Artykuł metodologiczny

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex immunofluorescence (mIF) to zaawansowana technika, która pozwala na szczegółową, przestrzennie rozdzielczą analizę próbek tkanek poprzez wizualizację wielu biomarkerów białkowych w jednej sekcji. Jednak większość technologii mIF napotyka znaczne kompromisy między czułością a przepustowością podczas multipleksowania, co stanowi krytyczne ograniczenie dla niezawodnego wykrywania biomarkerów o niskiej liczebności w wielu sekcjach tkanki. Nowe podejście do mIF wykorzystuje unikalne kody kreskowe DNA połączone z przeciwciałami, które są amplifikowane przez równoległy mechanizm amplifikacji pojedynczej cząsteczki. Metoda ta pozwala osiągnąć jakość barwienia wysoce porównywalną z immunohistochemią klasy klinicznej (IHC), zapewniając jednocześnie wysokie możliwości multipleksowania i wysokoprzepustowe obrazowanie na całym szkiełku. Test ten polega na amplifikacji koktajlu przeciwciał oznaczonych kodem kreskowym DNA na tkance, a następnie sekwencyjnych rundach etapów wykrywania w celu wizualizacji czterech oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie na cykl. Proces ten umożliwia zatem wykrycie ośmiu lub więcej biomarkerów na próbkę tkanki. Kluczowe etapy tej metody obejmują zautomatyzowane przygotowanie tkanek, zastosowanie pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych z kodami kreskowymi DNA, wzmocnienie sygnału oraz iteracyjne cykle wykrywania, obrazowania i usuwania sygnału. Po akwizycji obrazu następuje rejestracja obrazu i analiza pojedynczych komórek przy użyciu platformy do analizy danych obrazów przestrzennych wspomaganej sztuczną inteligencją. W tym badaniu protokół zastosowano do utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) wielotkankowych mikromacierzy (TMA), w tym migdałków, czerniaka, okrężnicy i rdzeni węzłów chłonnych w trzech egzemplarzach. Zaawansowane technologie mIF zapewniają lepszy wgląd w odpowiedź guza, mikrośrodowisko guza i krajobraz immunologiczny. Pokonując nieodłączne kompromisy między czułością, możliwościami multipleksowania i przepustowością obrazowania, naukowcy mogą teraz dążyć do zrozumienia heterogeniczności trudnych sygnatur molekularnych i biomarkerów odpowiedzi terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoce multipleksowana immunofluorescencja (mIF) to zaawansowana technika, która rewolucjonizuje dziedzinę analizy tkanek, umożliwiając jednoczesną wizualizację wielu biomarkerów białkowych w jednym przekroju tkanki1,2. Ta funkcja zapewnia niezrównany poziom szczegółowości i rozdzielczości przestrzennej, co często ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia interakcji między typami komórek o złożonej morfologii w mikrośrodowisku tkanek w wielu skalach przestrzennych3. Technika ta jest szczególnie cenna w badaniach onkologicznych, gdzie może być wykorzystana do kolokalizacji biomarkerów nowotworowych, celów leków białkowych, lokalnego statusu immunologicznego i punktów kontrolnych, interakcji między różnymi typami komórek, a nawet wzorców kolokalizacji subkomórkowej związanych z metabolizmem leków w tkance4,5,6.

Pomimo swojego potencjału, większość technologii mIF nadal stoi przed poważnymi wyzwaniami, szczególnie w zakresie równoważenia czułości i przepustowości z możliwościami multipleksowania. To ograniczenie jest szczególnie ważne w przypadku wykrywania biomarkerów klinicznych, które mogą wykazywać bardzo niską ekspresję, takich jak HER2 i PD-L17,8,9. Aby zrozumieć, dlaczego tak jest, konieczne jest zrozumienie innych modalności mIF. Te tradycyjne metody utorowały drogę dla bardziej wyrafinowanych platform mIF, ale mają swoje własne zestawy zalet i ograniczeń.

Bezpośrednia immunofluorescencja (DIF) wykorzystuje przeciwciała bezpośrednio sprzężone z fluoroforami lub z oligonukleotydem zdolnym do rekrutacji fluoroforów10. Ta metoda jest prosta do multipleksowania, ale cierpi na niższą czułość i trudności z rozdzieleniem sygnału z tła tkankowego lub artefaktów barwienia.

Immunofluorescencja pośrednia (IIF) wykorzystuje przeciwciało wtórne, które wiąże się z przeciwciałem pierwotnym. Ma to zwiększony sygnał w porównaniu z DIF opartym na podstawach. W połączeniu z ulepszonymi konstrukcjami komórek przepływowych, sekwencyjny IIF może wykryć do 40 biomarkerów w jednym teście2,11. Jednak nadal cierpią one na względny brak czułości w porównaniu ze strategiami wzmacniania sygnału opartymi na enzymach, takimi jak te, które można znaleźć w technikach immunohistochemicznych (IHC).

