Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

875 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67578

⸱

24 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Streszczenie

Skóra, jako największy organ w ludzkim ciele współpracujący ze środowiskiem zewnętrznym, odgrywa kluczowe funkcje fizjologiczne, w tym (1) chroni organizm przed ksenobiotykami i mikroorganizmami, (2) ułatwia termoregulację, (3) utrzymuje równowagę wody i elektrolitów, (4) syntezuje witaminę D oraz (5) uczestniczy w odporności. Niniejszy artykuł podkreśla kluczowe zaangażowanie skóry w mechanizmy immunologiczne, ukazując jej zdolność do immunomodulacji poprzez tłumienie lub wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej. Wcześniejsze wyniki pokazują, że u myszy immunizacja naskórna (EC) antygenem, samodzielnie lub w połączeniu z patogenowymi wzorcami molekularnymi (PAMP), może odpowiednio tłumić lub wzmacniać odpowiedzi immunologiczne. Konkretnie zaobserwowano, że szczepienia EC antygenem mogą hamować odpowiedzi immunologiczne w różnych modelach mysich chorób autoimmunologicznych lub alergicznego kontaktowego zapalenia skóry. Wyniki wskazują, że szczepienia EC antygenem w połączeniu z PAMPs mogą stanowić skuteczną strategię wzmacniającą odporność przeciw patogenom lub łagodząc alergie zależne od limfocytów typu 2 (Th2) wspierających T. Protokół ten określa metodę indukowania tłumienia skóry poprzez nadoskórne zastosowanie antygenu w mysiim modelu ludzkiego alergicznego zapalenia skóry kontaktowego (ACD) z nadwrażliwością kontaktową (CHS), pośredniczonego przez komórki Th1. Można jednak stosować go także do różnych modeli chorób myszy. Artykuł przedstawia immunomodulację indukowaną przez EC jako atrakcyjny model na myszy dla immunoterapii bezigiełowej w różnych zaburzeniach.

Wprowadzenie

Niniejszy artykuł przedstawia metodę inwestowania tolerancji (określanej w całym tekście jako "tłumienie") w myszim modelu nadwrażliwości kontaktowej (CHS) oraz odwrócenia tej tolerancji (określanej w całym tekście jako "kontrasupresja") poprzez nadoskórne (EC) zastosowanie antygenu samodzielnie lub w połączeniu z ligandami receptorów rozpoznawających patogeny (PRR), odpowiednio1. W opisanym protokole (a) haptenizowane immunoglobuliny myszy (TNP-Ig) są używane jako antygen do tłumienia nadwrażliwości kontaktowej lub (b) antygen z wzorcami molekularnymi powiązanymi z patogenami (PAMP), ligandy dla receptorów podobnych do Tollu (TLR) oraz receptorów białkowych podobnych do domeny oligomerizacji (NOD) (NLR) wiążących nukleotydy, aby odwrócić supresję indukowaną przez skórę 2,3,4. Wyniki wskazują, że immunomodulacja wywołana przez EC jest pośredniczona przez antygenowo-niespecyficzne komórki supresyjne T (T) oraz antygenowo-specyficzne komórki T-kontrasupresory (Tcs). Komórki te można badać w myszim modelu transferu komórek adopcyjnych, aby określić mechanizm testowanych reakcji. Obecny protokół opisuje dwa modele transferu komórek: "transfer adopcyjny do środka" oraz "transfer adopcyjny OUT". Transfer adopcyjny IN jest przydatny do testowania immunomodulacji w fazach aferentnych i eferentnych CHS. Z kolei "transfer adopcyjny OUT" odzwierciedla efekt immunomodulacji tylko w fazie eferentnej CHS.

Artykuł opisuje metodę supresji indukowanej przez skórę poprzez naepikutanne zastosowanie antygenu w mysiim modelu ludzkiego alergicznego zapalenia skóry kontaktowego (ACD) – nadwrażliwości kontaktowej (CHS) pośredniczonej przez limfocyty typu T typu 1 (Th1)5. Jednak podejście to zostało również przetestowane pod kątem skuteczności w regulacji (tłumieniu, tolerancji) eksperymentalnych modeli cyklotoksycznych limfocytów typu 1 (Tc1) leczonych przez T (Tc1), chorób autoimmunologicznych, takich jak zapalenie stawów wywołanych kolagenem (CIA)8,9, eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i mózgu (EAE)10,11 oraz wrzodziejącego zapalenia jelitagrubego 12. Ponadto protokół opisuje metodę kontrasupresji indukowanej przez skórę (odwróconą supresję) poprzez zastosowanie antygenu EC wraz z ligandami PRR w modelu mysim CHS 13,14,15,16. Przedstawione wyniki wskazują, że supresję antygenów niespecyficznych wywołaną przez EC można odwrócić poprzez oczyszczenie ligandów TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 i NOD2. Metoda kontrasupresji indukowanej przez skórę została również zastosowana w modelu zwierzęcym atopowego zapalenia skóry (AD), wykazując, że leczenie EC antygenem w obecności syntetycznych jednoniciowych cząsteczek DNA zawierających niemetylowane oligodeoksynukleotydy (CpG) – ligand TLR9 może tłumić odpowiedzi pośredniczone przez Th2 w sposób specyficzny dla antygenu (przesuwając odpowiedź immunologiczną w kierunku fenotypu Th1/Th17)17. Opisana metoda została również przetestowana w pneumokokowym zapaleniu płuc, wykazując, że szczepienie EC polisacharydem pneumokokowym sprzężonym z albuminą surowicy bydłej (PC-BSA), wraz z CpG, może potencjalnie wzmocnić odporność na Streptococcus pneumoniae18.

