Artykuł metodologiczny

Ocena sygnalizacji śmierci komórki za pomocą immunofluorescencji w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Modele in vivo szczurów są niezbędnymi narzędziami do badania mechanizmów patologicznych i celów terapeutycznych dla udaru niedokrwiennego. W niniejszej pracy opisano wykonywanie barwienia immunofluorescencyjnego w wycinkach mózgu z zawałem po zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u szczurów.

Streszczenie

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Większość przypadków udaru ma charakter niedokrwienny i wynika z niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCA). Obecne podejścia farmakologiczne w leczeniu udaru niedokrwiennego są ograniczone; Dlatego pilnie potrzebne są nowatorskie terapie zapewniające skuteczną neuroochronę przed uszkodzeniem niedokrwiennym po udarze. W tkance mózgowej po udarze niedokrwiennym obszar półcienia niedokrwiennego jest możliwy do uratowania, ale istnieje ryzyko progresji do nieodwracalnego uszkodzenia. Obszar półcienia otaczający rdzeń po zawale jest koncepcyjnym celem neuroprotekcji. Ponieważ przepływ krwi jest częściowo utrzymany w obszarze półcienia, komórki neuronalne i nieneuronalne w tym obszarze przejściowo przeżywają po udarze, a te komórki, które są nadal żywe, mogą zostać uratowane przez odpowiednie interwencje medyczne. Zrozumienie patofizjologii półcienia jest ważne w rozwoju terapii neuroprotekcyjnych, ponieważ szlaki śmierci komórkowej aktywowane w niedokrwiennym półcieniu mogą wskazywać na cele terapeutyczne, takie jak RUNX1 i katepsyny. Te cele białkowe funkcjonujące jako mediatory zaprogramowanej śmierci komórki mogą być dalej wykorzystywane w badaniach translacyjnych. O umiarkowanych rozmiarach i podobieństwie do ludzkiego mózgu, szczurzy model okluzji MCA in vivo (MCAO) naśladuje ludzki udar niedokrwienny i oferuje odpowiednie narzędzie do badania patologii półcienia, badania sygnalizacji śmierci komórki i oceny skutków potencjalnych celów w kontekście MCAO. Tutaj opisujemy, jak indukować MCAO u szczurów i jak wykonywać barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia sygnalizacji śmierci komórki w mózgu szczura po MCAO.

Wprowadzenie

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie1. Wysoka śmiertelność i zachorowalność na udar mózgu powodują ogromne obciążenie publicznej opieki zdrowotnej i poważne konsekwencje społeczno-gospodarcze. Chociaż częstość występowania i umieralność z powodu udaru mózgu pozostają stabilne, liczba pacjentów z udarem mózgu i zgonów związanych z udarem rośnie z biegiem dziesięcioleci2,3. Udary można sklasyfikować jako niedokrwienne lub krwotoczne. Większość przypadków udarów to udary niedokrwienne spowodowane niedrożnością głównej tętnicy mózgowej4. Do tej pory tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest jedynym zatwierdzonym przez FDA lekiem na udar niedokrwienny, ale jego zastosowanie jest mocno ograniczone przez wąskie okno terapeutyczne, powikłania i przeciwwskazania5,6,7. W związku z tym pilne jest opracowanie nowych opcji leczenia z szerszym oknem terapeutycznym w celu złagodzenia skutków udaru.

Eksperymentalne modele zwierzęce są użytecznymi narzędziami do badania patofizjologii udaru niedokrwiennego. U większości pacjentów udar niedokrwienny mózgu jest spowodowany zablokowaniem środkowej tętnicy mózgowej (MCA)8. W związku z tym opracowano modele niedrożności tętnic środkowych mózgu (MCAO) gryzoni, które przypominają zawał mózgu u ludzi. Chociaż istnieje kilka podejść MCAO, które są stosowane w badaniach na małych zwierzętach, najczęściej stosowaną metodą jest model szwu śródświetlnego, który polega na wprowadzeniu nylonowego włókna do środkowej tętnicy mózgowej z tętnic szyjnych zewnętrznych lub wewnętrznych, co powoduje przejściowe lub trwałe zamknięcie przepływu krwi4,9. Model ten prowadzi do dużej objętości zawału mózgu i umożliwia badanie sygnalizacji śmierci komórki w tkance mózgowej zawału za pomocą technik immunofluorescencyjnych.

