Artykuł metodologiczny

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

DOI:

10.3791/67581

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota, 2Minnesota Supercomputing Institute, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaproteomika kliniczna ujawnia interakcje gospodarz-mikrobiom leżące u podstaw chorób. Istnieją jednak wyzwania związane z tym podejściem. W szczególności trudna jest charakterystyka białek drobnoustrojów występujących w małej liczebności w stosunku do białek gospodarza. Inne istotne wyzwania wiążą się z wykorzystaniem bardzo dużych baz danych sekwencji białek, co utrudnia czułość i dokładność podczas identyfikacji peptydów i białek na podstawie danych ze spektrometrii mas, a także z pobieraniem taksonomii i adnotacji funkcjonalnych oraz przeprowadzaniem analiz statystycznych. Aby rozwiązać te problemy, przedstawiamy zintegrowany bioinformatyczny przepływ pracy dla metaproteomiki opartej na spektrometrii mas, który łączy generowanie niestandardowych baz danych sekwencji białek, generowanie i weryfikację dopasowania widma peptydów, kwantyfikację, adnotacje taksonomiczne i funkcjonalne oraz analizę statystyczną. Ten przepływ pracy oferuje również charakterystykę białek ludzkich (przy jednoczesnym priorytetowym traktowaniu białek mikrobiologicznych), oferując w ten sposób wgląd w dynamikę gospodarz-mikroorganizm w chorobie. Narzędzia i przepływ pracy są wdrażane w ekosystemie Galaxy, umożliwiając rozwój, optymalizację i rozpowszechnianie tych zasobów obliczeniowych. Zastosowaliśmy ten przepływ pracy do analizy metaproteomicznej wielu typów próbek klinicznych, takich jak wymazy z nosogardzieli i płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Tutaj pokazujemy jego użyteczność poprzez analizę pozostałości płynu z wymazów z szyjki macicy. Kompletny przepływ pracy i towarzyszące mu zasoby szkoleniowe są dostępne w Galaxy Training Network, aby wyposażyć zarówno amatorów, jak i doświadczonych badaczy w niezbędną wiedzę i narzędzia do analizy ich danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaproteomika oparta na spektrometrii mas (MS) identyfikuje i określa ilościowo białka mikrobiologiczne i ludzkie z próbek klinicznych. Podejście to pozwala lepiej zrozumieć reakcje mikrobiomu na chorobę i odkrywa potencjalne mediatory interakcji gospodarz-mikrobiom1,2. Chociaż analiza metaproteomiczna próbek klinicznych może odkryć interakcje mikrobiomu ze środowiskiem gospodarza, dziedzina ta nadal stoi przed wieloma wyzwaniami. Jednym z głównych wyzwań jest stosunkowo duża obfitość białek gospodarza (ludzkiego), co utrudnia identyfikację mniej obfitych białek drobnoustrojów. Co więcej, metaproteomika oparta na stwardnieniu rozsianym zależy od wykorzystania bardzo dużych baz danych sekwencji białek. Te bazy danych zawierają proteomy drobnoustrojów, które są obecne w próbce, co może skutkować dużą bazą danych zawierającą miliony sekwencji. Po wygenerowaniu widm tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) z białek trawionych tryptycznie, widma MS/MS są przeszukiwane w dużych bazach danych sekwencji białek, dopasowując sekwencję peptydową do każdego widma (dopasowanie widma peptydowego lub PSM). Jednak czułość maleje, a ryzyko wyników fałszywie dodatnich wzrasta wraz z dużymi bazami danych używanymi do metaproteomiki3. Ponadto konserwatywne sekwencje białek w taksonach i niewystarczająca adnotacja kodowanych białek ograniczają adnotacje taksonomiczne i funkcjonalne dla wykrytych peptydów i białek4,5. Przedstawiamy bioinformatyczny przepływ pracy do skutecznej analizy metaproteomicznej próbek klinicznych, który rozwiązuje wiele z tych wyzwań i zapewnia dostępne zasoby oprogramowania dla naukowców do badania dynamiki mikrobiomu gospodarza leżącej u podstaw chorób ludzkich.

Kliniczna metaproteomika została wykorzystana do zbadania różnych typów próbek, w tym kału i wymazów z pochwy, między innymi, w celu rozszyfrowania mechanizmów patogennych w chorobach i warunkach6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. W tym miejscu używamy metaproteomicznego przepływu pracy bioinformatycznego do analizy podzbioru danych MS/MS z próbek płynu testowego Pap (PTF) od pacjentów z rakiem jajnika (OVCA) i pacjentek bez OVCA21. Narzędzia programowe i przepływ pracy są dostępne za pośrednictwem platformy Galaxy, która usprawnia opracowywanie i wykonywanie złożonych klinicznych przepływów pracy metaproteomicznej22,23,24,25. Galaxy to platforma typu open source, która została zaprojektowana dla bioinformatyki i biologii obliczeniowej. Zapewnia środowisko internetowe do korzystania z narzędzi i przepływów pracy typu open source, w którym badacze akademiccy mogą wykonywać i udostępniać złożone analizy danych. Kwitnąca globalna społeczność programistów, analityków danych i użytkowników końcowych utrzymuje ekosystem Galaxy, w tym Galaxy Training Network (GTN; https://training.galaxyproject.org/), który oferuje zasoby szkoleniowe online i na żądanie22,23,24,25,26,27. Nasz przepływ pracy ma na celu ujawnienie nowego zrozumienia dynamiki gospodarz-mikroorganizm w próbkach klinicznych, a także wygenerowanie nowych, dobrze scharakteryzowanych celów peptydowych będących przedmiotem zainteresowania w celu opracowania ukierunkowanych testów klinicznych opartych na stwardnieniu rozsianym do dalszych badań próbek klinicznych6,20,28. Ponadto manuskrypt ten ma na celu zwrócenie uwagi na metodologię przepływu pracy w metaproteomice klinicznej. Bardziej szczegółowe i przyjazne dla początkujących przewodniki znajdują się w GTN (https://training.galaxyproject.org/), ponieważ jest to cenne źródło informacji, z którego można korzystać równolegle z tym manuskryptem dla użytkowników poszukujących dodatkowych wyjaśnień, które nie zostały omówione. Społeczność Galaxy jest autorem licznych manuskryptów, które mają pomóc początkującym użytkownikom platformy Galaxy20,21,22,23,24,25,26,27.

