Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67579

⸱

15 listopada 2024

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Allergy, Critical Care and Sleep Medicine, Emory University, 2Atlanta Veterans Affairs Health Care System

W tym artykule

Podsumowanie

Nadużywanie alkoholu osłabia odporność makrofagów pęcherzykowych (AM) z powodu stłumionego oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki. Niedawno wykazaliśmy, że ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa zależność od glutaminy w oddychaniu mitochondrialnym u AM. W niniejszym artykule przedstawiono metody określania zastosowania glutaminy do oddychania mitochondrialnego w AM traktowanych EtOH przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

Makrofagi pęcherzykowe (AM) są pierwszą linią obrony komórkowej w dolnych drogach oddechowych przed patogenami. Jednak przewlekłe i nadmierne spożywanie alkoholu upośledza zdolność AM do fagocytacji i usuwania patogenów z przestrzeni pęcherzykowej, częściowo poprzez rozregulowany metabolizm paliw i bioenergetykę. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że przewlekłe spożywanie etanolu (EtOH) upośledza bioenergetykę mitochondriów i zwiększa poziom mleczanu w AM. Co więcej, niedawno wykazaliśmy, że EtOH zwiększa zależność od glutaminy i maksymalne oddychanie zależne od glutaminy, jednocześnie zmniejszając elastyczność, odchodząc od oddychania zależnego od pirogronianu w kierunku oddychania zależnego od glutaminy. Glutaminoliza jest ważną ścieżką kompensacyjną dla oddychania mitochondrialnego, gdy pirogronian jest używany do produkcji kwasu mlekowego lub gdy inne źródła paliwa są niewystarczające. Korzystając z mysiej linii komórkowej AM, komórek MH-S, wystawionych na działanie braku EtOH lub EtOH (0,08%) przez 72 godziny, określiliśmy zależność oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki od glutaminy jako źródła paliwa za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Pomiary w czasie rzeczywistym przeprowadzono w odpowiedzi na siarczek etylu bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo) etylu (BPTES), inhibitor glutaminazy 1, który zapobiega enzymatycznej konwersji glutaminy do glutaminianu, w nośniku pożywki lub w odpowiedzi na sam nośnik, a następnie przeprowadzono badanie stresu mitochondrialnego. Protokół krok po kroku przedstawiony w niniejszym dokumencie opisuje nasze metody i obliczenia do analizy średnich poziomów podstawowego oddychania mitochondrialnego zależnego od glutaminy, mitochondrialnego oddychania związanego z ATP, maksymalnego oddychania mitochondrialnego i wolnej pojemności oddechowej mitochondriów w wielu powtórzeniach biologicznych i eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) dotyka ponad 28 milionów ludzi w Stanach Zjednoczonych1. Osoby z AUD są 2-4 razy bardziej narażone na rozwój infekcji dróg oddechowych2,3, zwiększając ryzyko przedwczesnej zachorowalności i śmiertelności3,4,5. Nadużywanie alkoholu zwiększa podatność na infekcje dróg oddechowych, częściowo poprzez tłumienie funkcji immunologicznych płuc. Makrofagi pęcherzykowe (AM) są pierwszą linią obrony komórkowej przed patogenami w dolnym płucu, gdzie fagocytują i usuwają wdychane drobnoustroje. Jednak przewlekłe spożywanie alkoholu upośledza zdolność AM do pochłaniania i zabijania patogenów6,7.

Funkcje immunologiczne AMs, takie jak fagocytoza, są procesami wymagającymi energii, które wymagają metabolicznie aktywnych szlaków niezbędnych do wytwarzania wysokiego poziomu adenozynotrójfosforanu (ATP). Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna jest najbardziej wydajnym procesem komórkowym do wytwarzania ATP, ale przewlekła ekspozycja na etanol (EtOH) zwiększa stres oksydacyjny pochodzenia mitochondrialnego, co może skutkować dysfunkcją mitochondriów w AMs8,9,10. Oddychanie mitochondrialne mierzone za pomocą wskaźnika zużycia tlenu przez komórki (OCR) można określić ilościowo za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym. Do określenia bioenergetyki mitochondriów wykorzystuje się profile oddychania mitochondrialnego oceniane w odpowiedzi na oligomycynę (inhibitor syntazy ATP), cyjanek karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP, rozprzęgacz protonów) oraz rotenon/antymycynę A (R/A, odpowiednio inhibitory kompleksu mitochondrialnego I i III). Przewlekłe EtOH zmniejsza bioenergetykę mitochondriów w AMs, o czym świadczy zmniejszone mitochondrialne oddychanie podstawowe, oddychanie sprzężone z ATP, maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność oddechowa10.

