Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Summary

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Abstract

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to populacja komórek macierzystych, które mogą samoodnawiać się i różnicować w wiele linii komórkowych. Wśród nich MSCs znajdujące się w szpiku kostnym, znane jako mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC), odgrywają kluczową rolę w osteogenezie, wspomaganiu układu krwiotwórczego, naprowadzaniu/migracji i immunosupresji. BMSC są szeroko stosowane w badaniach biologii komórki i inżynierii tkankowej ze względu na ich potencjał w komórkowych strategiach terapeutycznych, a także ich łatwą dostępność, stabilność genetyczną i niską immunogenność. Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) i BMSC współistnieją w szpiku kostnym, ale mają odrębne komórki progenitorowe. Podczas ekstrakcji komórek ze szpiku kostnego zwykle uzyskuje się wiele typów komórek, co może prowadzić do niejednorodności populacji komórek, potencjalnie powodując stronniczość i nie spełniając wysokich standardów eksperymentalnych. Dlatego tak ważne jest opracowanie skutecznych technik poprawy jednorodności i wydajności BMSC in vitro. W badaniu przedstawiono szczegółowy protokół oczyszczania, ekspandowania i fenotypowania opartego na cytometrii przepływowej BMSC uzyskanych od myszy BALB/c. Jednorodność i fenotyp komórek macierzystych BMSC trzeciego pasażu scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej, wykazując dodatniość dla CD29, CD44 i Sca-1, ujemność dla CD45 i CD31 oraz potwierdzając ich zdolność do różnicowania osteogennego i adipogennego. Ten ekonomiczny protokół zapewnia łatwą i wydajną metodę uzyskania wystarczającej liczby jednorodnych BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, co jest niezbędne do postępu badań na modelach mysich i szeroko zakrojonych badań przedklinicznych.

Introduction

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) są znane ze swoich właściwości multipotencjalnych i są szeroko stosowane w leczeniu różnych chorób ze względu na ich właściwości samoodnawialne, różnicujące i immunomodulujące ^1,2. BMSC są łatwo dostępne, zdolne do rozległej ekspansji, wykazują właściwości immunosupresyjne i nie wywołują natychmiastowych reakcji immunologicznych³, co czyni je atrakcyjnymi do zastosowań w inżynierii tkankowej i skutecznymi nośnikami w terapii komórkowej.

W szpiku kostnym głównymi mieszkańcami są dwie główne populacje komórek macierzystych i ich potomstwo, krwiotwórcze komórki macierzyste i BMSC⁴. Tradycyjnie, BMSC uzyskuje się poprzez celowaną aspirację szpiku kostnego i identyfikuje się jako komórki przylegające do tworzywa sztucznego in vitro. Jednak metoda ta jest niewystarczająca do odróżnienia BMSC od innych subpopulacji szpiku kostnego, w tym komórek śródbłonka, perycytów, leukocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych⁵. Dlatego potrzebny jest łatwy i skuteczny protokół izolacji BMSC.

Obecne prace szczegółowo opisują separację i oczyszczanie BMSC poprzez ich fizyczne przyleganie do plastikowych płytek do hodowli komórkowych. Eksperymenty z cytometrią przepływową przeprowadzono na BMSC trzeciego pasażu przy użyciu markerów powierzchniowych CD29, CD44 i Sca-1, zgodnie z zaleceniami komitetu Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) Mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC)⁶. Zgodnie z kryteriami ISCT, mysie MSCs charakteryzują się dodatnim wynikiem dla CD29, CD44 i antygenu komórek macierzystych 1 (Sca-1) oraz ujemnym dla markera komórek krwiotwórczych CD45 i markera komórek śródbłonka CD31. Ponadto BMSC powinny być multipotencjalne, wykazując trójliniowe różnicowanie w osteoblasty, chondrocyty i adipocyty. W tym eksperymencie osteogeneza została wywołana w wyekstrahowanych BMSC, z barwieniem ALP wykonanym w dniu 7 i testem czerwieni alizarynowej S w dniu 21 w celu oceny różnicowania. Indukowano również dyferencjowanie adipogenne wyizolowanych i oczyszczonych BMSC, przy czym barwienie czerwienią olejową wykonano w 21 dniu w celu oceny adipogenezy.