Kluczowym aspektem immunomodulacji indukowanej przez EC jest wybór modelu oraz charakter antygenu. Artykuł zawiera tabelę opisującą użyte antygeny, czas ekspozycji na antygeny oraz specyficzność testowanych modeli w limfocytach T (patrz Tabela 1). Opisana metoda immunomodulacji jest skierowana do chorób związanych z limfocytami T specyficznymi dla antygenów. Skuteczność tej metody oceniano poprzez zastosowanie kompatybilnego antygenu EC. Kompatybilność antygenu jest kluczowa, aby skutecznie oddziaływać z limfocytami T zaangażowanymi w proces chorobowy. Zastosowanie plastra białkowego lub peptydowego na nienaruszoną skórę ułatwia penetrację antygenów przez skórę19,20. Zwiększone przenikanie antygenu przypisuje się zwiększonej potności pod opatrunkiem. Zmiany w przepuszczalności naskórka występują w ciągu 4-10 godzin od założenia plastra, podczas gdy immunomodulacja wywołana EC-indukowana może pozostać skuteczna do dwóch tygodni 5,14.

Chociaż leczenie EC jest szeroko stosowane, istnienie wielu wariantów tej metody może budzić pytania. Obecne ustalenia sugerują, że zakres uszkodzenia naskórka przed podaniem antygenu może wpływać na charakter powstałej odpowiedzi immunologicznej21. Powierzchowne uszkodzenie naskórka wywołuje uwalnianie przeciwzapalnych cytokin przez komórki Langerhansa, co sprzyja inicjacjiodpowiedzi Th22. Natomiast bardziej rozległe uszkodzenia naskórka sprzyjają uwalnianiu cytokin prozapalnych i ułatwiają dostarczanie antygenów do komórek dendrytycznych skórnych23. Przedstawiony protokół podkreśla (a) rozpoznanie wyzwań związanych z zastosowaniem tej metody u małych i aktywnych zwierząt, szczególnie myszy; (b) uwzględnienie takich czynników jak stan skóry po goleniu maszynką, prawidłowy kontakt substancji ze skórą, czas ekspozycji oraz higieniczne warunki skóry podczas leczenia EC, co może decydować o skuteczności zabiegu. Przed zastosowaniem antygenu ważne jest rozważenie metody depilacji skóry, zarówno fizycznej, jak i chemicznej, ponieważ różne preparaty skóry mogą wpływać na jej stan na różne sposoby. Uznaje się, że wszystkie te procedury mogą aktywować komórki odpornościowe skóry, co może prowadzić do infekcji skóry lub wpływać na postęp choroby. Potencjalne skutki uboczne związane z chorobami skóry po depilacji powinny być głównym czynnikiem przy wyborze metody depilacji. Naukowcy opisali metodę immunosupresji stymulowanej limfocytami T, indukowaną za pomocą zastosowania antygenu EC na skórze grzbietowej ogolonej brzytwą, demonstrując jej wpływ na różne mysie modele odpowiedzi immunologicznych. Zastosowanie antygenu EC wraz z PAMPs indukuje antygenowo-specyficzne komórki T-kontrasupresorowe. Ponadto przedstawiona metoda stosowania EC, szczególnie przy powtarzającej się ekspozycji na antygeny lub PAMP, nie powoduje niepokojących skutków ubocznych.

Opisany protokół podkreśla znaczenie różnych czynników w osiąganiu wiarygodnych i powtarzalnych wyników tą metodą, zwłaszcza u małych zwierząt, takich jak myszy. Nieinwazyjny charakter tego podejścia zazwyczaj skutkuje mniejszym ryzykiem niepożądanych reakcji (takich jak ból, infekcja czy bliznowactwo) w porównaniu z technikami immunizacji śródskórnej lub iniekcyjnymi. Szczepienia nadoskórne są przyjazne dla użytkownika i łatwe do podawania w warunkach nieklinicznych, poprawiając dostępność i przestrzeganie przepisów w porównaniu z bardziej inwazyjnymi metodami.