Obszar otaczający rdzeń po zawale, określany jako półcień, jest celem potencjalnych terapii udarowych10,11. Ponieważ przepływ krwi w półcieniu jest częściowo utrzymany, uszkodzone neurony i komórki nieneuronalne w tym obszarze można uratować poprzez hamowanie aktywacji sygnalizacji śmierci komórki. Celowanie w szlaki śmierci komórkowej może być obiecującą strategią neuroprotekcji po udarze12. Dlatego ocena sygnalizacji śmierci komórki ma kluczowe znaczenie dla eksperymentalnych badań nad udarem. Ostatnio wykazano, że katepsyna-B, proteaza lizosomalna, odgrywa rolę w pośredniczeniu w programowanej śmierci komórki po udarze mózgu i zyskała znaczną uwagę w dziedzinie neurologicznej13. Katepsyna-B stanowi potencjalny cel dla neuroprotekcji, który zasługuje na dalsze badania.

Ten artykuł pokazuje, jak wywołać MCAO za pomocą metody szwu śródświetlnego u szczurów. Pokazujemy również, jak wykonać barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazaliowego (TTC) w celu określenia wielkości zawału i wykrycia komórek apoptotycznych za pomocą barwienia końcowym deoksynukleotydylotransferazą dUTP (TUNEL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół i opisane tutaj eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Uniwersytetu Syczuańskiego. Opieka nad zwierzętami i ich wykorzystywanie były zgodne z lokalnymi i międzynarodowymi kryteriami etycznymi.

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano dorosłe samce szczurów rasy Sprague-Dawley o wadze 250-280 g. Szczury były trzymane w standardowych warunkach środowiskowych (temperatura 20-22 °C, 12 godzin cyklu światła/ciemności), karmione standardową dietą dla szczurów i wodą o wysokiej czystości. Zabieg chirurgiczny został przeprowadzony w sterylnych warunkach.

1. Model szczura MCAO

  1. Wywołać znieczulenie początkowe za pomocą 4% izofluranu z tlenem w dawce 1 l/min. Monitorować głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia stopy. Podczas znieczulenia należy podać maść do oka, aby zapobiec wysuszeniu. Wstrzyknąć szczurowi 1 ml soli fizjologicznej podskórnie w celu uzupełnienia objętości oraz 5 mg/kg karprofenu i 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia przedoperacyjnego. Izofluran należy początkowo zmniejszać do 3,5%, a następnie stopniowo do 2% przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Umieść szczura w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 36,5 ± 0,1 °C na regulowanej macie grzewczej z sondą monitorującą temperaturę doodbytniczą. Ogol i zdezynfekuj skórę szyi roztworem dezynfekującym jodofor.
  3. Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej szyi i cofnij tkanki miękkie, aby odsłonić naczynia szyjne. Użyj kleszczy, aby wyizolować prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA).
  4. Użyj szwów, aby podwiązać proksymalne prawe CCA i zacisnąć prawe ICA i ECA za pomocą mikroklipsa na ich początku.
  5. Włóż nylonową żyłkę pokrytą okrągłą silikonową końcówką do światła CCA przez małe nacięcie i zawiąż węzeł w CCA, aby zapobiec krwawieniu i przemieszczaniu się nylonowej żyłki.
  6. Otwórz prawy mikroklips ICA i włóż nylonową żyłkę do prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA) przez kikut ICA, aż silikonowa końcówka zatka początek MCA (~18-20 mm).
  7. Odetnij odsłoniętą część nylonowej żyłki i zamknij nacięcie linii środkowej szyi.
  8. Po 2 godzinach okluzji MCA otwórz nacięcie szyi i rozwiąż węzeł w CCA. Następnie wyjmij nylonową żyłkę, aby ponownie stopić MCA. Podwiązać dystalną prawą CCA i zamknąć nacięcie szyi szwami ciągłymi lub przerywanymi.
  9. Po operacji buprenorfinę podaje się we wstrzyknięciu podskórnym co 8 godzin, w dawce 0,03 mg/kg. Obserwuj szczury przez cały okres rekonwalescencji po znieczuleniu w ogrzewanej klatce z matą grzewczą o regulowanej temperaturze. Aby zachęcić do jedzenia, umieść w klatce szalkę Petriego z puree z paszy. Trzymaj jednego szczura w klatce po operacji.
  10. Poddać szczury pozorowane tej samej procedurze bez wprowadzania żyłki.
    UWAGA: W sumie 9 zwierząt jest używanych w każdej grupie do pomiaru wielkości zawału (n = 3), analizy immunofluorescencyjnej (n = 3) i wykrywania apoptozy (n = 3).
  11. Oceń funkcje neurologiczne po 2 godzinach od MCAO i 22 godziny po reperfuzji za pomocą skali oceny behawioralnej Zea-Longa ze skalą 0-5 punktów14. Wyklucz stawki z wynikiem 0 lub 4.

