typowa szybkość wstrzykiwania wynosi 1-2 ml/min.
    4. Po całkowitym wstrzyknięciu zawiesiny komórkowej odłączyć rurkę A od kranu ii).
      UWAGA: Na tym etapie można przeprowadzić zliczanie komórek, aby zmierzyć szybkość zatrzymywania komórek w rusztowaniu zdecelularycznym. Typowy wskaźnik retencji komórek wynosi 80-90%, niezależnie od liczby wstrzykniętych komórek19.
      Jakość bezkomórkowego rusztowania płuc ściśle określa szybkość retencji komórek. Każdy wyciek z pozbawionego komórek płuca (np. z głównego PA, powierzchni płuca) powoduje niższy wskaźnik retencji komórek. Upewnij się, że nie ma widocznego wycieku z pozbawionego komórek płuca, wstrzykując 2-3 ml pożywki hodowlanej za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do jednego z zaworów odcinających w bioreaktorze opartym na perfuzji i potwierdź, że pozbawione komórek płuca nieznacznie rozszerzają się podczas wstrzykiwania pożywki.
  4. Posiew narządowy perfuzyjny
    1. Umieścić komorę narządową w inkubatorze CO2 .
    2. Przymocuj rurkę B do głowicy pompy podłączonej do pompy pulsacyjnej.
    3. Zamknij szklane drzwi inkubatoraCO2. Upewnij się, że rurka jest prawidłowo umieszczona między szklanymi drzwiczkami a gumową uszczelką (Rysunek 3B).
    4. Inkubować rusztowanie pozbawione komórek w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, aby wstrzyknięte komórki śródbłonka osiadły w rusztowaniu.
      UWAGA: Upewnij się, że pompa pulsacyjna jest zawsze wyłączona między krokami 3.4.1 i 3.4.4.
    5. Uruchom pompę z prędkością 6 obr./min, co skutkuje perfuzją pożywki o 2 ml/min za pomocą rurki L/S 14. Obserwuj, jak pozbawione komórek płuco jest lekko rozszerzane wraz z perfuzją pożywki.
    6. Zamknij drzwi inkubatora (Rysunek 3C).
    7. Dokonaj wymiany nośnika za pomocą zaworu odcinającego iii). Zmieniaj połowę nośnika co 2 lub 3 dni.
      1. Zatrzymać napęd pompy, podłączyć sterylną strzykawkę o pojemności 50 ml do zaworu odcinającego iii) i pobrać 50 ml pożywki z komory.
      2. Napełnij kolejną sterylną strzykawkę o pojemności 50 ml 50 ml wstępnie podgrzanego podłoża i przenieś pożywkę do komory przez zawór odcinający iii). Odpowiednio przełączyć zawór odcinający, a następnie uruchomić pompę pulsacyjną.
    8. Zbierz zrecellularowany blok płuco-serce po co najmniej 2 dniach hodowli narządów perfuzyjnych.
      UWAGA: W naszym badaniu 2 dni hodowli perfuzyjnej wystarczyły do jednorodnej rewaskularyzacji bezkomórkowego rusztowania płuc przy użyciu 3 × 107 HUVEC. W przypadku stosowania mniej niż 3 × 107 HUVEC, może być wymagana dłuższa inkubacja w celu poprawy wydajności recelularyzacji.

4. Ortotopowy przeszczep bioinżynieryjnego płuca

  1. Przygotowanie leku
    1. Przygotować złożony środek znieczulający MMB, mieszając midazolam (stężenie końcowe, 4 mg/kg), medetomidynę (stężenie końcowe, 0,75 mg/kg) i winian butorfanolu (stężenie końcowe, 5 mg/kg) z solą fizjologiczną klasy klinicznej.
    2. Przygotować roztwór heparyny, mieszając go z solą fizjologiczną klasy klinicznej (stężenie końcowe, 1000 j./ml).
    3. Przygotować cefazolinę sodową, mieszając ją z solą fizjologiczną klasy klinicznej (jedna dawka, 30 mg/kg).
  2. Zabiegu chirurgicznego
    1. Przygotowanie mankietów
      1. Delikatnie przetrzyj trzy rodzaje angiocewnika drobnym papierem ściernym, aby naczynia pozostały zamknięte.
      2. Przygotuj mankiet oskrzelowy z teflonowego cewnika o długości 1 mm 20 g za pomocą skalpela #11. Przed przecięciem angiocewnika użyj tylnej części skalpela #11, aby zrobić wgłębienie w angiocewnikowniku, aby związać nylon 10-0.