Wszystkie dodatkowe tabele (np. parametry narzędzi) i rysunki (np. przykładowe wykresy) dla tego manuskryptu zostały dostarczone jako osobne pliki i są odpowiednio przywoływane. W tym manuskrypcie użyto aktualnych wersji narzędzi w Galaxy w wersji 2.3.0. Dlatego wyniki mogą się nieznacznie różnić w zależności od aktualizacji Galaxy i wersji narzędzi. Platforma Galaxy i jej narzędzia są open-source i mogą być wykorzystywane do celów badań akademickich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane spektralne MS/MS uzyskano z pozbawionych elementów identyfikacyjnych próbek PTF, które zostały zebrane przy użyciu procedur zgodnych z wytycznymi i przepisami zatwierdzonymi przez radę instytucji, jak wcześniej opisano21,29,30.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd całego przepływu pracy, który składa się z pięciu modułów. Wszystkie dane wejściowe, wyjściowe i narzędzia programowe podsumowano w tabeli uzupełniającej 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Podsumowanie modułów przepływu pracy metaproteomiki klinicznej w Galaxy. Kompletny przepływ pracy metaproteomiki klinicznej składa się z pięciu modułów: Generowanie bazy danych, Odkrywanie, Weryfikacja, Kwantyfikacja i Interpretacja danych. (A) Obszerna, obszerna baza danych zawiera sekwencje białek z gatunków drobnoustrojów, które uważa się za obecne w próbce, ludzi i powszechnych zanieczyszczeń. Narzędzie programowe MetaNovo bezpośrednio dopasowało dane spektralne MS/MS do peptydów i wywnioskowało białka i ich organizm źródłowy na podstawie surowych danych MS i dużej bazy danych sekwencji wejściowych białek, tworząc zredukowaną bazę danych33. Zredukowana baza danych z MetaNovo jest następnie łączona z białkami ludzkimi i białkami zanieczyszczeń w celu stworzenia bazy danych do odkrywania peptydów. orazDwa algorytmy identyfikacji peptydów, SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant, dopasowują sekwencje peptydów do widm MS/MS i bazy danych białek wabiących cel49. orazPeptydy zidentyfikowane przez SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant są następnie weryfikowane za pomocą PepQuery2. PepQuery2 rygorystycznie ponownie bada przypuszczalnie zidentyfikowane sekwencje peptydów mikrobiologicznych i ich dopasowane widma MS/MS w porównaniu z innymi potencjalnymi dopasowaniami do ludzkiego proteomu gospodarza i/lub zanieczyszczeń, weryfikując w ten sposób wysoce pewne dopasowania mikrobiologiczne40,41. Zweryfikowane peptydy są wykorzystywane do generowania zweryfikowanej bazy danych sekwencji białek, która zostanie wykorzystana do ilościowego oznaczania peptydów i białek. (D) MaxQuant42 przeszukuje dane MS/MS w stosunku do zweryfikowanej sekwencji białek i określa ilościowo peptydy mikrobiologiczne i wywnioskowane białka wraz z białkami ludzkimi. (E) Unipept45 i MSstatsTMT46 są używane w ostatnim kroku do opisywania białek za pomocą taksonomii i informacji funkcjonalnych (akcesje Komisji ds. Enzymów), a także do generowania wykresów wulkanów i porównań. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Etykietowanie TMT i generowanie widm MS/MS

  1. Aby przygotować się do analizy stwardnienia rozsianego, należy przeprowadzić pobieranie próbek klinicznych zgodnie z wytycznymi i przepisami.
    UWAGA: Ponieważ niniejszy protokół kładzie nacisk na bioinformatyczny przepływ pracy, procedury pobierania próbek klinicznych mogą różnić się od tych, które zostały użyte w tym manuskrypcie. W tym przypadku białka zostały tryptycznie strawione do mieszaniny peptydów, znakowane, frakcjonowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu wygenerowania danych spektralnych MS/MS do dalszej analizy przy użyciu platformy Galaxy. Szczegółowe instrukcje przetwarzania próbek zostały wcześniej opisane przez Boylan et al.29 oraz Afiuni-Zadel et al.30.
  2. Wyizoluj białka z próbek klinicznych i strawij je na peptydy za pomocą trypsyny29,30.
  3. Oznaczyć białka odczynnikiem Tandem Mass Tag (TMT)-11-plex. Ten odczynnik do znakowania pomoże w ilościowym określeniu peptydów i białek31,32.
    1. Podziel oznaczone próbki losowo i równomiernie na cztery grupy eksperymentalne oparte na TMT.
    2. Dla każdej grupy eksperymentalnej dołącz jedną zbiorczą próbkę referencyjną oznaczoną unikalnym znacznikiem TMT, która posłuży jako wspólne odniesienie do porównania z każdą pojedynczą próbką w czterech grupach eksperymentalnych31,32.
  4. Przeprowadzić frakcjonowanie offline na próbkach zbiorczych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami o wysokim pH (RPLC)29,30.
  5. Analizuj frakcje metodą chromatografii cieczowej tandemowej MS (LC-MS/MS) za pomocą hybrydowego spektrometru mas kwadrupolowo-orbitrapowego29,30. Zapisz wygenerowane dane spektralne MS/MS w formacie Thermo Raw (thermo.raw).
    UWAGA: W razie potrzeby pliki Thermo Raw są konwertowane do formatu Mascot Generic Format (.mgf), aby były kompatybilne z różnymi programami. W tym tekście skróty "RAW" i "MGF" oznaczają format pliku wejściowych zestawów danych MS/MS. Na rysunkach zestawy danych MS/MS są dla uproszczenia reprezentowane przez te same ikony RAW.

2. Konfiguracja modułu

UWAGA: Wybrane przyciski/menu są pogrubione. Przykładowe pliki, przepływy pracy i parametry narzędzi są dostępne za pośrednictwem tabel uzupełniających. Więcej informacji na temat korzystania z Galaxy można znaleźć na stronie GTN FAQs (https://training.galaxyproject.org/training-material/faqs/galaxy/).