Protocol

Postępowanie ze zwierzętami zostało zatwierdzone zgodnie z wytycznymi etyki zwierząt laboratoryjnych (nr aprobaty etycznej: PZSHUTCM2211070009) Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. W badaniu wykorzystano ośmiotygodniowe samice myszy BALB/c (stopień SPF, 20 ± 1 g masy ciała). Protokół ten określa oczyszczanie, pasażowanie, fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej oraz osteogenne i adipogenne różnicowanie BMSC pochodzących od myszy. Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Postępowanie ze zwierzętami

1. Trzymanie myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w indywidualnie wentylowanych klatkach, po pięć myszy w klatce. Zapewnij paszę klasy SPF i sterylną wodę. Utrzymuj 12-godzinny cykl światła/ciemności.
   UWAGA: Ta metoda została przetestowana i uznana za wykonalną zarówno w przypadku szczepów myszy BALB/c, jak i C57BL/6. W tym artykule jako przykładu użyto głównie BALB/c.

2. Zbieranie kości udowych i piszczelowych z tylnych kończyn myszy

1. Poddaj zwierzęta eutanazji poprzez uduszenie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy⁷ zgodnie z wytycznymi etycznymi.
2. Namocz myszy w 75% etanolu przez 5 minut (Rysunek 1A).
   UWAGA: Komórki macierzyste zostały pobrane w ciągu 30^minut2 po eutanazji, a cały proces, w tym płukanie szpiku, filtracja i wysiew na płytki hodowlane, został zakończony w ciągu 2 godzin, aby zapewnić optymalną żywotność komórek.
   UWAGA: Użyj dorosłych myszy (w wieku ≥8 tygodni), aby uzyskać optymalną wydajność BMSC; Myszy w wieku 8–12 tygodni są idealne⁸.
3. Wykonaj nacięcie około 1 cm na tylnej kończynie ścięgna Achillesa za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych (ryc. 1B).
4. Wykonaj okrągłe nacięcie wokół tylnej kończyny ścięgna Achillesa sterylnymi nożyczkami, aby odsłonić dystalną kość piszczelową (ryc. 1C).
5. Oderwij skórę od nacięcia w kierunku biodra, aby usunąć ją z obu kończyn tylnych (ryc. 1D).
6. Przeciąć wzdłuż kości biodrowej, aby oddzielić głowę kości udowej od kości biodrowej (ryc. 2A).
   UWAGA: Unikaj uszkodzenia obustronnych stawów kości udowej podczas sekcji, aby zapobiec utracie szpiku kostnego.
7. Umieść zebrane kości udowe i piszczelowe w naczyniu o średnicy 60 mm, w którym znajduje się sterylny, wstępnie schłodzony PBS zawierający 2% penicyliny/streptomycyny (ryc. 2B).
8. Odetnij jak najwięcej ścięgien i mięśni od kości piszczelowej i strzałkowej za pomocą sterylnego skalpela, aby ułatwić późniejsze zaczerwienienie (ryc. 2C).
9. Zwrócono przetworzone kości do PBS zawierającego 2% penicyliny/streptomycyny i przeniesiono je do sterylnego kaptura w celu przeprowadzenia kolejnych etapów izolacji.