Immunofluorescencja oparta na katalizie enzymatycznej jest najczęściej obserwowana w metodach IHC wykorzystujących peroksydazę chrzanową (HRP) do chromogennego (DAB) lub fluorescencyjnego osadzania barwników (np. wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA)). Ponieważ testy te są oparte na tym samym enzymie katalitycznym, ich czułość wykrywania jest podobna, dzięki czemu wielospektralne testy mIF oparte na TSA są odpowiednie do zastosowań klinicznych2,12. Zaletą wzmocnienia sygnału opartego na DNA jest możliwy wysoki stopień multipleksowania przy zachowaniu doskonałego wzmocnienia sygnału i modularności. W przeciwieństwie do tego, metody oparte na HRP są mniej modułowe i trudne do optymalizacji, co wymaga dodatkowych cykli opracowywania i testowania paneli.

immunofluorescencja przeciwciał DNA z kodem kreskowym
Zademonstrowany tutaj test mIF wykorzystuje polimerazę DNA do jednoczesnej amplifikacji przeciwciał oznaczonych kodem kreskowym DNA, a następnie cykle barwienia i odbarwiania sondy reporterowej przy użyciu czterech fluorescencyjnych oligonukleotydów na rundę obrazowania (Figura 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Graficzna ilustracja protokołu testu immunofluorescencji multipleksowej. Przeciwciała sprzężone z kodami kreskowymi są dodawane w jednym kroku, a kody kreskowe są jednocześnie amplifikowane. W każdym cyklu dodawane są grupy czterech sond fluorescencyjnych, co pozwala na jednoczesną wizualizację czterech markerów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

To jednorundowe dodawanie przeciwciał i jednoetapowa amplifikacja znacznie upraszcza protokół testu. Proces ten jest ułatwiony dzięki zautomatyzowanym, wysokowydajnym systemom barwienia i skanowania, które zapewniają powtarzalne wyniki od szkiełka do szkiełka i partii po partii na dużej liczbie próbek wykorzystywanych w badaniach klinicznych13.

Jedną z głównych zalet tej technologii jest jej zdolność do utrzymania wysokiej czułości przy jednoczesnym umożliwieniu rozległego multipleksowania2. Przepływ pracy zapewnia również, że przepustowość obrazowania pozostaje wysoka, rozwiązując w ten sposób jedno z głównych ograniczeń wysoce multipleksowanych technologii mIF (np. > 8 biomarkerów) w badaniach klinicznych. Jest to szczególnie ważne w badaniach klinicznych, w których subtelne różnice w celach terapeutycznych dla leków o niskiej liczebności (np. niski poziom HER2) u różnych pacjentów mogą dostarczyć krytycznych informacji na temat odpowiedzi terapeutycznej.

Oprócz tych kluczowych atrybutów, ten test zapewnia również konfigurowalność panelu, możliwości obrazowania całego preparatu o wysokiej przepustowości oraz rozdzielczość optyczną niezbędną do badania procesów subkomórkowych i kompartmentów, a także wypukłości komórkowych związanych z makrofagami i komórkami dendrytycznymi. Możliwość badania złożonych fenotypów komórkowych w wielu skalach przestrzennych jest krytyczną zaletą obrazowania optycznego w porównaniu z metodami opartymi na obrazowaniu cytometrii masowej (IMC)2.

W tej pracy przedstawiono protokół dla 8-pleksowego testu mIF przy użyciu autostainera i skanera całego szkiełka. Ten test obejmuje panel ośmiu przeciwciał pierwszorzędowych: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 i pan-Cytokeratin14. Ten panel markerów pozwoli na immunoprofilowanie tkanki nowotworowej i identyfikację komórek znajdujących się w środowisku guza lub zrębu. Protokół ten wykorzystuje zautomatyzowaną maszynę do barwienia szkiełek do wstępnego barwienia i wymiany sondy, a barwienie i obrazowanie można zakończyć w ciągu 2 dni. Przedstawiono również metody walidacji testu mIF i przeprowadzania analizy otrzymanych obrazów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty muszą być zgodne z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki badań na ludziach. Wszystkie skrawki tkanek wykorzystane w tym protokole zostały pozyskane od zewnętrznego dostawcy tkanek.

1. Przygotowanie próbki tkanki

  1. Wybierz blok tkanki FFPE do barwienia za pomocą testu mIF. W przypadku korzystania z szkiełek tkankowych FFPE upewnij się, że próbki mają grubość od 3 do 5 μm, są zamontowane na dodatnio naładowanych szkiełkach i są wolne od zmarszczek lub innych rozdarć, które mogłyby negatywnie wpłynąć na wyniki końcowe.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, unikaj barwienia próbek tkanek, które zostały pocięte na sekcje ponad 2 miesiące wcześniej. Ponadto unikaj klocków, które były przechowywane przez ponad 10 lat lub które wydają się być wizualnie suche.
  2. W przypadku pracy z blokami tkankowymi FFPE należy użyć mikrotomu, aby wyciąć wymaganą liczbę szkiełek tkankowych o grubości 4 μm, montując szkiełka na dodatnio naładowanym szkiełku podstawowym. Aby osiągnąć najbardziej spójne wyniki, zamontuj wszystkie prowadnice w tej samej orientacji. Upewnij się, że tkanka jest wolna od zmarszczek i rozdarć.
  3. Jeśli próbki nie mają być natychmiast barwione, należy je przechowywać w szkiełku pod azotem przez okres do 2 miesięcy.

