Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.
Artykuł metodologiczny
Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ciągu ostatnich dziesięcioleci poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu mechanizmów determinacji losu komórek. Jednak proces, w którym komórki zdeterminowane przez los tworzą trójwymiarowe kształty organizmów, pozostaje niejasny. Najnowsze postępy w mikroskopii konfokalnej ułatwiły obserwację dynamiki komórek podczas ich rozwoju za pomocą obrazowania na żywo. Poczwarka Drosophila melanogaster jest idealna do obrazowania na żywo ze względu na jej bezruch, przezroczysty naskórek poczwarki i dostępność fluorescencyjnych linii reporterowych. Podstawowym wyzwaniem dla obrazowania jest poczwarka, czyli naskórek otaczający poczwarkę, który utrudnia obrazowanie optyczne. Podczas gdy poprzednie metody obejmowały częściowe lub całkowite usunięcie poczwarki, utrzymanie żywotności poczwarki przez dłuższy czas po tej procedurze pozostawało wyzwaniem. W tym artykule przedstawiono prostą metodę obrazowania nogi Drosophila w fazie poczwarki na żywo, polegającą na całkowitym usunięciu poczwarki. Metoda polega na usunięciu poczwarki z poczwarki przyklejonej do taśmy dwustronnej, a następnie zmontowaniu małej komory na naczyniu ze szklanym dnem, aby zamknąć poczwarkę i kroplę wody. Ta konfiguracja jest prosta, niezawodna i wspiera wydłużone przeżycie poczwarki, zapobiegając wysuszeniu. Długoterminowe obrazowanie poczwarki Drosophila na żywo znacząco przyczyniło się do uchwycenia, w jaki sposób dorosła noga ulega dramatycznym trójwymiarowym zmianom strukturalnym w ciągu 2-3 dni. Zmiany te obejmują przejściowe tworzenie intrygującej struktury (struktury podobnej do Partenonu) przez komórki nabłonkowe, szybkie zwężanie się tkanek, tworzenie stawów i wydłużanie szczeciny. Metoda ta ma zastosowanie do obserwacji różnych tkanek i może być potencjalnie łączona z innymi technikami, takimi jak optyczna indukcja genów, w celu lepszego zrozumienia dynamiki komórek podczas tworzenia ostatecznego kształtu tkanek w stadium poczwarki.
Wprowadzenie
Pomimo znacznego postępu w ciągu ostatnich kilku dekad w wyjaśnianiu mechanizmu determinacji losu komórki, nadal nieuchwytne jest, w jaki sposób komórki determinowane przez los budują trójwymiarowe kształty organizmu. Dzięki ulepszeniom technologicznym w mikroskopii konfokalnej, w ostatnich latach wzrasta liczba prób ujawnienia dynamiki komórek podczas rozwoju za pomocą obrazowania na żywo1,2. Poczwarka Drosophila melanogaster jest preferowana do obrazowania na żywo ze względu na jej odpowiednie cechy: bezruch, przezroczystość naskórka poczwarki i dostępność fluorescencyjnych linii reporterowych3,4,5. Największą przeszkodą w wykonaniu obrazowania na żywo poczwarki Drosophila jest poczwarka (przypadek poczwarki), zdeformowany i opalony końcowy naskórek larwalny otaczający poczwarkę. Aby uniknąć przeszkód optycznych, poczwarka została częściowo lub całkowicie usunięta za pomocą wcześniej opisanych metod1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Całkowite usunięcie poczwarki maksymalizuje obszar obserwacji i możliwość zastosowania do różnych tkanek. Jednak poczwarka bez poczwarki zazwyczaj umiera w ciągu około pół dnia, prawdopodobnie z powodu wysuszenia. Dlatego utrzymanie wilgotności poczwarki ma kluczowe znaczenie dla przedłużonego obrazowania na żywo. Podczas gdy dokładny czas przeżycia poczwarki po całkowitym usunięciu poczwarki w poprzednich metodach jest niejasny, zgłoszone przykłady trwały zwykle do około 20 godzin. Ponieważ stadium poczwarki trwa około czterech dni, spodziewano się, że metoda jeszcze dłuższego obrazowania na żywo przyczyni się do uchwycenia całego procesu tworzenia się kształtu tkanki.
