Techniki hodowli i przetwarzania trójwymiarowych organoidów dla powstawania mięśniaków miometrialnych i macicy

Summary

Protokół ten określa ręcznie wykonywaną technikę tworzenia hydrożeli zawierających kolagen, osadzonych w trójwymiarowych hodowlach organoidalnych komórek macierzystych z tkanki mięśniaków miometrialnych i macicznych.

Abstract

Mięśniaki macicy są najczęstszymi łagodnymi, monoklonalnymi guzami ginekologicznymi w macicy kobiety. Aby pokonać typowe przeszkody związane z metodami badań tych patologii, dążyliśmy do opracowania strategii tworzenia trójwymiarowych modeli organoidów komórek macierzystych miometrium i mięśniaków macicy, wykorzystując hydrożele zawierające kolagen jako rusztowania osadzające. Konkretnie wykorzystano hydrożele zawierające kolagen w płytkach o niskim przyczepie V-bottom z 96 dołkami. Metoda ta umożliwiła opracowanie trójwymiarowych organoidów dwóch typów komórek macierzystych z prawidłowego miometrium oraz mięśniaków macicy, poprzez osadzenie ich w hydrożelach zawierających kolagen i tworzenie organoidów w odpowiednim ośrodku do proliferacji komórek macierzystych. Organoidy skutecznie różnicowały się, rozmnażały i samoorganizowały w złożone struktury, tworząc zrównoważony system. Znaczenie tego modelu polega na zrozumieniu patofizjologii i etiopatogenezy, a także w testowaniu nowych leków zapobiegających lub leczących mięśniaków macicy.

Introduction

Mięśniaki macicy, czyli leiomyomy, są najczęstszymi łagodnymi guzami macicy¹. Dotykają znaczną część kobiet w okresie rozrodczym, a badania sugerują, że około 77% kobiet doświadcza ich w pewnym momencie. Podczas gdy wiele kobiet ma mięśniaki bez objawów, aż 25% doświadcza takich objawów jak nieprawidłowe krwawienie z macicy, ból miednicy czy niepłodność². Rozwój i wzrost mięśniaków są zależne od różnych czynników, w tym hormonów płciowych, czynników wzrostu, zmian genetycznych i innych mechanizmów biologicznych³.

Aby badać patogenezę i testować skuteczność leków, opraco....

Protocol

Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etnicznych Uniwersytetu Chicagowskiego, z numerem zatwierdzenia IRB#20-1414. Według banku tkanek Uniwersytetu Chicagowskiego, świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich osób, od których pobrano tkankę.

1. 3D kultura organoidów

1. Hodować i utrzymywać izolowane i oczyszczone miometrialne oraz komórki macierzyste UF (SC), jak opisano wcześniej⁹.
2. Uzyskaj SC z ciekłego azotu i pozwól im się rozmrozić. Diagram przepływowy procesu hodowli przedstawiony jest na Rysunku 1.
3. Dodaj 5 ml białka czynnika przywiązania, aby przy....

Results

Już pierwszego dnia po zasiewaniu SC zaczęły się samoagregować, tworząc organoidy, jak pokazano. Ustaliliśmy optymalną gęstość wysiewu na 10 000 SC, które konsekwentnie tworzyły organoidy podczas uprawy w określonym systemie hodowlanym. System ten wykorzystywał hydrożele zawierające kolagen jako rusztowanie ECM dla osadzonych komórek macierzystych i medium do proliferacji komórek macierzystych przez 7 dni w ultranisko przymocowanej płytce 96-dołkowej (Rysunek 2C-G

Discussion

Organoidy to trójwymiarowe struktury przypominające miniaturyzowane narządy i składają się z samoorganizujących się komórek pochodzących z komórek macierzystych lub próbek tkanek¹¹. Tkankowe organoidy komórek macierzystych pacjentów mają potencjał zrewolucjonizowania badań biomedycznych i zastosowań klinicznych dzięki niezwykłej zdolności do dokładnego odwzorowania fizjologii i choroby UF¹². Tutaj badanie próbuje zniwelować tę lukę, wprowadzając system hodowli organoidów po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-fotonowy confocal  Mikroskop	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 mikropłyt sferoidalnych	InSphero	CS-09-004-03	Płytki typu V-bottom z niskim mocowaniem
Alexa Fluor 488 kozi antymysuszy IgG	Life Technologies, Kalifornia, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 koziczy antykróliczy IgG	Life Technologies, Kalifornia, USA	(A11037)	(1:1000)
Anty-Ahr [RPT]	GeneTex, Tajwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anty-alfa przeciwciało na mięśnie gładkie Aktyna	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 & mikro; g/mL
Przeciwciało anty-Kolagen III	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Przeciwciało przeciw SOX1 & nie;	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Czynnik przywiązania	Gibco, USA	S-006-100
Blokowanie bufora	Dako	X0909	5%  surowica końska & nbsp;+ 0,5% & nbsp; Triton X-100  w 1X  PBS
Kriostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol)	Thermo Scientific, Niemcy	62248	1 mg/mL
DNaza I	Thermo-Scientific, Litwa	EN0521
Dullbecco' zmodyfikowanego Eagle' średnie DMEM i  F12	Gibco, USA	21041-025
Serum bydła płodu	Omega Scientific i nie wiadomo; Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (hydrożele zawierające kolagen)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (medium proliferujące komórki macierzyste bez surowicy & )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
Związek OCT (Związek o optimalnej temperaturze cięcia)	Sakura, USA	4583
Mikroskop Olympus BX41 oraz nbsp;	Olympus America, Center Valley, PA
Roztwór inhibitora proteazy owomukoidalnej	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	roztwór aktywacyjny (1,1 mM EDTA, 0,067 mM merkaptoetanolu, 5,5 mM L-cysteiny HCl)
PBS (sól fizjologiczna z buforem fosforanow)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldehyd) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. i in.  QuPath: oprogramowanie open source do analizy obrazów w patologii cyfrowej. Raporty naukowe  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Oprogramowanie do analizy bioobrazowania
Mikroskop poklatkowy
Kolby do hodowli tkanek	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsyna	Gibco, USA	A12859-01	0,25% trypsyny i 0,1% EDTA w HBSS bez wapnia lub magnezu
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium uzupełnione DAPI	Vector Laboratories, Kalifornia, USA	#  UX-93952-24	1  ng/mL