2. Rejestracja dodatkowych odczynników i przeciwciał pierwotnych do początkowej konfiguracji

  1. W oprogramowaniu autostainer przejdź do zakładki Konfiguracja odczynnika u góry ekranu. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać nowe odczynniki.
  2. Testy barwienia i wymiany będą wykorzystywać dziewięć pojemników z odczynnikami, zgodnie z informacjami znajdującymi się w tabeli 1. Aby użyć ich, na przykład, dla pierwszego odczynnika o nazwie Wash Buffer, o skróconej nazwie ISPWsh1, postępuj zgodnie z instrukcjami. Wybierz typ jako Pomocniczy i sprawdź, czy zarówno *BWash, jak i DI są wymienione w obszarze Kompatybilne bulki. Zaznacz pole Preferowane przed zapisaniem.
  3. Powtórzyć ten proces dla pozostałych odczynników pomocniczych, używając nazw i nazw skróconych znajdujących się w Tabeli 1.
    1. Odczynnik Amplification Solution (ULTAmp1) nie jest kompatybilny z Bond Wash. W oknie konfiguracji odczynnika wybierz *BWash i kliknij przycisk <<, aby przenieść ten odczynnik z listy kompatybilnych odczynników do sekcji dostępnych odczynników. Nieusunięcie Bond Wash jako odczynnika kompatybilnego z odczynnikiem do roztworu do amplifikacji może skutkować znacznie zmniejszoną wydajnością barwienia testu.
  4. Po zarejestrowaniu wszystkich pojemników z odczynnikami utwórz zestaw do wykrywania badań przed rozpoczęciem pierwszego uruchomienia. Zestaw do wykrywania będzie wymagał jednego pojemnika do miareczkowania o pojemności 30 ml.
  5. Dodaj 30 ml pojemnika do miareczkowania do zestawu do wykrywania. Aby zapobiec rozdzieleniu tych dwóch elementów, przyklej pojemnik do miareczkowania do różdżki.
  6. Zeskanuj kod kreskowy po lewej stronie zestawu wykrywającego. W kolejnym wyskakującym oknie nazwij zestaw detekcji (np. InSituPlex Kit). Ustaw datę wygaśnięcia na 10 lat od daty rejestracji.
    UWAGA: Ustawiona tutaj data ważności nie jest datą podaną na odczynniku, ale datą ważności odczynnika w pojemniku do miareczkowania. Ustawienie daty wygaśnięcia daleko w przyszłość gwarantuje, że zestaw nie wygaśnie niepotrzebnie.
  7. Jako pierwszą pozycję odczynnika zestawu wybierz Wash Buffer jako odczynnik z menu rozwijanego.
  8. Kliknij pole kodu kreskowego dla tej pozycji odczynnika i zeskanuj kod kreskowy zaklejonego taśmą pojemnika do miareczkowania o pojemności 30 ml, aby zarejestrować ten pojemnik jako bufor do płukania i połączyć pojemnik z odczynnikiem z różdżką wykrywania.
  9. Po połączeniu pojemnika do miareczkowania z zestawem kliknij przycisk Dodaj, aby zapisać i zamknąć wyskakujące okienko.
  10. Napełnij pojemnik do miareczkowania 30 ml 1x Bond Wash i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C między cyklami barwienia.

Tabela 1: Odczynniki pomocnicze do konfiguracji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Wstępna konfiguracja protokołu

  1. Po pomyślnej rejestracji wszystkich pojemników z odczynnikami przejdź do zakładki Konfiguracja protokołu u góry ekranu oprogramowania autostainera.
  2. Potwierdź, jaka wersja oprogramowania jest aktualnie uruchomiona, klikając logo w prawym górnym rogu ekranu. Powstałe wyskakujące okienko wyświetli aktualnie zainstalowaną wersję Oprogramowania pod nagłówkiem Informacje o oprogramowaniu.
  3. Jeśli oprogramowanie jest w wersji 7.0 lub nowszej, będzie dostępny wstępnie zainstalowany szablon protokołu barwienia. U dołu ekranu sprawdź, czy opcja Preferowany stan jest ustawiona na Wszystkie. Nazwij protokół szablonu *ISP Staining Assay. W przypadku wcześniejszych wersji oprogramowania protokół można znaleźć w tabeli 2.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy *ISP Staining Assay i skopiuj protokół. W wyświetlonym oknie pop-up zmień nazwę protokołu Staining Assay 1 na skróconą nazwę (ISP_IHC1)
  5. W preferowanym systemie wykrywania wybierz ten, który został utworzony podczas początkowej konfiguracji odczynnika w kroku 2.6.

Tabela 2: Protokół barwienia immunofluorescencyjnego multipleksowego. *MARKER odpowiada roztworowi przeciwciała, a bufor płuczący odpowiada roztworowi BOND Wash. Wszystkie inne odczynniki pomocnicze mają odpowiednio nazwane składniki zestawu. Ten protokół jest kompatybilny z oprogramowaniem w wersji 7.0 i nowszych, BXD 39 i nowszych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Konfiguracja odczynnika