Dorosła noga Drosophila jest doskonałym modelem do badania procesu tworzenia trójwymiarowych kształtów tkanek. Wywodzi się z zawiązków w kształcie dysku (dysku nogi) powstałych w stadiach larwalnych. Regiony odpowiadające każdemu segmentowi w odnodze dorosłego osobnika są określane przez stadium przedsłupkowe11. Następnie krążek nogi wystaje ze środkowej części, tworząc wzdętą strukturę rurkową około 11 godzin po utworzeniu poczwarki (APF). W jaki sposób tkanka ta, o swoim prostym kształcie, osiąga w kolejnych etapach swój ostateczny kształt dorosłej nogi, od dawna pozostaje niejasne. Opublikowano kilka badań dotyczących tego problemu12,13,14. Ponieważ obserwowali utrwalone lub hodowane tkanki, nie można było prześledzić ciągłych zmian w poszczególnych komórkach, a uzyskane informacje były nieco fragmentaryczne. Aby w pełni zrozumieć proces kształtowania, niezbędna jest ciągła obserwacja zmian w poszczególnych komórkach poprzez długoterminowe obrazowanie na żywo.
Niedawne badanie ujawniło dynamiczną deformację trójwymiarowych struktur na poziomie tkankowym i komórkowym przez długoterminowe obrazowanie na żywo (Rysunek 1). Najbardziej intrygującym odkryciem w tym badaniu jest przejściowe tworzenie się nieoczekiwanie złożonej struktury przez komórki nabłonkowe. Ta struktura, nazwana "strukturą podobną do Partenonu", charakteryzuje się wypustkami apikopodstawnymi i podstawnymi połączeniami komórek nabłonkowych przypominającymi siatkę. Co ważne, powstawanie i zanikanie tej struktury zbiega się z gwałtownym zwężeniem tkanek15. Późniejsze formowanie kształtu, w tym formowanie stawów i wydłużanie włosia, trwało 2-3 dni. Długoterminowe obrazowanie na żywo skutecznie uchwyciło całą historię tych trwających kilka dni sekwencyjnych wydarzeń.
Ten artykuł przedstawia krok po kroku metodę wykonywania całodniowego obrazowania nogi Drosophila na żywo w fazie poczwarki z całkowitym usunięciem poczwarki. Metoda jest łatwa do naśladowania i może być stosowana do różnych innych tkanek.
Protokół
Ten protokół wykorzystuje szczepy Drosophila melanogaster wykazujące ekspresję fluorescencyjnych reporterów15. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie poczwarki
- Za pomocą pędzla zbierz z fiolek białe poczwarki pożądanego szczepu Drosophila melanogaster i umieść je w naczyniach lub pustych fiolkach (Rysunek 2A).
UWAGA: W tym badaniu "białe poczwarki" odnoszą się do etapu między momentem, w którym larwa staje się całkowicie nieruchoma, a zanim poczwarka staje się brązowa. Ten etap trwa około 30 minut w temperaturze 25 °C. - Wysiaduj białe poczwarki przez co najmniej 14 godzin w temperaturze 25 °C, aż rozwiną się do etapu, który ma być obserwowany (Rysunek 2B).
UWAGA: Poczwarkę można usunąć dopiero po pełnym uformowaniu naskórka poczwarki po 12-13,5 h APF i łatwo usunąć dopiero po 14 h APF. - Zetrzyj klej i odrzuć jedzenie od puparium pędzlem nasączonym wodą destylowaną.
UWAGA: Brzuszna strona poczwarki powinna być szczególnie czysta, aby uzyskać wystarczającą przyczepność do taśmy dwustronnej w późniejszych etapach. - Umieść poczwarki na chusteczkach czyszczących na kilka minut do wyschnięcia.
UWAGA: Pozostała wilgoć na poczwarce uniemożliwiłaby dobrą przyczepność do taśmy dwustronnej. - Przymocuj kawałek taśmy dwustronnej do szklanego szkiełka.
- Umieść wysuszone poczwarki na dwustronnej taśmie brzuszną stroną do dołu (Rysunek 2C).
- Delikatnie popchnij grzbietową stronę poczwarki wysuszonym pędzlem, aby uzyskać lepszą przyczepność do taśmy dwustronnej.
- Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie otwórz wieczko za pomocą kleszczy (Rysunek 2 D,E).
UWAGA: Wieczko to przednio-grzbietowy obszar poczwarki, z którego wychodzi dorosła mucha, łatwo się otwierając. - Od krawędzi otwartego wieczka włóż jedną z końcówek kleszczy w przestrzeń między poczwarką a poczwarką (Rysunek 2F).
UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić naskórka poczwarki końcówką kleszczy. - Chwyć poczwarkę kleszczami i wyciągnij ją na zewnątrz, aż się otworzy.