Tabela 1: Modulacja odpowiedzi immunologicznej wywołana przez EC w różnych modelach chorób myszy. Skróty: ACD = alergiczne kontaktowe zapalenie skóry; AD = atopowe zapalenie skóry; Ag = antygen; CIA = zapalenie stawów wywołane kolagenem; CHS = nadwrażliwość kontaktowa; CFA = kompletny adiuwant Freunda; COLL II = kolagen typu II; DNFB = 2,4-dinitrofluorobenzen; DNP-BSA = dinitrofenyl sprzężony z albuminą surowicy bydłej; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; EC = naskórny; LPS = lipopolisacharyd; OVA = owalbumina; PAMP = wzorzec molekularny związany z patogenem; PC-BSA = polisacharyd pneumokokowy sprzężony z albuminą surowicy bydlęcej; Th1 = limfocyt pomocniczy typu 1 T; Tc1 = T limfocyt cytotoksyczny typu 1; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzen; TNP-Ig = 2,4,6-trinitrofenylowo-sprzężone immunoglobuliny myszy; Ts = Komórki supresorowe T; Tcs = T komórki kontrasupresyjne. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przedstawione w tym artykule zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi 1. i 2. Lokalnego Komitetu Etycznego ds. Testów na Zwierzętach w Krakowie, Polska. Procedury były zgodne z lokalnymi zaleceniami, szczególnie w zakresie podawania ketaminy/ksylazyny lub izofluranu jako środków znieczulanych, golenia skóry myszy żyletkami, stosowania substancji/haptenów na ogoloną skórę i po obu stronach uszu oraz zbierania obwodowych narządów odpornościowych. W badaniu wykorzystano samce i samice myszy CBA/J (H-2k) w wieku 6-12 tygodni, o masie ciała od 20 do 25 g. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Myszy domowe razem; Ważne jest, aby zapobiegać negatywnym skutkom izolacji dla ich zachowania i samopoczucia. Dla istotności statystycznej należy stosować 10-12 zwierząt na grupę.

2. Przygotowanie obszaru operacyjnego

  1. Dezynfekuj stół operacyjny roztworem 70% etanolu przed i po wszystkich zabiegach. Jeśli używanie myszy wymaga warunków sterylnych, wszystkie operacje wykonuj w szafie biobezpieczeństwa.

3. Indukcja komórek supresorowych (T) dla reakcji CHS pośredniczonej Th1

UWAGA: Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 1A.