  1. Rozmrozić wszystkie odczynniki zestawu z wyjątkiem koniugatów przeciwciał, enzymu amplifikacji, inicjatora wymiany i neutralizatora wymiany w temperaturze pokojowej. Pozostałe elementy zestawu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, zarejestruj nowy pojemnik do miareczkowania dla każdego z odczynników zdefiniowanych w kroku 2.3. Umieść nową wkładkę do miareczkowania w każdym z nich.
  3. Weź system wykrywania badań zarejestrowany w kroku 2.6 i upewnij się, że powiązany pojemnik buforowy do płukania jest wypełniony do 30 ml roztworem do płukania 1x Bond. Umieścić pojemniki do miareczkowania dla każdego odczynnika w systemie.
  4. Przygotuj rozcieńczalnik Ab Diluent w odpowiednim pojemniku. Wymagana objętość wynosi 350 + (150 μl x liczba szkiełek) i składa się z rozcieńczalnika przeciwciał, jak podano. Zmieszaj bufor do wymieszania po rozmrożeniu.
  5. Przygotować roztwór do barwienia przeciwciał w pojemniku z roztworem barwiącym przeciwciała 1. Dodaj wszystkie przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 do dostarczonego rozcieńczalnika przeciwciał. Wymagana objętość to 350 + (150 μL x liczba szkiełek). Nie należy mieszać zapasów przeciwciał ani kompletnego roztworu do barwienia przeciwciał, mieszać tylko przez pipetowanie.
  6. Przygotuj mieszankę przed amplifikacją w pojemniku na miks przed amplifikacją. Wymagana objętość wynosi 350 + (150 μl x liczba szkiełek) i składa się z mieszanki wstępnego amplifikacji, jak doszono. Zwiruj ten roztwór po rozmrożeniu.
  7. Przygotować roztwór do amplifikacji w pojemniku z roztworem do amplifikacji. Wymagana objętość wynosi 350 + (150 μl x liczba szkiełek) i składa się z enzymu amplifikacyjnego rozcieńczonego w stosunku 1:10 w buforze do amplifikacji. Nie należy mieszać enzymu amplifikacyjnego ani gotowego roztworu do amplifikacji, mieszać tylko przez pipetowanie.
  8. Przygotuj jądrową plamę przeciwplamową w pojemniku na przeciwplamę jądrową. Wymagana objętość wynosi 350 + (300 μl x liczba szkiełek) i składa się z dostarczonego roztworu barwnika jądrowego rozcieńczonego w stosunku 1:100 w wodzie ultraczystej. Wymieszaj przez wirowanie.
  9. Przygotować mieszaninę sond fluorescencyjnych odpowiadającą pierwszej rundzie obrazowania w pojemniku sondy fluorescencyjnej. Wymagana objętość to 350 + (450 μl x liczba szkiełek), składająca się z sond fluorescencyjnych 1 roztwór rozcieńczony w stosunku 1:20 w buforze sondy. Zwiruj składniki po rozmrożeniu, a także końcową kompletną mieszankę.
  10. Gdy wszystkie odczynniki zostaną przygotowane i umieszczone w odpowiednich pojemnikach, umieść pełną różdżkę odczynnika w oprogramowaniu, aby umożliwić zmierzenie objętości odczynnika.

5. Uruchom instalację

  1. Po przygotowaniu wszystkich odczynników przejdź do zakładki Ustawienia slajdów w górnej części oprogramowania i wybierz przycisk Nowe badanie. W razie potrzeby dodaj identyfikator badania, nazwę badania i komentarze do badania. Zapoznaj się z Rysunek 2 jako przykład.
  2. Pod objętością dozowania wybierz 150 μl i *Dewax 4 kroki jako protokół przygotowania. Jeśli kroki *Dewax 4 nie pojawiają się w menu rozwijanym, znajdź ten protokół w menu Ustawienia protokołu i zaznacz pole Preferowany. Naciśnij przycisk OK.
  3. Po utworzeniu badania należy wybrać przycisk Dodaj slajd po prawej stronie ekranu ustawień slajdu. W obszarze Komentarze do slajdów nadaj slajdowi unikatową nazwę.
  4. Dla dodatkowych pól na tym ekranie ustaw Typ tkanki na Testuj tkankę i ustaw objętość dozowania na 150 μl, przy czym tryb barwienia to Pojedynczy w menu rozwijanym po lewej stronie i Rutynowy w menu rozwijanym po prawej stronie. W obszarze Proces wybierz IHC, a znacznikiem jest roztwór do barwienia przeciwciał.
  5. W sekcji protokołu w oknie Dodaj slajd wybierz Test barwienia 1 do barwienia, * Dewax 4 kroki jako przygotowanie i *HIER 20 min z ER2 jako HIER. Protokół enzymatyczny pozostanie *----. Po zakończeniu kliknij przycisk Dodaj slajd. Zapoznaj się z Rysunek 2 jako przykład.
  6. W razie potrzeby powtórz ten proces dla liczby slajdów, które mają zostać uruchomione w badaniu, upewniając się, że pole Komentarze do slajdów jest aktualizowane dla każdego dodanego slajdu, aby można było je później jednoznacznie zidentyfikować. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj wszystkie etykiety, umieszczając je w odpowiednich sekcjach tkanki.
  7. Załaduj każdy slajd na tacę i umieść płytki pokrywy na każdej sekcji przed załadowaniem tacy do oprogramowania. Po dodaniu odczynników i szkiełek wybierz odpowiedni autostainer po prawej stronie oprogramowania. Po wybraniu tej opcji widoczne będą wszystkie trzy tace na suwaki i informacje o wszystkich odczynnikach w oprogramowaniu, w tym odczynniki luzem i te dodane podczas przygotowywania odczynników.
  8. Upewnij się, że pojemniki na odczynniki luzem są napełnione, a pojemniki na odpady mają wystarczającą objętość, aby zakończyć przebieg, a następnie naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć bieg.
  9. Każdy bieg trwa około 5 godzin i 15 minut. Zanotuj czas zatrzymania i upewnij się, że szkiełka zostały usunięte z autostainera natychmiast po zakończeniu protokołu.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Monity dotyczące oprogramowania. (A) Nowy monit o badanie w oprogramowaniu Autostainer, pokazujący prawidłowe ustawienia dla protokołu barwienia multipleksowanej immunofluorescencji (mIF). (B) Dodaj monit Slide w oprogramowaniu, pokazujący prawidłowe ustawienia dla protokołu barwienia mIF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Obrazowanie

  1. Po zakończeniu protokołu barwienia usuń poplamione szkiełka i szkiełko nakrywkowe z podłoża montażowego. Poczekaj, aż podłoże montażowe utwardzi się w ciemności, aż szkiełko nakrywkowe zostanie mocno przymocowane na miejscu (zwykle 1 godzina lub dłużej, punkt przerwy).
  2. Preparaty obrazowe na mikroskopie fluorescencyjnym lub skanerze całego preparatu z odpowiednimi filtrami do testu. Barwniki używane w tym teście są zazwyczaj kompatybilne z filtrami do DAPI, FITC, TRITC, Cy5 i Cy7.
  3. Obrazy będą wyglądały podobnie do tych w Rysunek 3A. Wizualnie upewnij się, że wszystkie obszary tkanki są odpowiednio ostre i że sygnały pojawiają się na odpowiednim poziomie intensywności (nie są prześwietlone/niedoświetlone). W razie potrzeby ponownie narysuj slajdy z różnymi ustawieniami ekspozycji.
  4. Po obrazowaniu, jeśli konieczna jest dodatkowa runda obrazowania, zanurz szkiełka w 1x PBS, aż szkiełka nakrywkowe same odpadną. (pauza)