- Podnieś rozerwane fragmenty poczwarki za pomocą kleszczy i przyklej je do taśmy dwustronnej (Rysunek 2G).
- Powtarzaj kroki 1.10-1.11, aż otwór poczwarki dotrze do tylnego końca, pozostawiając niewielką część poczwarki (Rysunek 2 H,I).
UWAGA: Gdyby płyn wydostał się z poczwarki, zostałby uszkodzony (Rysunek 2K). Aby zaobserwować prawidłowy rozwój, unikaj obrazowania uszkodzonych poczwarek.
2. Konfiguracja obrazowania
- Umieść 1 μl wody destylowanej lub oleju silikonowego (w przypadku korzystania z silikonowej soczewki zanurzeniowej) na dnie naczynia ze szklanym dnem.
- Namocz pędzel w wodzie destylowanej i delikatnie zgarnij poczwarkę (Rysunek 2J).
- Umieść poczwarkę brzuszną stroną do dołu na wodzie destylowanej lub oleju silikonowym (Rysunek 2L).
- Za pomocą mikropipety umieść 10 μl wody destylowanej w pobliżu krawędzi szklanej części naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 2L).
- Umieść kółko smaru silikonowego ze strzykawką wokół krawędzi szklanej części naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 2M).
- Nałóż szkiełko nakrywkowe na smar silikonowy, aby go uszczelnić (Rysunek 2M). Montaż jest zilustrowany w Rysunek 2N.
UWAGA: Upewnij się, że między szkiełkiem nakrywkowym a smarem silikonowym nie ma żadnych szczelin.
3. Obrazowanie konfokalne
- Włącz odwrócony konfokalny mikroskop laserowy i oprogramowanie do obrazowania.
- Umieść naczynie na stoliku przyjmującym odwrócony mikroskop konfokalny.
- Znajdź poczwarki z soczewką obiektywową o małym powiększeniu w obserwacji jasnego pola. Upewnij się, że poczwarki nie wykazują żadnego wycieku płynu ustrojowego.
- Wyśrodkuj żądany obszar poczwarki, aby obserwować go w obszarze zainteresowania (ROI).
UWAGA: Przednio-boczna strona stępu w pierwszej i drugiej nodze oraz brzuszna strona stępu w trzeciej nodze są zorientowane w kierunku brzusznej strony poczwarki. Dlatego przekrój podłużny stępu wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej można zaobserwować w pierwszej i drugiej nodze, podczas gdy te wzdłuż osi przednio-tylnej można zaobserwować w trzeciej nodze. - Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę do obrazowania na żywo.
UWAGA: Jeśli używana jest soczewka zanurzona w wodzie, woda między soczewką a naczyniem ze szklanym dnem wyschnie podczas długotrwałej obserwacji. Zalecane są soczewki bez zanurzenia lub z olejkiem silikonowym. - Dostosuj warunki żądanej obserwacji i rozpocznij akwizycję danych.
UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniom poczwarki, moce lasera powinny być minimalne, o ile można uzyskać wyraźne obrazy. Minimalizacja zwrotu z inwestycji i zwiększenie rozmiaru kroku są pomocne w oszczędzaniu czasu na pozyskiwanie stosu Z. Przyszła transformacja tkanki powinna być brana pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o głębokości stosu Z. W przypadku obserwacji nogi przy 15-25 h APF, ponieważ noga bardzo się zwęża, najbliższa część szkiełka nakrywkowego (nabłonek boczny) szybko przesuwa się głębiej. Biorąc pod uwagę ten ruch, bardzo głębokie stosy Z powinny być ustawione od pierwszego. Przykład ustawienia mikroskopu konfokalnego do obrazowania na żywo okolicy stępu nogi od 15-30 h APF znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Blaknięcie fluorescencji jest nieuniknione podczas długotrwałego obrazowania na żywo. Aby złagodzić ten problem, zaleca się użycie minimalnej mocy lasera. Wtyczka ImageJ "AutoEnhance"16 jest zalecana do przetwarzania danych obrazowania na żywo w celu skompensowania efektów zanikania.