      3. Przygotuj mankiet do żyły płucnej (PV) z teflonowego cewnika 22 G o długości 0,8 mm, a mankiet PA z teflonowego cewnika 24 G o długości 0,6 mm.
        UWAGA: Przygotowanie to można wykonać przed dniem eksperymentu.
    2. Mocowanie mankietu do bioinżynieryjnego płuca
      1. Umieść blok płuco-serce na kawałku sterylnej gazy zwilżonej zimną solą fizjologiczną, umieść pod nim kolejny kawałek suchej, czystej gazy i włóż szalkę Petriego do styropianowego pudełka wypełnionego czystym lodem.
        UWAGA: Umieszczenie suchej gazy zapobiega przypadkowemu zamarznięciu bloku płuco-serce.
      2. Umieść klips do tętniaka, aby zabezpieczyć tchawicę i gazę (Rysunek 4A). Umieść mały kawałek gazy na sercu, zakrywając również prawe płuco. Umieść kolejną gazę na lewym płucu. Wyreguluj to cofnięcie za pomocą zwilżonej gazy, aby jak najwyraźniej odsłonić lewą wnękę.
      3. Ostrożnie odetnij struktury wnęki od siebie za pomocą prostych lub kątowych mikrokleszczyków, w zależności od preferencji (Rysunek 4B). Rozpocznij preparację od więzadła płucnego wzdłuż nerwu błędnego. Naciąć opłucną trzewną pod PV i przesunąć razem aortę zstępującą i nerw błędny przez tylną część lewej wnęki płucnej na stronę czaszki.
      4. Rozetnij lewą główną część ciała od pnia płucnego do samej krawędzi lewego płuca (Rysunek 4C). Następnie należy podzielić PA na poziomie pnia płucnego, aby uzyskać odpowiednią długość.
      5. Rozetnij lewe PV od lewej strony lewego przedsionka do samej krawędzi lewego płuca (Rysunek 4D). Podziel lewą fotowoltaikę na poziomie lewego przedsionka, aby uzyskać odpowiednią długość.
      6. Zawieś mankiet PA tuż nad PA za pomocą stabilizacji clamp i włóż PA do wnętrza mankietu (Rysunek 4E). Złóż PA na mankiecie), odsłaniając powierzchnię śródbłonka. Zabezpiecz wokół mankietu nylonowym krawatem 10-0 (Rysunek 4F). Umieść mankiet na PV w identyczny sposób (Rysunek 4G,H).
      7. Podziel lewe oskrzela na poziomie cariny. Umieść mankiet na oskrzelu w identyczny sposób (Rysunek 4I).
    3. Procedura dla myszy odbiorcy
      1. Znieczulić mysz biorcę mieszaniną MMB i.p. za pomocą igły 27 G i zaintubować, wprowadzając pod mikroskopem poliuretanowy angiocewnik 20 G. Umieść mysz odbiorcy na podgrzewaczu elektrycznym z regulacją temperatury w prawej bocznej pozycji odleżynowej i podłącz angioczatera do respiratora. Ustaw respirator w następujący sposób: tlen 2 l/min, częstość oddechów 120 uderzeń na minutę, objętość oddechowa 0,5 ml. Wysterylizuj ścianę klatki piersiowej 70% etanolem i wstrzyknij mieszaninę cefazoliny s.c.
      2. Naciąć skórę nożyczkami. Przetnij tkankę podskórną i mięśnie za pomocą kauteryzacji. Otwórz klatkę piersiową przez 3.przestrzeń międzyżebrową i umieść zwijacze klatki piersiowej.
        UWAGA: Chociaż torakotomia musi być wystarczająco duża do implantacji, nie należy uszkadzać tętnicy sutkowej wewnętrznej, co może prowadzić do masywnego krwawienia.
      3. Wytnij więzadło płucne bawełnianym wacikiem i dużymi nożyczkami sprężynowymi. Umieść zakrzywiony środek do oczyszczania tętnic na lewym płucu biorcy, aby łatwo cofnąć płuco. Za pomocą ustawionych pod kątem mikrokleszczy rozciąć opłucną śródpiersia wokół lewej wnęki płucnej.
        UWAGA: Podstawa preparacji opłucnej jest podobna do anatomicznej resekcji płuc człowieka.
      4. Wypreparuj PA od oskrzeli za pomocą zakrzywionych mikrokleszczy od śródpiersia do samej krawędzi lewego płuca (Ryc. 5A). W podobny sposób wypreparuj oskrzela z PV.