Komórki mają różne poziomy zależności od źródeł paliw, takich jak pirogronian, glutamina, czy kwasy tłuszczowe, do produkcji ATP. Mają również poziom elastyczności, dzięki któremu mogą przełączać zużycie paliwa w celu regulacji bioenergetyki komórkowej. Glutaminoliza jest kluczowym szlakiem oddychania mitochondrialnego, szczególnie gdy pirogronian jest przetaczany w kierunku produkcji kwasu mlekowego lub gdy kwasy tłuszczowe są niewystarczające. Nasze ostatnie badanie wykazało, że przewlekła ekspozycja na EtOH zwiększa zależność AM od glutaminy i zmniejsza elastyczność AM w korzystaniu z glutaminy i innych źródeł paliwa do oddychania mitochondrialnego11. Wyniki te, wraz z danymi wykazującymi, że leczenie komórek MH-S narażonych na EtOH inhibitorem utleniania pirogronianu UK5099 nie zmieniło bioenergetyki mitochondriów w porównaniu z komórkami MH-S narażonymi na kontrolę pożywki leczonych UK5099, sugerują odejście od oddychania zależnego od pirogronianu w kierunku oddychania zależnego od glutaminy w komórkach EtOH MH-S. Jednak ta zmiana jest niewystarczająca, aby sprostać wymaganiom bioenergetycznym AM11. W niniejszym artykule opisano metody oceny glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego w przewlekłych AM narażonych na EtOH za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Protokół ten został stworzony i zoptymalizowany dla formatu 96 dołków (obszar 11,04 mm2) i powinien być dostosowany do większych rozmiarów dołków do hodowli komórkowych. Zależność od glutaminy w bioenergetyce mitochondriów określa się za pomocą siarczku etylu bis-2-(5-fenyloacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-ylo) (BPTES, inhibitor glutaminazy 1) w celu selektywnego hamowania enzymatycznej konwersji glutaminy do glutaminianu. Dane przedstawione w tym badaniu są dodatkowymi powtórzeniami biologicznymi dla grup eksperymentalnych traktowanych pożywką kontrolną i BPTES nieleczonej kontrolnej i przewlekłej linii komórkowej myszy AM narażonej na EtOH, komórek MH-S, które są publikowane w Crotty et al.11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przewlekłe narażenie na EtOH in vitro

  1. Hodowla komórek MH-S, linii komórkowej makrofagów pęcherzykowych myszy, w kompletnej pożywce zawierającej RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną, 11,9 mM wodorowęglanem sodu, 40 mg/ml gentamycyny i 50 μM 2-merkaptoetanolem w temperaturze 37°C z 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  2. Hodowlane komórki MH-S należy traktować z EtOH lub bez EtOH (0,8 mg/ml lub 0,08%) przez 72 godziny, przy czym EtOH należy wymieniać co 24 godziny. Komórki MH-S poddane działaniu EtOH inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w oddzielnym nawilżanym inkubatorze zawierającym 0,08% EtOH w wodzie inkubatora.