Wyniki
Oto przykład 44-godzinnego obrazowania na żywo rozwijającego się Muszka owocówka opisano odnogę dorosłego osobnika w stadium poczwarki. Muchy wykazujące ekspresję His2Av-mRFP17 (znakowanie jąder komórkowych) i sGMCA18 (białko wiążące aktynę Moesyna znakowane GFP, etykietujące aktynę) pobrano na etapie białej poczwarki i inkubowano przez 15 h w 25 °CPuparium usunięto i zamocowano zgodnie z protokołem (Rysunek 2). Obrazy stosu Z (Z-stack) nadgarstka i stopki, w pobliżu końca nogi, były pomyślnie pozyskiwane co 15 min od 16. do 60. godziny APF w temperaturze pokojowej (nie ściśle, lecz w przybliżeniu 25 °C). Pierwsza połowa serii obrazów jest przedstawiona w Rysunek 3, druga połowa w Rycina 4, oraz film z całego procesu w Film 1W miarę szybkiego zwężania się tkanki kończyny, komórki nabłonkowe przejściowo tworzyły intrygującą strukturę, tzw. strukturę przypominającą Partenon, charakteryzującą się wypustkami apikalno-bazalnymi oraz połączeniami bazalnymi (Rysunek 3). Zmniejszenie grubości nabłonka obserwowano nawet po niemal całkowitym ukończeniu obrysu (Rycina 4). Cały proces przedstawiono w zestawieniu w Rycina 1.
Rycina 1: Przegląd formowania się ostatecznego kształtu Drosophila dorosłego nadnadgarstka podczas stadium poczwarki. Cały proces został podzielony na pięć etapów w oparciu o zmiany morfologiczne na poziomie tkankowym i komórkowym zaobserwowane w eksperymentach z długotrwałego obrazowania na żywo. Po lewej stronie przedstawiono reprezentatywne zdjęcia lub obrazy renderowane powierzchniowo (sygnał sGMCA) odpowiadające kilku punktom czasowym. Po prawej stronie zamieszczono krótkie opisy zdarzeń w każdym etapie. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Hiraiwa i in.15. Patrz również Film 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Usuwanie puparium i montaż preparatu do obrazowania na żywo. (A) Biała poczwarka zebrana w szalce. (B) Poczwarka pokazana na (A) po inkubacji przez 15 h w 25 °C. Obszar zaznaczony kolorem cyjan wskazuje operculum. (C) Zdjęcie przedstawiające poczwarkę przyklejoną do kawałka dwustronnej taśmy klejącej. (D-J) Seria obrazów przedstawiająca procedurę usuwania puparium. (D) Operculum jest podnoszone pęsetą. (E) Operculum zostaje usunięte. (F) Końcówka pęsety zostaje włożona między kutykulę poczwarki a puparium. (G) Puparium zostaje częściowo otwarte. (H) Końcówka pęsety zostaje włożona ponownie. (I) Puparium otwarte, z pozostawieniem jedynie niewielkiej części końca tylnego. (J) Poczwarka podnoszona za pomocą pędzla. (K) Przykład wycieku płynu ustrojowego z poczwarki. Płyn wypływający z rany przebitej końcówką pęsety jest wskazany grotami strzałki. (L-N) Obrazy i ilustracje przedstawiające montaż preparatu. (L) Obraz z widokiem z góry przedstawiający umieszczone poczwarki i wodę destylowaną na dnie szalki z szklanym dnem. (M) Szalka po zakończeniu montażu preparatu. Wzdłuż krawędzi wokół części szklanej nałożono smar silikonowy, a na smarze umieszczono szkiełko nakrywowe w celu uszczelnienia. (N) Schematyczny rysunek montażu preparatu poczwarki Drosophila do długoterminowego obrazowania na żywo. (O) Zamontowana poczwarka rozwinięta niemal do stadium imago. (P) Zamontowana poczwarka w trakcie wykluwania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Dynamiczne zmiany kształtu komórek nabłonkowych nadgarstka w 16-27,5 h APF. (A) Ilustracja poczwarki widzianej od strony brzusznej. Przerywany prostokąt odpowiada obszarowi zaobserwowanemu w (B-E). L1: pierwsza noga, L2: druga noga, L3: trzecia noga. (B,C,D,E) Kadry z obrazowania na żywo dystalnej części nadgarstka u muchy wykazującej ekspresję sGMCA (zielony) i His2Av-mRFP (magenta). Tkanka szybko się zwęża, a wcięcia w obszarach stawowych postępują. (B',C',D',E') Powiększenie obszarów otoczonych przerywanymi liniami odpowiednio w (B,C,D,E). Strzałka i grot strzałki w (C') wskazują odpowiednio przykład projekcji apiko-bazalnych oraz położenie połączeń bazalnych. Struktura przypominająca Partenon zaczyna formować się w (B'), jest w pełni uformowana w (C'), zaczyna znikać w (D') i staje się trudna do zauważenia w (E'). Na wszystkich rysunkach strona