3. Oczyszczanie i hodowla myszy BMSC

1. Przygotuj kompletną pożywkę MEM Alpha Modification (αMEM) do hodowli BMSC, uzupełniając αMEM 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptomycyną.
   UWAGA: Wybierz pożywkę αMEM, ponieważ zawiera ona 1000 mg/l glukozy, co jest stosunkowo niskim stężeniem. Pomaga to zapobiegać hamowaniu proliferacji komórek, która może wystąpić w środowiskach o wysokim poziomie glukozy⁹
2. Weź strzykawkę o pojemności 50 ml i przymocuj igłę dołączoną do strzykawki.
3. Pobrać 20 ml pożywki αMEM do strzykawki o pojemności 50 ml, a następnie wymienić igłę na igłę dołączoną do strzykawki o pojemności 1 ml.
   UWAGA: Użyj igły strzykawkowej o pojemności 1 ml, aby dostosować się do rozmiaru kości i zminimalizować uszkodzenie komórek. Strzykawka o pojemności 50 ml pozwala na skuteczne płukanie szpiku kostnego przy zmniejszonym ryzyku zanieczyszczenia komórek w wyniku wielokrotnego wkłuwania.
4. Użyj nożyczek, aby odciąć oba końce oddzielonej kości udowej lub piszczelowej w sterylnym kapturze.
5. Wbić igłę w kość wzdłuż przeciętej krawędzi i przepłukać szpik kostny do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm zawierającego kompletną pożywkę αMEM (ryc. 2D).
6. Kilkakrotnie przepłukuj ubytki kostne, aż kawałki kości będą blade, aby upewnić się, że większość szpiku kostnego została usunięta (ryc. 2E).
7. Delikatnie pipetować w górę i w dół 40 razy za pomocą końcówki pipety, aby maksymalnie rozproszyć zagregowane komórki.
8. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia zanieczyszczeń, fragmentów tkanek i nierozproszonych grudek.
9. Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przenieść do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm i dodać kompletną pożywkę αMEM do końcowej objętości 15 ml na szalkę.
   UWAGA: Posaz wszystkie komórki szpiku kostnego pobrane z kości udowych i piszczelowych każdej myszy w jednym naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm, aby ułatwić wzrost komórek. Na podstawie wcześniejszych eksperymentów można wyizolować około 1 × 10⁷ BMC od 8-tygodniowej myszy (z dwóch kości udowych i dwóch piszczeli). Komórki te wysiewa się do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm o gęstości 1,8 × 10⁵ komórek/^cm2 dla hodowli pierwotnej.
10. Trzymaj naczynie obiema rękami i delikatnie obracaj nim ruchem ósemkowym 15 razy, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek w naczyniu.
11. Umieścić naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i hodować je przez 5 dni (ryc. 3A).
    UWAGA: W tym okresie należy unikać przesuwania szalki hodowlanej, aby zapewnić równomierny wzrost komórek.

4. Zastąpienie pożywki αMEM na hodowlę BMSC

1. Obserwuj komórki pod mikroskopem, aby określić, czy osiągnęły 80% konfluencji. Jeśli nie, przystąp do wymiany pożywki 5^dnia .
2. Pobrać 3 ml PBS za pomocą sterylnej pipety Pasteura i dozować ją z wysokości 1 cm nad szalką hodowlaną w różnych pozycjach.
   UWAGA: Unikaj dozowania płynu po jednej stronie naczynia, ponieważ może to usunąć przylegające komórki z powodu nadmiernej siły uderzenia i uniemożliwić skuteczne usunięcie niechcianych komórek.
3. Po dodaniu 3 ml PBS delikatnie potrząśnij naczyniem hodowlanym, aby dokładnie umyć komórki, a następnie usuń PBS z naczynia za pomocą pipety. Powtórz proces mycia jeszcze raz, aby upewnić się, że komórki są dokładnie umyte.
4. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura pobrać 15 ml kompletnej pożywki αMEM i dozować ją z wysokości 1 cm nad naczyniem hodowlanym w różnych pozycjach.
5. Umieść naczynie hodowlane z powrotem w inkubatorze i monitoruj, aż komórki osiągną 80% zbiegu przed subkulturacją (ryc. 3B).

5. Przejście BMSC

1. Dwukrotnie przemyj 80% zlewających się komórek PBS (ryc. 3C).
   UWAGA: Mycie komórek PBS przed trawieniem pomaga usunąć resztki pożywki i wydzieliny komórkowe oraz zmniejsza przyleganie MSC do szalki hodowlanej.
2. Trawić komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA, inkubując w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 2–3 minuty.
3. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml kompletnej pożywki αMEM do zawiesiny komórek.
4. Odessać zawiesinę komórkową z naczynia hodowlanego za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml i delikatnie przepłukać dno naczynia, aby usunąć wszystkie przylegające komórki.
5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Za pomocą pipety usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml kompletnej pożywki αMEM.
   UWAGA: W przypadku subhodowli stwierdzono, że gęstość wysiewu wynosząca około 4 × 10⁴ komórki/^cm2 jest optymalna dla dalszego wzrostu i proliferacji.
7. Podziel komórki w stosunku 1:1–1:2 na nowe 100-milimetrowe szalki do hodowli komórkowych (stanowi to 1^{. pasaż} , P1) (ryc. 3D).
8. Dziel komórki mniej więcej co trzy dni w stosunku 1:1,5, gdy osiągną 80% konfluencji, aby wygenerować drugie przejście (P2) (ryc. 3E) i trzecie przejście (P3) (ryc. 3F) BMSC.