2. Pomiar wielkości zawału (Rysunek 1)

  1. Złóż szczury w ofierze w głębokim znieczuleniu (4% izofluranu) za pomocą gilotyny i ostrożnie odizoluj cały mózg od czaszki.
  2. Zamrozić mózg w temperaturze -20 °C na 20 minut i pokroić zamrożony mózg na sześć plasterków koronalnych z zachowaniem odległości 2 mm między plasterkami. Plamić plastry mózgu 2% TTC przez 15 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
  3. Utrwal plastry mózgu 4% paraformaldehydem przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Sfotografuj poplamione plasterki aparatem cyfrowym, z ustawieniem trybu automatycznego dla obiektów z bliska.
  4. Przenieś zdjęcia do komputera i zmierz rozmiar zawału za pomocą ImageJ. Przedstaw rozmiar zawału jako stosunek sumy obszaru zawału w 6 plasterkach do sumy całego obszaru mózgu w tych samych wycinkach. Wyraż dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).

3. Analiza immunofluorescencyjna kriosekcji mózgu (Rysunek 2)

  1. Wywołać znieczulenie za pomocą 4% izofluranu i 1 l/min tlenu. Naciąć skórę i tkankę podskórną, aby odsłonić serce.
  2. Usuń osierdzie i wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Przelej 200 ml soli fizjologicznej przez lewą komorę, a następnie 200 ml 4% paraformaldehydu.
  3. Otwórz czaszkę i usuń nienaruszony mózg.
  4. Utrwal mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez ponad 24 godziny. Następnie odwodnić go w serii gradientów roztworu sacharozy o stężeniach 10%, 15% i 30%, aż tkanka opadnie, około 6-8 godzin dla każdego stężenia.
  5. Osadź mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i usuń pęcherzyki powietrza, jeśli takie istnieją. Następnie zamroź mózg w ciekłym azocie i przechowuj go w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  6. Podzielić mózg na sekcje za pomocą kriostatu o grubości 5 μm. Podczas przekroju upewnić się, że temperatura w komorze utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C. Oznacz miejsce cięcia w oparciu o miejsce modelu i warunki eksperymentalne. Przechowuj sekcje w zamrażarce.
  7. Pozwól, aby zamrożone skrawki zrównoważyły się w temperaturze pokojowej przez ~ 30 minut, aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne. Następnie namocz skrawki sterylnym PBS 3x przez 5 minut każda.
  8. Obrysuj tkankę pisakiem immunohistochemicznym. Inkubować z 20 μg/ml proteinazy K (bez RNazy) i 0,3% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Namocz skrawki sterylnym PBS 3x przez 5 minut każda. Nałożyć 3% BSA na zarysowaną tkankę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w celu zablokowania.
  10. Po zablokowaniu usunąć roztwór, dodać odpowiednie przeciwciało pierwszorzędowe (rekombinowane przeciwciało monoklonalne katepsyny-B królika, 1:200) i inkubować skrawki przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C.
  11. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć skrawki sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 3x przez 5 minut każda.
  12. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-szczurze IgG [H+L] [sprzężone z FITC], 1:200) z wymaganym fluoroforem i inkubować skrawki w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc je przed światłem.
  13. Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć skrawki sterylnym PBS zawierającym 0,1% Tween-20 3x przez 5 min każda. Zabejcuj sekcje medium montażowym zawierającym DAPI i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.
  14. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z następującymi ustawieniami: długość fali wzbudzenia 488 nm, długość fali emisji 520 nm i czas naświetlania 500 ms. Przechowuj skrawki w ciemności w temperaturze 4 °C w celu długotrwałej konserwacji.