7. Wstępna konfiguracja protokołu Exchange

  1. Jeśli oprogramowanie jest w wersji 7.0 lub nowszej, będzie dostępny wstępnie zainstalowany szablon protokołu autostainer. U dołu ekranu sprawdź, czy opcja Preferowany stan jest ustawiona na Wszystkie. Protokół szablonu będzie nosił nazwę *ISP Signal Exchg. W przypadku wcześniejszych wersji oprogramowania protokół można znaleźć w tabeli 3.
  2. Kliknij prawym przyciskiem myszy *ISP Signal Exchg i skopiuj protokół. W wyświetlonym oknie pop-up zmień nazwę protokołu Exchange Protocol 1 na skróconą nazwę ISPEXCH1. Przed kontynuowaniem upewnij się, że pole Preferowane jest zaznaczone i przypisz tę samą nazwę zestawu, jak określono w kroku 2.6.

Tabela 3: Protokół wymiany sygnału immunofluorescencji multipleksowej. Bufor płuczący odpowiada roztworowi BOND Wash. Wszystkie inne odczynniki pomocnicze mają odpowiednio nazwane składniki zestawu. Ten protokół jest kompatybilny z oprogramowaniem w wersji 7.0 i nowszych, BXD 39 i nowszych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

8. Konfiguracja i uruchomienie protokołu Exchange

  1. Rozmrozić bufor wymiany w temperaturze pokojowej. Neutralizator wymiany i inicjator wymiany należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Do wykonania protokołu wymiany potrzebne są dwa pojemniki do miareczkowania odczynnika oraz zestaw detekcyjny.
  2. Przygotuj roztwór wymienny w odpowiednim pojemniku. Wymagana objętość to 350 + (450 μl x liczba szkiełek) i składa się z inicjatora wymiany rozcieńczonego w stosunku 1:500 w buforze wymiany. Nie należy mieszać enzymu wymiennego ani gotowego roztworu wymiennego, mieszać tylko przez pipetowanie.
  3. Przygotuj drugą mieszankę sond fluorescencyjnych w pojemniku na sondy fluorescencyjne 2. Wymagana objętość wynosi 350 + (450 μl x liczba szkiełek) i składa się z sondy fluorescencyjnej 2 roztwór rozcieńczony w stosunku 1:20 i neutralizatora wymiany rozcieńczony w stosunku 1:40 w buforze sondy 2. Mieszanina sondy fluorescencyjnej i bufor sondy mogą być zawirowane, ale neutralizator wymienny i końcowy połączony roztwór powinny być mieszane tylko pipetą.
  4. Gdy wszystkie odczynniki są przygotowane, umieść pełną różdżkę na autostainerze i pozwól, aby odczynniki zostały przetestowane przez maszynę.
  5. Dodaj wszystkie slajdy zgodnie z krokiem 5. Podczas dodawania slajdu zmień znacznik na *Negatywny. W przypadku opcji Przygotowanie, HIER i Enzym wybierz opcję *----, ponieważ dla protokołu wymiany nie jest potrzebne odwoskowanie ani pobieranie antygenu. Po zakończeniu kliknij przycisk Dodaj slajd.
  6. W razie potrzeby powtórz ten proces dla liczby slajdów, które mają zostać uruchomione w badaniu, upewniając się, że pole Komentarze do slajdów jest aktualizowane dla każdego dodanego slajdu, aby można było je później jednoznacznie zidentyfikować.
  7. Po dodaniu wszystkich preparatów zamknij okno Dodaj slajd i wydrukuj wszystkie etykiety, umieszczając je w odpowiednich sekcjach tkanki.
  8. Załaduj każdy slajd na tacę i umieść płytki pokrywy na każdej sekcji przed załadowaniem tacy do oprogramowania.
  9. Po dodaniu wszystkich odczynników i szkiełek wybierz odpowiedni autostainer w oprogramowaniu; będzie on znajdował się po prawej stronie. Po wybraniu tej opcji widoczne będą wszystkie trzy tace na suwaki i informacje o wszystkich odczynnikach w oprogramowaniu, w tym odczynniki luzem i te dodane podczas przygotowywania odczynników.
  10. Upewnij się, że pojemniki na odczynniki luzem są napełnione, a pojemniki na odpady mają wystarczającą objętość, aby zakończyć przebieg.
  11. Po potwierdzeniu naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć bieg. Wypełnienie protokołu trwa około 90 minut. Zanotuj czas zatrzymania i upewnij się, że slajdy zostały usunięte natychmiast po zakończeniu biegu.