6. Przygotowanie P3 BMSC do identyfikacji fenotypowej i różnicowania osteogennego

1. Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych.
2. Umyj P3 BMSC dwukrotnie 3 ml PBS.
3. Trawić BMSC P3 za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA, inkubując w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 2-3 minuty, gdy osiągną 80% konfluencji.
4. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml kompletnej pożywki αMEM do zawiesiny komórek.
5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
   UWAGA: Przygotowane tutaj granulki P3 BMSC będą używane do identyfikacji fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej oraz do oceny różnicowania osteogennego lub adipogennego.

7. Identyfikacja fenotypowa BMSC za pomocą cytometru przepływowego

1. Zawiesić osady komórkowe P3 BMSC w 1,5 ml roztworu PBS zawierającego 2% FBS i dostosować stężenie do 5 × 10⁶ komórek/ml.
2. Porcję 100 μl zawiesiny komórek do każdej z 11 probówek, aby uzyskać 5 × 10⁵ komórek w probówce. Przygotuj następujące grupy: ślepa próba etykiety, kontrola izotypu CD29, CD29, kontrola izotypu CD44, kontrola CD44, kontrola izotypu Sca-1, kontrola izotypu Sca-1, kontrola izotypu CD31, kontrola izotypu CD31, kontrola izotypu CD45 i kontrola CD45.
   UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano następujące fluorochromy: CD29-FITC, CD29 izotyp-FITC, CD44-APC, CD44 izotyp APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 izotyp-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 izotyp-PerCPcy5.5, CD31-PE i CD31 izotyp-PE (jak pokazano w tabeli materiałów). Te fluorochromy mogą być modyfikowane w oparciu o konfiguracje różnych cytometrów przepływowych.
3. Dla każdej grupy dodać następujące odczynniki: 2 μl PBS do grupy ślepej na etykiecie, 2 μl izotypu CD29 do grupy kontrolnej izotypu CD29 (rozcieńczenie 1:50), 2 μl CD29 do grupy CD29 (rozcieńczenie 1:50), 0,5 μl izotypu CD44 do grupy kontrolnej izotypu CD44 (rozcieńczenie 1:200), 0,5 μL CD44 do grupy CD44 (rozcieńczenie 1:200), 0,5 μL izotypu Sca-1 do grupy kontrolnej izotypu Sca-1 (rozcieńczenie 1:200), 0,5 μL Sca-1 do grupy Sca-1 (rozcieńczenie 1:200), 2 μL izotypu CD31 do grupy kontrolnej izotypu CD31 (rozcieńczenie 1:50), 2 μL CD31 do grupy CD31 (rozcieńczenie 1:50), 2 μl izotypu CD45 do grupy kontrolnej izotypu CD45 (rozcieńczenie 1:50) i 2 μl CD45 do grupy CD45 (rozcieńczenie 1:50).
   UWAGA: Przeciwciała zastosowano zgodnie ze zoptymalizowanymi zaleceniami producenta dotyczącymi cytometrii przepływowej. Wstępne eksperymenty potwierdziły optymalne barwienie i swoistość dla komórek docelowych. Zapoznaj się z wytycznymi producenta dotyczącymi dawkowania i w razie potrzeby przeprowadź wstępne testy miana.
4. Delikatnie wymieszać, odwirować za pomocą wirówki palmowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
5. Dodać 900 μl PBS do każdej probówki, wymieszać przez odwrócenie i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
6. Zawiesić osad komórkowy w każdej probówce z 300 μl PBS i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego.
   UWAGA: Komórki nie muszą być utrwalane 2,5% obojętnym formaldehydem, jeśli test cytometru przepływowego można zakończyć w ciągu 1–2 godzin. Jeśli analiza nie może być przeprowadzona w ciągu 1–2 godzin, utrwal komórki 2,5% obojętną buforowaną formaliną (przygotowaną przez zmieszanie 10% neutralnej buforowanej formaliny z PBS w stosunku 1:3) i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez noc do późniejszego testu cytometru przepływowego.
7. Dostosuj napięcie cytometru przepływowego za pomocą pustej grupy etykiet, aby upewnić się, że autofluorescencja komórek mieści się w zakresie około 1/4–1/3 osi współrzędnych. Sekwencyjnie załaduj komórki z grup izotypu CD29, CD29, CD44, CD44, izotypu Sca-1, Sca-1, izotypu CD31, CD31, izotypu CD45 i CD45. Ustaw bramkę P1 (zgodnie z definicją na wykresie FSC/SSC) tak, aby przechwyciła 10 000 komórek, działając ze średnią prędkością.
   UWAGA: Upewnij się, że cytometr przepływowy jest wyposażony w odpowiednie kanały, takie jak te powszechnie używane w eksperymentach: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 i APC lub inne kanały, które odpowiadają fluoresceinom sprzężonym z przeciwciałami.