  1. Serwer Galaxy Europe
    1. Uzyskaj dostęp do serwera Galaxy Europe (Galaxy EU; https://usegalaxy.eu/).
    2. Utwórz konto lub zaloguj się. Do utworzenia nowego konta wymagany jest prawidłowy adres e-mail. Zaloguj się jako użytkownik, aby korzystać z Galaxy.
  2. Przygotowanie historii galaktyki
    1. Jeśli użytkownik importuje przykładowe dane wejściowe z Tabeli uzupełniającej 2, wykonaj kroki 2.2.1.1-2.2.1.3.
      1. Otwórz przykładowe historie galaktyk, korzystając z linków podanych w Tabeli Uzupełniającej 2.
      2. Kliknij szary przycisk Importuj tę historię znajdujący się w lewym górnym rogu (środkowego) panelu. Zmień nazwę historii i kliknij przycisk Kopiuj historię. W razie potrzeby dodaj ich zestawy danych do tej historii, klikając przycisk Prześlij w skrajnym lewym panelu i dodaj pliki do przesłania.
      3. Kliknij przycisk Start > Close (Rozpocznij) Zamknij. Przesłane pliki pojawią się w panelu historii po prawej stronie. Poczekaj, aż kolor zestawu danych zmieni kolor na zielony przed użyciem.
        UWAGA: W przypadku importowania (kopiowania) istniejącej historii nie należy tworzyć osobnej (nowej) historii.
    2. Jeśli użytkownik tworzy nową historię i przesyła swoje dane, wykonaj kroki 2.2.2.1.-2.2.2.2.
      1. W panelu Historia (po prawej stronie) kliknij raz ikonę + (plus), aby utworzyć nową historię o nazwie "Historia nienazwana". Kliknij ikonę ołówka obok historii i kliknij Zapisz. Te same kroki dodawania zestawów danych do istniejącej (przykładowej) historii mają zastosowanie do przesyłania danych.
      2. W skrajnym lewym panelu kliknij Prześlij i dodaj pliki do przesłania. Kliknij przycisk Start > Close (Rozpocznij) Zamknij. Przesłane pliki pojawią się w nowej historii. Poczekaj, aż kolor zestawów danych zmieni kolor na zielony.
    3. Jeśli użytkownik analizuje jednocześnie wiele plików MS/MS, wykonaj kroki 2.2.3.1.-2.2.3.3.
      1. Umieść je w kolekcji zestawów danych, aby wybrać je jako jedne dane wejściowe. Kliknij ikonę znacznika wyboru w panelu Historia i wybierz (sprawdź) zestawy danych.
      2. Kliknij przycisk z informacją o liczbie wybranych zestawów danych (np. 4 z 8 wybranych), a następnie w menu rozwijanym kliknij opcję Utwórz listę zestawów danych. W wyskakującym okienku wpisz nazwę kolekcji (np. MGF Data, RAW Data). W razie potrzeby wybierz, czy oryginalne zestawy danych zostaną ukryte po utworzeniu kolekcji.
      3. Kliknij niebieski przycisk Utwórz kolekcję w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka. Kliknij ikonę znacznika wyboru w panelu Historia, aby usunąć zaznaczenie zestawów danych.
        UWAGA: Każdy z pięciu modułów powinien być uruchomiony we własnej (zaimportowanej lub nowej) historii Galaxy, aby poprawić wrażenia użytkownika. Aby uniknąć nadmiarowości, późniejsze instrukcje modułu pominą konfigurację i skupią się na krokach przepływu pracy.
  3. Importowanie i uruchamianie przepływu pracy
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby wszyscy użytkownicy, niezależnie od tego, czy korzystają z danych przykładowych, czy swoich danych, korzystali i/lub dostosowywali modułowe przepływy pracy z ustalonymi parametrami (Tabela uzupełniająca 2). W ten sposób użytkownicy mogą uniknąć konieczności wyszukiwania i ustawiania parametrów dla każdego narzędzia. W razie potrzeby użytkownicy mogą wyszukać narzędzia, klikając przycisk Narzędzia w skrajnym lewym panelu i wpisując nazwę narzędzia (tak dokładnie, jak to możliwe) w pasku wyszukiwania w sąsiednim panelu. Pasujące narzędzia pojawią się automatycznie. Kliknij właściwy wynik wyszukiwania i ustaw odpowiednie parametry (patrz Plik uzupełniający 1). Przed uruchomieniem narzędzia użytkownicy mogą skonfigurować powiadomienia e-mail, aby powiadamiać ich o zakończeniu zadania, wybierając przycisk na końcu parametrów. Dla wygody dostępne są dwa przyciski Uruchom: jeden w prawym górnym rogu środkowego panelu, a drugi po polach parametrów. Tabela uzupełniająca 3 zawiera dodatkowe zasoby szkoleniowe. Wersje narzędzi i baz danych są aktualne i działają w momencie pisania tego tekstu (czerwiec 2024 r.), ale mogą ulec zmianie wraz z aktualizacją Galaxy oraz powiązanych narzędzi i baz danych.
    1. Otwórz przepływ pracy w nowej karcie, korzystając z łączy w Tabeli uzupełniającej 2.
      1. Kliknij przycisk Importuj w prawym górnym rogu panelu. Otworzy się nowa karta z zielonym polem, które potwierdza, że przepływ pracy został zaimportowany. Zielone pole będzie również zawierało dwie opcje: zacznij od razu korzystać z tego przepływu pracy lub wróć do poprzedniej strony.
      2. Kliknij pierwszy przycisk ("rozpocznij korzystanie z tego przepływu pracy..."), aby otworzyć kartę Przepływ pracy w środkowym panelu interfejsu, w której wyświetlane są wszystkie zapisane przepływy pracy. Znajdź przepływ pracy, który został właśnie zaimportowany, i kliknij niebieski przycisk odtwarzania (trójkąt). Spowoduje to wyświetlenie pól wejściowych.
        UWAGA: Dla każdego podanego przepływu pracy pola wejściowe odpowiadają przykładowym danym wejściowym (tabela uzupełniająca 2). Jeśli użytkownik analizuje swoje dane, jego dane wejściowe powinny być odpowiednio nazwane, aby upewnić się, że dla każdego modułu są używane właściwe pliki.
    2. Jeśli użytkownik chce wyświetlić przepływy pracy na serwerze Galaxy EU, wykonaj kroki 2.3.2.1-2.3.2.4.
      1. Kliknij przycisk Przepływ pracy w górnym pasku witryny Galaxy. Na tej karcie kliknij kartę podrzędną Moje przepływy pracy, aby wyświetlić wszystkie zaimportowane przepływy pracy. Aby wyświetlić przepływ pracy, kliknij przycisk Edytuj z ikoną ołówka w celu otwarcia edytora przepływu pracy.
      2. W edytorze przepływu pracy możesz wchodzić w interakcje z przepływem pracy, na przykład klikać i przeciągać w celu reorganizacji, klikać narzędzia, aby je wyświetlić, zmieniać parametry itp. Po wprowadzeniu zmian zapisz edytowany przepływ pracy, klikając ikonę dysku w górnej części prawego panelu, a w razie potrzeby uruchom przepływ pracy, klikając ikonę odtwarzania (również w górnej części prawego panelu).
      3. Tworzenie przepływów pracy specyficznych dla użytkownika w celu analizowania niestandardowych danych wejściowych. W zależności od wiedzy użytkownika z zakresu metaproteomiki i doświadczenia z platformą Galaxy, zbuduj przepływ pracy, a następnie przeanalizuj dane.
      4. Jeśli użytkownik jest mniej doświadczony, przetestuj różne narzędzia w historii, a następnie wyodrębnij przepływ pracy z ich ukończonej analizy.
        UWAGA: Ten wyodrębniony przepływ pracy można rozszerzać, poprawiać i ponownie wykorzystywać, co pozwala użytkownikom na dokładne odtworzenie swojej pracy. Bardziej szczegółowe instrukcje można znaleźć w sekcji FAQ GTN dotyczącej przepływów pracy (https://training.galaxyproject.org/training-material/faqs/galaxy/#workflows).
    3. Kliknij każde pole wejściowe i wybierz odpowiednie dane wejściowe. Sekcje od 3 do 7 opisują wejścia modułu. Sprawdź, czy wszystkie dane wejściowe są w akceptowanym formacie, aby uniknąć błędów. Kliknij akceptowane formaty pod każdym polem wejściowym, aby sprawdzić, czy wszystkie pliki są kompatybilne z narzędziami. Po zakończeniu kliknij Uruchom workflow.
      UWAGA: Jeśli użytkownik woli skonfigurować narzędzia ręcznie, materiały instruktażowe dla każdego modułu tego przepływu pracy metaproteomiki klinicznej są dostępne na stronie internetowej GTN (https://gxy.io/GTN:P00019). Szacowane czasy wykonania kluczowych narzędzi zostały uwzględnione w tabeli uzupełniającej 2, ale środowiska wykonawcze są zależne od rozmiaru danych wejściowych, zależności narzędzi (takich jak wymagania dotyczące pamięci w porównaniu z przydzieloną pamięcią), zaplanowanych czasów konserwacji, błędów itp. Stany zadań są wskazywane kolorem zestawu danych, a po wybraniu (kliknięciu) zestawu danych pojawi się komunikat informujący, czy zadanie oczekuje na umieszczenie w kolejce (szary), uruchomiony (pomarańczowy) czy zakończony niepowodzeniem (czerwony). Po zakończeniu zadania zestaw danych zmieni kolor na zielony (brak komunikatu potwierdzającego). Użytkownicy mogą wyrazić zgodę na otrzymywanie powiadomień e-mail, które będą ich powiadamiać o zakończeniu zadań (patrz UWAGA na początku kroku 2.3). Poniższe instrukcje dotyczące modułu pominą wyraźne kroki konfiguracji, ponieważ są one takie same dla każdego modułu (patrz sekcja 2 i często zadawane pytania dotyczące GTN, jeśli to konieczne) i opiszą kluczowe narzędzia dla każdego modułu. Pełna lista używanych narzędzi znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1. Nazwy narzędzi zostały pogrubione. Dla porównania, wszystkie nazwy, wersje i opisy narzędzi są zawarte w Tabeli materiałów. Jeśli użytkownik korzysta z przykładowych przepływów pracy z tabeli uzupełniającej 2, zapoznaj się z przykładowymi nazwami plików znajdującymi się w nawiasach na końcu każdego kroku. Jeśli użytkownik uruchamia narzędzia niezależnie, przykładowe nazwy plików mogą zostać zignorowane. Aby zmienić nazwę zestawu danych, kliknij ikonę ołówka w prawym górnym rogu zestawu danych. W polu "Nazwa" wpisz nową nazwę i kliknij Zapisz.