4. Wykrywanie apoptozy za pomocą barwienia TUNEL (Rysunek 3)

UWAGA: Komercyjny zestaw testowy TUNEL jest używany do barwienia TUNEL. Ten zestaw TUNEL zawiera roztwór roboczy buforu DNazy I, bufor równoważący deoksynukleotydylotransferazę (TdT), roztwór roboczy do znakowania i roztwór roboczy DAPI.

  1. Perfuzja i izolacja mózgu przy użyciu tej samej procedury, co powyżej (kroki 3.2-3.3). Zanurz mózg w 4% paraformaldehydzie na 3-4 godziny w celu utrwalenia.
  2. Pokrój mózg na plastry koronalne o grubości około 2 mm, zaczynając od końca rostralnego do końca ogonowego, i zanurz w 4% paraformaldehydzie na dodatkowe 12 godzin. Po utrwaleniu umyj plastry mózgu pod bieżącą wodą przez 1 godzinę.
  3. Zanurz plastry mózgu w roztworach etanolu o stężeniach 50%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100% kolejno na 35-50 minut każdy w celu odwodnienia.
  4. Traktuj wycinki mózgu przezroczystym czynnikiem biologicznym I typu TO przez 35-50 minut, a następnie środkiem czyszczącym II przez 35-50 minut, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta.
  5. Zanurz plastry mózgu kolejno w pożywce do zatapiania I na 60 minut, w pożywce II na 60 minut, na 60 minut, a na 60 minut.
  6. Umieść plastry mózgu w kasecie do osadzania. Zamknij kasetę, wyraźnie ją oznacz i umieść w chłodni w celu zestalenia.
  7. Ustaw mikrotom na początkową grubość 10 μm, aby przyciąć blok tkanki. Następnie dostosuj grubość do 5 μm do krojenia.
  8. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 45 °C, unieść skrawki tkanek na powierzchni wody i podnieść je na szkiełka. Po około 30 s wyjmij szkiełka, wysusz je w temperaturze pokojowej i przechowuj w suszarce.
  9. Odparafinować zmagazynowane fragmenty mózgu, zanurzając je w środku czyszczącym na 2 cykle po 10 minut każdy.
  10. Aby nawodnić sekcje, namocz je w bezwodnym etanolu na 5 minut, powtarzając 3 razy. Przenieś sekcje do 90% etanolu na 3 min. Następnie namocz skrawki w 80% etanolu przez 3 minuty. Na koniec zanurz sekcje w 70% etanolu na 3 minuty.
  11. Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda. Delikatnie usuń nadmiar wilgoci za pomocą bibuły filtracyjnej.
  12. Do każdej próbki należy podać 100 μl 1x roztworu roboczego proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Po przepuszczalności płukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.
  13. Przygotować próbki do kontroli dodatniej.
    1. Dodać 100 μl 1x roztwór roboczy buforu DNazy I (zestaw do oznaczania TUNEL) do permeabilizowanej próbki i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ostrożnie usunąć nadmiar płynu z próbki za pomocą bibuły chłonnej.
    2. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu roboczego DNazy I (200 U/ml) do próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10-30 min. Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 min każda.
  14. Przygotować próbki do kontroli ujemnej.
    1. Nałożyć 100 μl 1x roztworu roboczego buforu DNazy I na przefiltrowaną próbkę i równoważyć w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Inkubować ujemną próbkę kontrolną z buforem DNazy I w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut, upewniając się, że nie dodano enzymu DNazy I. Przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.
  15. Do każdej próbki nanieść 100 μl końcowego buforu równoważącego deoksynukleotydylotransferazę (TdT) (zestaw do oznaczania TUNEL) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 10-30 minut. Następnie usuń bufor równowagi TdT za pomocą papieru chłonnego.
  16. Do każdej próbki dodać 50 μl roztworu roboczego do znakowania (zestaw do oznaczania TUNEL), a następnie inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej, ciemnej komorze przez 60 minut. Jeśli intensywność sygnału jest niska, rozważ wydłużenie czasu reakcji znakowania DNA. Następnie przepłukać próbki w PBS 3x przez 5 minut każda.
  17. Po osuszeniu nadmiaru wilgoci nanieść roztwór roboczy DAPI (zestaw do oznaczania TUNEL) i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 5 minut, aby przeciwdziałać barwieniu jąder. Następnie przepłukać próbki w PBS 4x przez 5 minut każda. Usuń nadmiar płynu papierem chłonnym i uszczelnij szkiełka za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.
  18. Zeskanuj zabarwione szkiełka za pomocą systemu obrazowania multispektralnego Vectra Polaris i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania systemowego.