        UWAGA: Sekcję można łatwo przeprowadzić, gdy opłucna zostanie wypreparowana podczas poprzedniego manewru (krok 4.2.3.3).
      5. Umieść węzeł jedwabiu 10-0 u podstawy PA, aby zamknąć (Rysunek 5B). Umieść wąski, kątowy klips tętniakowy u podstawy PV i oskrzela (Rysunek 5C).
      6. Owiń nylon 10-0 wokół oskrzeli, PA i PV, pozostawiając luźne, aby zabezpieczyć mankiety w kolejnych krokach.
      7. Naciąć PA, oskrzela i PV biorcy na krawędzi lewego płuca biorcy za pomocą nożyczek z mikrosprężynami (Rysunek 5D). Delikatnie rozszerz PA i PV za pomocą prostych mikrokleszczyków. Usunąć krew z PA i PV za pomocą soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 1 ml i 24 G angiocathater.
        UWAGA: Nacięcia PA, oskrzela i PV znajdują się w około jednej trzeciej drogi dookoła. Proste mikrokleszczyki są delikatne i nadają się do rozszerzania.
      8. Umieść bioinżynieryjne płuco, które jest pokryte zwilżoną gazą, na lewym płucu biorcy (Ryc. 5E), jak najbliżej śródpiersia biorcy.
      9. Wkładanie mankietu PA dawcy do PA biorcy (Rysunek 5F).
        UWAGA: Na PA dawcy będzie pewne rozciągnięcie. Jeśli rozmiar nacięcia PA jest odpowiedni, istnieje mniejsze prawdopodobieństwo, że mankiet dawcy zostanie przemieszczony. Przesunięcie bioinżynieryjnego płuca w pobliże śródpiersia zapobiegnie również przemieszczeniu się mankietu dawcy.
      10. Zabezpiecz mankiet nylonowym krawatem 10-0 (Rysunek 5G). W podobny sposób włóż i zabezpiecz oskrzela dawcy (Rysunek 5H) i mankiety PV (Rysunek 5I,J).
      11. Zdejmij wąskokątny zacisk tętniakowy (Rysunek 5L). Obserwuj, że krew cofa się poza mankiet PV i zdejmij jedwabną opaskę z PA, aby wznowić wsteczny przepływ krwi do bioinżynieryjnego płuca.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem decelularyzacji, płuca myszy są widocznie białe i półprzezroczyste (Rysunek 6A). Składniki komórkowe powinny zostać całkowicie usunięte, ale struktura pęcherzyków płucnych pozostaje nienaruszona w obserwacji histologicznej (Rysunek 6B,C). Recellularizowane płuca myszy przy użyciu 3 × 107 HUVEC z 2-dniową hodowlą bioreaktora opartego na perfuzji wykazują jednorodny rozkład HUVEC (Rysunek 7A). HUVEC migrują do obwod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioinżynieria narządów to wymagające przedsięwzięcie. Kosztowny proces selekcji utrudnia cykl badawczo-rozwojowy w tej dziedzinie. Wykorzystując myszy jako platformę eksperymentalną, przestrzeń, komórki i pożywki są znacznie zmniejszone w porównaniu z poprzednio używaną platformą szczurzą. Chociaż pomiar szczegółowych parametrów fizycznych, takich jak wymiana gazowa, opór naczyniowy lub podatność płuc, nie został jeszcze osiągnięty, model płuc myszy pozwala na przyspieszenie czasu badań, ponieważ umożliwia szybką iteracj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów w związku z tym manuskryptem.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane finansowo przez Grant-in-Aid for Scientific Research / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B)) #22KK0132 dla TS, JSPS KAKENHI Grant Number 21K08877 dla TW, Leave a Nest Grant Ikeda-Rika award for FT, oraz Grant-in-Aid for JSPS Fellows #21J21515 dla FT. Jesteśmy bardzo wdzięczni Pani Maiko Ueda, personelowi technicznemu w Rdzeniu Badań Biomedycznych Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Tohoku, za jej intensywną pracę w zakresie obserwacji histologicznej. Doceniamy również porady techniczne Pani Yumi Yoshida i Pana Koji Kaji z Centrum Instrumentów Badawczych w IDAC, Uniwersytet Tohoku, za ich wsparcie w zakresie przetwarzania obrazu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DECELULARYZACJA
27 G x 1/2 cala Igła BD PrecisionGlideBD305109Lub równoważna igła iniekcyjna 27 G
Cewnik BD Insyte IV 20 GA X 1,8 8INBD381237Lub odpowiednik cewnika dożylnego 20 G
Szew jedwabny Blade (4-0)NescoGA04SBLub odpowiednik
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Cewnik do żyły szyjnej szczura, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301Zalecany dla myszy o wadze 30 g i mniejszej.