3. Moduł 1: Generowanie bazy danych sekwencji białek

UWAGA: Jeśli użytkownik chce skorzystać z przykładowych danych wejściowych i przepływu pracy z Tabeli Uzupełniającej 2, powinien postępować zgodnie z instrukcjami w sekcji 2. W przypadku modułu 1 zaimportuj dane wejściowe i przepływ pracy dla GENEROWANIA BAZY DANYCH. Kolumna danych wyjściowych w tabeli uzupełniającej 2 zawiera przykłady ukończonych historii wydruków w celach informacyjnych. Dla wszystkich modułów odpowiedni samouczek dotyczący OWS można znaleźć w tabeli uzupełniającej 3.

  1. Należy sporządzić wykaz gatunków, które są powiązane z chorobą lub stanem będącym przedmiotem zainteresowania i/lub miejscem pobrania próbek.
    1. Listę tych gatunków można uzyskać z przeglądu literatury. Alternatywnie, jeśli próbki były wcześniej analizowane, należy uzyskać listę gatunków z 16S rRNA lub sekwencjonowania metagenomicznego.
    2. Zapisz tę listę gatunków jako plik tabelaryczny (np. Species.tabular).
      UWAGA: Korzystając z listy gatunków, zostanie wygenerowana duża, obszerna baza danych sekwencji białek znanych mikroorganizmów chorobotwórczych, a przy użyciu MetaNovo, ta duża baza danych, która zawiera miliony sekwencji białek, zostanie następnie zredukowana do łatwiejszej w zarządzaniu bazy danych zawierającej białka obecne w próbkach. Krok redukcji bazy danych ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele narzędzi do przeszukiwania baz danych nie jest w stanie obsłużyć milionów sekwencji. Zmniejszona baza danych zostanie połączona z białkami ludzkimi i zanieczyszczeniami w celu wygenerowania kompaktowej bazy danych w celu wygenerowania kompaktowej bazy danych, która zostanie wykorzystana do identyfikacji peptydów w następnym module (sekcja 4).
  2. Użyj listy gatunków (Species.tabular) jako danych wejściowych dla UniProt (pobierz proteom jako fasta), aby wygenerować bazę danych sekwencji białek (Species UniProt FASTA.fasta).
  3. Uruchom narzędzie Protein Database Downloader, aby wygenerować dwie dodatkowe bazy danych sekwencji białek: Human SwissProt (tylko recenzja) i białka zanieczyszczeń (Human SwissProt Protein Database.fasta, Contaminants [cRAP] Protein Database.fasta). Białka zanieczyszczające są również określane jako powszechne repozytorium białek przybyszowych lub cRAP.
  4. Użyj trzech baz danych białek jako danych wejściowych dla FASTA Merge Files i Filter Unique Sequences, aby wykluczyć duplikaty i wygenerować dużą bazę danych sekwencji białek (Human UniProt Microbial Proteins cRAP for MetaNovo.fasta).
  5. Użyj dużej (kompleksowej) bazy danych (z kroku 3.4) i zestawów danych MS (MGF) jako danych wejściowych dla MetaNovo33, aby wygenerować zredukowaną bazę danych (MetaNovo Compact Database.fasta).
  6. Uruchom FASTA Merge Files i Filter Unique Sequences w bazie danych wygenerowanej przez MetaNovo, bazach danych Human SwissProt (tylko recenzowane) i cRAP, aby wygenerować zredukowaną (docelową) bazę danych sekwencji białek mikrobiologicznych, ludzkich i zanieczyszczających, które będą używane do wykrywania peptydów (Human UniProt Microbial Proteins [z MetaNovo] i cRAP.fasta).

4. Moduł 2: Odkrywanie peptydów poprzez przeszukiwanie bazy danych

UWAGA: Jeśli użytkownik chce skorzystać z przykładowych danych wejściowych i przepływu pracy z Tabeli Uzupełniającej 2, koniecznie postępuj zgodnie z instrukcjami w Sekcji 2. W przypadku modułu 2 zaimportuj dane wejściowe i przepływ pracy dla funkcji DISCOVERY. Dla wszystkich modułów odpowiedni samouczek dotyczący OWS można znaleźć w tabeli uzupełniającej 3. SearchGUI34,35,36 i PeptideShaker37 są oddzielnymi programami, ale będą traktowane jako jeden program do identyfikacji i przetwarzania peptydów, ponieważ są używane razem. W celu zapewnienia kompatybilności oprogramowania, zestawy danych MS/MS zostaną przekonwertowane z RAW na MGF dla SearchGUI/PeptideShaker za pomocą narzędzia msconvert (w dostarczonym przepływie pracy). MaxQuant38 może przetwarzać pliki RAW.

