Techniki hodowli i przetwarzania trójwymiarowych organoidów dla powstawania mięśniaków miometrialnych i macicy

Summary

Protokół ten określa ręcznie wykonywaną technikę tworzenia hydrożeli zawierających kolagen, osadzonych w trójwymiarowych hodowlach organoidalnych komórek macierzystych z tkanki mięśniaków miometrialnych i macicznych.

Abstract

Mięśniaki macicy są najczęstszymi łagodnymi, monoklonalnymi guzami ginekologicznymi w macicy kobiety. Aby pokonać typowe przeszkody związane z metodami badań tych patologii, dążyliśmy do opracowania strategii tworzenia trójwymiarowych modeli organoidów komórek macierzystych miometrium i mięśniaków macicy, wykorzystując hydrożele zawierające kolagen jako rusztowania osadzające. Konkretnie wykorzystano hydrożele zawierające kolagen w płytkach o niskim przyczepie V-bottom z 96 dołkami. Metoda ta umożliwiła opracowanie trójwymiarowych organoidów dwóch typów komórek macierzystych z prawidłowego miometrium oraz mięśniaków macicy, poprzez osadzenie ich w hydrożelach zawierających kolagen i tworzenie organoidów w odpowiednim ośrodku do proliferacji komórek macierzystych. Organoidy skutecznie różnicowały się, rozmnażały i samoorganizowały w złożone struktury, tworząc zrównoważony system. Znaczenie tego modelu polega na zrozumieniu patofizjologii i etiopatogenezy, a także w testowaniu nowych leków zapobiegających lub leczących mięśniaków macicy.

Introduction

Mięśniaki macicy, czyli leiomyomy, są najczęstszymi łagodnymi guzami macicy¹. Dotykają znaczną część kobiet w okresie rozrodczym, a badania sugerują, że około 77% kobiet doświadcza ich w pewnym momencie. Podczas gdy wiele kobiet ma mięśniaki bez objawów, aż 25% doświadcza takich objawów jak nieprawidłowe krwawienie z macicy, ból miednicy czy niepłodność². Rozwój i wzrost mięśniaków są zależne od różnych czynników, w tym hormonów płciowych, czynników wzrostu, zmian genetycznych i innych mechanizmów biologicznych³.

Aby badać patogenezę i testować skuteczność leków, opracowano modele in vitro i modele zwierzęce. Komórki w hodowlach 2D są zmuszane do wzrostu na płaskiej powierzchni, co zniekształca ich kształt i zmienia zachowanie w porównaniu do zachowania w środowisku tkanek 3D. Główną wadą kultury 2D w porównaniu do 3D jest słabe odzwierciedlenie naturalnego środowiska komórkowego w tkance, nie odwzorowując dokładnie złożonych interakcji między komórkami i matrycami komórkowymi, które zachodzą w organizmie żywym, co prowadzi do potencjalnie niedokładnych wyników podczas badania zachowań i reakcji komórek na bodźce⁴. Dodatkowo, komórki UF i miometrialne szybko tracą reakcję hormonalną w kulturze^{2D 5}. Ogólnie rzecz biorąc, różne modele zwierzęce dostarczyły istotnych informacji dotyczących patofizjologii UF⁶. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, organoidy 3D oferują kilka zalet: upraszczają eksperymenty, są kompatybilne z obrazowaniem w czasie rzeczywistym oraz umożliwiają badanie specyficznych dla człowieka aspektów rozwojowych i chorób, które nie są dobrze reprezentowane w modelach zwierzęcych⁷. Z drugiej strony, eksperymenty z bardziej zaawansowanymi zwierzętami, takimi jak naczelne, są bardzo trudne do uzasadnienia etycznie, a do tego wysokie koszty⁸. Model 3D organoidów jest zazwyczaj lepszy od hodowli komórek 2D, ponieważ wierniej naśladuje architekturę tkanek in vivo , a jednocześnie jest bardziej kontrolowany, wydajny i opłacalny niż modele zwierzęce. Dlatego kluczowe jest opracowanie skuteczniejszych modeli alternatywnych, które wiernie oddają naturalny wzrost komórek i złożoność chorych tkanek.