dystalna znajduje się po prawej, a grzbietowa na górze. Stadia są przedstawione w prawych dolnych rogach w (B,C,D,E). Paski skali: B,C,D,E: 50 µm; B',C',D',E': 10 µm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Hiraiwa i wsp.15. Patrz również Film 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Zmiany kształtu warstwy komórek nabłonkowych nadgarstka w 41-60 h APF. (A,B,C,D) Pojedyncze klatki z tego samego sekwencyjnego zestawu danych obrazowania na żywo co na Rycini 3. Przerywane prostokąty na (A,B,C,D) zostały odpowiednio powiększone na (A',B',C',D'). Około 48 h APF (A-B') formowanie kształtu zewnętrznego, takie jak wydłużanie szczecinek, pazurków i pulvillu, jest prawie zakończone. Dno wciągniętego stawu przemieściło się proksymalnie, a następnie, po około 54 h APF, postępowało formowanie struktury stawu kulistego. Różnica morfologiczna między nabłonkiem grzbietowym a brzusznym stała się widoczna (podwójne strzałki i otwarte podwójne strzałki na B',C',D'). Po 54 h APF (C-D') grubość warstwy nabłonkowej zmniejszyła się, niemal nie zmieniając obrysu segmentów. Na wszystkich rycinach góra to strona grzbietowa, a prawa to strona dystalna. Paski skali: A,B,C,D: 50 µm; A',B',C',D': 20 µm. Rycina ta została zacytowana z pracy Hiraiwa et al.15. Patrz również Film 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Przykład obserwacji odnóża z wykorzystaniem funkcji Bright Z. (A,B) Obrazy odpowiadającego regionu, głębokości i etapu trzeciej nogi muchy wykazującej ekspresję sGMCA (zielony) i His2Av-mRFP (magenta), z (B) lub bez (A) użycia funkcji Bright Z. (A) Płaszczyzna XY na głębokości 59,1 µm wyodrębniona z obserwacji regionu nadgarstka w trzeciej nodze w 16 h APF, nabyta bez użycia funkcji Bright Z. (A') Widok w przekroju odpowiada żółtej pionowej linii w (A). Pionowa linia w (A') wskazuje płaszczyznę ogniskowania obrazu (A). (B) Płaszczyzna XY na głębokości 61,6 µm wyodrębniona z obserwacji regionu nadgarstka w trzeciej nodze w 16 h APF, nabyta z użyciem funkcji Bright Z. Dostosowano zarówno napięcie PMT, jak i moc lasera. Widoczność obrazu jest poprawiona w porównaniu do (A). (B') Widok w przekroju odpowiada żółtej pionowej linii w (B). Żółta pionowa linia w (B') wskazuje płaszczyznę ogniskowania obrazu (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Plik uzupełniający 1: Przykład ustawień mikroskopu konfokalnego do obrazowania na żywo regionu nadgarstka nogi w przedziale 15-30 h APF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Film 1: Długoterminowe obrazowanie na żywo dystalnej części nadgarstka przez 44 h. Wykorzystano muchy wykazujące ekspresję sGMCA (zielony) i His2Av-mRFP (magenta). Najbardziej reprezentatywna płaszczyzna XY została wyodrębniona z tego samego zestawu danych co Rycina 3 i Rycina 4. Groty strzałek wskazują przykłady przyszłych obszarów stawowych. Szybko poruszające się komórki w tkance to komórki podobne do makrofagów. Sygnał przypominający sznurek, rozciągający się wzdłuż segmentów nadgarstka, jest częścią przegrody. Znacznik czasu wskazuje gg: mm. Kierunek dystalny znajduje się po prawej stronie, a grzbietowy u góry. Film ten został zaadaptowany z pracy Hiraiwa et al.15Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w stadium poczwarki. Dysk imaginalny nogi wystaje ze środkowej części, tworząc strukturę rurkową, a następnie ostateczne ukształtowanie się dorosłej nogi następuje w stadium poczwarki w sposób, który był nieuchwytny. Wcześniejsze próby obserwacji tego procesu polegały głównie na barwieniu utrwalonym, hodowli tkankowej i skaningowym mikroskopie elektronowym 12,13,14. Metody te nie były w stanie śledzić ciągłych zmian w poszczególnych komórkach i uzyskano jedynie fragmentaryczne informacje. Dzięki metodzie opisanej w tym badaniu, ostateczny proces kształtowania się kształtu okolicy stępu może być z powodzeniem obserwowany jako całodniowe sekwencyjne obrazowanie na żywo za pomocą mikroskopu konfokalnego, a zmiany w poszczególnych komórkach mogą być śledzone w sposób ciągły. Intrygująca dynamika komórek ujawniona przez to obrazowanie na żywo została szczegółowo opisana w ostatnim raporcie15.