8. Różnicowanie osteogenne BMSC

1. Zawiesić granulki P3 BMSC w kompletnej pożywce αMEM, dostosowując stężenie do 1 × 10⁵ komórek/ml.
2. Zasiać P3 BMSC na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej, dodając 1 ml kompletnej pożywki αMEM zawierającej 1 × 10⁵ komórek do każdej studzienki.
3. Hodować BMSC P3 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 przez} 3–5 dni, aż osiągną ponad 90% konflufluacji. Co 2 dni należy wymieniać kompletną pożywkę αMEM na nową.
4. Podziel różne studzienki równo na dwie grupy: negatywną grupę kontrolną (bez indukcji różnicowania osteogennego) i grupę różnicowania osteogennego
5. Przygotować pożywkę indukującą różnicowanie osteogenne, uzupełniając kompletną pożywkę αMEM o 10 mmol/l β-glicerofosforanu, 50 mg/l kwasu L-askorbinowego i ^10-8 mol/l deksametazonu.
6. Odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć BMSC P3 1 ml PBS.
7. Dodaj pożywkę indukującą różnicowanie osteogenne do studzienek grupy różnicowania osteogennego w celu indukcji różnicowania osteogennego (1 ml / studzienkę).
8. Dodać kompletną pożywkę αMEM do studzienek grupy kontrolnej (1 ml/studzienkę).
9. Hodować BMSC P3 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ przez 7 lub 21 dni, zastępując pożywkę indukującą różnicowanie osteogenne lub kompletną pożywkę αMEM tą samą świeżą pożywką co 3 dni.
   UWAGA: Komórki z 7-dniową indukcją są używane do barwienia fosfatazą alkaliczną (ALP). Komórki z 21-dniową indukcją są używane do testu czerwieni S alizaryny.

9. Identyfikacja zróżnicowanych komórek osteogennych z barwieniem ALP

1. Umyj komórki w każdym dołku 24-dołkowej płytki jednorazowo 1 ml PBS.
2. Utrwal komórki, dodając 0,5 ml 10% buforowanego roztworu formaliny i inkubując przez 20 minut.
3. Ponownie umyj komórki w każdej studzience 1 ml PBS.
4. Dodać 0,5 ml odczynnika do barwienia fosfatazy alkalicznej 1-Step NBT/BCIP do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut owijając folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
5. Wyrzuć roztwór, umyj komórki w każdym dołku jednorazowo 1 ml wody destylowanej i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
6. Obserwuj i uzyskuj obrazy barwionych kolonii za pomocą kamery, aby zidentyfikować komórki ALP-dodatnie z czarno-fioletowym osadem.
   UWAGA: Odczynnik do barwienia fosfatazy alkalicznej (ALP) 1-Step NBT / BCIP wytwarza silny, nierozpuszczalny czarno-fioletowy osad w reakcji z ALP, który można łatwo zwizualizować.

10. Identyfikacja zróżnicowanych komórek osteogennych za pomocą testu czerwieni S alizaryny

1. Umyj komórki w każdym dołku 24-dołkowej płytki jednorazowo 1 ml PBS.
2. Utrwal komórki, dodając 0,5 ml 10% buforowanego roztworu formaliny i inkubując przez 20 minut.
3. Umyj komórki w każdym dołku 24-dołkowej płytki jednorazowo 1 ml PBS.
4. Dodać 0,5 ml 0,1% czerwieni alizarynowej S w 0,1 mol/l Tris-HCl (pH 8,3) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30–60 minut.
5. Wyrzuć roztwór, umyj komórki w każdym dołku jednorazowo 1 ml wody destylowanej i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
6. Obserwuj i uzyskuj obrazy barwionych kolonii za pomocą kamery, aby zidentyfikować czerwone komórki S-dodatnie alizaryny.
   UWAGA: Test czerwieni S alizaryny do różnicowania MSC do dojrzałych zmineralizowanych komórek kostnych powoduje powstanie kompleksu S-wapnia czerwieni alizarynowej, który wytwarza jaskrawoczerwone zabarwienie, które można zaobserwować wizualnie.