9. Obrazowanie

  1. Powtórz obrazowanie dla nowej rundy sond, jak w kroku 5. Obrazy pojawią się jak w Rysunek 3B.

>10. Układanie (do obrazowania białek >4-plex)

  1. Dla tego samego slajdu będzie teraz dostępnych wiele obrazów. Połącz obrazy w oprogramowaniu do wspólnej rejestracji obrazów, aby wygenerować ułożony w stos obraz 8-plex.
  2. Zarejestruj obrazy z każdej rundy w następujący sposób.
    1. Każdy okrągły obraz jest nazwany w następujący sposób: _ gdzie to unikalna nazwa slajdu (kod kreskowy), a to ciąg znaków, który po posortowaniu alfabetycznym umieści obraz rundy 1 jako pierwszy, a obraz rundy 2 jako drugi. Np. dla = 1234ABC, pliki mogą mieć nazwy 1234ABC_Round1 i 1234ABC_Round2, ze wszystkimi plikami posiadającymi odpowiednie rozszerzenie (np. .czi) skanera. Umieść wszystkie okrągłe obrazy w jednym folderze o nazwie np. Obrazy źródłowe.
    2. W oprogramowaniu do wspólnej rejestracji kliknij przycisk Ustaw w sekcji katalogu obrazów źródłowych w interfejsie użytkownika, a gdy pojawi się monit, wybierz folder utworzony powyżej.
    3. Ustaw typ pliku w sekcji Obrazy źródłowe na rozszerzenie obrazów źródłowych (np. .czi, .qptiff itp.). Oprogramowanie wyświetli teraz dwa okrągłe obrazy razem w tabeli pokazującej, że slajd 1234ABC ma 2 okrągłe obrazy.
    4. W razie potrzeby ustaw lokalizację wyjściowych obrazów stosowych na inny katalog niż folder obrazów źródłowych za pomocą przycisku Ustaw w sekcji katalogu obrazów stosowych interfejsu użytkownika, a gdy pojawi się monit, wybierz folder Żądane wyjście. W przeciwnym razie folder obrazów źródłowych będzie używany domyślnie.
    5. Domyślnie tworzona jest tylko reprezentacja stosu w pliku .afi. Zaznacz opcję zapisania pliku OME.tif całego stosu w sekcji opcji przetwarzania interfejsu.
    6. Aby zweryfikować dokładność korejestracji w całej próbce, zaznacz opcję Walidacja w sekcji danych wyjściowych interfejsu.
    7. Naciśnij przycisk START, aby rozpocząć korejestrację obrazu.

11. Analiza obrazu

  1. Po zobrazowaniu slajdów wizualizuj i analizuj slajdy przy użyciu dowolnej metody analizy, takiej jak pakiet do przetwarzania obrazów STARVUE firmy Ultivue lub QuPath15.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z powyższym protokołem, tkanka FFPE zostanie wybarwiona wieloma celami, a wysokiej jakości obrazy wszystkich markerów w grupach po cztery zostały uzyskane (Rysunek 3A,B). Oprogramowanie do wspólnej rejestracji obrazów pozwoli na łączenie i współrejestrowanie obrazów z tego samego slajdu, jak widać na Rysunek 3C. Podobne wyniki przedstawiono na rysunku Rysunek 4 dla preparatu tkankowego raka jelita grubego (CRC).

Sukces protokołu powinien być określony poprzez ocenę oczekiwanego wzorca barwienia. W pokazanym przykładzie CRC każdy z barwionych celów ulega ekspresji w oczekiwanym przedziale subkomórkowym, np. jądrowy FoxP3, błoniasty CD3, cytoplazmatyczny CD68 (Figura 4B-D). Każdy z celów funkcjonalnych ulega ekspresji na odpowiednim typie komórki, jak pokazano na przykładzie kolokalizacji PD1 i CD3 lub PDL-1 i CD68, które pokazują odpowiednio wyczerpanie limfocytów T i makrofagów immunosupresyjnych. Ocena dobrego stosunku sygnału do tła, pozwalającego na skuteczne odróżnienie prawdziwego sygnału dodatniego od potencjalnego szumu tła, jest zwykle wykonywana jakościowo przez patologów lub ekspertów ds. analizy obrazu, którzy potwierdzają jakość barwienia, umożliwiając pomyślną analizę obrazu. Aby jeszcze bardziej potwierdzić jakość i wydajność barwienia, można dodać porównanie ze złotym standardem IHC (chromogenny DAB) na odcinkach seryjnych (patrz przykład w Rysunek 5), a także pozytywną próbkę tkanki kontrolnej, taką jak ludzki migdałek, która dla większości celów immunologicznych może być przydatna do potwierdzenia powodzenia procesu barwienia. Należy pamiętać, że nowotwory mogą wykazywać niższą ekspresję celów niż ludzki tonsil16.

Po jakościowym potwierdzeniu wyników, można przeprowadzić analizę ilościową. W tej pracy polega to przede wszystkim na obliczeniu gęstości komórek różnych fenotypów (liczba komórek/mm2) wyrażających określony cel lub cele, a także na obliczeniu średnich poziomów intensywności celów funkcjonalnych, które mogą wykazywać szeroki zakres dynamiczny ekspresji. Oceniając precyzję testów mIF, seryjne odcinki barwione tymi samymi markerami powinny wykazywać porównywalne sygnały między szkiełkami, co można zobaczyć jakościowo w Rysunek 6. Przykładowe wyniki ilościowe gęstości pojedynczych markerów w różnych typach tkanek przedstawiono na rysunku Rysunek 7. Analiza obrazu na tych obrazach umożliwia identyfikację komórek dodatnich i obliczenie odpowiedniej dodatniej gęstości komórek dla każdego markera, a także średniej intensywności sygnału na komórkę dodatnią. Pozwala to na obliczenie współczynnika zmienności (CV) dla każdego markera w celu oceny precyzji testu multipleksowania (tabela 4).

