Manipulowanie siłami mechanicznymi w rozwijającym się sercu danio pręgowanego za pomocą kulek magnetycznych

Summary

Ten protokół przedstawia metodę szczepienia magnetycznego koralika do rozwijającego się serca danio pręgowanego za pomocą mikrochirurgii, umożliwiając manipulowanie siłami mechanicznymi in vivo i wywołując mechaniczny, zależny od bodźca napływ wapnia do komórek wsierdzia.

Abstract

Siły mechaniczne nieustannie dostarczają informacji zwrotnych do programów morfogenetycznych zastawek serca. U danio pręgowanego rozwój zastawki serca opiera się na skurczu serca i bodźcach fizycznych generowanych przez bijące serce. Hemodynamika wewnątrzsercowa, napędzana przepływem krwi, jawi się jako podstawowa informacja kształtująca rozwój serca embrionalnego. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodę manipulowania siłami mechanicznymi in vivo poprzez przeszczepienie kulki magnetycznej o średnicy od 30 μm do 60 μm w świetle serca. Wprowadzenie kulki odbywa się za pomocą mikrochirurgii u znieczulonych larw bez zaburzania pracy serca i umożliwia sztuczną zmianę warunków brzegowych, modyfikując w ten sposób siły przepływu w układzie. W rezultacie obecność kulki wzmacnia siły mechaniczne doświadczane przez komórki wsierdzia i może bezpośrednio wywołać mechaniczny napływ wapnia zależny od bodźca. Takie podejście ułatwia badanie szlaków mechanotransdukcji, które rządzą rozwojem serca i może dostarczyć informacji na temat roli sił mechanicznych w morfogenezie zastawki serca.

Introduction

Od czasu wprowadzenia pod koniec lat siedemdziesiątych¹, danio pręgowany (Danio rerio) stał się potężnym modelowym systemem do badania zawiłości rozwoju serca i wrodzonych wad serca. W przeciwieństwie do większości kręgowców, w tym zarodków myszy i piskląt, które polegają na funkcjonalnym układzie sercowo-naczyniowym i nie mogą przetrwać wczesnych wad serca, danio pręgowany zapewnia wyjątkową przewagę, umożliwiając badanie ciężkich fenotypów serca. Wynika to z ich niewielkich rozmiarów, które ułatwiają wystarczające zaopatrzenie w tlen poprzez pasywną dyfuzję, umożliwiając przetrwanie nawet przy braku skurczu serca i aktywnego krążenia....

Protocol

Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole są zgodne z dyrektywą europejską 2010/63/UE i wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w ramach licencji na projekt PP6020928.

1. Pozyskiwanie zarodków danio pręgowanego do szczepienia koralików

1. Przekroczyć odpowiednią linię żyłki danio pręgowanego i wyhodować zarodki na pożywce Danieau w temperaturze 28,5 °C. Bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące krzyżowania linii ryb danio pręgowanego można znaleźć w bazie danych JoVE Science Education Database²⁷.
2. Traktuj zarodki 1-fenylo-2-tiomocznikiem (PTU) od 24 g....

Results

Przykłady udanego szczepienia koralików są pokazane w Rysunek 3, Wideo 3 i Wideo 4. Koralik magnetyczny został prawidłowo umieszczony w przedsionku serca danio pręgowanego, co pozwoliło na niezakłócony przepływ krwi i brak obserwowanego krwotoku. Dodatkowo, ściany serca zachowały swoją integralność strukturalną bez zapadania się (Rysunek 3 i Wideo 3). Po 24 godzinach zarodek nie wykazywał żadnych oznak obrzęku osierdzia, .......

Discussion

Krytyczne kroki w protokole i rozwiązywanie problemów

Montowanie zarodków danio pręgowanego

Ważna jest ilość agarozy użytej do zamontowania zarodków. Utworzona kopuła nie powinna być zbyt duża, ponieważ może to utrudnić manipulację koralikiem od powierzchni do zarodków. I odwrotnie, nie powinien być zbyt mały; Posiadanie wielu koralików na szczycie agarozy, umieszczonych blisko zarodków i ich żółtka, może powodować zamiesza.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Niezbędny sprzęt do hodowli, hodowli i pobierania
danio pręgowanego Naczynie ze szklanym dnem (35 mm x 15  mm)	VWR International	734-2905
Blok grzewczy	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Kleszcze jubilerskie	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont nr 5, L 4 1/4 cala,
Probówki do mikrowirówek	Eppendorf	30120094
Pipeta Pasteura
szalka		Petriego
Stereomikroskop
Odczynniki
4 mg/ml roztwór
Pożywka Danieau (60x roztwór podstawowy)
PureCube Glutation MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-fenylo-2-tiomocznik)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	16520-050
Podłoże Danieau (60x roztwór podstawowy)
34,8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1,6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5,8 g CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9,78 g MgCl2· 6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Rozpuść składniki w H2O do końcowej objętości 2 l. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH, a następnie autoklaw.
4 mg/ml roztwór podstawowy trykainy
400 mg proszku trikainy (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu)	Sigma-Aldrich	A5040
97,9 ml podwójnie destylowany H2O
2,1 ml 1 M Tris (pH 9)
Dostosować pH do 7, a następnie podwielokrotnie i przechowywać w temperaturze -20 °C.