Naszym celem było przygotowanie procedury do przeprowadzenia 3D hodowli organoidów mięśniaków mięśniaków i macicy z użyciem hydrożeli zawierających kolagen, z procedurą manualną, podkreślając główne zalety i ograniczenia.

Protocol

Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etnicznych Uniwersytetu Chicagowskiego, z numerem zatwierdzenia IRB#20-1414. Według banku tkanek Uniwersytetu Chicagowskiego, świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich osób, od których pobrano tkankę.

1. 3D kultura organoidów

1. Hodować i utrzymywać izolowane i oczyszczone miometrialne oraz komórki macierzyste UF (SC), jak opisano wcześniej⁹.
2. Uzyskaj SC z ciekłego azotu i pozwól im się rozmrozić. Diagram przepływowy procesu hodowli przedstawiony jest na Rysunku 1.
3. Dodaj 5 ml białka czynnika przywiązania, aby przygotować kolbki z wstępną powłoką. Inkubuj przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 37 °C. Następnie wyrzuć nadmiar białka czynnika przywiązania.
4. Hodować SC w kolbach o pojemności 75 cm^2, używając 10 mL podłoża zawierającego zarówno zmodyfikowane medium Eagle's (DMEM) Dulbecco, jak i F12, uzupełnione surowicą płodową bydła (FBS) o 12%. Inkubuj kolbę w inkubatorze niedotlenienia 37 °C z stężeniem tlenu 2% aż do osiągnięcia 90% zbiegu, jak pokazano na Rysunku 2A.
   UWAGA: Hipoksja może odgrywać istotną rolę w rozwoju komórek macierzystych, ponieważ może wspierać ich proliferację i przeżycie.
5. Po osiągnięciu połączenia komórek odłącz komórki za pomocą roztworu 25% trypsyny-0,1% EDTA w HBSS bez wapnia i magnezu.
   1. Aby to zrobić, usuń podłoże do hodowli komórkowych. Przemyj komórki 1x PBS. Dodaj 1 ml trypsyny do jednej komórki o powierzchni 25 cm² i inkubuj przez 2-3 minuty.
   2. Gdy komórki zaczną się odłączać, dodaj podłoże z surowicą, aby zatrzymać reakcję trypsyną. Aspiruj roztwór ogniwa do probówki 15 mL i wiruj przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej.
   3. Ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając granulat nienaruszony.
6. Następnie ponownie zawiesz osad komórkowy w 1 mL medium proliferającego komórki macierzyste wolne od surowicy. Rozproszyj grudki delikatnym pipetowaniem.
7. Wykonaj ilościową identyfikację komórek za pomocą hemocytometru.
   1. Wymieszaj 100 μL zawiesiny ogniwowej z 10 μL 0,4% roztworu Trypan Blue.
   2. Krótko zawiruj mieszaninę i pipetuj 10 μL zawiesiny Trypana z niebieskich komórek do komory hemocytometru pomiędzy wcięciem komory a szklaną pokrywą ( Rysunek 2B).
   3. Polić komórki w polach 1-4, użyj następujących równań do obliczenia liczby komórek:
      Komórki/mL = (liczba policzonych komórek/łączna liczba policzonych pudełek) x współczynnik rozcieńczenia x 10 000
      Łączna liczba komórek w próbce = komórki/mL x całkowita objętość próbki
8. Wymieszaj około 10 000 komórek z 2 μL hydrożeli zawierających kolagen oraz 98 μL bezsurowicowych komórek macierzystych proliferającego medium, co daje końcową objętość 100 μL^{na dołek}5 dla płytki V-bottom z 96 dołkami.
9. Pipeta włóż 100 μL mieszaniny komorowej do każdego dołku płytki o niskim przyczepie V-bottom z 96 dołkami. Wiruj w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ilości 100 x g.
10. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5%_CO2 na 30 minut.
11. Dodaj do każdego dołku dodatkową objętość 100 μL bezserowych komórek macierzystych proliferujących bez hydrożeli zawierających kolagen, aby zapewnić niezbędne składniki odżywcze do wzrostu organów.
12. Kompensuj odparowanie w ośrodku, dodając 10-20 μL bezsurowicowych komórek macierzystych do każdej dołki w przypadku nadmiernego parowania, które zdarza się rzadko.
13. Hodować komórki przez 7 dni, aby zapewnić pełny wzrost organoidów (rysunek 2C-H). Zmieniaj medium proliferujące komórki macierzyste wolne od surowicy dwa razy w tygodniu (delikatnie aspirując stare medium, a następnie dodając świeże medium), aby wydłużyć hodowlę organoidów pochodzących od SC do 21 dni.