  1. W dniu "0" znieczulaj myszy 30% izofluranem w glikolu propylenowym metodą otwartej kropli. Trzymaj mysz w lewej dłoni, odsłaniając grzbietową stronę ciała. Prawą ręką napienią szarą mydłą wodą i nałóż ją na skórę.
    1. Używając sterylnej żyletki, delikatnie ogol obszar skóry o powierzchni 2 cm². Unikaj uszkadzania skóry. Wszelkie zmiany skórne dyskwalifikują myszy z dalszych zabiegów.
      UWAGA: Szare mydło to naturalny i hipoalergiczny produkt z łagodnej bazy roślinnej. Skutecznie regeneruje i nawilża suchą i wrażliwą skórę. Mydło to nie zawiera sztucznych barwników, syntetycznych zapachów ani składników pochodzenia zwierzęcego. Składniki obejmują palmian sodu, ziarno palmy sodu, akwaminę (woda), glicerynę, ekstrakt z kwiatów/liści/łodyg Taraxacum Officinale (Taraxacum Officinale), kwas palmowy, kwas palmowy, chlorek sodu, glikol propylenowy, tetrasodowy EDTA, kwas etidronowy. Szare mydło jest przeznaczone dla wrażliwej i wrażliwej skóry, podatnej na podrażnienia i łuszczycę. Skutecznie oczyszcza problematyczną skórę, zapobiegając nadmiernej suchości i uczuciu napięcia. To mydło łagodzi także podrażnienia, nawilża i przyspiesza regenerację skóry. Co ważne, nie narusza to ochronnej bariery skóry.
  2. Włóż myszy do klatki. Po goleniu odczekaj co najmniej sześć godzin przed nałożeniem antygenu, aby skóra wyschła i została oczyszczona przez zwierzę.
  3. W dniu "+1" przygotuj roztwór antygenu 2,4,6-trinitrofenylowo-sprzężonej z myszą immunoglobuliną (TNP-Ig) o stężeniu 1 mg/mL w bezpłodnej soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Przygotuj objętość antygenu 1200 μL dla dziesięciu myszy. Wymieszaj roztwory tuż przed użyciem w fiolce 2 mL. Chroń TNP-Ig przed światłem, przykrywając fiolkę folią aluminiową.
    UWAGA: Uwzględnić grupę kontrolną CHS myszy leczonych wyłącznie preparatem (DPBS), aby ocenić niespecyficzne reakcje zapalne wywołane goleniem i nałożeniem rozpuszczalnika na ogolone miejsce. Do indukcji Ts należy użyć innego typu antygenu, aby sprawdzić ich specyficzność antygenową. Immunoglobuliny myszy (Ig) zostały przygotowane z surowicy myszy i sprzężone z haptenem TNP (Plik uzupełniający 1). Przezcały okres 24,25 stosowano pojedynczy preparat o poziomie podstawienia 40 TNP na cząsteczkę Ig (TNP40-Ig).
  4. Tego samego dnia znieczulaj myszy podając 30% izofluranu w glikolu propylenowym. Antygen należy nałożyć na wcześniej ogolone miejsce, zakładając gazę o średnicy 1 cm2 nasączoną w 100 μL antygenu (przygotowanej w kroku 3.3). Przykryj to cienką plastikową plastą (2 cm²) i zabezpiecz taśmą klejącą z tkanin. W grupie kontrolnej CHS stosuj tylko DPBS.
    UWAGA: Przezroczyste koszulki na dokumenty o średnicy 30 μm mogą być używane do plastikowej naszywki. Taśma klejąca powinna być łatwa do zdejmowania, elastyczna i dopasowana do kształtu ciała oraz zapewniać przepuszczalność powietrza i pary wodnej.
  5. W dniu "+5" znieczulaj myszy 30% izofluranem w glikolu propylenowym. Ostrożnie wytnij plaster nożyczkami bezpieczeństwa z zaokrąglonymi rogami, a następnie delikatnie usuń taśmę klejącą. Pozwól myszom swobodnie się poruszać i naturalnie czyścić skórę przez co najmniej 4 godziny. W razie potrzeby ogol odrośnięte włosy w miejscu aplikacji antygenu, choć zwykle nie jest to wymagane.
    UWAGA: Przetnij taśmę samoprzylepną tylko w miejscu podawania antygenu (gaza i plastik), gdzie mocno przylega tylko na krawędziach opatrunku. Odczekaj co najmniej 4 godziny przed nałożeniem antygenu, aby skóra wyschła i została oczyszczona przez zwierzę.
  6. W dniu "+5" powtórz krok 3.3 i 3.4.
  7. W dniu "+8" powtórz krok 3.5. Oznacza to zakończenie tygodniowej ekspozycji skóry na antygen. Po tym okresie użyj myszy do testowania tłumienia reakcji CHS – in vivo aktywnych modeli (krok 6) lub uśpi, aby służyły jako dawcy komórek T w "adopcyjnym transferze IN" (krok 8) lub w "adopcyjnym transferze OUT" (krok 9).

4. Indukcja antysupresorycznych limfocytów T (Tcs) dla reakcji CHS podleganej Th1

UWAGA: Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 1B.

  1. W dniu "0" wykonaj kroki 3.1-3.2.
  2. W dniu "+1" przygotuj mieszankę 100 μg antygenu TNP-Ig i 100 μg LPS (przykład PAMP) w 100 μL DPBS. Przygotuj roztwór tuż przed użyciem w fiolce 2 mL i zabezpiecz go przed światłem, owijając fiolkę folią aluminiową, jeśli antygen jest światłoczuły.
    UWAGA: Aby ocenić kontrasupresję (odwrócenie supresji indukowanej przez skórę), należy włączyć grupę kontrolną do supresji (grupę kontrolną Ts), gdzie myszy leczone są wyłącznie antygenem TNP-Ig. Ponadto należy uwzględnić myszy leczone wyłącznie DPBS (kontrola CHS) oraz wyłącznie LPS (kontrola PAMP), aby określić zakres niespecyficznej modulacji odpowiedzi immunologicznych. LPS jest przykładem cząstki immunostymulującej26. Specyficzne cechy każdego stymulatora odporności zależą od użytego modelu myszy, typów komórek odpornościowych zaangażowanych w badaną odpowiedź immunologiczną oraz farmakokinetyki badanych substancji.
  3. Tego samego dnia znieczulaj myszy podając 30% izofluranu w glikolu propylenowym. Na wcześniej ogoloną skórę nałóż plaster gazy o średnicy 1cm 2 , nasycony roztworem zawierającym 100 μL tej mieszaniny (przygotowanej w kroku 4.2). Przymocuj gazę cienką plastikową plastrą (2 cm²) i przyklej ją na miejsce za pomocą kleju do tkanin. W grupach kontrolnych stosuje się DPBS (kontrola CHS), LPS (kontrola PAMP), albo tylko TNP-Ig (grupa kontrolna T).
    UWAGA: Przezroczyste koszulki na dokumenty o średnicy 30 μm mogą być używane do plastikowej naszywki. Taśma klejąca powinna być łatwa do zdejmowania, elastyczna i dopasowana do kształtu ciała oraz zapewniać przepuszczalność powietrza i pary wodnej.
  4. W dniu "+5" wykonaj krok 3.5.
  5. W dniu "+5" powtórz kroki 4.2-4.3.
  6. W dniu "+8" powtórz krok 3.5. Tydzień ekspozycji skóry na antygen zmieszany z LPS się kończy. Po tym okresie myszy testują w modelach reakcji CHS – in vivo aktywnej (krok 6) lub uśpią je, aby pełnić rolę dawców komórek Tcs w "adoptive transfer OUT" (krok 10).