Cewnik do żyły szyjnej szczura, PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV1307Zalecany dla myszy o wadze powyżej 30 g.
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
Wtryskiwacze PinPortInstechPNP3M
, 22 GInstechPNP3F22-50Pasuje do C30PU-RJV1307
PinPorts, 25 GInstechPNP3F25-50Pasuje do C20PU-MJV1301
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
Sterylna strzykawka, 5 mlGeneryczny
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
HODOWLA
EGM-2 Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejLonzaC2519A
pompy EasyLoad IIICole-Parmer243934
kanisterHarioSCN-200TŚrednica wewnętrzna: 80 mm
Mieszadło magnetyczne grzewczeGeneric
Łącznik przynęty, PVDF, Do miękkiej rurkiNordson Medical2-9965-01Żeński, pasuje do rurki z ID 1.5 mm (L/S 14)
Złączka do przynęty, PVDF, Do miękkiej rurkiNordson Medical2-9964-01Męski, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzną 1.5 mm (L/S 14)
Złączka do przynęty, PVDF, Do miękkiej rurkiNordson Medical2-9965-03Żeński, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzną 3 mm (L/S 16)
Złączka przynęty, PVDF, do miękkiej rurkiNordson Medical2-9964-03Męska, pasuje do rurki z średnicą wewnętrzna 3 mm (L/S 16)
Mieszadło magnetyczneGeneric
Masterflex L/S Digital Precision Modular Drive ze zdalnym I/O i sterownikiem laboratoryjnymCole-Parmer07557-00
Rurka do pompy precyzyjnej Masterflex L/S, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Rurka do pompy Masterflex L/S Pricision, silikon utwardzany platyną, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylizowany promieniami gammaMilliporeSLGPR33RS
Butelka z trawą Pyrex 250 ml, zakrętka GL-45Corning1395-250
Silikonowa septa do GL45 Otwarta górna nakrętka PBTCorning1395-455S
Silikonowy korek świetlnyIMG07763-18Górna średnica: 87 mm, Dolna średnica: 75 mm
Sterylna strzykawka, 10 mL, 50 mlOgólny
CHIRURGIA MYSZY (Izolacja bloku płuco-serce | Przeszczep płuc)
10-0 Krawaty nylonoweKono SeisakushoN/A
10-0 Krawaty jedwabneKono SeisakushoN/A
4-0 Opaski jedwabneKono SeisakushoN/A
Zacisk tętniczy, zakrzywiony 45 mm, rowkowanyNatsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV Cewnik 24GABD381512Or odpowiednik cewnika dożylnego 24G
Kleszcze naczyniowe Bulldog 45mm zakrzywioneNatsume seisakusyoM2
Winian butorfanolu Meiji Seika PharmaN/A
CefazolinSodium Otsuka PharmaceuticalN/A
Kleszcze Dumonta #5/45Fine Science Tools1251-35
Cienkie nożyczki sprężynowe w stylu vannasFine Science Tools15403-08Końcówka 45°, 0,01 x 0,06 mm
Zestaw do kauteryzacji GeminiAparat HarvardRS-300
Zakrzywiona końcówka zacisku Halsted-Mosquito, 125 mmCentrum badań biologicznych16181670
Uchwyt na igłę Hegar, 150 mmB Braun/AesculapBM065R
Roztwór heparynyMochida SeiyakuN/A
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoN/A
Mikrokleszcze prosteB Braun/AesculapBD33R
MidazolamWentylator myszy SandozN/A
Aparat HarvardModel 687&handel;
Sól fizjologiczna, klasa klinicznaOtsuka PharmaceuticalN/A
szalka Petriego, 60 x 15 mmBD351007
Safelet Cath PU Cewnik poliuretanowy o rozmiarze 20 Nipro09-031
Nożyczki ze stali nierdzewnej Sakaki zakrzywione 14 cmCentrum biobadań64152034
Uchwyt na skalpelCentrum badań biologicznych16101040
System chowania małych zwierzątFine Science Tools18200-20
Zapasowy skalpel #11Muranaka Medical Instruments567-001-03
Nożyczki sprężynowe, 15 cmCentrum BiobadańPRI13-3736
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsM525Preferowany jest mikroskop chirurgiczny klasy klinicznej z elastycznym systemem ramienia.