2. Sekcjonowanie mrożone

1. Pobierz komórki z płyty 96-dołkowej w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
2. Do kriosekcji płucz organoidy 2 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS; 1x). Dodaj 500 μL PBS do organoidów, następnie wiruj i wyrzucaj supernatant.
3. Utrwalić organoidy 500 μL 4% paraformaldehydu (PFA) przez 60 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ponownie przemyć 1x PBS.
4. Ponownie zawiesij organoidy w 100 μL 2% błękitu metylenowego, aby barwić przez 20 minut. Przemyj 1x PBS i krioprotekcję przez noc, zawieszając w 500 μL 30% sacharozy.
5. Następnego dnia usuń roztwór sacharozy przez wirowanie. Organoidy osadzić w związku o Optymalnej Temperaturze Cięcia (OCT) i zamrożenie gwałtownie w temperaturze −80 °C.
6. Organoidy osadzone w OCT przecinają za pomocą kriostatu, optymalna głębokość przekroju wynosi 10 μm, a następnie natychmiast umieszczają przekroje na szkiełkach, po jednym przekroju na każdej szkiełce.
7. Utrzymuj szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego według następującej metody.
8. Umyj zamk 3 razy 100 μL 1x PBS. Następnie dodaj 100 μL 0,1% trytonu do PBS (1x) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
9. Blokuj organoidy 5% BSA w 1x PBS przez 60 minut i inkubuj przez noc z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko Sox-2 z rozcieńczeniem (1:500) oraz aktyną mięśni gładkich α (α-SMA) z końcowym stężeniem 1 μg/mL.
10. Przemyj organoidy 100 μL 1x PBS 3x, a następnie inkubuj przez 1 godzinę w ciemności z fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi Alexa Fluorescent (1:1000).
11. Przemyj 100 μL 1x PBS 2x, a następnie zamontuj w medium montażowym Antifade z dodatkiem DAPI (1 ng/mL).
12. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 20x. Zobacz rysunek 3A i przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy bioobrazowania.

3. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów całopowierzchniowych

1. Wyjmij organoidy z podłoża (krok 1.11) do rurki mikrowirówki i myj 2 razy 500 μL 1x PBS.
2. Utrwalaj organoidy 500 μL 4% PFA przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć PFA i przepłucz 500 μL PBS 3x.
3. Przepuszczaj stałe organoidy 0,5 mL bufora blokującego przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnego dnia usuń bufor blokujący, dodaj przeciwciała pierwotne (300-500 μL) kolagenu III (COL3A1) z rozcieńczeniem (1:500) oraz AHR z rozcieńczeniem (1:1000), a następnie inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
5. Przemyj organoidy 3 razy 500 μL 1x PBS, a następnie inkubuj z przeciwciałami wtórnymi (594 przeciwciała dla kóz i 488 przeciw myszom dla kóz) przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
6. Przepłucz organoidy 3x 500 μL 1x PBS, następnie inkubuj z 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) w 1x PBS (300-500 μL na próbkę) w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
7. Przemyj organoidy trzy razy 500 μL 1x PBS i obrazuj na mikroskopie konfokalnym (Rysunek 3B).

