Płukanie nosa solą fizjologiczną może być użyte do pobrania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa psa. Ponieważ podejście to jest stosunkowo nieinwazyjne i nie narusza tkanek nosa, można je wykonywać seryjnie. Komórki i białka pobrane z techniki płukania nosa mogą być przetwarzane do różnych analiz laboratoryjnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Płukanie solą fizjologiczną do pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena lokalnego mikrośrodowiska immunologicznego w jamie nosowej psa może być ważna dla badania prawidłowego stanu tkanek i stanów chorobowych, szczególnie tych związanych z miejscowym stanem zapalnym. Zoptymalizowaliśmy technikę oceny lokalnego mikrośrodowiska immunologicznego nosa psów za pomocą seryjnego płukania nosa. Krótko, gdy psy są pod narkozą i znajdują się w pozycji leżącej mostka, wstępnie podgrzana sterylna sól fizjologiczna jest spłukiwana do chorego nozdrza za pomocą elastycznego cewnika z miękkiej gumy. Przepływ wsteczny płynu jest zbierany do stożkowych rurek i proces ten się powtarza. Płyny zawierające usunięte komórki i białka są łączone, a zebrane próbki płukania nosa są filtrowane przez sitko komórkowe w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń i śluzu. Próbki są odwirowywane, a granulki komórek są izolowane do analizy. Po przetworzeniu próbek analizy, które mogą nastąpić po płukaniu nosa, obejmują cytometrię przepływową, analizę transkryptomiczną komórek za pomocą sekwencjonowania RNA masowego lub jednokomórkowego i/lub oznaczanie ilościowe cytokin obecnych w płynie płukanym.
Wprowadzenie
U psów rutynowo rozwijają się stany zapalne nosa przez całe życie. Podstawowa przyczyna ostrego lub przewlekłego nieżytu nosa u psów może wahać się od zakaźnego (wirusowego: np. grypy, paragrypy, herpeswirusów; bakteryjnego [np. Bordetella, mykoplazmy], grzybiczego [np. aspergiloza, kryptokokoza]; pasożytniczego [np. Roztocza nosa]) do nowotworowego (np. nowotwory zatok przynosowych, najczęściej histotypy raka lub mięsaka) do ciała obcego (np. ciało obce, donosowa migracja przemieszczonych zębów) do chorób przyzębia, a także idiopatyczny zapalny nieżyt nosa u psów1,2,3,4,5,6,7.
Oprócz badania fizykalnego, stosuje się różne podejścia do oceny stanu jamy zatokowej u psów z zapaleniem nosa. Procedury obrazowania mogą obejmować zdjęcia rentgenowskie (zębowe, czaszki), tomografię komputerową (CT) lub rezonans magnetyczny (MRI). Innym podejściem do obrazowania jamy nosowej jest rynoskopia. Pobieranie próbek tkanek może obejmować pobieranie wymazów z nosa, próbek szczoteczek lub biopsji tkanek, na podstawie których można przeprowadzić ocenę cytologiczną i/lub histopatologiczną, a także pobranie próbki do hodowli grzybów lub bakterii. Próbki te można uzyskać na różne sposoby, od "ślepego" pobierania próbek, po obrazowanie za pomocą rynoskopii lub zaawansowanego obrazowania, i pozyskiwane przez nozdrza, z nosogardzieli lub z chirurgicznym podejściem trepanacji, rynotomii lub sinusotomii.
Płukanie nosa, które polega na podawaniu sterylnego roztworu soli fizjologicznej do jamy nosowej, było również używane do pobierania próbek z jamy nosowej psów w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Alternatywna wersja techniki płukania nosa, która była stosowana w przypadku guzów nosa, jest określana jako hydropulsacja nosa, opisana jako silne płukanie nosa, które może usunąć duże próbki guza w celu oceny diagnostycznej, a także zapewnić ulgę terapeutyczną w celu poprawy objawów klinicznych związanych z rakiem nosa8.
Prezentujemy tutaj kolejną wersję techniki płukania nosa do zamierzonego celu zbierania i analizowania komórek i białek mikrośrodowiska immunologicznego nosa. Dzięki delikatnemu, stosunkowo nieinwazyjnemu podejściu, zoptymalizowaliśmy tę technikę płukania nosa do seryjnego pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa. W badaniach z udziałem psów z niezapalnymi jamami nosowymi, aktywnym zakażeniem wirusem opryszczki i guzami zatok przynosowych wykazaliśmy przydatność płukania nosa do pobierania i przetwarzania próbek do dalszych zastosowań9,10.