5. Indukcja komórek efektorowych T (Teff) dla reakcji CHS podłożonej Th1 (faza sensytyzacji CHS)

  1. W dniu "0" ogol klatkę piersiową i odwłok myszy (2 × powierzchni 2 cm) szarym mydłem z wodą, a następnie żyletką. Pozwól skórze odpocząć przez 6 godzin przed nałożeniem hapte, aby zapobiec podrażnieniu.
  2. Tego samego dnia, tuż przed użyciem, przygotuj roztwór hapten (5%) w szklanej fiolce i przykryj go folią aluminiową, aby chronić przed światłem: 2,4,6-trinitrochlorobenzen (TNCB) w mieszance acetonu i etanolu (stosunek 1:3).
  3. Tego samego dnia uwrażliw myszy, nakładając 150 μL haptenu na wcześniej ogolone miejsce. Należy stosować sam nośnik (mieszankę acetonu i etanolu) w grupie kontrolnej z ujemnymi ocenami w celu oceny niespecyficznej reakcji zapalnej. Przed powrotem zwierzęcia do klatki odczekaj 30 sekund, aż skóra wyschnie.
    UWAGA: Używaj rękawiczek; TNCB wywołuje u większości osób silne reakcje alergiczne.

6. Model aktywny: Testowanie komórek Ts lub Tcs w CHS pośredniczonym przez Th1

UWAGA: Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 2.

  1. Indukuj komórkę Ts lub Tcs, stosując kroki 3 i 4. Zabieg ten trwa od dnia "0" do dnia "+8".
  2. W dniu "+8" zacznij indukować komórki Teff, wykonując krok 5.
  3. Cztery dni później oceniaj odpowiedź CHS, wykonując fazę ewokacji (wyzwanie). Krótko mówiąc, nałóż TNCB na obie strony uszu. Następnie zmierz grubość uszu, mierząc je mikrometrem. Szczegółowy opis tego testu oraz innych możliwych punktów końcowych jest podawany gdzie indziej (Zemelka-Wiacek M. i in.27).

7. Izolacja komórek Teff, T lub Tcs od myszy dawcy

  1. Dezynfekuj stół operacyjny roztworem 70% etanolu zarówno przed, jak i po każdym zabiegu. Wszystkie procedury wykonuj w szafie bioasekuracyjnej, aby zachować sterylność i używaj sterylnych narzędzi. Aby wyizolować komórki T, Tcs i Teff w dniu "+8", użyj myszy zaszczepionych na EC, opisanych odpowiednio w krokach 3, 4 i 5.
    UWAGA: Stosuj stosunek dawców do odbiorców 1:1.
  2. Znieczulać dawców za pomocą intraotrzewnowego (i.p.) wstrzyku mieszaniny ketaminy (90-120 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Zapewniaj wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona przez co najmniej 5 minut.
  3. Dezynfekuj całą okolicę brzucha znieczulonej myszy 70% etanolem, a następnie naciń warstwę brzucha (3-4 cm), aby odsłonić jamę otrzewną. Izoluj węzły chłonne pomocnicze i pachwinowe (ALN) oraz śledzionę (SPL) za pomocą sterylnych kleszczy do rurek wypełnionych sterylnym DPBS, które są uzupełniane o 1% surowicy płodowej bydła (FBS). Łącz ALN od wszystkich dawców w jednej fiolce, a SPL w innej i trzymaj fiolki w lodzie. Każda pachka zawiera dwa węzły chłonne pachwinowe, natomiast jeden węzeł pachwinowy znajduje się w okolicy biodra obok trzech naczyń krwionośnych. SPL umieszczone są po lewej stronie ciała, za jelitem i żołądkiem.
    UWAGA: Pracuj z narzędziami sterylnymi pod szafą biobezpieczeństwa, aby utrzymać warunki sterylne. Po tym zabiegu myszy muszą zostać uśpione zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucję.
    1. Rozcieraj tkankę pomiędzy zmarzniętymi końcami dwóch szkiełek mikroskopowych. Przecedź zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o porze 70 μm.
  4. Przepłucz komórki 30 mL DPBS z dodatkiem 1% FBS. Wiruj w 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1-5 mL DPBS.
  5. Policz żywotność komórki za pomocą hemocytometru i Trypan Blue. Wymieszaj 10 μL zawiesiny ogniw z 90-990 μL Trypan Blue, dostosowując objętość do liczby ogniw. Włącz ten czynnik rozcieńczenia do obliczeń opłacalności.
  6. Przygotuj mieszankę ALN i SPL (stosunek 1:1). Przestrzegaj liczby komórek: używaj do 1 do 5 x 10 komórek7 T lub Tcs na biorcę w 1 mL DPBS uzupełnionej o 1% FBS oraz 7 x 10 komórek 7 Teff na biorcę w 1 mL DPBS. Utrzymuj stosunek dawców do odbiorców dla wszystkich populacji komórek 1:1 oraz stosunek dawca do DPBS 1:1. Trzymaj fiolki z komórkami na lodzie.
    UWAGA: Przeprowadzenie dalszych eksperymentów in vitro wymaga proporcjonalnego zwiększenia liczby dawców komórek.
    UWAGA: Dodatkowo, izolowane komórki Teff, T i Tcs mogą poddawać się dodatkowej oczyszczaniu lub analizom z użyciem cytometrii przepływowej, takiej jak fenotypowanie lub ocena wydzielania cytokin. Możliwe jest również inicjowanie hodowli komórkowych w celu badania zdolności proliferacji komórek lub ilościowego określenia poziomu cytokin w supernatantach hodowlanych. Przeprowadzenie dalszych eksperymentów wymaga proporcjonalnego zwiększenia liczby dawców komórek.

