Ten protokół przedstawia metodę szczepienia magnetycznego koralika do rozwijającego się serca danio pręgowanego za pomocą mikrochirurgii, umożliwiając manipulowanie siłami mechanicznymi in vivo i wywołując mechaniczny, zależny od bodźca napływ wapnia do komórek wsierdzia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Manipulowanie siłami mechanicznymi w rozwijającym się sercu danio pręgowanego za pomocą kulek magnetycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siły mechaniczne nieustannie dostarczają informacji zwrotnych do programów morfogenetycznych zastawek serca. U danio pręgowanego rozwój zastawki serca opiera się na skurczu serca i bodźcach fizycznych generowanych przez bijące serce. Hemodynamika wewnątrzsercowa, napędzana przepływem krwi, jawi się jako podstawowa informacja kształtująca rozwój serca embrionalnego. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodę manipulowania siłami mechanicznymi in vivo poprzez przeszczepienie kulki magnetycznej o średnicy od 30 μm do 60 μm w świetle serca. Wprowadzenie kulki odbywa się za pomocą mikrochirurgii u znieczulonych larw bez zaburzania pracy serca i umożliwia sztuczną zmianę warunków brzegowych, modyfikując w ten sposób siły przepływu w układzie. W rezultacie obecność kulki wzmacnia siły mechaniczne doświadczane przez komórki wsierdzia i może bezpośrednio wywołać mechaniczny napływ wapnia zależny od bodźca. Takie podejście ułatwia badanie szlaków mechanotransdukcji, które rządzą rozwojem serca i może dostarczyć informacji na temat roli sił mechanicznych w morfogenezie zastawki serca.
Wprowadzenie
Od czasu wprowadzenia pod koniec lat siedemdziesiątych1, danio pręgowany (Danio rerio) stał się potężnym modelowym systemem do badania zawiłości rozwoju serca i wrodzonych wad serca. W przeciwieństwie do większości kręgowców, w tym zarodków myszy i piskląt, które polegają na funkcjonalnym układzie sercowo-naczyniowym i nie mogą przetrwać wczesnych wad serca, danio pręgowany zapewnia wyjątkową przewagę, umożliwiając badanie ciężkich fenotypów serca. Wynika to z ich niewielkich rozmiarów, które ułatwiają wystarczające zaopatrzenie w tlen poprzez pasywną dyfuzję, umożliwiając przetrwanie nawet przy braku skurczu serca i aktywnego krążenia krwi2,3,4. Ponadto jedną z wielu istotnych cech danio pręgowanego jest przezroczystość optyczna ich zarodków, która umożliwia nieinwazyjne monitorowanie rozwijającego się serca5,6,7,8.
Siły mechaniczne nieustannie dostarczają informacji zwrotnej do programów morfogenetycznych zastawki serca9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, a nieprawidłowy przepływ krwi jest powszechnie uznawany za wspólny czynnik w różnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych23,24. U danio pręgowanego rozwój zastawki serca opiera się na skurczu serca i siłach mechanicznych generowanych przez bijące serce. Wiele mutantów danio pręgowanego wykazało znaczenie bodźców mechanicznych generowanych przez serce w walwurogenezie. Co ciekawe, całkowity brak skurczu serca, a co za tym idzie, przepływu krwi spowodowany mutacjami sercowej troponiny T (tnnt2) w mutantach cichego serca (sih) skutkuje brakiem konwergencji tkanek i grupowania komórek wsierdzia (EdC) we wczesnych stadiach morfogenetycznych25.
Hemodynamika wewnątrzsercowa i siły mechaniczne generowane przez przepływ krwi wyłaniają się jako podstawowe składniki epigenetyczne kształtujące rozwój embrionalnego serca danio pręgowanego. Liczne badania sugerują, że prawidłowa morfogeneza serca u danio pręgowanego wymaga wyraźnych bodźców przepływu, a odchylenia od tych wzorców fizjologicznych prowadzą do wad zastawki serca10,13,14,22,26. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodę, zaadaptowaną z Fukui et al.13, do manipulowania siłami mechanicznymi in vivo poprzez szczepienie kulki magnetycznej o średnicy od 30 μm do 60 μm w rozwijającym się bijącym sercu danio pręgowanego. Technika ta polega na mikrochirurgicznym wprowadzeniu koralika do światła serca znieczulonych larw bez zaburzania pracy serca. Obecność kulki prowadzi do wzmocnienia sił mechanicznych doświadczanych przez EdC, bezpośrednio wyzwalając mechaniczny dopływ wapnia zależny od bodźca13. Podejście to umożliwia badanie szlaków mechanotransdukcji, które regulują morfogenezę serca i oferuje środki do pogłębienia naszej wiedzy na temat roli sił mechanicznych w tworzeniu zastawek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole są zgodne z dyrektywą europejską 2010/63/UE i wytycznymi Ministerstwa Spraw Wewnętrznych w ramach licencji na projekt PP6020928.