Dla udanego długoterminowego obrazowania na żywo kluczowe jest utrzymanie żywotności poczwarki i zapewnienie, że jej rozwój pozostanie niezakłócony. W opisanej tutaj metodzie poczwarka usunięta z poczwarki rozwinęła się w dorosłego pharata i w wielu przypadkach dorosłego (ryc. 2O,P). Czasy zmian morfologicznych rozwijającego się stępu obserwowane tą metodą były zgodne z wcześniejszymi doniesieniami 12,13,14. Co więcej, komórki nabłonkowe wykazywały zmiany, takie jak zmniejszenie grubości nawet w ciągu 48-60 godzin APF (32-44 godzin po zamontowaniu) (ryc. 4B'-D'). Fakty te sugerują, że poczwarka pozostaje nienaruszona i nie doświadcza prawie żadnych zakłóceń ani opóźnień w swoim normalnym rozwoju podczas długotrwałego obrazowania na żywo przy użyciu opisanej tutaj metody. Należy pamiętać, że żywotność poczwarki pozbawionej poczwarki poddanej obrazowaniu na żywo może się różnić w zależności od czasu usunięcia poczwarki, obchodzenia się z nią podczas zabiegu, zakresu fototoksyczności w obrazowaniu i użytych szczepów much.
Jednym z krytycznych kroków gwarantujących nienaruszalność poczwarki i jej rozwój jest usunięcie poczwarki bez szkody dla poczwarki. Stabilne przyleganie poczwarki do taśmy dwustronnej i ostrożne obchodzenie się z kleszczami to klucz do sukcesu. Kluczowe znaczenie ma również zapobieganie odwodnieniu poczwarki. W związku z tym kluczowe znaczenie ma unikanie wszelkich szczelin między szkiełkiem nakrywkowym a smarem silikonowym.
Aby uniknąć wysuszenia poczwarki, wiele wcześniejszych metod polegało na częściowym usunięciu poczwarki 1,2,3,4,5,6,7. Jednak w przypadku obserwacji całej poczwarki preferowane jest całkowite usunięcie poczwarki. Chociaż maksymalny czas przeżycia poczwarki nie jest znany, opisano kilka metod, w których poczwarka jest całkowicie usuwana, 8,9,10. Najczęstszym podejściem do zapewnienia wilgoci poczwarce w tych metodach jest użycie zwilżonej bibuły filtracyjnej. W porównaniu z poprzednimi metodami, ta opisana tutaj zapewnia wilgoć poprzez wlanie kropli wody w prostszy i łatwiejszy sposób. Dodatkowo, wiele poprzednich metod polega na zamontowaniu poczwarki na szkiełku podstawowym. Podczas montowania poczwarki usuniętej z poczwarki na szkiełku podstawowym może wystąpić problem polegający na tym, że dociśnięcie szkiełka nakrywkowego do poczwarki powoduje naprężenia poczwarki lub przechylone szkiełko nakrywkowe wprowadza szumy, zniekształcenia i brak jasności obrazów. Opisana metoda wykorzystuje naczynie ze szklanym dnem, co eliminuje konieczność dociskania szkiełka nakrywkowego do poczwarki, co pozwala na obserwację tkanek w stanie jak najbardziej zbliżonym do ich naturalnego stanu. Ponieważ nie ma potrzeby regulacji kąta szkła nakrowego, konfiguracja jest stabilna, łatwa w obsłudze i bardziej niezawodna. Dlatego ta metoda nie wymaga prawie żadnych specjalistycznych umiejętności, dzięki czemu nawet początkujący mogą z powodzeniem wykonywać obrazowanie na żywo.