5. Analiza statystyczna

  1. Przedstaw wyniki eksperymentu jako środki ± SEM i przeanalizuj dane za pomocą testu t Studenta dla porównań dwóch grup za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 10 (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Ustaw wartość p mniejszą niż 0,05 jako różnicę statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szczury są poddawane 120-minutowemu niedokrwieniu podczas MCAO, po którym następuje 22-godzinna reperfuzja. Śmiertelność była minimalna podczas operacji MCAO i wynosiła około 25% w okresie reperfuzji. Znaczne uszkodzenie mózgu zaobserwowano w grupie MCAO, podczas gdy zawału nie zaobserwowano w mózgu w grupie Sham (24,87 ± 1,21% vs. 0% suma powierzchni zawału do całego obszaru mózgu; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0,001; Rysunek 1A,B). W grupie MCAO immunoreaktywność ka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niedrożność tętnicy mózgowej prowadzi do pozbawienia tlenu i składników odżywczych, a następnie do aktywacji reaktywnych form tlenu, wewnątrzkomórkowego przeciążenia wapniem, uwalniania glutaminianu i indukcji reakcji zapalnych15. Ta seria zdarzeń powoduje śmierć komórki i nieodwracalne uszkodzenie tkanek w mózgu po zawale. Półcień można potencjalnie uratować poprzez interwencję medyczną w odpowiednim oknie terapeutycznym16. Jedynym zatwierdzonym sposobem leczenia udaru nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Simiao Wu był wspierany przez Departament Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (2024YFHZ0330) oraz Szpital Zachodniochiński Uniwersytetu Syczuan. Weihong Był wspierany przez Departament Nauki i Technologii prowincji Syczuan (2023YFS0297) oraz Uniwersytet Syczuański. Dziękujemy Yi Zhangowi i Yue Li z Głównego Ośrodka Badawczego Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Syczuańskiego za ich wsparcie techniczne w zakresie obrazowania i analizy TUNEL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/ASystem obrazowania wielospektralnego Vectra Polaris 
Bezwodny etanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.
BuprenorfinySzpital w Chinach ZachodnichNie dotyczy
KarprofenSzpital w Chinach ZachodnichNie
Przeciwciało katepsyny-BAbcam Ab214428
KriostatLEICA LEICA CM 1950
Aparat cyfrowyOLYMPUSTG-7
Goat Anti-Rat IgG (H+L) (sprzężony z FITC)Elabscience  E-AB-1021
Surowica koziaSolarbioSL038
Oprogramowanie GraphPad Prism 10Nie dotyczyhttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJNie dotyczyhttps://imagej.net/ij/
długopis immunohistochemicznyBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
Oprogramowanie InFormOprogramowanie systemowe Akoya Biosciencesw wersji 2.6.0dla systemu obrazowania wielospektralnego 
Roztwór dezynfekujący JodophorHuatian Technology Industry Co.Nie dotyczy
IsofluraneRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Podłoże montażowe zawierające monofilament nylonowy DAPISolarbioS2110
RWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optymalna temperatura skrawania (OCT)EprediaN/A
Roztwór buforowy fosforanu (PBS)SolarbioN/A
Prism GraphPad Wersja 10
ProteinazaK TiangenRT403-02
SalineKelun Co.Nie dotyczy
szczurów Sprague-DawleyHuafukang Co.Nie dotyczy
SacharozyBioFroxx1245GR500
Narzędzia chirurgiczneRWD Life Science Co.Nie dotyczy
Przezroczysty czynnik biologiczny   Beijing Solarbio Nauka & Tecnology Co., Sp. z o.o.http://www.solarbio.net/
Roztwór chlorku trifenylotetrazolu (TTC)SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
Zestaw TUNELElabscience  E-CK-A321
Nie dotyczy dotyczy Paraformaldehyd Biosharp N/A

Bibliografia

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie immunofluorescencyjneszczurzy model udaruzamkni cie t tnicy rodkowej m zguneuroprotekcja penumbryekspresja katepsyny Bbarwienie TUNELdetekcja apoptozyanaliza tkanki m zgowej

Powiązane artykuły