  1. Uruchom FastaCLI, aby dodać sekwencje białek wabiących do zredukowanej (docelowej) bazy danych w celu wygenerowania bazy danych sekwencji białek wabika (FastaCLI MetaNovo Human SwissProt cRAP with decoys.fasta).
    UWAGA: FastCLI będzie musiał zostać uruchomiony tylko dla SearchGUI/PeptideShaker. MaxQuant może dodawać wabiki i zanieczyszczenia do bazy danych sekwencji białek. W tym przypadku zredukowana baza danych zawiera już zanieczyszczenia (cRAP), więc MaxQuant został ustawiony tak, aby dodawać tylko wabiki.
  2. Uruchom SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant, aby przeszukać zestawy danych MS w zmniejszonej bazie danych w celu zidentyfikowania peptydów i ostatecznie przypisania ich do sekwencji białkowych za pomocą przeszukiwania bazy danych sekwencji. Patrz Tabela Uzupełniająca 4, aby zapoznać się z parametrami narzędzia.
    UWAGA: W tym przypadku zostaną użyte dwa programy do identyfikacji peptydów (SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant) do identyfikacji sekwencji peptydów i białek poprzez przeszukiwanie bazy danych sekwencji. Programy te identyfikują peptydy w widmach MS/MS i przeszukują bazę danych sekwencji białek, dopasowując obserwowane i teoretyczne dane peptydowe, w tym masy peptydów i widma. W następnym module zidentyfikowane peptydy zostaną zweryfikowane za pomocą PepQuery2 w celu sprawdzenia, czy uzyskano peptydy mikrobiologiczne (sekcja 5).
    1. Uruchom SearchGUI, aby wygenerować plik archiwum zawierający pliki PSM (Wyszukaj GUI na danych [#].searchgui_archive).
    2. Użyj pliku archiwum SearchGUI jako danych wejściowych dla PeptideShaker w celu wygenerowania raportu PSM, raportu peptydowego i raportu białkowego (Peptide Shaker on data [#]: [nazwa raportu].tabular).
    3. Uruchom MaxQuant, aby wygenerować pliki grup białek i peptydów (MaxQuant Protein Groups.tabular, MaxQuant Peptides.tabular).
      UWAGA: MaxQuant wymaga eksperymentalnego pliku projektowego, który zawiera warunki eksperymentu, grupy próbek i relacje między próbkami (Experimental Design Discovery MaxQuant.tabular). Ten plik informuje MaxQuant o tym, jak organizować i analizować dane MS. Przykład znajduje się w tabeli uzupełniającej 5. Jeśli używasz danych użytkownika, użytkownicy muszą zmodyfikować ten plik, aby pasował do ich zestawów danych MS.
  3. Użyj narzędzi do manipulowania tekstem, aby zarządzać danymi wyjściowymi z obu programów. Zapoznaj się z przepływem pracy DISCOVERY w Tabeli uzupełniającej 2, aby zobaczyć, które narzędzia mają zastosowanie do SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant.
    UWAGA: W Galaxy zaimplementowano następujące narzędzia do manipulacji tekstem. Najważniejsze narzędzia zostały wyróżnione poniżej, dlatego zdecydowanie zaleca się, aby użytkownicy zapoznali się z przepływem pracy DISCOVERY, aby zobaczyć dodatkowe narzędzia, które nie zostały tutaj omówione. Zapoznaj się z sekcją 2, aby uzyskać instrukcje dotyczące wyświetlania przepływu pracy.
    1. Wybierz dopasowania mikrobiologiczne (Wybierz drobnoustrojowe PSMs.tabular z SGPS, Wybierz peptydy drobnoustrojne (MQ).tabular).
    2. Użyj Filter and Query Tabular39, aby wybrać pewne PSM i zapytać o ich numery dostępu do białek (Filter confident microbial PSMs.tabular, zapytaj o wyniki na danych [# i #].tabular).
    3. Użyj opcji Wytnij, aby wyodrębnić sekwencje peptydowe jako nowy zestaw danych (Wytnij dane [#].tabular).
    4. Użyj opcji Grupa, aby uzyskać unikatowe wpisy (np. unikalne sekwencje peptydów) dla każdego programu (MQ Peptides.tabular, SGPS Distinct Peptides.tabular).
  4. Połącz dwie listy peptydów w jeden zestaw danych (SGPS-MQ Peptides.tabular).
  5. Grupa, aby usunąć zduplikowane sekwencje peptydowe. Ostateczna lista odrębnych peptydów mikrobiologicznych zostanie wykorzystana do weryfikacji PepQuery2 (Distinct Peptides.tabular).

5. Moduł 3: Weryfikacja peptydów mikrobiologicznych

UWAGA: Jeśli użytkownik chce skorzystać z przykładowych danych wejściowych i przepływu pracy z Tabeli Uzupełniającej 2, koniecznie postępuj zgodnie z instrukcjami w Sekcji 2. W przypadku modułu 2 zaimportuj dane wejściowe i przepływ pracy dla WERYFIKACJI. Dla wszystkich modułów odpowiedni samouczek dotyczący OWS można znaleźć w tabeli uzupełniającej 3.

  1. Użyj następujących danych wejściowych dla PepQuery240,41 Lista odrębnych peptydów drobnoustrojów (Odrębne peptydy dla PepQuery.tabular); Zestawy danych spektralnych MS (MGF); Human UniProt Reference (wraz z izoformami) (Human UniProt+Isoforms FASTA.fasta) i bazami danych sekwencji białek cRAP (cRAP.fasta). Patrz parametry w tabeli uzupełniającej 6.
    UWAGA: Weryfikacja obecności peptydów i białek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych danych i istotnych wglądów w proteom systemu biologicznego. PepQuery2 umożliwia walidację nowych, specyficznych dla choroby peptydów będących przedmiotem zainteresowania z czułością i swoistością. Zidentyfikowane peptydy mikrobiologiczne (z modułu 2) zostaną przeszukane w stosunku do sekwencji białek ludzkich i zanieczyszczających w celu sprawdzenia, czy są one pochodzenia mikrobiologicznego (należy uniknąć błędnego przypisania peptydów ludzkich). Zweryfikowane peptydy zostaną wykorzystane do wygenerowania bazy danych sekwencji zweryfikowanych białek, co jest niezbędne do ograniczenia wprowadzania wyników fałszywie dodatnich podczas kwantyfikacji białek w następnym module (sekcja 6).
    1. Jeden plik rangi PSM zostanie wygenerowany dla każdego zestawu danych MS/MS używanego jako dane wejściowe (PepQuery2 przy kolekcji [#]: psm_rank.tabular). Uruchom polecenie Zwiń kolekcję na plikach rang PSM, aby utworzyć jeden połączony zestaw danych (Zwiń kolekcję na danych [#] .tabular) i Filtruj, aby zachować pewne PSM (Filtruj według [PSM rank collection].tabular).
    2. Uruchom polecenie Usuń początek, aby wykluczyć nagłówki kolumn, i Wytnij, aby wyodrębnić zweryfikowane sekwencje peptydów jako nowy zestaw danych.
  2. Uruchom polecenie Cut w raportach peptydowych z SearchGUI/PeptideShaker i MaxQuant (SGPS Peptide Report.tabular, MaxQuant Peptide Report.tabular), aby wyodrębnić sekwencje peptydów i wpisy białek jako nowy zestaw danych peptyd-białko (dla każdego programu) i usuń początek, aby wykluczyć nagłówki kolumn.
  3. Połącz sekwencje peptydowe i wpisy białek z obu programów, aby utworzyć nowy (połączony) zestaw danych peptyd-białko.
  4. Uruchom tabelaryczne zapytanie na połączonym zestawie danych peptyd-białko i zweryfikowane peptydy, aby przypisać zweryfikowane peptydy do powiązanych z nimi wpisów białkowych (Peptide and Protein from Peptide Reports.tabular). Wpisy białek są katalogowane według ich numerów dostępu do białek (znanych również jako identyfikatory UniProt ID).
  5. Grupa, aby zachować unikalne zweryfikowane peptydy i powiązane z nimi identyfikatory UniProt .
  6. Uruchom tabelaryczne zapytanie, aby wyodrębnić identyfikatory UniProt (UniProt-ID ze zweryfikowanych Peptides.tabular).
  7. Umieść identyfikatory UniProt w UniProto, aby uzyskać powiązane z nimi sekwencje białek jako nową bazę danych (UniProt.fasta).
  8. Uruchom FASTA Merge Files i Filter Unique Sequences w bazie danych sekwencji białek generowanych przez UniProt, bazie danych Human UniProt (wraz z izoformami) i bazach danych zanieczyszczeń, aby wygenerować zweryfikowaną bazę danych, która zostanie wykorzystana do kwantyfikacji peptydów (Baza danych ilościowych dla MaxQuant.fasta).

6. Moduł 4: Kwantyfikacja MaxQuant

UWAGA: Jeśli użytkownik chce skorzystać z przykładowych danych wejściowych i przepływu pracy z Tabeli Uzupełniającej 2, koniecznie postępuj zgodnie z instrukcjami w Sekcji 2. W przypadku modułu 2 zaimportuj dane wejściowe i przepływ pracy dla modułu QUANTIFICATION. Dla wszystkich modułów odpowiedni samouczek dotyczący OWS można znaleźć w tabeli uzupełniającej 3.