Głównymi ograniczeniami tej metody są głębokość obserwacji i rozdzielczości czasowe. W warunkach obserwacji stępu można uzyskać wyraźne obrazy tylko do głębokości około 40 μm. Użycie funkcji Bright Z pomaga rozwiązać ten problem. Na przykład, jak pokazano na rysunku 5, zwiększanie mocy lasera i napięcia PMT wraz ze wzrostem głębokości poprzez zastosowanie funkcji Bright Z poprawiło jakość obrazów w głębszych pozycjach. Jednak zwiększenie mocy lasera wiąże się z kompromisem obejmującym fototoksyczność i zanikanie sygnału. Dlatego konieczne jest znalezienie optymalnych warunków, które są zgodne z celem obserwacji. Rozdzielczość czasowa ma również znaczenie podczas obserwacji szybko poruszających się komórek i tkanek. Redukcja wycinków i zawężenie ROI to wiodące rozwiązania tego problemu. Korzystanie z nowoczesnego sprzętu o zwiększonej czułości detektora lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem może poprawić rozdzielczość czasu. Kolejne ograniczenie dotyczy stadium poczwarki. Poczwarkę można usunąć dopiero po pełnym uformowaniu naskórka poczwarki po 12-13,5 h APF19i można ją łatwo usunąć dopiero po 14 h APF. Wcześniejsze stadia niż 12 h APF można częściowo zaobserwować poprzez zamontowanie poczwarki bez usuwania poczwarki15, mimo że uzyskanie wyraźnych obrazów jest trudne ze względu na szybkie ruchy tkanek i przeszkody optyczne ze strony poczwarki w tym stanie.
Rozwiązywanie problemów
Trudność w usuwaniu poczwarki
Podczas usuwania poczwarki ważne jest przyleganie brzusznej strony poczwarki do taśmy dwustronnej. Klej i żywność muszą zostać usunięte z powierzchni puparium, a późniejsze suszenie jest ważne, ponieważ mokre powierzchnie uniemożliwiają dobrą przyczepność. Warto zauważyć, że taśma dwustronna w tabeli materiałów ma silniejszą przyczepność po wewnętrznej stronie. Wewnętrzna (mocniejsza) strona powinna być używana do przylegania poczwarki. Cięcie poczwarki nożyczkami preparacyjnymi zamiast rozdzierania jej kleszczami jest pomocne, gdy usunięcie poczwarki jest trudne.
Wyciek płynu z poczwarki
Bardzo ważne jest, aby usunąć poczwarkę bez szkody dla poczwarki. Wyciek płynu ustrojowego poczwarki wskazuje na uszkodzenie poczwarki (ryc. 2K). Takich poczwarek należy unikać w obrazowaniu na żywo. Aby zapobiec uszkodzeniom poczwarki podczas usuwania poczwarki, oprócz ostrożnego obchodzenia się z nią, zaleca się stosowanie kleszczy ze stosunkowo szerokimi końcówkami.
Słaba jakość obrazu
Gdy sygnał fluorescencyjny jest zbyt słaby, istnieje wiele sposobów regulacji jasności, takich jak zwiększenie napięcia PMT, otwarcie otworu (CA), spowolnienie prędkości skanowania i zwiększenie mocy lasera. Należy pamiętać, że każda metoda ma skutki uboczne: zwiększenie napięcia PMT może zwiększyć szum, otwarcie otworu zmniejsza rozdzielczość osi Z, spowolnienie prędkości skanowania wydłuża czas skanowania, a zwiększenie mocy lasera zwiększa ryzyko fototoksyczności i wybielania. Należy znaleźć odpowiednie ustawienia w zależności od obszaru zainteresowania, rodzajów i poziomów ekspresji reporterów fluorescencyjnych oraz pożądanej długości obrazowania na żywo. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się zminimalizowanie mocy lasera w przypadku długotrwałego obrazowania na żywo.
Zanikanie fluorescencji
Zanikanie fluorescencji jest nieuniknione w długotrwałym obrazowaniu na żywo. Zaleca się minimalne użycie mocy lasera, aby uniknąć tego problemu. Aby skompensować blaknięcie, podczas przetwarzania pozyskanych danych obrazowania na żywo zalecana jest wtyczka ImageJ "AutoEnhance"16 .