8. Transfer adopcyjny IN: Testowanie testosteronu w CHS pośredniczonym przez Th1

UWAGA: Procedura ta została przedstawiona na Rysunku 3. Pracuj sterylnie i używaj 70% roztworu etanolu zarówno przed, jak i po każdym zabiegu. Upewnij się, że wszystkie operacje komórkowe są prowadzone w szafie bioasekuracyjnej, aby zachować sterylność i używać sterylnych narzędzi.

  1. Indukuj i izoluj komórki T (dawców), stosując się do kroków 3 i 7. Przepłukaj ogniwa 30 mL DPBS. Wirować w 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić pellet komórkowy w 200 μL DPBS na odbiorcę (stosunek dawca do odbiorcy 1:1).
  2. Biorcy (naiwne myszy syngeneiczne): znieczulają biorców intracitonealnym (i.p.) mieszanką ketaminy (90-120 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona przez co najmniej 5 minut.
  3. Podaj dożylnie (i.v.) przygotowaną mieszankę 1-5 x 10 komórek7 T (krok 8.2) w dawce 200 μL do osoby znieczulonej.
  4. Tego samego dnia wywołaj reakcję CHS podsycaną Th1. W skrócie, indukuj komórkę Teff (fazę sensytyzacji) opisaną w krokach 5.1-5.3. Cztery dni później oceń odpowiedź CHS, wykonując fazę wywołania (wyzwanie) opisaną w kroku 6.3.

9. Transfer adopcyjny OUT: Testowanie testosteronu w CHS pośredniczonym przez Th1

  1. Indukuj i izoluj komórki T oraz Teff (dawców), stosując kroki 3, 5 i 7. Trzymaj izolowane T i Teff w dwóch oddzielnych fiolkach. Podziel komórki Teff na dwie fiolki: jedną dla "grupy testowej T", a drugą dla "kontroli CHS".
    UWAGA: Pracuj sterylnie i używaj roztworu etanolu 70% zarówno przed, jak i po każdym zabiegu. Upewnij się, że wszystkie operacje komórkowe są prowadzone w szafie bioasekuracyjnej, aby zachować sterylność i używać sterylnych narzędzi. Włącz grupę kontrolną biorców, którym podano będzie wyłącznie komórki Teffa ("kontrola CHS"). W tej grupie należy uwzględnić dodatkowych dawców, aby utrzymać stosunek dawców do odbiorców 1:1. Aby poprawić jakość wyników, należy dodać biorce otrzymujące komórki kontrolne przeniesione od dawców leczone EC roztworem rozpuszczalnika. Decyzja o dodaniu dodatkowej grupy odbiorców i dawców musi być starannie zaplanowana, ponieważ takie podejście wymaga wielu myszy, co nie spełnia zasady 3R (Redukuj, Ulepszaj, Zasteniaj).
  2. Dodaj komórki Ts do komórek Teffa dla "grupy testowej T". Dodaj odpowiednią ilość DPBS do komórek Teff w fiolce "CHS control".
    UWAGA: Zachowaj liczbę komórek 1-5 x 10 7 T oraz 7 x 10 komórek 7 Teff na biorcę.
  3. Wszystkie fiolki wymieszaj delikatnie. Przechowywaj fiolki w kąpieli wodnej (37 °C) przez 30 minut, mieszając delikatnie co 5 minut.
  4. Przepłukaj każdą fiolkę komórkami 30 mL DPBS z dodatkiem 1% FBS. Wirować w 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Przelej supernatant i ponownie zawiesij granulki komórkowe w 200 μL DPBS na odbiorcę.
  5. Przepuszczaj każdą zawiesinę komórkową przez sitko komórek o średnicy 70 μm. W razie potrzeby dostosuj objętość 200 μL DPBS na odbiorcę.
  6. Biorcy (naiwne myszy syngeneiczne): znieczulają biorców intracitonealnym (i.p.) mieszanką ketaminy (90-120 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona przez co najmniej 5 minut.
  7. Podaj dożylny zastrzyk przygotowanych komórek.
  8. Tego samego dnia wywołaj fazę wywołania CHS (wyzwanie) opisaną w kroku 6.3. Uwzględnij "negatywną kontrolę", gdzie wyzwanie CHS tylko przeprowadza.