figure-results-1
Rysunek 3: Obrazy rdzenia mikromacierzy tkankowej (TMA) uzyskane z kolejnych rund barwienia w protokole immunofluorescencji 8-plex. (A) Obraz uzyskany z pierwszej rundy obrazowania, zawierający markery CD8, PD1, PD-L1 i CD68. Po protokole wymiany, (B) pokazuje drugą rundę obrazowania na tym samym szkiełku dla drugiej rundy markerów CD3, CD4, FoxP3 i CK/SOX10, a (C) pokazuje wspólnie zarejestrowany obraz łączący obrazy (A) i (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Reprezentatywne barwienie tkanki raka jelita grubego (CRC) za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego 8-plex. Rysunek przedstawia fenotypy komórkowe, które można zidentyfikować poprzez kolokalizację wielu celów w tej samej komórce. (góra) Obraz całego szkiełka tkanki CRC. (na dole) Szczegółowe widoki regionów uwydatniania tkanek (A) limfocytów T-reg (CD3 + / CD4 + / FOXP3 +), (B) komórek eksprymujących PD-1 i PD-L1 w obrębie guza i zrębu, (C) wyczerpanych cytotoksycznych limfocytów T (CD3 + / CD8 / PD-1), (D) komórek nowotworowych unikających układu odpornościowego (PD-L1 + / CK+) i makrofagów immunosupresyjnych (CD68 + / PDL1 +). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 5: Jakościowe porównanie barwienia immunohistochemicznego (IHC) z immunofluorescencyjnym (IF). Skrawki seryjne barwione jednomarkerowym barwnikiem immunohistochemicznym (DAB, górny rząd), immunofluorescencją pojedynczego markera (ISP monoplex) i jednokanałowym widokiem immunofluorescencji multipleksowej (ISP multiplex) wykazującym jakościową zgodność między różnymi metodami barwienia. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 6: Barwienie sekcji szeregowej. (A) Diagram przedstawiający układ wielotkankowego TMA. (B) Reprezentatywne obrazy 8-pleksowe rdzeni tkankowych każdego typu tkanki w TMA. (C) Reprezentatywne obrazy CD8 w rdzeniu migdałka w sześciu szeregowych odcinkach TMA barwionych w jednym przebiegu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 7: Kwantyfikacja gęstości pojedynczego markera dla każdego typu tkanki uwzględnionej w TMA. Gęstości na tkankę to średnie zagęszczenia w trzech reprezentatywnych rdzeniach każdego typu tkanki na szkiełku TMA. Oś y reprezentuje gęstości pojedynczych markerów w różnych typach tkanek na osi x, w jednostkach komórek dodatnich/mm2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 8: Analiza obszaru zainteresowania (ROI) względnego sygnału fluorescencyjnego porównująca wzmocniony ISP mIF opisany w tym protokole z pośrednim IF. (A) Reprezentatywny szkiełko barwione dla CK (po lewej) lub PD-L1 (po prawej) ze wskazanymi pięcioma ROI. (B) Reprezentatywne obrazy ROI dla CK (na górze) i PD-L1 (na dole). Średnia intensywność sygnału osiągnięta przy wzmocnionym mIF (fioletowy) i pośredniej IF (niebieski) dla (C) CK i (D) PD-L1 w pięciu ROI, z których każdy ma wymiary 100 μm x 100 μm i zawiera około 200 komórek. Wartości osi Y pokazują dowolne jednostki fluorescencyjne, a słupki błędów pokazują odchylenia standardowe (n=3). (E) Względne natężenie sygnału osiągnięte przy wzmocnionym ISP mIF (fioletowym) i pośrednim IF (niebieskim) obliczono, biorąc pod uwagę stosunek średniego wzmocnionego sygnału mIF do średniego pośredniego sygnału IF we wszystkich ROI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 4: Obliczony współczynnik wariancji (CV). CV dodatniej gęstości komórek i średniej intensywności sygnału dla obrazów migdałków pokazano na Rysunek 6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano protokół wysokoprzepustowego, bardzo czułego barwienia immunofluorescencyjnego multipleksu przy użyciu automatycznego barwienia. Podczas przeprowadzania tego protokołu etapy przygotowania odczynnika są krytyczne i zasługują na uwagę. Konieczne jest upewnienie się, że odczynniki są odpowiednio wymieszane i prawidłowo odmierzone, aby zminimalizować zmienność barwienia między różnymi szkiełkami w tym samym przebiegu lub między różnymi seriami przy użyciu tych samych składników.

Typowe problemy związane z wykonywaniem tego protokołu obejmują niewłaściwe mieszanie odczynników przed załadowaniem oraz możliwość utraty tkanek z powodu niewłaściwej procedury usuwania szkiełek nakrywkowych. Chociaż ten protokół barwienia ma zastosowanie do każdego typu tkanki FFPE, w tym typów raka, niektóre typy tkanek mogą wymagać bardziej ostrożnego obchodzenia się (np. tkanki o wysokiej zawartości tłuszczu). Aby uniknąć utraty tkanki, należy pozwolić, aby szkiełka nasunięte pokrywą nasiąkły wystarczająco długo, aby szkiełko nakrywkowe samo się odczepiło. Nie zmuszaj szkiełka nakrywkowego do odsunięcia lub podważenia szkła.

Ograniczeniem jest to, że podczas gdy wiele z najczęściej stosowanych celów w immunologii onkologicznej jest zwalidowanych i gotowych do użycia, niektóre cele mogą wymagać opracowania testu przed włączeniem do panelu multipleksowego. Chociaż proces ten jest stosunkowo szybki, może to wymagać dodatkowych kilku tygodni, zanim będzie można korzystać z niestandardowego panelu multipleksowego.