Dzięki całkowitemu usunięciu poczwarki, metoda ta ma szerokie zastosowanie w przypadku innych tkanek poprzez modyfikację ROI i orientacji poczwarki. Rzeczywiście, mimo że nie są to obrazowania na żywo, bliższa część nogi, trąba, nabłonek głowy w pobliżu czułka i nabłonek grzbietowej klatki piersiowej były obserwowane tą metodą w Hiraiwa i wsp.15. Takie zastosowanie do szerokiego zakresu tkanek może ułatwić dalszą integrację z innymi technikami, takimi jak optyczna indukcja genów. Metoda ta może być również stosowana do gatunków cyklorrhanowskich (tworzących poczwarki) innych niż Drosophila. Co więcej, może być potencjalnie stosowany w przypadku innych gatunków owadów, jeśli mają one przezroczysty naskórek poczwarki. Ten artykuł zawiera szczegółowe instrukcje dla badaczy Drosophila , jak przeprowadzić obrazowanie poczwarki na żywo w celu uchwycenia dynamiki komórek w żywych tkankach.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni dr Masayuki Miura (Uniwersytet Tokijski) i dr Yuya Fujisawa (Uniwersytet Tokijski) za porady techniczne, a także dziękujemy Bloomington Stock Center za materiały do latania.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie 35 mm/szklane naczynie IWAKI | 3911-035 | ||
| Chusteczki czyszczące | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | |
| Dumont #3c Kleszcze | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Eppendorf Research plus 2-20 µ L | Eppendorf | 3123000098 | |
| Szczep muchy: His2Av-mRFP, sGMCA | Bloomington Drosophila Stock Center | 59023 | |
| FV3000 | Odwrócony mikroskop konfokalny | EVIDENT | |
| Oprogramowanie FV31S-SW | EVIDENT | dla FV3000 | |
| G40L | Shin-Etsu Smar silikonowy | ||
| Micro Cover Glass 18 x 18 mm 0,13-0,17 mm | MATSUNAMI | C018181 | |
| Micro Slide Glass 76 x 26 mm 0,9-1,2 mm | MATSUNAMI | S7213 | |
| NEO-SABLE Rozmiar 0 okrągły, drobny | Pędzel Pentel | XZBNR-0 | |
| SIL300CS-30CC | Olej silikonowy | EVIDENT | |
| System stereoskopowy SZX7 | EVIDENT | ||
| Strzykawka Terumo 50 ml | Terumo | SS-50ESZ | |
| Przezroczysta taśma dwustronna | Scotch | 665-1-12 | Ponieważ warstwa wewnętrzna ma silniejszą przyczepność niż warstwa zewnętrzna, warstwa wewnętrzna powinna być używana do utrwalania poczwarek. |
| UPLSAPO10x | EVIDENT | ||
| UPLSAPO40XS | Silikonowa soczewka zanurzeniowa | EVIDENT | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas - 2,5 mm Cutting | Edge Fine Science Tools | 15000-08 | opcjonalnie |
Bibliografia
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development. J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat Protoc. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Chiba, M., et al. Activatable photosensitizer for targeted ablation of lacZ-positive cells with single-cell resolution. ACS Cent Sci. 5 (11), 1676-1681 (2019).
- Umetsu, D., et al. Local increases in mechanical tension shape compartment boundaries by biasing cell intercalations. Curr Biol. 24 (16), 1798-1805 (2014).
- Tran, N. V., et al. Programmed disassembly of a microtubule-based membrane protrusion network coordinates 3D epithelial morphogenesis in Drosophila. EMBO J. 43 (6), 568-594 (2024).
- Hellerman, M. B., Choe, R. H., Johnson, R. I. Live-imaging of the Drosophila pupal eye. J Vis Exp. (95), e52120(2015).
- O'Connor, J. T., Shannon, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protoc. 3 (2), 101396(2022).
- Ziserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J Vis Exp. (51), e2706(2011).
- Tögel, M., Pass, G., Paululat, A. In vivo imaging of Drosophila wing heart development during pupal stages. Int J Dev Biol. 57 (1-2), 13-24 (2013).
- Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term in vivo tracking of inflammatory cell dynamics within Drosophila pupae. J Vis Exp. (136), e57871(2018).
- Kojima, T. Developmental mechanism of the tarsus in insect legs. Curr Opin Insect Sci. 19, 36-42 (2017).
- Mirth, C., Akam, M. Joint development in the Drosophila leg: Cell movements and cell populations. Dev Biol. 246 (2), 391-406 (2002).
- Mirth, C. Ecdysteroid control of metamorphosis in the differentiating adult leg structures of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 278 (1), 163-174 (2005).
- Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg. Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).
- Hiraiwa, S., et al. Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging. Dev Genes Evol. , (2024).
- ImageJ plugin page. , Signaling RIKEN. Available at: https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/ (2024).
- Pandey, R., Heidmann, S., Lehner, C. F. Epithelial re-organization and dynamics of progression through mitosis in Drosophila separase complex mutants. J Cell Sci. 118 (4), 733-742 (2005).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149 (2), 471-490 (2000).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
Przedruki i uprawnienia