1. Pozyskiwanie zarodków danio pręgowanego do szczepienia koralików
- Przekroczyć odpowiednią linię żyłki danio pręgowanego i wyhodować zarodki na pożywce Danieau w temperaturze 28,5 °C. Bardziej szczegółowe instrukcje dotyczące krzyżowania linii ryb danio pręgowanego można znaleźć w bazie danych JoVE Science Education Database27.
- Traktuj zarodki 1-fenylo-2-tiomocznikiem (PTU) od 24 godzin po zapłodnieniu (hpf), aby zahamować tworzenie się pigmentu, stosując stężenie 0,003% PTU w pożywce Danieau.
- Jeśli używasz linii znakowanej fluorescencyjnie, zbadaj zarodki pod stereoskopem fluorescencyjnym przed rozpoczęciem szczepienia koralików i wybierz 10-20 zdrowych zarodków, które wykazują jasną fluorescencję. Delikatnie zdechorionować wstępnie wybrane zarodki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy, upewniając się, że zarodki nie są uszkodzone.
2. Montaż zarodków danio pręgowanego
- Przygotuj 20 ml pożywki Danieau zawierającej 0,02% trikainy.
- Przygotować 2 ml porcji 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) zawierającej 0,02% tricainy w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Umieść probówki w bloku grzewczym o temperaturze 38 °C, aby utrzymać agarozę LMP w stanie ciekłym.
UWAGA: 1% agaroza LMP może być przygotowana z wyprzedzeniem do użycia w dniu montażu i szczepienia koralików. - Przenieś 3-6 zdekorionowanych zarodków na szalkę Petriego zawierającą pożywkę Danieau uzupełnioną 0,02% trikainą.
- Po znieczuleniu zarodki przenieś je do naczynia ze szklanym dnem o wymiarach 35 mm x 15 mm z minimalną ilością podłoża. Szybko dodaj 300-400 μl 1% agarozy LMP zawierającej trikainę, aby stworzyć kopułę. Za pomocą kleszczy ustaw zarodki tak, aby leżały prosto, w kontakcie ze szkłem, stroną brzuszną skierowaną do góry, jak pokazano na Rycina 1. Odczekaj ~4 min, aż agaroza stwardnieje.
UWAGA: Ilość agarozy używana do mocowania zarodków jest bardzo ważna. Celuj w kopułę o pojemności około 350 μl, która powinna zapewnić wystarczające pokrycie, pozostawiając kilka milimetrów przestrzeni nad zarodkami. Dla początkujących montowanie mniejszej liczby zarodków na raz może być bezpieczniejszym podejściem.
3. Szczepienie koralików
- Po zestaleniu się agarozy nałóż na wierzch około 0,5 μl kulek magnetycznych.
UWAGA: Użyj końcówki do pipety o pojemności 10 μl, aby przenieść kulki magnetyczne. Dokładny pomiar 0,5 μl nie jest konieczny, ponieważ kulki są silnie skoncentrowane w zawiesinie. Samo włożenie końcówki do fiolki po odwirowaniu w dół wystarczy, aby zebrać odpowiednią ilość kulek. - Dodaj kroplę pożywki Danieau zawierającej 0,02% tricainy na wierzch agarozy i koralików.
- Wybierz odpowiedni koralik.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie. Rozmiar koralików może się nieznacznie różnić, od 30 μm do 60 μm średnicy, dlatego wybór odpowiedniego koralika na oko, na podstawie próbki i wielkości serca, jest niezbędny. - Po wybraniu odpowiedniego koralika użyj pęsety, aby umieścić go na wierzchu żółtka (Rysunek 2A i Wideo 1).
- Stwórz zmianę żółtka lub "dziurę" w środku żółtka za pomocą jednego ramienia pęsety (Rysunek 2B i Wideo 2).