Istnieje kilka różnic między tym testem a innymi technologiami immunofluorescencji multipleksowej. W porównaniu z technologiami opartymi na immunofluorescencji bezpośredniej i pośredniej, zademonstrowany tutaj test ma znacznie wyższy poziom amplifikacji, co pozwala na znaczną poprawę stosunku sygnału do szumu, szczególnie w kanałach, które mają tendencję do wykazywania autofluorescencji tkankowej, takich jak kanał FITC. Powoduje to ~30 razy silniejszy sygnał niż immunofluorescencja bezpośrednia i ~ 10 razy silniejszy sygnał niż immunofluorescencja pośrednia, jak określono ilościowo za pomocą analizy intensywności całego slajdu i ręcznej analizy opartej na ROI (ryc. 8). Metoda ta umożliwia znacznie bardziej czułe wykrywanie białek docelowych przy znacznie krótszych czasach ekspozycji i eliminuje potrzebę manipulacji obrazem, w tym odejmowania tła, co grozi usunięciem sygnałów o niskiej intensywności.

W porównaniu z testami mIF opartymi na amplifikacji katalizowanej enzymatycznie test pokazany tutaj ma znacznie lepszą zdolność do przeprowadzania multipleksowania, a także ma prostszy przebieg pracy i ogólnie krótszy czas wykonywania testu (ryc. 1). W tym teście przeciwciała są dodawane do siebie w jednym kroku i jednocześnie amplifikowane, co znacznie upraszcza protokół testu. Co więcej, niektóre technologie oparte na enzymach, takie jak wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA), mogą wykazywać interferencję między różnymi przeciwciałami, co nazywa się efektem parasola 12,17,18. Zastosowana tutaj technologia amplifikacji pozwala uniknąć tego problemu, umożliwiając wykrycie wielu kolokalizowanych i koeksprymowanych markerów na tej samej komórce, jak widać na rysunku 4.

Około 90% nowotworów u ludzi powstaje z komórek nabłonkowych19. Dzieje się tak dlatego, że często stanowią one pierwszą linię obrony przed środowiskiem zewnętrznym i szybciej się namnażają, co prowadzi do szybszej akumulacji potencjalnie onkogennych mutacji. W tym przypadku stan zapalny odgrywa kluczową rolę w nowotworzeniu nowotworzenia, progresji i rozprzestrzenianiu się. W ciągu ostatniej dekady wiele terapii ukierunkowanych na inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i komórki odpornościowe stało się potężnym arsenałem przeciwko wielu typom nowotworów 5,20,21. Jednak znaczna część pacjentów nadal nie reaguje na leczenie. Jest prawdopodobne, że mikrośrodowisko guza (TME) i lokalny krajobraz immunologiczny odgrywają kluczową rolę. Profilowanie sygnatur molekularnych TME związanych z różnicową odpowiedzią na lek u wielu pacjentów może być możliwe lepsze zdefiniowanie biomarkerów terapeutycznych. Raport ten pokazuje, że technologia mIF może być stosowana do równoległego profilowania wielu biomarkerów białkowych, w tym markerów o niskiej ekspresji, na setkach całych preparatów próbek lub mikromacierzy nowotworowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy: K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. i A. Vasaturo są pracownikami firmy Ultivue, która produkuje multipleksowe zestawy immunofluorescencyjne używane w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Ultivue.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klon anty-CD3UltivueBC33 (BioCare). Część ULT50801 klonu
anty-CD4UltivueSP35 (Abcam). Część klonu
anty-CD68UltivueKP1 (BioCare) ULT50801 bazie danych anty-CD68. Część ULT50801 klonu
anty-CD8UltivueC8/144B (BioCare). Część klonów ULT50801
Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10UltivueAE1/AE3 (Bethyl Labs) i BC34 (BioCare). Część ULT50801, dostarczana w postaci mieszaniny
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Część klonu
anty-PD1Ultivue. Część ULT50801 klonu
anty-PDL1Ultivue73-10 (Abcam). Część
mikroskopu ULT50801 Axioscan.Z1Zeissnazywa mikroskop fluorescencyjny w tekście
Roztwór do odwoskowywania BondLeica AR9222
OtwarteLeicaAR9640
, 30 ml
BondLeicaDS9455
Wkładki do miareczkowaniaLeica
Uniwersalne płytki nakrywkoweLeicaOPT9719
Bond Wash Solution 10x KoncentratLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicanazywany "autostainerem" w tekście
Leicaw wersji 6.0 lub nowszej
Szkiełka nakrywkowe, grubość #1.5Etanol Corning2980-244
, 200 proofBloki tkankowe VWR89370-084
FFPEBioIVTróżnią się między sobą
Test OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801zawiera wszystkie inne składniki Ultivue
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 z 2,7 mM KCl i 137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144nazywany "podłożem montażowym" w tekście
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Bufor wzmacniający UltivueUltivueczęść ULT50801
Ultivue Rozcieńczalnik przeciwciałUltivueczęść
ULT50801 bufora wymianyUltivue Ultivueczęść
inicjatora wymiany Ultivue część ULT50801 inicjatora wymianyUltivueczęść neutralizatora wymiany ULT50801
UltivueULT50801
Sondy fluorescencyjne Ultivue 1Ultivueczęść ULT50801
Sondy fluorescencyjne Ultivue 2CzęśćULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueczęść
ULT50801 Ultivue Probe BufferUltivueczęść ULT50801
Woda ultraczystaSigma-AldrichW4502
Ultivue CAL20 (Abcam) ULT50801 Roztwór do odzyskiwania epitopów Bond Leica AR9222 pojemniki Zestaw do wykrywania badań Leica OP309700 Bond Zestaw do miareczkowania OPT9049 Bond Bond Leica S21.4611 Oprogramowanie BondRX Typy tkanek część

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Automatyczna immunofluorescencjaprzeciwcia a z kodem kreskowym DNAwzmocnienie sygna uobrazowanie ca ych preparat wproteomika przestrzennamikroarray tkanekanaliza pojedynczych kom rekfenotypowanie immunologicznetkanka utrwalona w formalinie

Powiązane artykuły