W tym manuskrypcie opisujemy technikę płukania nosa solą fizjologiczną do seryjnego pobierania próbek mikrośrodowiska immunologicznego nosa u psów. Zapewniamy szczegóły protokołu skutecznego pozyskiwania próbki płukania nosa przy minimalnym zakłóceniu tkanek, a następnie przetwarzania próbek do różnych analiz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ta procedura płukania nosa została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Kolorado oraz Komisję Oceny Klinicznej (IACUC #2425). Schemat metody płukania nosa przedstawiono w Rysunek 1.
1. Przygotowanie do płukania nosa
- Dzień przed zabiegiem płukania nosa napełnij pięć strzykawek o pojemności 20 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,9% roztwór chlorku sodu) i zamknij nakrętką. Umieścić strzykawki w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 oC, aby mogły się ogrzać przez noc.
2. Ułożenie psa do płukania nosa
- Znieczulić psa do zabiegu (np. poprzez dożylne (IV) wstrzyknięcie deksmedetomidyny (1-4 μg/kg) i butorfanolu (0,2-0,5 mg/kg) przez cewnik dożylny), a następnie podać propofol IV (2-5 mg/kg) miareczkowany do momentu intubacji; utrzymać znieczulenie 1-2% izofluranem wziewnym, aby uzyskać efekt). Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając reakcję powiekową i ton szczęki.
- Nasmaruj oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
- Monitoruj dane telemetryczne serca, ciśnienie krwi, kapnografię i wartości pulsoksymetrii przez cały czas trwania zabiegu.
- Ułóż znieczulonego psa w pozycji leżącej mostka. Umieść głowę psa tak, aby była naturalnie i wygodnie ustawiona pod kątem w dół od krawędzi stołu zabiegowego, aby uzyskać optymalne pobranie próbki z płukania nosa.
- Napompuj mankiet rurki dotchawiczej, aby zapewnić szczelne uszczelnienie dróg oddechowych.
3. Wykonywanie płukania nosa
- Wytnij sterylny, czerwony gumowy cewnik 8 FR u podstawy, tak aby ściśle przylegał do jednej z ampułkostrzykawek o pojemności 20 ml zawierających ciepłą sól fizjologiczną. Zmierz sterylny cewnik z czerwonej gumy tak, aby dystalna końcówka cewnika sięgała mniej więcej do połowy jamy nosowej po wprowadzeniu przez nozdrze. W przypadku pobierania próbki guza nosa należy skorzystać z obrazowania lub wskazówek rynoskopowych, aby oszacować lokalizację aspektu rostralnego guza nosa w celu zmierzenia długości cewnika z czerwonej gumy, tak aby końcówka rozciągała się do aspektu rostralnego guza.
- Następnie odetnij cewnik na końcówce na określoną długość cewnika donosowego, tak aby końcówka wylądowała w odpowiednim miejscu po włożeniu do jamy nosowej. Należy jednak pozostawić dodatkową długość podstawy cewnika wystającą na zewnątrz nozdrza (długość cewnika od punktu mocowania strzykawki do wejścia do nozdrza, około 3-5 cm). Nałóż znak trwałym markerem na podstawowy koniec cewnika, aby wskazać punkt początkowy, odpowiadający wejściu do nozdrza; Z góry określona długość cewnika będzie rozciągać się donosowo, a końcówka cewnika będzie umieszczona w żądanym miejscu w jamie nosowej.
- Wykonanie zabiegu płukania nosa będzie wymagało udziału dwóch osób. Niech jedna osoba (osoba A) będzie odpowiedzialna za wprowadzenie cewnika do jamy nosowej i podanie płukania, a druga osoba (osoba B) za pobranie próbki wychodzącej z nosa.
- Niech osoba A ustawi się przed i poniżej głowy psa. Rękami w rękawiczkach poproś osobę A, aby delikatnie poprowadziła końcówkę czerwonego gumowego cewnika do przyśrodkowej części jamy nosowej i przesuwała go, aż znak na cewniku zrówna się z zewnętrzną częścią nozdrza. Podczas tego procesu upewnij się, że cewnik jest podłączony do strzykawki zawierającej podgrzaną sterylną sól fizjologiczną. Niech osoba B trzyma stożkową rurkę o pojemności 50 ml poniżej nozdrza z założonym cewnikiem.
- Osoba A delikatnie zamyka przeciwległe nozdrze i zaczyna wlewać sól fizjologiczną do jamy nosowej z powolnym, stałym naciskiem lub pulsacyjnym wlewem. Ponieważ głowa psa jest ustawiona pod kątem skierowanym w dół, osoba B zbiera płyn, który spływa z jamy nosowej grawitacyjnie do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
- Powtórz tę technikę płukania nosa dla maksymalnie pięciu 20 ml płukania solą fizjologiczną, zmieniając stożkowe rurki w razie potrzeby w celu zebrania zbiorczych próbek. Zanotować całkowitą objętość zebranego płynu z płukania nosa w stosunku do ilości soli fizjologicznej podanej po zakończeniu zabiegu.