UWAGA: Głębokość zmiany nie powinna wnikać zbyt głęboko w żółtko; Powinien znajdować się w przybliżeniu na poziomie żyły kardynalnej. Średnica utworzonego otworu będzie odpowiadać końcówce ramienia pęsety. Upewnij się, że zmiana została wykonana w żółtku i unikaj kontaktu z żyłami kardynalnymi, celując poniżej nich. Niewielka ilość żółtka zwykle wypływa po utworzeniu. - Umieść koralik w zmianie utworzonej w kroku 3.5 i delikatnie popchnij go do przodu, aż dotrze do bieguna żylnego. Tam skurcze serca spowodują ssanie, wciągając koralik do światła serca (Rysunek 2 i Wideo 2).
UWAGA: Ściana żylna zostaje naruszona podczas wprowadzania koralików, a wysoka gęstość żółtka pomaga zminimalizować rozległe krwawienie. Zmiana żółtkowa zwykle goi się w ciągu kilku minut po wprowadzeniu koralików. Niektóre zarodki mogą wykazywać obrzęk osierdzia 20-24 godziny po przeszczepieniu koralików.
4. Odmontowywanie zarodków danio pręgowanego
- Po zaszczepieniu kulek magnetycznych we wszystkich zamontowanych zarodkach, dodaj 1-2 ml pożywki Danieau zawierającej PTU do naczynia ze szklanym dnem.
- Za pomocą pęsety delikatnie rozbij agarozę LMP i ostrożnie wyjmij rybę, upewniając się, że nie pozostała na niej agaroza.
- Za pomocą pipety Pasteura przenieść zarodki na nową szalkę Petriego zawierającą pożywkę Danieau z PTU i pozwolić im dojść do siebie i rozwinąć się w temperaturze 28,5 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykłady udanego przeszczepienia kulek przedstawiono na Rycynie 3, w Wideo 3 oraz Wideo 4. Kulka magnetyczna została prawidłowo umieszczona w przedsionku serca danio pręgowanego, co pozwoliło na swobodny przepływ krwi i nie spowodowało wystąpienia krwotoku. Ponadto ściany serca zachowały swoją integralność strukturalną, nie ulegając zapadnięciu (Rycina 3 i Wideo 3). Po 24 h w embrionie nie zaobserwowano oznak o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne kroki w protokole i rozwiązywanie problemów
Montowanie zarodków danio pręgowanego
Ważna jest ilość agarozy użytej do zamontowania zarodków. Utworzona kopuła nie powinna być zbyt duża, ponieważ może to utrudnić manipulację koralikiem od powierzchni do zarodków. I odwrotnie, nie powinien być zbyt mały; Posiadanie wielu koralików na szczycie agarozy, umieszczonych blisko zarodków i ich żółtka, może powodować zamiesza...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Vermot za dyskusje i komentarze na temat protokołu. Jesteśmy wdzięczni wszystkim pracownikom zakładu rybackiego Imperial College London. Projekt ten otrzymał dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020: GA N°682939, Additional Ventures (numer nagrody 1019496), MRC (MR/X019837/1) oraz BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P było wspierane przez stypendium Wydziału Bioinżynierii (Imperial College London). HF był wspierany przez JSPS KAKENHI (23H04726 i 24K02207), program JST FOREST (23719210), Uehara Memorial Foundation, Cell Science Research Foundation, Takeda Medical Research Foundation oraz Novartis Research Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Niezbędny sprzęt do hodowli, hodowli i pobierania | |||
| danio pręgowanego Naczynie ze szklanym dnem (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Blok grzewczy | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Kleszcze jubilerskie | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont nr 5, L 4 1/4 cala, |
| Probówki do mikrowirówek | Eppendorf | 30120094 | |
| Pipeta Pasteura | |||
| szalka | Petriego | ||
| Stereomikroskop | |||
| Odczynniki | |||
| 4 mg/ml roztwór | |||
| Pożywka Danieau (60x roztwór podstawowy) | |||
| PureCube Glutation MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenylo-2-tiomocznik) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Invitrogen | 16520-050 | |
| Podłoże Danieau (60x roztwór podstawowy) | |||
| 34,8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9,78 g MgCl2· 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Rozpuść składniki w H2O do końcowej objętości 2 l. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH, a następnie autoklaw. | |||
| 4 mg/ml roztwór podstawowy trykainy | |||
| 400 mg proszku trikainy (sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 ml podwójnie destylowany H2O | |||
| 2,1 ml 1 M Tris (pH 9) | |||
| Dostosować pH do 7, a następnie podwielokrotnie i przechowywać w temperaturze -20 °C. |
Bibliografia
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
- Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
- Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
- Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
- Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
- Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
- Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
- Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
- Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
- Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
- Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
- Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
- da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
- Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
- Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
- Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