  1. Użyj zweryfikowanej bazy danych sekwencji białek i zestawów danych MS (RAW) jako danych wejściowych dla MaxQuant42.
    UWAGA: Pamiętaj, że MaxQuant wymaga eksperymentalnego pliku projektowego i może to być ten sam plik, który jest używany do identyfikacji peptydów (krok 4.2). W razie potrzeby zmień nazwy plików. Zweryfikowana baza danych z poprzedniego modułu jest wymagana w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich podczas oznaczania ilościowego białka. Kwantyfikacja białek umożliwia naukowcom pomiar i porównanie obfitości peptydów i białek w próbkach biologicznych. Ten krok jest niezbędny do zrozumienia zróżnicowanej ekspresji białek poprzez uzyskanie wglądu w zmiany ilościowe w różnych warunkach.
    1. Wygeneruj pliki dowodów, grup białek i peptydów (MaxQuant Evidence.tabular, MaxQuant Protein Groups.tabular, MaxQuant Peptides.tabular).
  2. Wybierz peptydy mikrobiologiczne z pliku MaxQuant Peptides (Wybierz peptydy drobnoustrojowe.tabular).
  3. Wytnij tylko sekwencje peptydów mikrobiologicznych (Wytnij dane [#].tabular).
  4. Grupa, aby uzyskać listę ilościowo oznaczonych peptydów mikrobiologicznych (Quantified Peptides.tabular).

7. Moduł 5: Interpretacja danych

UWAGA: Jeśli użytkownik chce skorzystać z przykładowych danych wejściowych i przepływu pracy z Tabeli Uzupełniającej 2, koniecznie postępuj zgodnie z instrukcjami w Sekcji 2. W przypadku modułu 2 zaimportuj dane wejściowe i przepływ pracy dla INTERPRETACJI DANYCH. Dla wszystkich modułów odpowiedni samouczek dotyczący OWS można znaleźć w tabeli uzupełniającej 3. Dane wyjściowe z kwantyfikacji MaxQuant w poprzednim module zostaną tutaj wykorzystane do adnotacji taksonomicznych i funkcjonalnych przy użyciu Unipept oraz analizy statystycznej przy użyciu MSstatsTMT. Unipept umożliwia naukowcom identyfikację i ilościowe określenie mikroorganizmów w różnych środowiskach i integruje się z publicznymi bazami danych (takimi jak UniProt) w celu pobierania zaktualizowanych adnotacji. MSstatsTMT został zaprojektowany z myślą o solidnej analizie statystycznej ilościowych danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu znakowania TMT.

  1. Użyj listy ilościowo oznaczonych peptydów mikrobiologicznych (Quantified Peptides.tabular) jako danych wejściowych dla Unipept43,44,45, aby wykonać adnotacje taksonomiczne i funkcjonalne. Patrz Tabela uzupełniająca 7, aby zapoznać się z parametrami i listą wyników.
  2. Interesującymi rezultatami Unipept są drzewo taksonomii drobnoustrojów oraz drzewo białek Komisji ds. Enzymów Mikrobiologicznych (EC) (Microbial Taxonomy Tree.d3_hierarchy, Microbial EC Proteins Tree.d3_hierarchy).
    1. Aby wyświetlić drzewa, kliknij zestaw danych, aby otworzyć opcje. Kliknij Visualize (4opcja od lewej) > przeglądarkę taksonomii Unipept.
    2. Aby wyświetlić adnotacje taksonomiczne i funkcjonalne w tabeli (Unipept peptinfo.tabular): kliknij ikonę oka w prawym górnym rogu zestawu danych. Przewiń, aby zobaczyć każdy peptyd w osobnym wierszu i informacje w różnych kolumnach.
  3. Przed wykonaniem analizy statystycznej przy użyciu MSstatsTMT uruchom polecenie Select w pliku MaxQuant Protein Groups, aby utworzyć dwa nowe zestawy danych: białka drobnoustrojów i białka ludzkie (Microbial Proteins.tabular, Human Proteins.tabular). Białka mają znaczniki taksonomiczne, które wskazują ich pochodzenie.
    1. Wyklucz białka zanieczyszczeń za pomocą tagu "con_".
    2. Zachowaj białka mikrobiologiczne i ludzkie, które są oznaczone odpowiednio znacznikami mikrobiologicznymi (np. "_9LACO") i "_HUMAN" (Microbial-Proteins.tabular, Human-Proteins.tabular).
  4. MSstatsTMT42,46,47 będzie używany do przeprowadzania analizy statystycznej. Jako dane wejściowe należy użyć pliku MaxQuant Evidence (z modułu 4) oraz wybranych białek mikrobiologicznych (lub białek ludzkich) z poprzedniego kroku. Ten przepływ pracy nadaje priorytet białkom mikrobiologicznym, ale oferuje również opcję charakteryzowania białek ludzkich. Patrz Tabela uzupełniająca 8, aby zapoznać się z parametrami i listą wyników.
    UWAGA: MSstatsTMT wymaga pliku adnotacji i macierzy porównawczej (znanej również jako macierz kontrastu). Plik adnotacji określi, w jaki sposób kwantyfikacje zostaną połączone, podczas gdy macierz porównawcza pomieści różne grupy próbek. Przykłady tych plików zostały zamieszczone w Tabeli Uzupełniającej 9 i Tabeli Uzupełniającej 10.