10. Transfer adopcyjny OUT: Testowanie Tcs w CHS pośredniczonym przez Th1

  1. Indukuj i izoluj komórki T, Tcs i Teff (dawców), wykonując kroki 3-5 oraz krok 7.
    UWAGA: Pracuj sterylnie i używaj roztworu etanolu 70% zarówno przed, jak i po każdym zabiegu. Upewnij się, że wszystkie operacje komórkowe są prowadzone w szafie bioasekuracyjnej, aby zachować sterylność i używać sterylnych narzędzi. Należy uwzględnić dwie grupy kontrolne biorców: "kontrolę CHS", w której podawane są wyłącznie komórki Teff, oraz "kontrolę T", w której komórki Teffa będą inkubowane wyłącznie komórkami T. W tych grupach należy stosować dodatkowych dawców, aby utrzymać stosunek dawców do odbiorców 1:1.
  2. Trzymaj izolowane komórki T i Tcs w osobnych fiolkach. Podziel komórki Teffa na trzy fiolki: jedną dla "grupy testowej Tcs", jedną dla "kontroli T" i jedną dla "kontroli CHS".
  3. Pierwsza inkubacja: Dla (a) "grupy testowej Tcs" dodaj komórki Tcs do komórek Teff. Dla (b) "kontroli T" i (c) "kontroli CHS" dodaj odpowiednią ilość DPBS do komórek Teffa (patrz Tabela 2).
    UWAGA: Zachowaj liczbę komórek 1-5 x 10 7 Tcs oraz 7 x 10 komórek 7 Teff na odbiorcę.
  4. Wszystkie fiolki wymieszaj delikatnie. Trzymaj w kąpieli wodnej (37 °C) przez 30 minut, mieszając delikatnie co 5 minut.
  5. Przepłukaj każdą fiolkę komórkami 30 mL DPBS z dodatkiem 1% FBS. Wirować w dawce 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Przelewać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 1 ml DPBS z dodatkiem 1% FBS na biorcę. Utrzymuj stosunek mieszanki komórkowej do DPBS 1:1.
  6. Druga inkubacja: Dla grupy testowej (a) "Tcs" dodaj komórki T do mieszaniny preinkubowanych komórek Teff i Tcs. Dla (b) "kontroli T" dodaj komórki Ts do mieszaniny preinkubowanych komórek Teff z DPBS. Dla (c) "kontroli CHS" należy dodać odpowiednią ilość DPBS do przedinkubowanych komórek Teff.
    UWAGA: Zachowaj liczbę komórek 1-5 x 10 7 Ts na biorcę. Przeprowadzaj inkubacje we wszystkich grupach eksperymentalnych (a, b i c), aby zapewnić jednolitą utratę komórek podczas procedur mycia i wirowania.
  7. Wszystkie fiolki wymieszaj delikatnie. Trzymaj w kąpieli wodnej (37 °C) przez 30 minut, mieszając delikatnie co 5 minut.
  8. Przepłukuj każdą fiolkę komórkami 30 mL DPBS. Wirować w 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Przelej supernatant i ponownie zawiesij granulki komórkowe w 200 μL DPBS na odbiorcę.
  9. Przepuszczaj każdą zawiesinę komórkową przez sitko komórek o średnicy 70 μm. W razie potrzeby dostosuj objętość 200 μL DPBS na odbiorcę.
  10. Biorcy (naiwne myszy syngeneiczne): znieczulają biorców intracitonealnym (i.p.) mieszanką ketaminy (90-120 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona przez co najmniej 5 minut.
  11. Podaj dożylny zastrzyk przygotowanych komórek.
  12. Tego samego dnia wywołaj fazę wywołania CHS (wyzwanie) opisaną w kroku 6.3. Uwzględnij "negatywną kontrolę", gdzie wyzwanie CHS tylko przeprowadza.