11. Przygotowanie pożywki do różnicowania indukcji adipogennej A dla BMSC

UWAGA: Do różnicowania BMSC w adipocytach często stosuje się zestaw do różnicowania adipogennego mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy (patrz tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi.

1. Płodową surowicę bydlęcą (składnik zestawu, określaną jako surowica) umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C na co najmniej 6 godzin przed całkowitym rozmrożeniem.
2. Umieść suplement A-I (składnik zestawu) w lodówce w temperaturze 4°C co najmniej 30 minut przed przygotowaniem; umieścić suplement A-II (składnik zestawu) w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozmrożenia.
3. Odwróć lub delikatnie postukaj w probówkę z odczynnikiem, aby wymieszać zawartość.
4. Odwirować probówkę z odczynnikiem Supplement A-II o masie 300 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że odczynnik zbiera się na dnie w celu łatwego pobrania.
5. Dokładnie wyczyść zewnętrzne opakowanie wszystkich elementów 75% alkoholem medycznym i otwórz je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Dodaj serum, suplement A-I i suplement A-II do podłoża.
   UWAGA: Aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie, podgrzej podłoże podstawowe (składnik zestawu) do 37 °C, w przeciwnym razie suplement A-II może wytrącić się z powodu ekspozycji na zimno.
7. Użyj niewielkiej ilości podłoża podstawowego do przepłukania każdej butelki i probówki, upewniając się, że wszystkie składniki zostały przeniesione do podłoża podstawowego.
8. Zabezpiecz nakrętkę butelki Basal Medium i delikatnie wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać.
9. Zamknij butelkę folią parafinową, zawiń ją w folię aluminiową i oznacz nazwą, datą przygotowania i innymi szczegółami.

12. Przygotowanie pożywki do różnicowania indukcji adipogennej B dla BMSC

1. Umieścić płodową surowicę bydlęcą w lodówce o temperaturze 4 °C na co najmniej 6 godzin przed całkowitym rozmrożeniem.
2. Umieść suplement B (składnik zestawu) w lodówce o temperaturze 4 °C do czasu całkowitego rozmrożenia przez co najmniej 30 minut przed przygotowaniem.
3. Odwróć lub delikatnie postukaj w probówkę z odczynnikiem, aby wymieszać zawartość.
4. Odwirować probówkę z suplementem B, aby stężyć odczynnik na dnie w celu łatwiejszego zbierania.
5. Dokładnie wyczyść zewnętrzne opakowanie wszystkich elementów 75% alkoholem medycznym i otwórz je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Dodaj surowicę i suplement B do podłoża podstawowego.
7. Użyj niewielkiej porcji podłoża podstawowego do umycia każdej butelki i probówki, upewniając się, że wszystkie składniki są w pełni przeniesione do podłoża.
8. Zabezpiecz nakrętkę butelki Basal Medium i delikatnie wstrząśnij, aby dokładnie wymieszać.
9. Zamknij butelkę parafilmem, zawiń ją w folię aluminiową i oznacz nazwą, datą przygotowania i innymi szczegółami.

13. Różnicowanie adipocytów BMSC

1. Dodaj 1 ml 0,1% żelatyny do sześciodołkowej płytki, potrząsając nią, aby równomiernie pokryć dno każdej studzienki.
2. Umieścić sześciodołkową płytkę pokrytą 0,1% żelatyną w sterylnym kapturze lub inkubatorze_CO2 na co najmniej 30 minut.
3. Odessać żelatynę, a płytka jest gotowa do wysiewu komórek lub poczekaj, aż studzienki wyschną przed wysiewem po 30 minutach.
4. Wysiewać Bmsc P3 o gęstości 4 × 10⁴ komórek/^cm2 w każdym dołku płytki sześciodołkowej, dodając 2 ml kompletnego podłoża do każdej studzienki.
5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ z 5% CO₂ i wilgotnością nasyconą.
6. Ostrożnie odessać pożywkę i dodać 2 ml pożywki A do indukcji różnicowania adipogennego do każdej studzienki, gdy komórki osiągną 100% zbieżność.
7. Odessać pożywkę A z dołków po 3 dniach indukcji i dodać 2 ml pożywki do różnicowania adipogennego B.
8. Odessać pożywkę B po 1 dniu i przełączyć z powrotem na pożywkę A w celu dalszej indukcji.
9. Stosuj naprzemiennie pożywki A i B i codziennie obserwuj komórki. Jeśli skurcz lub śmierć komórki nastąpi podczas indukcji z pożywką A, natychmiast przełącz się na pożywkę B.
10. Powtarzaj proces indukcji i konserwacji, aż pojawi się wystarczająca liczba kropelek lipidów o odpowiedniej wielkości, a następnie przygotuj się do barwienia.