Sugita tytanowy klips do tętniaka zakrzywiony smukły, nr 98Mizuho medical17-001-98
Tytanowy klips Sugita aplikator, 110 mmMizuho medical17-013-53
Podgrzewacz elektryczny z regulacją temperaturyOgólny
Ultracienki wacik bawełnianyOgólny
MANKIET
Grzywna papier ściernyOgólny
wentyl teflonowy angiocewnik Venula o grubości 20Top1160
Venula 22 kaliber Teflonowy angiocewnikTop1161
Venula 24 kaliber Teflonowy angiocewnikTop1124
KOMÓRKOWA BIOREAKTOR NA BAZIE PERFUZJI Igła 20 G Ogólny 3-drogowy kran Ogólny Świdr korkowy Ogólny rozmiar wytaczania, 6-10 mm Głowica Szkło NACZYNIOWY I OSKRZELOWY

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoffman, T. W. Waiting list dynamics and lung transplantation outcomes after introduction of the lung allocation score in the Netherlands. Transplant Direct. 7 (10), e760(2021).
  4. Wilk, A. R., Edwards, L. B., Edwards, E. B. The effect of augmenting OPTN data with external death data on calculating patient survival rates after organ transplantation. Transplantation. 101 (4), 836-843 (2017).
  5. Neizer, H., Singh, G. B., Gupta, S., Singh, S. K. Addressing donor-organ shortages using extended criteria in lung transplantation. Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 49-50 (2020).
  6. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  7. Anand, R. P. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
  8. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaco-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: An overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  9. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16 (8), 927-933 (2010).
  10. Petersen, T. H. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  11. Leiby, K. L. Rational engineering of lung alveolar epithelium. NPJ Regen Med. 8 (1), 22(2023).
  12. Kitano, K., et al. Orthotopic transplantation of human bioartificial lung grafts in a porcine model: A feasibility study. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 34 (2), 752-759 (2022).
  13. Ohata, K., Ott, H. C. Human-scale lung regeneration based on decellularized matrix scaffolds as a biologic platform. Surg Today. 50 (7), 633-643 (2020).
  14. Ren, X. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nat Biotech. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  15. Doi, R. Transplantation of bioengineered rat lungs recellularized with endothelial and adipose-derived stromal cells. Sci Rep. 7 (1), 8447(2017).
  16. Stone, K. C., Mercer, R. R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J. D. Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 6 (2), 235-243 (1992).
  17. Basil, M. C., Morrisey, E. E. Lung regeneration: a tale of mice and men. Semin Cell Dev Biol. 100, 88-100 (2020).
  18. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Weibel, E. R. Lung structure and the intrinsic challenges of gas exchange. Compr Physiol. 6 (2), 827-895 (2016).
  19. Tomiyama, F., et al. Orthotopic transplantation of the bioengineered lung using a mouse-scale perfusion-based bioreactor and human primary endothelial cells. Sci Rep. 14 (1), 7040(2024).
  20. Stoian, A., Adil, A., Biniazan, F., Haykal, S. Two decades of advances and limitations in organ recellularization. Curr Issues Mol Biol. 46 (8), 9179-9214 (2024).
  21. Crabbe, A. Recellularization of decellularized lung scaffolds is enhanced by dynamic suspension culture. PLoS One. 10 (5), e0126846(2015).
  22. Daly, A. B. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 1-16 (2012).
  23. Regulations for Animal Experiments and Related Activities. , Tohoku University. at https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/ (2024).
  24. Sokocevic, D., et al. The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs. Biomaterials. 34 (13), 3256-3269 (2013).
  25. Ren, X., et al. Ex vivo non-invasive assessment of cell viability and proliferation in bio-engineered whole organ constructs. Biomaterials. 52, 103-112 (2015).
  26. Watanabe, T. Mesenchymal stem cells attenuate ischemia-reperfusion injury after prolonged cold ischemia in a mouse model of lung transplantation: a preliminary study. Surg Today. 47 (4), 425-431 (2017).
  27. Watanabe, T., et al. Donor IL-17 receptor A regulates LPS-potentiated acute and chronic murine lung allograft rejection. JCI Insight. 8 (21), e158002(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung BioengineeringDecellularized Mouse LungsHuman Endothelial CellsOrgan TransplantationPerfusion Organ CultureBioreactor SetupHeart Lung BlockRecellularization ProtocolHistological AnalysisCapillary Network Formation

Related Articles