Tabela 2: Harmonogram inkubacji komórek podczas "transferu OUT" TCS. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie to analizuje, czy antygeny stosowane wyłącznie przez skórę lub w połączeniu z PAMP mogą indukować odpowiednio komórki T lub Tcs, które modulują reakcję CHS. Immunizacja myszy CBA/J za pomocą EC 100 μg TNP-Ig lub TNP-Ig plus 100 μg LPS indukuje odpowiednio komórki Ts lub Tcs. Myszy zostały następnie uwrażliwione na 5% TNCB i poddane temu samemu haptenie 4 dni później. Reakcję oceniono poprzez pomiar obrzęku uszu przed i po wyzwaniu. Każdy eksperyment ma kontrolę ujemną, która służy do oceny niesp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania przeprowadzono na wielu różnych modelach zwierzęcych i z użyciem wielu szczepów myszy, takich jak BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1, B10.PL i SJL, wykazują, że szczepienie EC przypisanym antygenem może być wszechstronnym i potencjalnie nieograniczonym sposobem tworzenia tolerancji i kontrolowania niepożądanych odpowiedzi immunologicznych. Obecny protokół przedstawia dwa modele transferu komórek: (1) "transfer adopcyjny IN", który jest przydatny do oceny immunomodulacji zarówno fazy aferentnej, jak i eferentnej CH...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie to zostało wsparte grantami z Polskiego Komitetu Badań Naukowych Granty 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 oraz z Narodowego Centrum Nauki nr N401 3554 33 dla M.S. Wykresy zostały narysowane za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 10.2.3, a rysunki 1-3 zostały stworzone w BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Autorzy dziękują Dorocie Woźniak za opiekę nad koloniami myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,4,6-trinitrochlorobenzen (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JaponiaC0307
2,4,6-trinitrofenylowo-sprzężona immunoglobulina myszy (TNP-Ig)Katedra Nauk Biomedycznych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Jagielloński Uniwersytet Medyczny, Kraków, Polska
aceton (odczynnik ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy179124
Folia aluminiowaMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyZ185140   
analityczna waga  Sartorius Weighing Technology GmbH, Getyndka, NiemcyPRACTUM224-1, 29105177
Albumina surowicy bydła (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyA9418
CBA/J (H-2k)  Jednostka hodowlana Katedry Nauk Biomedycznych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Jagielloński Uniwersytet Medyczny, Kraków, Polska
sitko komórkowe, por o rozmiarze 70 & mu; mBIOLOGIX, Chiny15-1070
pojemność jednorazowych pipet: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco′ fosforanem buforowana sól fizjologiczna (DPBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144
Tubki Safe-Lock eppendorf 1,5mlEppenforf, Niemcy30120086
Rurki bezpieczne eppendorf, 2,0 mlEppenforf, Niemcy30120094
Etanol 100% (absolutny alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.07017
etanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.59010
Serum bydła płodowego (FBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USAA3160802
szkiełka mikroskopowe (piaskowane, pojedyncze, matowe)ThermoScientific, Portsmouth, NH, USA421-004T
Pryzmat grafowego podkładuGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
Szare mydło (mydło Bialy Jelen)Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polska163057
HemocytometrVWR, Avantor, USA612-5719
inkubator Heracell 150iTermoelektron   LED Gmbh, Niemcy41071068
izofluran (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, USA8AGG9623
Ketamina 100 mg/mL, roztwór do wstrzykiwaniaBiowet Puławy Sp. z o.o., Puławy, Polskakat.# niedostępny
laboratorium Wirówka (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Niemcy75002425
Laboratorium Wirówka (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermo Scientific, NiemcyB00013899
lipopolisacharyd (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyL-8274
maska (FFP2)VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone111-0917
MikrometrMitutoyo, Tokio, Japonia193-111
Mikroskop z obiektywamiLeica Microsystems CMS GmbH, NiemcyDM1000, 294011-082007
glikol propylenowy Chempur, Piekary figure-materials-1 Polska114489005
ŻyletkaVWR, Radnor, Pensylwania, Stany ZjednoczonePERS94-0462
przezroczyste koszulki dokumentów 30 & Micro; mSCHEMAT5906961126542
trypan blueMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyT8154
rurki 15 mL sterylneMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430055 (Corninig)
rurki 50 mL, sterylneMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyCLS430290 (Corning)
fiolki, z zakrętką, przezroczyste szkło (tylko fiolka) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy27173
Viscoplast Polovis, klej jedwabny, 5x0,0125m3M Polska, Nadarzyn, Polska7100231620
kąpiel wodna AJL Electronic, PolskaLW102
Roztwór ksylazyny (xylapan 20 mg/mL) do zastrzykówVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzów Wielkopolski, Polskakat.# niedostępny

Bibliografia

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Immunizacja epicutaneousprotokół immunomodulacjinadwrażliwość kontaktowasupresoryjne limfocyty Tefektorowe limfocyty Ttransfer adopcyjnyodporność skóryalergiczne zapalenie skóry kontaktowewzorce molekularne związane z patogenami
Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.