  5. Interesujące wyniki MSstatsTMT to wulkan i wykresy porównawcze dla białek mikrobiologicznych (Microbial Proteins Volcano Plot.pdf, Microbial Proteins Comparison.pdf). Wyświetl wykresy, klikając ikonę oka w prawym górnym rogu zestawu danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny protokół opisany tutaj został zademonstrowany na plikach MS/MS uzyskanych z podzbioru próbek PTF21. Do et al.21 przeanalizowali cztery pliki MS/MS z próbek PTF, które zostały zebrane zgodnie z procedurami opisanymi przez Boylan et al.29i Afiuni-Zadel et al.30. Ten przepływ pracy nadaje priorytet białkom mikrobiologicznym, ale oferuje elastyczność w charakterystyce białek ludzkich równolegle z białkami mikrobiologicznymi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad metaproteomiką kliniczną oferują potencjalne przełomy w badaniach klinicznych, ale nadal istnieją wyzwania związane z ich wdrożeniem. Mniejsza liczebność białek drobnoustrojów w stosunku do białek gospodarza w większości próbek utrudnia wykrywanie i charakteryzowanie białek niebędących gospodarzami 6,10. Zależność od dużych baz danych sekwencji białek w celu dokładnej identyfikacji i kwantyfikacji peptydów i białek, wraz ze złożonością taksonomicznie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Amy Skubitz i dr Kristin Boylan (University of Minnesota) za pilotażowe zestawy danych oraz dr Paulowi Piehowskiemu, dr Tao Liu i dr Karin Rodland (Pacific Northwest National Laboratories (PNNL)) za ich doświadczenie w zbieraniu próbek i przetwarzaniu próbek PTF oraz generowaniu danych MS znakowanych TMT używanych w tym badaniu. Projekt ten został częściowo sfinansowany przez Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA), National Institutes of Health/National Cancer Institute Grant Number: 5R01CA262153 (A.P.N.S.), 1R21CA267707 (P.D.J i T.J.G.) oraz National Institutes of Health/National Cancer Institute Grant Number: P30CA077598 (P.D.J. i T.J.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zwiń kolekcjęGalaxyPGalaxy Wersja 5.1.1Łączy kolekcję listy zestawów danych w jeden plik (w kolejności listy)
Łączenie zestawów danychGalaxyPGalaxy Wersja 0.1.1Łączenie plików od końca do głowy
WytnijGalaxyPGalaxy Wersja 1.0.2Wytnij (wybierz) określone kolumny z pliku
FASTA Scalanie plików i filtrowanie unikalnych sekwencjiGalaxyPGalaxy Wersja 1.2.0Łączenie plików bazy danych FASTA
FastaCLI GalaxyPGalaxy Wersja 4.0.41+galaxy1Dołącza sekwencje zwodzące do plików FASTA
FASTA-tablularGalaxyPGalaxy w wersji 1.1.0Konwertuj sekwencje w formacie FASTA do formatu rozdzielanego tabulatorami
FiltrujGalaxyPGalaxy w wersji 1.1.1Filtruj kolumny za pomocą prostych wyrażeń
Filtr tabelarycznyGalaxyPGalaxy Wersja 3.3.0Filtruj plik tabelaryczny za pomocą filtrów liniowych
Serwer Galaxy Europe (EU)GalaxyPhttps://usegalaxy.eu/
GroupGalaxyPGalaxy Wersja 2.1.4Grupuj plik według określonej kolumny i wykonuj funkcje agregujące
Parametry identyfikacyjneGalaxyPGalaxy Wersja 4.0.41+galaxy1Ustaw parametry identyfikacyjne dla SearchGUI/PeptideShaker
Learning Pathway: Przepływy pracy metaproteomiki klinicznej w GalaxyGalaxyPhttps://training.galaxyproject.org/training-material/learning-pathways/clinical-metaproteomics.html
MaxQuantGalaxyPGalaxy w wersji 2.0.3.0+galaxy0 (moduł Discovery); Galaxy Version 1.6.17.0+galaxy4 (moduł kwantyfikacji)Pakiet oprogramowania do proteomiki ilościowej do analizy dużych plików danych spektrometrii mas
MetaNovoGalaxyPGalaxy Wersja 1.9.4+galaxy4Przeszukuj dane MS/MS w bazie danych FASTA (znanych białek), aby utworzyć docelową bazę danych (dopasowanych białek) do analizy spektrometrii
mas msconvertGalaxyPGalaxy Wersja 3.0.20287.2Konwertuj i/lub filtruj pliki spektrometrii mas
MSstatsTMTGalaxyPGalaxy Version 2.0.0+galaxy1Pakiet oparty na R do wykrywania zróżnicowanych ilości białek w eksperymentach proteomicznych opartych na spektrometrii mas typu shotgun przy użyciu znakowania tandemowego znacznika masy (TMT)
PepQuery2GalaxyPGalaxy w wersji 2.0.2+galaxy0Wyszukiwarka skoncentrowana na peptydach do identyfikacji i/lub walidacji znanych i nowych peptydów będących przedmiotem zainteresowania
PeptideShakerGalaxyPGalaxy Wersja 2.0.33+galaxy1Interpretuj wyniki z SearchGUI w celu identyfikacji białek
Pobieranie bazy danych białekGalaxyPGalaxy Wersja 0.3.4Pobierz określone sekwencje białek jako plik FASTA
Zapytaj o tabelarycznąwersję GalaxyPGalaxy w wersji 3.3.0Załaduj pliki tabelaryczne do  Baza danych SQLite
Usuń początekGalaxyPGalaxy Wersja 1.0.0Usuń określoną liczbę wierszy (nagłówka) z pliku
SearchGUIGalaxyPGalaxy Wersja 4.0.41+galaxy1Uruchom wyszukiwarki na listach szczytów MGF i przygotuj wyniki do wprowadzenia do Peptide Shaker
WybierzGalaxyPGalaxy w wersji 1.0.4Wybierz linie, które pasują do wyrażenia
UnipeptGalaxyPGalaxy Wersja 4.5.1Pobierz wpisy UniProt i informacje taksonomiczne dla peptydów tryptycznych
UniProtGalaxyPGalaxy Wersja 2.3.0Pobierz proteom jako plik XML (UniProtXML) lub FASTA z UniProtKB