14. Barwienie czerwienią olejową O (ORO)

UWAGA: Wszystkie zabiegi należy wykonywać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć oderwania kropelek lipidów.

1. Po zakończeniu różnicowania indukcji adipogennej odessać pożywkę do różnicowania indukcji adipogennej z płytki 6-dołkowej i delikatnie przemyć 1×PBS 2–3 razy.
2. Dodaj 2 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny do dołka i utrwalaj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj roztwór roboczy Oil Red O, mieszając bulion Oil Red O z wodą destylowaną w stosunku 3:2. Po wymieszaniu odwirować przy 250 × g przez 4 minuty i użyć supernatantu.
4. Odessać utrwalacz i delikatnie przemyć PBS 2-3 razy, zapewniając dokładne usunięcie utrwalacza.
5. Dodaj 0,8 ml roztworu czerwonej plamy O do każdej studzienki, pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
6. Odessać roztwór plamy, przemyć dwukrotnie 1 ml 75% etanolu.
7. Dodaj 1 ml barwnika przeciwbarwnego hematoksyliny do każdego dołka przez 2 minuty, a następnie aspiruj.
8. Dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki i obserwuj wyniki barwienia adipogennego pod mikroskopem.
9. Uszczelnić zabarwioną płytkę sześciodołkową parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Nie przechowywać dłużej niż 1 tydzień. Kropelki lipidów mogą się łączyć, tracąc stan zabarwienia.

Results

BMSC pochodzące od myszy izolowano i hodowano przez około 2 tygodnie w celu wygenerowania BMSC trzeciego pasażu (P3) (Figura 3). Jak pokazano na rycinie 3A, komórki świeżo wyekstrahowane ze szpiku kostnego pozostały jednojądrzaste z widocznymi kropelkami tłuszczu. Komórki w kształcie wrzeciona pojawiły się w naczyniu hodowlanym, osiągając konfluencję 60%-80% w piątym^{dniu hodowli} (ryc. 3B,C...