2. Posiewanie komórek MH-S do oceny glutaminy jako źródła paliwa za pomocą bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Upewnij się, że nieleczone komórki kontrolne (Con) i przewlekłe MH-S traktowane EtOH są hodowane do co najmniej 50% konfluencji (70% -90% konfluencji jest idealne) w kolbach T-75 w celu przejścia do 96-dołkowej płytki mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego. Przygotować mapę płytową dla 5-6 kontrprób technicznych na kontrpróbę biologiczną warunków eksperymentalnych Con i EtOH oraz kontroli pożywek dla każdego z nich w celu porównania z iniekcjami BPTES (łącznie cztery grupy dla biologicznych n = 1).
  2. Przepłukać komórki pożywką lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.
  3. Dodać 6 ml pożywki zawierającej surowicę do kolby.
  4. Zeskrob komórki, aż zostaną odłączone, a spód płytki będzie czysty. Trypsyna nie jest potrzebna do odwarstwienia komórek MH-S, ale może być pomocna w innych typach komórek.
  5. Oddzielić komórki za pomocą pipety serologicznej lub pipety o pojemności 1 ml.
  6. Przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować je przy 200 x g przez 6 minut.
  7. Odessać supernatant.
  8. Dodać 1 ml pożywki i dokładnie zawiesić komórki.
  9. Przenieść 10 μl do probówki mikrowirówkowej i dodać 10 μl błękitu trypanowego. Dobrze wymieszaj.
  10. Przenieść 10 μl mieszaniny komórek i błękitu trypanowego na jedną stronę hemocytometru lub licznika komórek.
  11. Policz liczbę komórek za pomocą mikroskopu świetlnego lub licznika komórek.
  12. Oblicz gęstość komórek jako średnią liczbę żywych komórek na mililitr.
  13. Wykonaj obliczenia dla potrzebnych rozcieńczeń:
    Liczba potrzebnych studzienek x 10000-15000 komórek = całkowita liczba potrzebnych komórek.
    Liczba potrzebnych studzienek x 80 μL = całkowita objętość potrzebnych zawieszonych komórek.
  14. Nałożyć 80 μl komórek do niezbędnych studzienek 96-dołkowej płytki mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego.
  15. Pozostaw studzienki narożne całkowicie pozbawione jakichkolwiek komórek lub pożywek. Studnie te będą wykorzystywane do pomiarów tła.
  16. Inkubować komórki w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc, aby umożliwić komórkom przyleganie i równowagę na płytce mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego.
  17. Traktuj komórki MH-S na 96-dołkowej płytce mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego przez 72 godziny, wykonując krok 1.
  18. Co najmniej 4 godziny i do 24 godzin przed uruchomieniem eksperymentu z bioanalizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego należy nawodnić 96-dołkowy wkład z płynem zewnątrzkomórkowym.
    1. Usuń górną część pakietu strumienia zewnątrzkomórkowego i umieść sondowaną część pakietu strumienia ekranem do góry na stole. Nanieść 200 μl roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego do każdej studzienki w dolnej części wkładu z przepływem zewnątrzkomórkowym.
    2. Złóż skrawki razem i owiń wkład zewnątrzkomórkowy flux pak w parafilm. Umieść go w inkubatorze z nawilżonym dodatkiemCO2 o temperaturze 37 °C lub kąpieli perełkowej o temperaturze 37 °C.
  19. Włącz komputer zawierający projekt testu i otwórz uruchomione/analityczne oprogramowanie dołączone do instrumentu do bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, aby umożliwić mu rozgrzanie się co najmniej 4 godziny przed wykonaniem eksperymentu.

3. Wykorzystanie bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do oceny glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego w komórkach MH-S