- Po zakończeniu, jeśli jest znieczulony deksmedetomidyną, należy podać domięśniowo taką samą objętość atipamezolu, jak w przypadku deksmedetomidyny, i pozwolić psu dojść do siebie po znieczuleniu. Aby zachować ostrożność, trzymaj psa w pozycji leżącej mostka z głową skierowaną w dół, aby ułatwić dodatkowy drenaż resztek soli fizjologicznej z płukania nosa.
4. Przetwarzanie próbki płukania nosa
- Delikatnie zmieszać i/lub odpipetować próbki płukania nosa znajdujące się w stożkowych rurkach, aby rozbić grudki zanieczyszczeń i komórek. Przełóż zebrane próbki płukania nosa przez filtr odcedzający komórki o średnicy 70 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia i śluz. Odwirować próbki o masie 300 × g przez 5-10 minut, aby utworzyć osad komórkowy.
- Zebrać supernatant przez aspirację pipetą i umieścić go w czystej probówce w celu analizy interesujących białek.
- Zawiesić osady komórkowe w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) lub preferowanym roztworze do testów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.
- Aby usunąć czerwone krwinki z próbek, wykonaj lizę chlorku amonu i potasu (ACK) w celu zebrania komórek jądrzastych z płukania nosa11,12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W przypadku zastosowania tej metody płukania nosa zebrana próbka będzie lekko mętna, a po zakręceniu probówką mogą być widoczne fragmenty debris komórkowego i śluzu. Próbkę uzna się za zanieczyszczoną krwią obwodową, jeśli procedura płukania nieumyślnie wywoła krwawienie, a próbka nabierze czerwonego zabarwienia. Choć część wprowadzonej soli fizjologicznej zostanie utracona podczas procedury, płukanie uzna się za negatywne, jeśli wprowadzona sól fizjologiczna nie wypłynie z nozdrza do probówki; potencjalnymi przyczynami ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W protokole płukania nosa składa się kilka krytycznych kroków. W odniesieniu do psa poddawanego zabiegowi płukania nosa, pies musi znajdować się w wystarczająco głębokiej płaszczyźnie znieczulenia, aby nie zareagował na założenie cewnika lub podanie płukania. Jeśli są reaktywne w znieczuleniu, może to pogorszyć jakość i ilość pobranych próbek z płukania, a także potencjalnie zwiększyć ryzyko ostrego uszkodzenia tkanki nosa z powodu miejscowego urazu z cewnika donosowego lub dla psa zasysającego płyn z płukania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Opisana tutaj technika płukania nosa dla psów została zoptymalizowana dzięki projektom wspieranym przez K01 OD03109, CCTSI Colorado Pilot Grant Award, CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program, oraz CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Dętki | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 µ L Pipeta | VWR | 89079-974 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL Strzykawki | VWR | BD302830 | |
| 50 mL Probówki stożkowe | VWR | 89039-656 | |
| 70 µ m Sitko do komórek | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR Sterylny czerwony gumowy cewnik | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK Bufor do lizy | Gibco | A1049201 | |
| Wirówka | Beckman Coulter | 366816 | |
| Sól fizjologiczna (0,9%) | Vetivex | 17033-492-01 | |
| Vortex | VWR | Numer katalogowy: 10153-838 |
Bibliografia
- Cohn, L. A. Canine nasal disease: An update. Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).
- Mortier, J., Blackwood, L. Treatment of nasal tumours in dogs: A review. J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).
- Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases. J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).
- Windsor, R. C., Johnson, L. R. Canine chronic inflammatory rhinitis. Clin Tech Small Anim Practice. 21 (2), 76-81 (2006).
- Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. Pathogenesis and treatment of canine rhinitis. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).
- Hazuchova, K., Neiger, R., Stengel, C. Topical treatment of mycotic rhinitis-rhinosinusitis in dogs with meticulous debridement and 1% clotrimazole cream: 64 cases (2007-2014). JAVMA. 250 (3), 309-315 (2017).
- Lobetti, R. Idiopathic lymphoplasmacytic rhinitis in 33 dogs. JS Afr Vet Assoc. 85 (1), 1-5 (2014).
- Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique. JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).
- Wheat, W., et al. Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs. BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).
- Darragh, L. B., et al. Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors. Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).
- Pinard, C. J., et al. Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients. Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).
- Choi, J. W., et al. Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function. PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