Discussion

Terapia komórkami macierzystymi cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na jej potencjał do zrewolucjonizowania medycyny regeneracyjnej. Badania przedkliniczne dostarczyły istotnych dowodów potwierdzających kliniczne zastosowanie komórek macierzystych, w szczególności BMSC¹³. Jednak wyzwania, takie jak niska wydajność komórek, zanieczyszczenie i powolny wzrost, utrudniają ich zastosowanie kliniczne. W związku z tym istnieje pilna potrzeba badań koncentrujących się na standaryzacji procesów pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawka 1 ml (igła strzykawki 22G)	UPRZEJMA GRUPA(KDL)	60017031
1-etapowy NBT/BCIP	Pierce Biotechnology, Inc.	34042	Barwienie fosfatazą alkaliczną
10% neutralna buforowana formalina	Wexis powiedział:	5200250	Utrwalanie komórek
Płytka 6-dołkowa	Wybór laboratoryjny	11110	Hodowla komórkowa
Płytka 24-dołkowa	Wybór laboratoryjny	11310	Hodowla komórkowa
40 μ m Sitko komórkowe	Cornig powiedział:	352340	Filtracja w celu usunięcia aglomeratów
Strzykawka 50 ml	UPRZEJMA GRUPA(KDL)	60017040
75% etanol	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	31009001	Zdezynfekuj skórę myszy
Alizaryna Czerwień S	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5533	Wykrywanie złogów wapnia i zwapniałych guzków
Przeciwciało monoklonalne APC CD44 (klon: IM7)	eBionauka	17-0441-82	Cytometria przepływowa
Kontrola izotypu APC Rat IgG2b kappa (klon: eB149/10H5)	eBionauka	17-4031-82	Cytometria przepływowa
Autoklaw	Japonia Firma Hiryama	HVE-50 (wersja angielska)	Sterylizacja narzędzi chirurgicznych
Inkubator CO2	Thermo Fisher Technology (Chiny) Co., Ltd.	300583057	Hodowla komórkowa
Przepływometria Cytoflex	Beckman Coulter	A00-1-1102	Cytometria przepływowa
deksametazon	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D4902	Różnicowanie osteogenne BMSC
Naczynie (100mm)	Corning	430167	Hodowla komórkowa
Talerz (60mm)	Corning	430166	Umieszczenie próbki podczas przeszczepu
Waciki dezynfekujące	Szanghaj Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Zdezynfekuj skórę myszy
Jednorazowe sterylne rękawiczki	Szanghaj Honglong Industrial Co., Ltd	YT21131	Sterylna operacja
Podwójny lew Napromieniowana dieta gryzoni	Suzhou Shuangshi Eksperymentalna technologia pasz dla zwierząt Co., Ltd.	GB 14924.3	Pasza
Surowica bydlęca płodu	Shanghai Biosun Sci& Tech Co., Sp. z o.o.	Zobacz materiał BS-0002-500	Hodowla komórkowa
FITC Chomik Anty-Szczur CD29 (klon: Ha2/5)	BD Nauki biologiczne	555003	Cytometria przepływowa
FITC Chomik IgM, λ 1 Kontrola izotypu (klon: G235-1)	BD Nauki biologiczne	553960	Cytometria przepływowa
żelatyna (0,1%)	OriCell (OriCell)	GLT-11301 powiedział:	zwiększają zdolność adhezyjną komórek
Klatka na myszy IVC	Suzhou Monkey King Animal Sprzęt eksperymentalny Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Bariera dla zwierząt
Kwas L-askorbinowy	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy A8960	Różnicowanie osteogenne BMSC
Znakowanie pióra	Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd.	YYST5 powiedział:	Zaznacz informacje komórkowe na szalce Petriego
Modyfikacja MEM Alpha (1x)	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	SH30265	Hodowla komórkowa
Zestaw do różnicowania adipogennego komórek macierzystych szpiku kostnego myszy	Cyagen	MUXMX-90031 powiedział:	Różnicowanie adipogenne BMSC
Nikon Eclipse Ti2 Mikroskop odwrócony Synstem	Japonia Nikon Korporatin	Ti2-U	Obserwuj komórki i rób zdjęcia
Nożyczki okulistyczne	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Przetnij skórę
Pęseta okulistyczna	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Ostrze biologiczne	Uzyskaj tkankę kostną myszy.
PIPETA PASTEURA	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	Zobacz materiał BS-XG-03M	Odessać pożywkę hodowlaną
PE Rat Anti-Mouse CD31 (klon: Ha2/5)	BD Nauki biologiczne	553373	Cytometria przepływowa
PE Szczur IgG2a, κ Kontrola izotypu (klon: R35-95)	BD Nauki biologiczne	553930	Cytometria przepływowa
PE-cyjanininy7 Ly-6A/E (Sca-1) Przeciwciało monoklonalne (klon: D7)	eBionauka	25-5981-82	Cytometria przepływowa
PE-cyjaninina 7 Szczur IgG2a kappa Kontrola izotypu (klon: eBR2a)	eBionauka	25-4321-82	Cytometria przepływowa
Penicylina-Streptomycyna	Szanghaj NianYue Biotechnology Co., Ltd	2585636	Hodowla komórkowa
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (klon: Ha2/5)	BD Nauki biologiczne	561869	Cytometria przepływowa
PerCP-Cy5.5 Szczur IgG2b, κ Kontrola izotypu (klon: A95-1)	BD Nauki biologiczne	550764	Cytometria przepływowa
Skalpele	Fabryka narzędzi chirurgicznych w Szanghaju Urządzenia medyczne? Grupa?Co., Sp. z o.o.	J11010-10# JZ	Odizoluj tylne kończyny i tułów myszy oraz usuń obce tkanki z kości
Sterylny kaptur	Thermo Fisher Technology (Chiny) Co., Ltd.	ECO0.9 (klasa ECO0.9)	Stół operacyjny chirurgiczny
sterylne obłożenia chirurgiczne	Henan Huayu Sprzęt medyczny Co., Ltd.	20160900	Zapewnij sterylne miejsce operacji
Probówka (50 ml)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Przechowywać przefiltrowany roztwór komórkowy
trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco (firma Gibco)	25200056	trawić przylegające komórki
β-glicerofosforan	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5422	Różnicowanie osteogenne BMSC