UWAGA: Ogólny przegląd tej procedury jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Sprawdź hodowane komórki MH-S poddane działaniu Con- i EtOH pod mikroskopem świetlnym i upewnij się, że komórki są zdrowe i przylegają do studzienek w monowarstwie. Upewnij się, że komórki są co najmniej w 70% zlewające się (90% zbieżności jest idealne), aby niezawodnie wykonać test.
  2. Przygotuj pożywkę bazową strumienia zewnątrzkomórkowego z następującymi dodatkami:
    1. Podwielokrotność 35 ml pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego do probówki o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj 350 μl 100 mM pirogronianu sodu (1 mM stężenie końcowe), 350 μL D-glukozy (10 mM stężenie końcowe) i 350 μL GlutaMAX, który jest bardziej stabilny na półce w porównaniu z L-glutaminą (2 mM stężenie końcowe).
      UWAGA: W tym samym stężeniu można również stosować świeżą L-glutaminę.
    3. Podgrzać roztwór do temperatury 37 °C i upewnić się, że pH wynosi 7,4 ± 0,05 w temperaturze 37 °C.
  3. Delikatnie odessać pożywkę wzrostową z zewnątrzkomórkowej płytki mikrokultury. Pozostaw jak najmniej pożywki bez zasysania komórek od dołu. Przemyć jednorazowo maksymalnie 50 μl pożywki bazowej uzupełnionej topnikiem zewnątrzkomórkowym.
  4. Dodać 180 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym do każdej studzienki i inkubować płytkę mikrokultury zewnątrzkomórkowej w inkubatorze z wilgotnością 37 °C bez zawartości CO2 przez 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić równowagę.
  5. Rozpuść odczynniki do testu utleniania glutaminy:
    1. Do probówki BPTES dodać 700 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 120 mM. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby prawidłowo rozpuścić związek.
      UWAGA: BPTES powoduje podrażnienie skóry i oczu oraz może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Podczas obsługi należy nosić rękawice ochronne, ochronę oczu i ochronę twarzy. Zawartość i pojemniki należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
    2. Do probówki z oligomycyną dodać 630 μl pożywki zasadowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 100 mM. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby prawidłowo rozpuścić związek.
    3. Do probówki FCCP dodać 720 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby prawidłowo rozpuścić związek.
      UWAGA: FCCP jest szkodliwy w przypadku połknięcia, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu, może powodować reakcję alergiczną skóry i może powodować długotrwałe szkodliwe skutki dla organizmów wodnych. Podczas obsługi należy nosić rękawice ochronne, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy. Zawartość i pojemniki należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
    4. Do probówki R/A dodać 540 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 50 mM. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby prawidłowo rozpuścić związek.
      UWAGA: Rotenon jest śmiertelny w przypadku połknięcia lub wdychania, powoduje podrażnienie skóry, powoduje poważne podrażnienie oczu, może powodować podrażnienie dróg oddechowych i jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, powodując długotrwałe skutki. Nosić rękawice ochronne, ochronę oczu, ochronę twarzy i ochronę dróg oddechowych. Zawartość i pojemniki należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów. Antymycyna A jest śmiertelna w przypadku połknięcia i jest bardzo toksyczna dla organizmów wodnych, powodując długotrwałe skutki. Zawartość i pojemniki należy usunąć do zatwierdzonego zakładu utylizacji odpadów.
  6. Przygotować stężenia robocze odczynników do utleniania substratu i mitochondrialnych testów wysiłkowych:
    1. W przypadku BPTES zmieszaj 1 500 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym z 500 μl 120 mM roztworu podstawowego BPTES, aby uzyskać roztwór roboczy 30 μM BPTES.
    2. W przypadku oligomycyny zmieszać 2,520 μl pożywki zasadowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym z 480 μl 100 mM oligomycyny, aby uzyskać 16 mM oligomycyny roztwór roboczy.
    3. W przypadku FCCP zmieszaj 2,865 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym ze 135 μl 100 mM FCCP, aby uzyskać roztwór roboczy FCCP o stężeniu 4,5 mM.
    4. W przypadku R/A zmieszać 2,700 μl pożywki bazowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym z 300 μl 50 mM R/A, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 5 mM R/A.
  7. Załaduj porty górnej części wkładu zewnątrzkomórkowego flux pak za pomocą następujących elementów:
    1. Załaduj do studzienek kontrolnych tła i pożywki kontrolnej 20 μl pożywki zasadowej uzupełnionej strumieniem zewnątrzkomórkowym do portu A, 22 μl oligomycyny do portu B, 25 μl FCCP do portu C i 27 μl R/A do portu D.
    2. Załadować do studzienek zawierających komórki 20 μl pożywki kontrolnej lub BPTES do portu A (stężenie końcowe 3 μM dla BPTES), 22 μl oligomycyny do portu B (stężenie końcowe 2 μM dla oligomycyny), 25 μL FCCP do portu C (stężenie końcowe 0,5 μM dla FCCP), i 27 μl R/A (końcowe stężenie 0,5 μM dla R/A) do portu D.
  8. Przeprowadzić eksperyment z bioanalizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego przy użyciu oprogramowania komputerowego do projektowania i analizy testów, który jest dołączony do instrumentu, przy użyciu następującego czasu i strategii wstrzykiwania:
    1. W przypadku iniekcji z portem A dla BPTES należy ustawić liczbę pomiarów na 6. Ustaw czas mieszania na 3 minuty, z czasem oczekiwania 0 minut i 3 minutami pomiaru.
    2. W przypadku wstrzyknięcia z portem B dla oligomycyny należy ustawić liczbę pomiarów na 3. Ustaw czas mieszania na 3 minuty, z czasem oczekiwania 0 minut i 3 minutami pomiaru.
    3. W przypadku iniekcji z portem C dla FCCP ustaw liczbę pomiarów na 3. Ustaw czas mieszania na 3 minuty, z 6-minutowym czasem oczekiwania i 3-minutowym czasem pomiaru.
    4. W przypadku iniekcji z portem D dla R/A należy ustawić liczbę pomiarów na 3. Ustaw czas mieszania na 3 minuty, z czasem oczekiwania 0 minut i 3 minutami pomiaru.
    5. Przejrzyj wszystkie zestawy tła, kontrolki multimediów i eksperymentalne studnie grupowe. Zapisz i uruchom test. Najpierw załaduj pakiet strumienia zewnątrzkomórkowego zastrzykami A-D. Kalibracja będzie następować, dopóki płytka ogniwa nie będzie gotowa do załadowania.
    6. Usuń płytkę komórkową natychmiast po zakończeniu testu. Zapisz wyniki, aby przeanalizować je później na innym urządzeniu.
    7. Sprawdź, czy komórki są nadal przylegające za pomocą mikroskopu świetlnego. Przemyć 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i lizować komórki preferowanym buforem do lizy komórek. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast oznaczyć stężenie białka.

4. Analiza wyników w celu oceny glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego w komórkach MH-S

  1. Wyodrębnij białko z komórek w każdym dołku, aby znormalizować dane dotyczące wskaźnika zużycia tlenu (OCR) do białka:
    1. Obliczyć stężenie (nanogramy/mikrolitr [ng/μl]) białka na studzienkę.
    2. Obliczyć średnie stężenie białka (ng/μl) dla całej płytki mikrokultury strumienia zewnątrzkomórkowego.
    3. Podziel stężenie białka w każdym dołku przez średnie stężenie białka na płytce, aby uzyskać współczynnik normalizacji.
    4. Zastosuj współczynnik normalizacji do pliku danych będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania komputerowego do projektowania i analizy testu.
  2. Upewnij się, że wartości OCR wszystkich studzienek tła są bliskie 0.
  3. Usuń zaznaczenie wszystkich dołków komórek, w których OCR wynosi < 10 na linii bazowej. Dane nie zostaną usunięte, ale w wyeksportowanym pliku danych pojawią się podświetlone dołki.
  4. Eksportuj dane z programu komputerowego do projektowania i analizy testów do komputerowego arkusza kalkulacyjnego.
  5. Otwórz plik w komputerowym programie arkusza kalkulacyjnego i posortuj wszystkie dane, zmniejszając wartości OCR. Usuń studzienki tła, studzienki, które zostały wcześniej odznaczone (i nie zostały usunięte), wszelkie studzienki o niskiej żywotności komórek, studzienki o niskiej konfluencji komórek, studzienki bez pełnego ukończenia strategii wstrzykiwania, studzienki z niedokładnymi odczytami stężenia białka, studzienki z wyjściowym OCR < 10 i wszelkie inne z góry określone kryteria.
  6. Posortuj wszystkie pozostałe dane według pomiaru, następnie według grupy, a następnie według OCR.
  7. Uśrednić techniczne powtórzenia każdego biologicznego N niezależnie za pomocą pomiaru. Upewnij się, że istnieje co najmniej 18 różnych wartości (3 na poziomie podstawowym, 3 po pożywce/BPTES, 3 po oligomycynie, 3 po FCCP i 6 po rotenonie/antymycynie A) na grupę eksperymentalną na biologiczny N po uśrednieniu kontrprób technicznych. Należy to zrobić osobno dla każdego biologicznego N, aby odchylenie standardowe lub błąd standardowy średniej można było obliczyć później dla analizowanych danych.
  8. Skopiuj wszystkie uśrednione wartości do nowego arkusza kalkulacyjnego, rozdzielając je grupami eksperymentalnymi.
  9. Uśrednić wartości OCR według strategii iniekcji w każdej grupie eksperymentalnej.
  10. Obliczać parametry bioenergetyki mitochondrialnej na podstawie zużycia tlenu:
    1. Oblicz oddychanie podstawowe:
      1. Oblicz podstawowe oddychanie mitochondrialne w następujący sposób:
        Podstawowe oddychanie mitochondrialne (zużyty pmol O2) = ([Pomiary AVG OCR #1, 2, 3 - Pomiary AVG OCR #16, 17, 18] x [Czas #3 - Czas #1])
        UWAGA: Oddychanie podstawowe powinno być podobne w grupach kontrolnych i BPTES, ponieważ ma to miejsce przed wstrzyknięciem inhibitora.
      2. Oblicz podstawowe oddychanie mitochondrialne niezależne od glutaminy w następujący sposób:
        Podstawowe oddychanie mitochondrialne niezależne: glutamina (spożyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Pomiary AVG OCR #16, 17, 18] x [Czas #9 - Czas #4])
        UWAGA: Podstawowe oddychanie mitochondrialne niezależne od glutaminy powinno być mniejsze niż podstawowe oddychanie mitochondrialne, chyba że komórki nie są silnie zależne od glutaminy.
      3. Oblicz podstawowe oddychanie mitochondrialne zależne od glutaminy w następujący sposób:
        Podstawowe oddychanie mitochondrialne zależne od glutaminy (zużyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #1, 2, 3 - Pomiary AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Czas #9 - Czas #4])
        UWAGA: Całkowite podstawowe oddychanie mitochondrialne nie powinno być odejmowane od podstawowego oddychania mitochondrialnego i nie powinno być zależne od glutaminy, ponieważ są one obliczane w różnych punktach czasowych.
    2. Oblicz oddychanie związane z ATP w następujący sposób:
      1. Oblicz całkowite mitochondrialne oddychanie sprzężone z ATP ze wszystkich paliw w następujący sposób:
        Całkowite mitochondrialne oddychanie związane z ATP ze wszystkich paliw (zużyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #1, 2, 3 - Pomiary AVG OCR #10, 11, 12] x [Czas #12 - Czas #10])
        UWAGA: Średni OCR dla pomiarów #10, 11 i 12 powinien być podobny między grupami kontrolnymi pożywek i BPTES, ponieważ oligomycyna powinna silnie hamować syntazę ATP, a hamowanie jednego szlaku paliwowego nie powinno zmieniać całkowitego oddychania związanego z ATP.
      2. Oblicz oddychanie mitochondrialne związane z ATP, które nie jest zależne od glutaminy, w następujący sposób:
        Oddychanie mitochondrialne związane z ATP niezależne od glutaminy (spożyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Pomiary AVG OCR #10, 11, 12] x [Czas #12 - Czas #10])
        UWAGA: Oddychanie mitochondrialne związane z ATP, które nie jest zależne od glutaminy, powinno być mniejsze niż oddychanie mitochondrialne połączone z ATP, chyba że komórki nie są silnie zależne od glutaminy.
      3. Oblicz oddychanie mitochondrialne związane z ATP zależne od glutaminy w następujący sposób:
        Oddychanie mitochondrialne związane z ATP zależne od glutaminy (zużyty pmolO2) = całkowite oddychanie mitochondrialne związane z ATP ze wszystkich paliw - Oddychanie mitochondrialne związane z ATP niezależne od glutaminy
    3. Oblicz maksymalne oddychanie w następujący sposób:
      1. Oblicz całkowite maksymalne oddychanie mitochondrialne w następujący sposób:
        Całkowite maksymalne oddychanie mitochondrialne (zużyty pmol O2) = ([Pomiary AVG OCR #13, 14, 15 - Pomiary AVG OCR #16, 17, 18] x [Czas #15 - Czas #13])
      2. Oblicz maksymalne oddychanie mitochondrialne niezależne od glutaminy w następujący sposób:
        Maksymalne oddychanie mitochondrialne niezależne od glutaminy (zużyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #13, 14, 15 grup BPTES - Pomiary AVG OCR #16, 17, 18 grup BPTES] x [Czas #15 - #Time 13])
      3. Oblicz maksymalne oddychanie mitochondrialne zależne od glutaminy w następujący sposób:
        Maksymalne oddychanie mitochondrialne zależne od glutaminy (zużyty pmolO2) = Całkowite maksymalne oddychanie mitochondrialne ze wszystkich paliw - Maksymalne oddychanie mitochondrialne niezależne od glutaminy
        UWAGA: Obliczenia te można wykorzystać do określenia zależności komórek od wolnej pojemności glutaminy w porównaniu z innymi paliwami. Im większe maksymalne oddychanie mitochondrialne, tym większa zależność od glutaminy, co można wyrazić jako grupy BPTES - grupy kontrolne wykazujące ubytek w maksymalnym oddychaniu mitochondrialnym lub jako procent całkowitego oddychania.
    4. Oblicz wolną wydolność oddechową w następujący sposób:
      1. Oblicz całkowitą wolną pojemność oddechową w następujący sposób:
        Całkowita zapasowa pojemność oddechowa (zużyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #13, 14, 15 - Pomiary AVG OCR #1, 2, 3] x [Czas #15 - Czas #13])
      2. Oblicz wolną wydolność oddechową niezależną od glutaminy w następujący sposób:
        Wolna pojemność oddechowa niezależna od glutaminy (spożyty pmolO2) = ([Pomiary AVG OCR #13, 14, 15 grup BPTES - Pomiary AVG OCR #1, 2, 3 grup BPTES] x [Czas #15 - Czas #13])
      3. Oblicz wolną pojemność oddechową zależną od glutaminy w następujący sposób:
        Wolna pojemność oddechowa zależna od glutaminy (zużyty pmolO2) = Całkowita wolna pojemność oddechowa ze wszystkich paliw - Wolna pojemność oddechowa niezależna od glutaminy
        UWAGA: To obliczenie przedstawia elastyczność komórek zależnych od glutaminy i czy mogą osiągnąć lepsze oddychanie bez glutaminy, gdy jest to potrzebne.
  11. Odejmij kontrole pożywek według grup inhibitorów i w razie potrzeby znormalizuj pmol O2 spożywany w stosunku do grupy kontrolnej.
  12. Twórz wykresy profili bioenergetycznych OCR (pmol O2/min), oddychania podstawowego (pmol O2), oddychania sprzężonego z ATP (pmol O2), maksymalnego oddychania (pmol O2) i wolnej pojemności oddechowej (pmol O2) zależnej od glutaminy.
  13. Przedstaw wartości bioenergetycznych punktów końcowych mitochondriów na wykresach słupkowych lub wyraź je jako średnie grup inhibitorów w stosunku do grup kontrolnych pożywki. Jeśli każde biologiczne N jest obliczane oddzielnie, należy obliczyć odchylenie standardowe lub błąd standardowy średniej dla analizowanych danych dla wszystkich biologicznych N .

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj wszystkie analizy statystyczne za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.
  2. Dla punktów liniowych profili bioenergetycznych OCR należy przeprowadzić dwukierunkową ANOVA, a następnie analizy post hoc Tukeya, aby porównać dane z tych czterech grup eksperymentalnych z dwoma czynnikami (strategia leczenia i wstrzykiwania): Con + media, Con + BPTES, pożywki EtOH + i EtOH + BPTES.
  3. W przypadku wykresów słupkowych oddychania podstawowego, oddychania sprzężonego z ATP, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności oddechowej zależnej od glutaminy, przeprowadź analizy testu t Studenta, aby porównać dane z dwóch grup eksperymentalnych, Con + BPTES i EtOH + BPTES.
  4. Przedstaw dane jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM). Rozważmy, że p < 0,05 jest statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przewlekła ekspozycja na EtOH zmniejsza zależność komórek MH-S od glutaminy.
Glutaminoliza jest kluczowym szlakiem oddychania mitochondrialnego, w którym glutamina służy jako istotne źródło paliwa dla bioenergetyki komórkowej. Aby określić, czy przewlekła ekspozycja na EtOH zmienia zależność komórek MH-S od glutaminy jako źródła paliwa dla oddychania mitochondrialnego, komórki MH-S traktowano kontrolnie bez EtOH (Con) lub EtOH, a następnie mierzono OCR w czasie w odpowiedzi na seryjne iniekcje odczyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dane przedstawione w niniejszym dokumencie są dodatkowymi kontrpróbami biologicznymi dla nieleczonych i przewlekle narażonych na EtOH komórek MH-S poddanych kontroli pożywki lub BPTES, które zostały opublikowane w Crotty et al.11. Opisany protokół służy do oceny zależności komórek MH-S narażonych na EtOH od glutaminy jako źródła paliwa do oddychania mitochondrialnego i bioenergetyki przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie mają do zgłoszenia żadnych istotnych finansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

Doceniamy wkład Sarah S. Chang, BS, w początkową hodowlę komórkową i przygotowanie komórek MH-S do eksperymentów. Prace te były wspierane przez NIAAA R01-AA026086 do SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 do KMC oraz NIGMS T32-GM008602 do Randy'ego Halla, Wydziału Farmakologii i Biologii Chemicznej, Emory University. Treść niniejszego raportu nie odzwierciedla poglądów Departamentu ds. Weteranów ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka stożkowa 15 ml VWR International, Inc.21008-670Służy do przygotowywania podstawowych stężeń odczynników związanych z mitochondriami.
2-merkaptoetanol Sigma Aldrich Co.M6250Służy do hodowli komórek MH-S.
Skrobak do komórekDot Scientific, Inc.70-1180Służy do skrobania ogniw MH-S z kolb T-75.
Countess 3 FL Instrument: licznik komórekFisher Scientific CompanyAMQAF2000Służy do liczenia liczby komórek MH-S do płytki do eksperymentów.
D-glukoza Sigma Aldrich Co.G8270Używany do ośrodka bazowego strumienia zewnątrzkomórkowego.
EthanolFisher Scientific Company4355720Eksperymentalne leczenie komórek MH-S.
Surowica bydlęcapłodu Sciencell Research Laboratories500Służy do hodowli komórek MH-S.
GentamycynaSigma Aldrich Co.G1397Służy do hodowli komórek MH-S.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Stosowany do podłoża bazowego strumienia zewnątrzkomórkowego.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/AOprogramowanie do analizy statystycznej. Do pobrania po zakupie na https://www.graphpad.com/features.
Komórki MH-SKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-2019Linia komórkowa makrofagów pęcherzykowych myszy.
Probówka do mikrowirówek Stany Zjednoczone Naukowe, Inc.4036-3212Służy do przygotowywania stężeń roboczych odczynników związanych z mitochondriami.
Microsoft 365 Excel: komputerowy arkusz kalkulacyjnyMicrosoftN/ASoftware do organizacji danych i obliczeń bioenergetyki mitochondrialnej. Do pobrania po zakupie na https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicylina/streptomycynaFisher Scientific Company15140122Służy do hodowli komórek MH-S.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiVWR International, Inc.45000-446Służy do mycia ogniw MH-S.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Służy do hodowli komórek MH-S.
Oprogramowanie Seahorse Wave Pro: oprogramowanie komputerowe do projektowania i analizy testówfirmy Agilent Technologies, Inc.Nie dotyczyKomputer jest podłączony do urządzenia Seahorse XF Pro Analyzer. Do pobrania z  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: podłoże bazowe strumienia zewnątrzkomórkowego, pH 7,4Agilent Technologies, Inc.103334-100Służy do przygotowywania stężeń podstawowych i roboczych odczynników związanych z mitochondriami oraz hodowli komórek MH-S przed seriami doświadczalnymi.
Seahorse XF Zestaw do testów warunków skrajnych związanych z utlenianiem glutaminyAgilent Technologies, Inc.103674-100Zawiera zapas BPTES, oligomycynę, FCCP i rotenon/antymycynę A.
Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowegoAgilent Technologies, Inc.Nie dotyczyBioanalizator strumienia zewnątrzkomórkowego.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-dołkowe wkłady z zewnątrzkomórkowym topnikiem, 96-dołkowe płytki do mikrohodowli strumienia zewnątrzkomórkowego i roztwór kalibruAgilent Technologies, Inc.102416-100Służy do przygotowania komórek MH-S do testów przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
Pipipeta serologiczna Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Służy do usuwania mediów z ogniw MH-S.
Wodorowęglan soduSigma Aldrich Co.S6014Służy do hodowli komórek MH-S.
Pirogronian sodu Sigma Aldrich Co.P4562Używany do pożywki bazowej strumienia zewnątrzkomórkowego.
Kolby T-75Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Służy do hodowli komórek MH-S.

Bibliografia

  1. 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021).
  2. Everts, R. J., et al. Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital. N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).
  3. de Roux, A., et al. Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia. Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).
  4. Moss, M. Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse. Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).
  5. Fernandez-Sola, J., et al. High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia. Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).
  6. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).
  7. Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).
  8. Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction. Biomed Res Int. 2014, 371593(2014).
  9. Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages. Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).
  10. Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4. Alcohol. 90, 27-38 (2021).
  11. Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).
  12. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  13. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  14. Chacko, B. K., et al. The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).
  15. Fan, Y., et al. Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology. STAR Protoc. 4 (1), 102073(2023).
  16. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).
  17. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  18. Winnica, D., et al. Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets. Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).
  19. Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity. Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).
  20. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  21. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health. Redox Biol. 10, 65-77 (2016).
  24. Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology. Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).
  25. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. 46, e2511(2010).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  27. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  28. Yeligar, S. M., et al. PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).
  29. Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199. J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).
  30. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Alcohol. 106, 30-43 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

metabolizm glutaminyprzewlekła ekspozycja na etanoloddychanie mitochondrialneglutaminolizaszybkość zużycia tlenuoddychanie zależne od ATPkomórki MHSinhibitor BPTES
Ocena glutaminy jako źródła paliwa dla makrofagów pęcherzykowych narażonych na przewlekłe działanie etanolu przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.