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, X., Li, L., Butcher, J., Stintzi, A., Figeys, D. Advancing functional and translational microbiome research using meta-omics approaches. Microbiome. 7 (1), 154(2019).
  2. Van Den Bossche, T., et al. The Metaproteomics Initiative: a coordinated approach for propelling the functional characterization of microbiomes. Microbiome. 9 (1), 243(2021).
  3. Tanca, A., et al. Evaluating the impact of different sequence databases on metaproteome analysis: insights from a lab-assembled microbial mixture. PloS One. 8 (12), e82981(2013).
  4. Seifert, J., et al. Bioinformatic progress and applications in metaproteogenomics for bridging the gap between genomic sequences and metabolic functions in microbial communities. Proteomics. 13 (18-19), 2786-2804 (2013).
  5. Muth, T., Renard, B. Y., Martens, L. Metaproteomic data analysis at a glance: advances in computational microbial community proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (8), 757-769 (2016).
  6. Bihani, S., et al. Metaproteomic analysis of nasopharyngeal swab samples to identify microbial peptides in COVID-19 patients. J Proteome Res. 22 (8), 2608-2619 (2023).
  7. Ayan, E., DeMirci, H., Serdar, M. A., Palermo, F., Baykal, A. T. Bridging the Gap between Gut Microbiota and Alzheimer's Disease: A metaproteomic approach for biomarker discovery in transgenic mice. Int J Mol Sci. 24 (16), 12819(2023).
  8. Levi Mortera, S., et al. A metaproteomic-based gut microbiota profiling in children affected by autism spectrum disorders. J Proteomics. 251, 104407(2022).
  9. Long, S., et al. Metaproteomics characterizes human gut microbiome function in colorectal cancer. NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 14(2020).
  10. Hardouin, P., Chiron, R., Marchandin, H., Armengaud, J., Grenga, L. Metaproteomics to Decipher CF Host-Microbiota interactions: Overview, challenges and future perspectives. Genes (Basel). 12 (6), 892(2021).
  11. Levi Mortera, S., et al. Functional and taxonomic traits of the gut microbiota in Type 1 diabetes children at the onset: A metaproteomic study. Int J Mol Sci. 23 (24), 15982(2022).
  12. Gonzalez, C. G., et al. Location-specific signatures of Crohn's disease at a multi-omics scale. Microbiome. 10 (1), 133(2022).
  13. Thuy-Boun, P. S., et al. Metaproteomics analysis of SARS-CoV-2-infected patient samples reveals presence of potential coinfecting microorganisms. J Proteome Res. 20 (2), 1451-1454 (2021).
  14. Grenga, L., et al. Taxonomical and functional changes in COVID-19 faecal microbiome could be related to SARS-CoV-2 faecal load. Environ Microbiol. 24 (9), 4299-4316 (2022).
  15. Biemann, R., et al. Fecal metaproteomics reveals reduced gut inflammation and changed microbial metabolism following lifestyle-induced weight loss. Biomolecules. 11 (5), 726(2021).
  16. Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., Carta, G., Schmidt, M. Increasing taxonomic and functional characterization of host-microbiome interactions by DIA-PASEF metaproteomics. Front Microbiol. 14, 1258703(2023).
  17. Jagtap, P. D., et al. BAL fluid metaproteome in acute respiratory failure. Am J Respir Cell Mol Biol. 59 (5), 648-652 (2018).
  18. Masson, L., Wilson, J., Amir Hamzah, A. S., Tachedjian, G., Payne, M. Advances in mass spectrometry technologies to characterize cervicovaginal microbiome functions that impact spontaneous preterm birth. Am J Reprod Immunol Microbiol. 90 (2), e13750(2023).
  19. Bankvall, M., et al. Metataxonomic and metaproteomic profiling of the oral microbiome in oral lichen planus - a pilot study. J Oral Microbiol. 15 (1), 2161726(2023).
  20. Kruk, M. E., et al. An integrated metaproteomics workflow for studying host-microbe dynamics in bronchoalveolar lavage samples applied to cystic fibrosis disease. mSystems. 9 (7), e0092923(2024).
  21. Do, K., et al. A novel clinical metaproteomics workflow enables bioinformatic analysis of host-microbe dynamics in disease. mSphere. 9 (6), e00793-e00823 (2024).
  22. Batut, B., et al. Community-driven data analysis training for biology. Cell Syst. 6 (6), 752-758.e1 (2018).
  23. Hiltemann, S., et al. Galaxy Training: A powerful framework for teaching. PLoS Comput Biol. 19 (1), e1010752(2023).
  24. Galaxy Community. The Galaxy platform for accessible, reproducible, and collaborative data analyses: 2024 update. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W83-W94 (2024).
  25. Blankenberg, D., et al. Dissemination of scientific software with Galaxy ToolShed. Genome Biol. 15 (2), 403(2014).
  26. Blank, C., et al. Disseminating metaproteomic informatics capabilities and knowledge using the Galaxy-P framework. Proteomes. 6 (1), E7(2018).
  27. Mehta, S., et al. A Galaxy of informatics resources for MS-based proteomics. Expert Rev Proteomics. 20 (11), 251-266 (2023).
  28. Armengaud, J. Metaproteomics to understand how microbiota function: The crystal ball predicts a promising future. Environ Microbiol. 25 (1), 115-125 (2023).
  29. Boylan, K. L., et al. A feasibility study to identify proteins in the residual Pap test fluid of women with normal cytology by mass spectrometry-based proteomics. Clin Proteomics. 11 (1), 30(2014).
  30. Afiuni-Zadeh, S., et al. Evaluating the potential of residual Pap test fluid as a resource for the metaproteomic analysis of the cervical-vaginal microbiome. Sci Rep. 8 (1), 10868(2018).
  31. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  32. Sivanich, M. K., Gu, T. -J., Tabang, D. N., Li, L. Recent advances in isobaric labeling and applications in quantitative proteomics. Proteomics. 22 (19-20), e2100256(2022).
  33. Potgieter, M. G., et al. MetaNovo: An open-source pipeline for probabilistic peptide discovery in complex metaproteomic datasets. PLoS Comput Biol. 19 (6), e1011163(2023).
  34. Vaudel, M., Barsnes, H., Berven, F. S., Sickmann, A., Martens, L. SearchGUI: An open-source graphical user interface for simultaneous OMSSA and X!Tandem searches. Proteomics. 11 (5), 996-999 (2011).
  35. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277(2014).
  36. Barsnes, H., Vaudel, M. SearchGUI: A highly adaptable common interface for proteomics search and de novo engines. J Proteome Res. 17 (7), 2552-2555 (2018).
  37. Vaudel, M., et al. PeptideShaker enables reanalysis of MS-derived proteomics data sets. Nature Biotechnol. 33 (1), 22-24 (2015).
  38. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  39. Johnson, J. E., et al. Improve your Galaxy text life: The Query Tabular Tool. F1000Res. 7, 1604(2018).
  40. Wen, B., Wang, X., Zhang, B. PepQuery enables fast, accurate, and convenient proteomic validation of novel genomic alterations. Genome Res. 29 (3), 485-493 (2019).
  41. Wen, B., Zhang, B. PepQuery2 democratizes public MS proteomics data for rapid peptide searching. Nat Commun. 14 (1), 2213(2023).
  42. Pinter, N., et al. MaxQuant and MSstats in Galaxy enable reproducible cloud-based analysis of quantitative proteomics experiments for everyone. J Proteome Res. 21 (6), 1558-1565 (2022).
  43. Mesuere, B., Willems, T., Van Der Jeugt, F., Devreese, B., Vandamme, P., Dawyndt, P. Unipept web services for metaproteomics analysis. Bioinformatics. 32 (11), 1746-1748 (2016).
  44. Gurdeep Singh, R., et al. Unipept 4.0: Functional analysis of metaproteome data. J Proteome Res. 18 (2), 606-615 (2019).
  45. Verschaffelt, P., Collier, J., Botzki, A., Martens, L., Dawyndt, P., Mesuere, B. Unipept Visualizations: an interactive visualization library for biological data. Bioinformatics. 38 (2), 562-563 (2022).
  46. Huang, T., et al. MSstatsTMT: Statistical detection of differentially abundant proteins in experiments with isobaric labeling and multiple mixtures. Mol Cell Proteomics. 19 (10), 1706-1723 (2020).
  47. Choi, M., et al. MSstats: an R package for statistical analysis of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. Bioinformatics. 30 (17), 2524-2526 (2014).
  48. Jagtap, P., et al. Workflow for analysis of high mass accuracy salivary data set using MaxQuant and ProteinPilot search algorithm. Proteomics. 12 (11), 1726-1730 (2012).
  49. Eng, J. K., Searle, B. C., Clauser, K. R., Tabb, D. L. A face in the crowd: recognizing peptides through database search. Mol Cell Proteomics. 10 (11), R111.009522(2011).
  50. Bihani, S., et al. Metaproteomics for coinfections in the upper respiratory tract: The case of COVID-19. Methods Mol Biol. 2820, 165-185 (2024).
  51. Jagtap, P., et al. A two-step database search method improves sensitivity in peptide sequence matches for metaproteomics and proteogenomics studies. Proteomics. 13 (8), 1352-1357 (2013).
  52. O'Bryon, I., Jenson, S. C., Merkley, E. D. Flying blind, or just flying under the radar? The underappreciated power of de novo methods of mass spectrometric peptide identification. Protein Sci. 29 (9), 1864-1878 (2020).
  53. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  54. Kumar, D., Yadav, A. K., Dash, D. Choosing an optimal database for protein identification from tandem mass spectrometry data. Proteome Bioinformatics. 1549, 17-29 (2017).
  55. He, T., et al. Comparative evaluation of Proteome Discoverer and FragPipe for the TMT-based proteome quantification. J Proteome Res. 21 (12), 3007-3015 (2022).
  56. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  57. Easterly, C. W., et al. metaQuantome: An integrated, quantitative metaproteomics approach reveals connections between taxonomy and protein function in complex microbiomes. Mol Cell Proteomics. 18 (8 suppl 1), S82-S91 (2019).
  58. Lewis, M., et al. A Quantitative synthesis of early language acquisition using meta-analysis. , (2016).
  59. Bergmann, C., et al. Promoting replicability in developmental research through meta-analyses: Insights from language acquisition research. Child Dev. 89 (6), 1996-2009 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

spektrometria masbaza danych sekwencji bia kowychidentyfikacja peptyd wadnotacja taksonomicznaadnotacja funkcjonalnailo ciowe oznaczenie bia ek mikrobiologicznychanaliza statystyczna

Powiązane artykuły