4. Dysocjacja organoidów

1. Rekonfunduj 100 mg papainy w filtrowanym roztworze aktywacyjnym do stężenia 250 U/mL, inkubuj roztwór w 37 °C przez 30 minut, aby aktywować enzym
   UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 2–8 °C przez nawet 2 tygodnie.
2. Przygotuj roztwór dysocjacyjny (bezpośrednio przed użyciem) z 30 U/mL papainy i 125 U/mL DNazy I w roztworze Hanksa Balanced Salt Solution (HBSS).
3. Przenieś organoidy (krok 1.11) na płytki z 24 dołkami i dodać 500 μL roztworu dysocjacyjnego.
4. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut na orbitalnym shakerze ustawionym na 90 obr./min.
5. Tryturuj przerywanie 5x-6x za pomocą pipettora o pojemności 1 mL w temperaturze pokojowej, aby uzyskać zawiesinę składającą się głównie z pojedynczych komórek.
6. Umieść zawiesinę ogniwa w rurce wirówki o pojemności 15 mL zawierającej roztwór inhibitora proteazy (1 mL 10 mg/mL) i wiruj w 300 x g przez 5 minut, aby wypuścić komórki i wyrzucić supernatant.
7. Ponownie zawiesić komórki w odpowiednim buforze, a powstała zawiesina pojedynczych komórek jest pokazana na rysunku 2I.

Results

Już pierwszego dnia po zasiewaniu SC zaczęły się samoagregować, tworząc organoidy, jak pokazano. Ustaliliśmy optymalną gęstość wysiewu na 10 000 SC, które konsekwentnie tworzyły organoidy podczas uprawy w określonym systemie hodowlanym. System ten wykorzystywał hydrożele zawierające kolagen jako rusztowanie ECM dla osadzonych komórek macierzystych i medium do proliferacji komórek macierzystych przez 7 dni w ultranisko przymocowanej płytce 96-dołkowej (Rysunek 2C-G

Discussion

Organoidy to trójwymiarowe struktury przypominające miniaturyzowane narządy i składają się z samoorganizujących się komórek pochodzących z komórek macierzystych lub próbek tkanek¹¹. Tkankowe organoidy komórek macierzystych pacjentów mają potencjał zrewolucjonizowania badań biomedycznych i zastosowań klinicznych dzięki niezwykłej zdolności do dokładnego odwzorowania fizjologii i choroby UF¹². Tutaj badanie próbuje zniwelować tę lukę, wprowadzając system hodowli organoidów po...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fotonowy confocal  Mikroskop	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 mikropłyt sferoidalnych	InSphero	CS-09-004-03	Płytki typu V-bottom z niskim mocowaniem
Alexa Fluor 488 kozi antymysuszy IgG	Life Technologies, Kalifornia, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 koziczy antykróliczy IgG	Life Technologies, Kalifornia, USA	(A11037)	(1:1000)
Anty-Ahr [RPT]	GeneTex, Tajwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anty-alfa przeciwciało na mięśnie gładkie Aktyna	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & mikro; g/mL
Przeciwciało anty-Kolagen III	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Przeciwciało przeciw SOX1 & nie;	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Czynnik przywiązania	Gibco, USA	S-006-100
Blokowanie bufora	Dako	X0909	5%  surowica końska & nbsp;+ 0,5% & nbsp; Triton X-100  w 1X  PBS
Kriostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol)	Thermo Scientific, Niemcy	62248	1 mg/mL
DNaza I	Thermo-Scientific, Litwa	EN0521
Dullbecco' zmodyfikowanego Eagle' średnie DMEM i  F12	Gibco, USA	21041-025
Serum bydła płodu	Omega Scientific i nie wiadomo; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hydrożele zawierające kolagen)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (medium proliferujące komórki macierzyste bez surowicy & )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
Związek OCT (Związek o optimalnej temperaturze cięcia)	Sakura, USA	4583
Mikroskop Olympus BX41 oraz nbsp;	Olympus America, Center Valley, PA
Roztwór inhibitora proteazy owomukoidalnej	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	roztwór aktywacyjny (1,1 mM EDTA, 0,067 mM merkaptoetanolu, 5,5 mM L-cysteiny HCl)
PBS (sól fizjologiczna z buforem fosforanow)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldehyd) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. i in.  QuPath: oprogramowanie open source do analizy obrazów w patologii cyfrowej. Raporty naukowe  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Oprogramowanie do analizy bioobrazowania
Mikroskop poklatkowy
Kolby do hodowli tkanek	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsyna	Gibco, USA	A12859-01	0,25% trypsyny i 0,1% EDTA w HBSS bez wapnia lub magnezu
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium uzupełnione DAPI	Vector Laboratories, Kalifornia, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL