Artykuł metodologiczny

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67617

⸱

14 lutego 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Streszczenie

Trwałość antybiotyku to zjawisko, w którym niewielka liczba komórek bakteryjnych w genetycznie podatnej populacji przeżywa antybiotykoterapię, która zabija inne genetycznie identyczne komórki. Bakterie trwałe mogą wznowić replikację po zakończeniu leczenia antybiotykami i powszechnie uważa się, że leżą one u podstaw niepowodzenia klinicznego leczenia. Niedawne prace wykorzystujące moc poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej, w której bakterie są znakowane fluorescencyjnymi reporterami transkrypcyjnymi, reporterami translacyjnymi i/lub barwnikami dla różnych cech komórkowych, poszerzyły naszą wiedzę na temat Escherichia coli uporczywość wykraczająca poza to, czego można się dowiedzieć z testów przeżycia antybiotyków na poziomie populacji. Takie podejścia jednokomórkowe, a nie masowe testy populacji, są niezbędne do nakreślenia mechanizmów tworzenia się przetrwałych, odpowiedzi na uszkodzenia i przeżycia. Jednak metody badania przetrwałości innych ważnych gatunków chorobotwórczych na tym poziomie szczegółowości pozostają ograniczone.

To badanie dostarcza elastycznego podejścia do obrazowania poklatkowego Pseudomonas aeruginosa (pałeczki Gram-ujemnej) i Staphylococcus aureus (gram-dodatniego ziarniaka) podczas antybiotykoterapii i rekonwalescencji. Omawiamy podejścia genetyki molekularnej do wprowadzania reporterów fluorescencyjnych do tych bakterii. Za pomocą tych reporterów, a także barwników, możemy śledzić zmiany fenotypowe, cechy morfologiczne i losy poszczególnych komórek w odpowiedzi na leczenie antybiotykami. Dodatkowo jesteśmy w stanie obserwować fenotypy poszczególnych osób utrzymujących się w trakcie reanimacji po leczeniu. Ogólnie rzecz biorąc, praca ta służy jako źródło informacji dla osób zainteresowanych śledzeniem przeżycia i ekspresji genów poszczególnych komórek leczonych antybiotykami, w tym osób utrzymujących się, zarówno w trakcie, jak i po leczeniu, w klinicznie ważnych patogenach.

Wprowadzenie

Patogeny bakteryjne mogą unikać działania antybiotyków poprzez dwa podstawowe mechanizmy: oporność na antybiotyki, która obejmuje zmiany genetyczne, oraz tolerancję fenotypową, która obejmuje zmiany niegenetyczne. Oporność na antybiotyki jest genetycznie zakodowanym zjawiskiem, które nadaje danej komórce bakteryjnej zdolność nie tylko do przetrwania, ale także do replikacji w obecności antybiotyku1. Tolerancja fenotypowa, która może obejmować bakterie tolerujące antybiotyki lub oporne na antybiotyki, występuje, gdy komórki wytrzymują bakteriobójcze leczenie antybiotykami, nie uzyskując zdolności do replikacji w obecności hamującego stężenia antybiotyku1,2. To, co odróżnia tolerancję od wytrwałości, to fakt, że tolerancja odnosi się do zdolności całej populacji do przeżycia leczenia, podczas gdy wytrwałość odnosi się do podzbioru izogenicznej, ale fenotypowo heterogenicznej populacji, która przeżywa leczenie antybiotykami. Kiedy hodowla klonalna jest traktowana antybiotykami bakteriobójczymi, a osoby, które przeżyły, które pozostają w kulturze, są wykreślane w czasie w skali logarytmiczno-liniowej, krzywa dwufazowa jest zwykle wykrywana, gdy obecne są osoby trwałe. Na tych krzywych pierwsza faza pokazuje, że większość populacji jest zabijana stosunkowo szybko, a druga faza wskazuje, że trwała frakcja antybiotyku jest zabijana w wolniejszym tempie lub wcale1,2.

Utrzymywanie się antybiotyków stanowi poważne obciążenie dla globalnych systemów opieki zdrowotnej. Na przykład uważa się, że utrzymujące się Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, na których skupia się ten artykuł, powodują infekcje oporne na antybiotyki, w tym nawracające infekcje dróg oddechowych u pacjentów z mukowiscydozą i przewlekłymi infekcjami ran3,4. Dlatego kluczowe znaczenie ma dalsze wyjaśnienie biologii komórek trwałych i programów fenotypowych. Chociaż poczyniono postępy w zrozumieniu, w jaki sposób przetrwały organizmy powstają i reanimują, nadal istnieją krytyczne luki w wiedzy dotyczącej koordynacji przeprogramowania metabolicznego i zdarzeń molekularnych w poszczególnych komórkach, które leżą u podstaw trwałości5,6,7,8.

Skuteczne badanie wytrwałości okazało się wyzwaniem technicznym. Ponieważ trwałość jest obserwowalna tylko w niewielkim podzbiorze populacji bakterii, techniki pobierania próbek z dużych populacji bakterii często nie są w stanie uchwycić istotnych informacji biologicznych1,2,8,9,10. Ponadto, ponieważ zmiany fenotypowe, które leżą u podstaw trwałości, są przejściowe i nie są dziedziczne, śledzenie losu komórek trwałych może być złożone1,8,9,10,11. Gdy bakterie trwałe wznowią wzrost, mogą się dzielić i dać początek zarówno trwałym, jak i nietrwałym, co uniemożliwia wzbogacenie populacji czystych przetrwałych przez hodowlę. Wyzwania te podkreślają zapotrzebowanie na techniki, które mogą spełniać następujące kryteria: 1) zdolność do przechwytywania informacji biologicznych o żywych, pojedynczych komórkach oraz 2) zdolność do stosowania w połączeniu z barwnikami fluorescencyjnymi, sondami, czujnikami i reporterami, które umożliwiają badanie fenotypów pojedynczych komórek w heterogenicznych populacjach w czasie.

Ostatnie osiągnięcia w technologiach jednokomórkowych umożliwiły skuteczne badanie niejednorodności bakterii i pokonanie tych przeszkód w badaniu trwałości12,13. Niektóre z tych technik obejmują mikroskopię fluorescencyjną, cytometrię przepływową/sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, mikrofluidykę i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki12,13. W tym miejscu opisujemy protokoły wyjaśniające fizjologię przetrwałości pojedynczej komórki za pomocą epifluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej transkrypcyjnych lub translacyjnych szczepów reporterowych. Mikroskopia fluorescencyjna jest potężną techniką, która spełnia kryteria badania fenotypów trwałych, a mianowicie zdolność do określenia, które pojedyncze komórki w dużej populacji rozmnażają się po usunięciu antybiotyku, a zatem można je zdefiniować jako trwałe. Wraz z wprowadzeniem technologii zautomatyzowanych kamer i komór inkubacyjnych, wychwytywanie żywych komórek bakteryjnych jest szeroko dostępne w całej dziedzinie mikrobiologii. Co najważniejsze, mikroskopia poklatkowa oferuje możliwość wizualizacji pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym, w ciągu godzin, a nawet dni, co umożliwia śledzenie bakterii przed, w trakcie i po antybiotykoterapii14,15,16. Wnioski z tych badań, wykorzystujące mikroskopię poklatkową, mają ogromny potencjał, aby uzyskać wgląd w złożone mechanizmy biologii przetrwałych.

Protokół

1. Generowanie fluorescencyjnych szczepów reporterowych S. aureus poprzez transformację i transdukcję

UWAGA: Szczepy reporterowe zawierają białko fluorescencyjne, które wskazuje na ekspresję interesującego genu lub białka. Reportery transkrypcyjne zawierają zduplikowaną kopię natywnej sekwencji promotora dla genu będącego przedmiotem zainteresowania przed białkiem fluorescencyjnym, dzięki czemu fluorescencja wzrasta wraz ze wzrostem ekspresji interesującego genu. Reporterzy translacyjni łączą otwarte ramki odczytu białka fluorescencyjnego i białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą elastycznego łącznika peptydowego. Wizualizacja szczepów reporterowych za pomocą mikroskopii żywych komórek może ujawnić, czy dany gen/białko będące przedmiotem zainteresowania jest związany z określonymi morfologiami komórek lub losami komórek (Rysunek 1, Dodatkowe wideo 1 i Dodatkowe wideo 2). Wybierz białko fluorescencyjne, które jest zoptymalizowane pod kątem kodonów dla S. aureus. Podczas gdy w tym badaniu wykorzystano sGFP z pCM29 podarowany przez dr Alexandra Horswilla, zestaw narzędzi genetycznych Nebraska Transposon Mutant Library zawiera plazmidy zawierające zoptymalizowane pod kątem kodonów sGFP, eYFP, eCFP, DsRed.T3 i eqFP65017,18.

  1. Przekształć plazmidy reporterowe w S. aureus RN4220.
    UWAGA: Poniższa sekcja protokołu została zaadaptowana z warsztatów Podstawy genetyki i metabolizmu gronkowcowego w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Nebrasce19,20.
    1. Najpierw przygotuj elektrokompetentny S. aureus RN4220. Przygotuj 200 ml bulionu B2, łącząc 2 g casaminokwasów, 5 g ekstraktu drożdżowego, 2 ml 10% K2HPO4, pH 7,5, 2 ml 50% roztworu glukozy i 5 g NaCl. Doprowadzić objętość do 100 ml sterylną ultraczystą wodą. Krótko wymieszać w temperaturze 37 °C w celu rozpuszczenia składników i wysterylizować za pomocą filtra butelkowego (wielkość porów 0,22 μm).
    2. Inokulować S. aureus RN4220 z zamrożonego bulionu przechowywanego w temperaturze -80 °C w 25% glicerolu w 30 ml bulionu B2 w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml i inkubować przez 18 godzin w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 125 obr./min.
    3. Inkubować dwie kolby z przegrodami o pojemności 250 ml z 50 ml bulionu B2 każda w temperaturze 37 °C przez noc, aby wstępnie ogrzać pożywkę na następny dzień.
    4. Następnego dnia zmierz OD600 w nocnej hodowli. Dodaj wystarczającą ilość kultury na noc do każdej kolby zawierającej 50 ml bulionu B2, aby uzyskać końcowy OD600 0,25.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,35-0,4,
      UWAGA: Sprawdź OD600 około 30 minut po subkulturze, aby upewnić się, że kultura nie rośnie powyżej 0,35-0,4. Jeśli OD600 nie osiągnie 0,35-0,4 w ciągu 1 godziny od subkulturacji, porzuć procedurę i spróbuj ponownie następnego dnia. Bakterie najprawdopodobniej rosły zbyt mocno w ciągu nocy i były zbyt głęboko w fazie stacjonarnej.
    6. Gdy hodowla osiągnie fazę środkowego logarytmu, wlać kulturę z każdej kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i komórek osadu przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 10 minut.
    7. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnej wody o temperaturze pokojowej (RT). Przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej.
    8. Ponownie odwirować komórki przy 21 000 x g przez 30 s, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml sterylnej wody RT. Powtórzyć wirowanie, usunięcie supernatantu i ponowne zawieszenie w 1 ml wody jeszcze dwa razy, w sumie trzy płukania.
    9. Odwirować komórki, usunąć wodę, a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnego glicerolu RT 10% (w wodzie, sterylnie przefiltrowanej) i pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    10. Osadzać komórki przez wirowanie przy 21 000 x g przez 30 s, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kolejnym 1 ml sterylnej glicerolu RT 10%. Ogniwa te są teraz elektrokompetentne.
    11. Porcjować 70 μl elektrokompetentnych ogniw do probówek do mikrowirówek typu snap-cap i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    12. Aby przekształcić elektrokompetentny S. aureus RN4220, rozmrozić podwielokrotność komórek na lodzie. Dodać 1 μg plazmidowego DNA do komórek, przesunąć próbkę do wymieszania i inkubować na lodzie przez 5 minut. Następnie należy elektroporować ogniwa i pozwolić im odzyskać w 390 μl pożywki B2 przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 225 obr./min, a następnie płytkować transformanty na selektywnym tryptycznym agarze sojowym.
      UWAGA: Większość wektorów wahadłowych użytych w tym badaniu posiada kasetę oporności na ampicylinę do selekcji u E. coli (100 μg/ml) oraz kasetę oporności na chloramfenikol (10 μg/ml) lub erytromycynę (Erm, 10 μg/ml) do selekcji u S. aureus. Wiele szczepów S. aureus, które są rutynowo stosowane w laboratorium, jest odpornych na Erm. Upewnij się, że interesujący nas szczep jest kompatybilny z selektywnym antybiotykiem przed użyciem danego wektora wahadłowego. Ważne jest, aby zminimalizować objętość DNA dodawanego do komórek (tj. <5 μl), aby zapobiec wyładowaniom łukowym, które występują, gdy próbka jest zbyt przewodząca podczas elektroporacji. Oczyszczanie plazmidowego DNA o wysokich stężeniach (≥300 ng/μl) z E. coli pomoże utrzymać niską objętość.
  2. Propagacja bakteriofaga na przekształconym S. aureus RN4220.
    UWAGA: Poniższa sekcja protokołu została zaadaptowana z metod Krausza i Bose21 i Olson22. Dwa z najczęściej stosowanych bakteriofagów do transdukcji S. aureus to φ11 i 80α. Procedura zbioru obu tych składników jest taka sama, z wyjątkiem tego, że otrzymujemy φ11 z S. aureus RN451 i 80α z S. aureus RN10359. φ11 był z powodzeniem używany między innymi z popularnymi szczepami JE2 i HG003 i jest używany w tym protokole23,24. Jednak fagi te mogą nie przekształcać skutecznie izolatów klinicznych, które mają różną oporność na fagi. Zapoznaj się z publikacjami Krausza i Bose21 i Olson22, aby zapoznać się z metodą przygotowania φ11 i oznaczania miana faga.
    1. Aby przetoczyć plazmid reporterowy, należy przygotować sześć płytek z tryptycznym agarem sojowym (TSA) z 5 mM CaCl2 i odpowiednim stężeniem selektywnego antybiotyku. Smuga S. aureus RN4220 przekształciła się z plazmidem reporterowym na płytkę TSA zawierającą selektywny antybiotyk i bez CaCl2 i inkubowała przez noc.
    2. Następnego dnia włączyć inkubator lub łaźnię wodną do temperatury 56 °C. Oznaczyć sześć probówek zatrzaskowych o pojemności 5 ml od 1 x 104 do 1 x 109 i podwielokrotność 40 μl 500 mM CaCl2 do każdej probówki z zatrzaskiem.
    3. Rozpuść miękki TSA (0,5% agaru) w kuchence mikrofalowej z poluzowaną nakrętką, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. Następnie wsypać 4 ml do każdej z probówek z zatrzaskiem. Odwróć probówki do wymieszania, a następnie umieść je w inkubatorze o temperaturze 56 °C, aby zapobiec zestaleniu się miękkiego agaru.
    4. Rozcieńczyć materiał fagowy do 1 x10 10 PFU/ml w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) + 5 mM CaCl2. Dodać 100 μl faga 1 x10 10 PFU/ml do probówki mikrowirówki zawierającej 900 μl TSB + 5 mM CaCl2 dla końcowego stężenia 1 x109 PFU/ml. Następnie rozcieńczyć seryjnie do dodatkowych probówek mikrowirówek zawierających 900 μL TSB + 5 mM CaCl2 aż do uzyskania stężenia 1 x 104 PFU/ml. Oznaczyć każdą z sześciu płytek agarowych TSA + 5 mM CaCl2 + selektywny antybiotyk za pomocą seryjnego rozcieńczenia: 1 x104 do 1 x 109 PFU/ml.
    5. Zawiesić na noc S. aureus RN4220 zawierający plazmid w 1 ml TSB + 5 mM CaCl2. Wyjąć probówkę z zatrzaskiem 109 z inkubatora i szybko dodać 10 μl ponownie zawieszonego RN4220 zawierającego plazmid i 100 μl 1 x10 9 rozcieńczenia faga PFU/mL, odwrócić w celu wymieszania i wlać zawartość na odpowiednią płytkę agarową TSA + 5 mM CaCl2 + selektywny antybiotyk
      6. .
    6. Wykonaj tę procedurę dla pozostałych rozcieńczeń fagów i ich odpowiednich płytek. Pozostawić miękki agar do zestalenia się na płytkach, a następnie inkubować z miękkim agarem skierowanym do góry przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Następnego dnia upewnij się, że płytki nazębne (obszary prześwitu na trawniku bakteryjnym) są widoczne na płytkach (Rysunek 2A). Blaszki miażdżycowe reprezentują obszary lizy, w których fagi z powodzeniem zainfekowały RN4220, a niektóre fagi wchłoną interesujący nas plazmid. Należy wybrać płytkę z najmniej rozcieńczonym zasobem fagowym, który ma lizę bliską konfluencji (przykład: 1 x 109 PFU/ml faga), a także płytki, na których podano dwa rozcieńczenia poniżej tego poziomu (w tym przypadku 1 x 108 PFU/ml i 1 x 107 PFU/ml, które powinny mieć lizę bliską zlewaniu się).
    8. Dodać 3 ml TSB + 5 mM CaCl2 do najmniej rozcieńczonej z tych płytek (1 x 109 PFU/ml, dla tego przykładu). Użyj sterylnego rozsiewacza komórek w kształcie litery L, aby delikatnie zeskrobać warstwę miękkiego agaru ze zwykłego agaru (Rysunek 2B). Użyj rozsiewacza komórek, aby jak najbardziej rozbić agar, aby ułatwić uwalnianie faga z miękkiego agaru.
    9. Gdy miękki agar na pierwszej płytce zostanie dokładnie rozdrobniony, delikatnie wlej miękki agar i zawiesinę bulionu na następną płytkę (w tym przypadku 1 x 108 PFU/ml). Zeskrob i rozbij miękki agar na tej płycie, a następnie wylej powstałą zawiesinę na ostatnią płytkę i powtórz
      10. .
    10. Po przygotowaniu miękkiej zawiesiny agarowej ze wszystkich trzech płytek, delikatnie wlej zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie odpipetować, aby jeszcze bardziej rozbić miękki agar, ale unikaj tworzenia się pęcherzyków. Nie należy wirować, ponieważ może to uszkodzić faga i zmniejszyć miano.
    11. Odwirować miękką zawiesinę agarową o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wlać supernatant do strzykawki podłączonej do filtra 0,45 μm.
      UWAGA: Konieczne jest delikatne nalewanie i unikanie dostania się kawałków agaru do filtra. Kawałki te zatkają filtr i uniemożliwią filtrowanie pozostałego supernatantu, zmniejszając miano.
    12. Określ miano otrzymanego lizatu fagowego za pomocą RN422021.
  3. Wprowadzić plazmidy reporterowe do interesujących szczepów S. aureus poprzez transdukcję.
    1. Przygotuj osiem płytek TSA zawierających 500 μg/ml cytrynianu sodu i odpowiednie stężenie selektywnego antybiotyku. Gęsto rozprowadzić pożądany szczep S. aureus biorcy na zwykłym TSA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia należy pobrać wymaz z płytki i ponownie zawiesić szczep biorcy w 1 ml TSB + 5 mM CaCl2.
    3. Rozcieńczyć zapas faga przenoszący pożądany plazmid reporterowy do 1x10 10 PFU/ml.
    4. Wymieszaj 1,5 ml TSB + 5 mM CaCl2, 0,5 ml ponownie zawieszonego szczepu biorcy i 0,5 ml rozcieńczonego materiału fagowego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min, przez 20 min.
      UWAGA: Dłuższe czasy inkubacji nie są zalecane, ponieważ prawdopodobnie zmniejszą one wydajność transdukcji, gdy zacznie lizować komórki biorcy.
    5. Bezpośrednio po tym dodać 1 ml sterylnie przefiltrowanego, lodowatego 0,02 M cytrynianu sodu (w wodzie) do stożkowej probówki i odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego 0,02 M cytrynianu sodu.
    6. Rozprowadzić 100 μl podwielokrotności na każdej z sześciu płytek TSA zawierających 500 μg/ml cytrynianu sodu i odpowiednie stężenie selektywnego antybiotyku do wyboru transduktorów. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      7. Następnego dnia należy rozprowadzić
    7. poszczególne kolonie z płytek transdukcyjnych na pozostałe dwie płytki TSA zawierające 500 μg/ml cytrynianu sodu i odpowiednie stężenie selektywnego antybiotyku. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Ten etap pasażowania na dodatkowych płytkach cytrynianu sodu pomaga zmniejszyć miano faga wokół transdukowanych komórek, zapobiegając lizie22.
    8. Wybierz pojedyncze kolonie z płytki smugowej, wyhoduj komórki do fazy wykładniczej w TSB zawierającym selektywny antybiotyk i przechowuj w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

2. Generowanie fluorescencyjnych szczepów reporterowych P. aeruginosa przez koniugację

UWAGA: Przeniesienie plazmidu reporterowego do P. aeruginosa ze szczepu klonującego E. coli można wykonać poprzez kojarzenie trójrodzicielskie25. Wymagany jest szczep dawcy E. coli, który przenosi plazmid będący przedmiotem zainteresowania (który powinien zawierać oriT do transferu małżeńskiego), E. coli HB101 + pRK2013 - szczep pomocniczy ułatwiający koniugację (użyj 50 μg/ml kanamycyny do utrzymania plazmidu pRK2013) oraz szczep biorcy P. aeruginosa, który otrzyma plazmid. W tym przykładzie interesujący plazmid ma marker oporności na tetracyklinę (Tet), więc każda hodowla E. coli z plazmidem będzie potrzebować 10 μg/ml Tet, a P. aeruginosa z plazmidem będzie potrzebować 75 μg/ml Tet do selekcji26.

  1. Zaszczepić bakterie z zamrożonych zapasów przechowywanych w temperaturze -80 °C w 25% glicerolu do bulionu lizogennego (LB) odpowiednim antybiotykiem do nocnego wzrostu, wstrząsając z prędkością 225 obr./min w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia rozprowadź 200 μl każdej płynnej kultury przez noc na płytce agarowej LB z odpowiednim selektywnym antybiotykiem. W zależności od tego, ile kryć transformacyjnych ma być wykonanych, rozłóż więcej płytek dla szczepów pomocnika i dawcy. Zaleca się jedną płytkę pomocnika/dawcy na transformację. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać gęste trawniki każdego szczepu.
  3. Następnego dnia zbierz trawniki, przecierając każdą powierzchnię płytki sterylnym wacikiem i wycierając go wzdłuż wnętrza probówki do mikrowirówki. Odwirować każdą probówkę na krótko (impuls przez 5 s), aby zebrać komórki na dno probówki. Zawiesić każdą komórkę w 200 μl LB.
    UWAGA: Zawiesiny powinny wyglądać na bardzo gęste, nieprzezroczyste i pozbawione grudek.
  4. W nowych probówkach do mikrowirówek do każdego krycia połącz 5 μl szczepu biorcy P. aeruginosa, 160 μl szczepu dawcy E. coli zawierającego interesujący nas plazmid i 160 μl pomocniczego szczepu E. coli HB101 + pRK2013. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić 50 μl mieszanki na wstępnie wysuszonej płytce agarowej LB. Umieść również 20 μl każdego pojedynczego szczepu na agarze LB w celu kontroli. Pozostaw plamy do całkowitego wyschnięcia na płytce, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3-6 godzin
    UWAGA: Wstępne suszenie agaru LB zapobiega rozprzestrzenianiu się plamki o objętości 50 μl na powierzchni, a tym samym zmusza komórki do interakcji na mniejszym obszarze.
  5. Po inkubacji delikatnie przesuń końcówkę pipety po miejscu dopasowania, aby przenieść niektóre komórki do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować krótko, aby zebrać komórki na dnie probówki. Zawiesić ponownie w 200 μl LB i umieścić całą remediację na płytce agarowej LB + Irgasan (Igr; 25 μg/mL) + Tet (75 μg/mL).
    UWAGA: P. aeruginosa jest wewnętrznie odporny na Igrasan, a plazmid będący przedmiotem zainteresowania zawiera marker oporności Tet, więc tylko pomyślnie przekształcony P. aeruginosa powinien być w stanie rosnąć na płytkach LB + Irgasan + Tet. W zależności od wydajności transformacji, ponowne zawieszenie i pokrycie całego miejsca łączenia może skutkować trawnikiem transformatorów następnego dnia. Aby uzyskać pojedyncze kolonie, należy albo (i) ponownie zawiesić całe miejsce krycia w większej objętości LB, a następnie umieścić na płytce 200 μl lub (ii) przenieść niewielką część miejsca krycia do probówki mikrowirówkowej, a następnie ponownie zawiesić w 200 μl i na płytce.
  6. Za pomocą punktów kontrolnych każdego szczepu delikatnie przesuń część gęstej plamki komórkowej na końcówkę pipety, przenieś do nowej probówki mikrowirówkowej, ponownie zawieś w 200 μl LB, a następnie umieść 50 μl na płytce agarowej LB + Irgasan + Tet (wiele punktów kontrolnych można umieścić na tej samej płytce agarowej). Pozostaw plamy do całkowitego wyschnięcia. Inkubować wszystkie płytki przez 16-20 godzin przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W przypadku punktów kontrolnych celem jest sprawdzenie, czy płytka z antybiotykiem jest selektywna dla transformantów P. aeruginosa. Jeśli plamki kontrolne są zbyt skoncentrowane po wykryciu na płytkach agarowych LB + Irgasan + Tet, trudno będzie określić, czy selekcja zadziałała następnego dnia, ponieważ pojawi się aureola martwych komórek, które można pomylić ze wzrostem.
  7. Następnego dnia potwierdź selektywność antybiotykową płytek LB + Irgasan + Tet, zwracając uwagę na brak wzrostu komórek dla poszczególnych punktów kontrolnych szczepu.
    UWAGA: Kolonie, które pojawiają się na płytce trójrodzicielskiej LB + Igrasan + Tet, to transformanty P. aeruginosa przenoszące interesujący nas plazmid.
  8. Opcjonalnie można zbierać i rozprowadzać kolonie na agarze LB + Irgasan + Tet i rosnąć przez noc, aby pozbyć się nadmiaru martwych E. coli z mieszanki godowej.
  9. Wybierz pojedyncze kolonie, hoduj przez 3-6 godzin w płynie LB + Tet (75 μg/ml) do widocznego zmętnienia, a następnie umieść zamrożone zapasy w 25% glicerolu (500 μl hodowli komórkowej + 500 μl 50% glicerolu w wodzie). Sprawdź, czy klony zostały pomyślnie przekształcone przez PCR kolonii, a następnie sekwencjonowanie Sangera lub całego plazmidu.

3. Określanie dawek antybiotyków dla testów trwałości

UWAGA: Aby wybrać dawkę danego antybiotyku, którą należy leczyć populację bakterii do eksperymentów z uporczywym organizmem, najpierw zmierz minimalne stężenie hamujące (MIC) antybiotyku w stosunku do interesującego nas szczepu bakteryjnego. Można to osiągnąć za pomocą metody mikrorozcieńczania bulionu - podejścia zatwierdzonego przez Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) - lub testu Epsilometer (E-test), który jest wykonywany przy użyciu pasków testowych z różnymi dawkami antybiotyków27. Po określeniu wartości MIC należy wybrać co najmniej pięć stężeń antybiotyku, które wahają się od 1 do 100 razy MIC do leczenia komórkowego.

  1. Zaszczepić bakterie z zamrożonych zapasów przechowywanych w temperaturze -80 °C w 25% glicerolu w 2 ml MHB (CA-MHB) o dostosowaniu kationów lub innej pożywki bogatej w składniki odżywcze. Hodować komórki przez około 4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min, a następnie przenieść 125 μl kultury do 25 ml świeżej, chemicznie zdefiniowanej pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Hodować bakterie przez 16 godzin (do fazy stacjonarnej) w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
    UWAGA: Pożywka z solą bazową (BSM) z bursztynianem jako jedynym źródłem węgla jest zwykle używana do eksperymentów z P. aeruginosa, a bogate chemicznie zdefiniowane podłoża są zwykle używane do eksperymentów z S. aureus28,29,30,31.
  2. Następnego ranka przygotuj 100x zapas antybiotyku (w odpowiednich rozpuszczalnikach) dla pożądanego zakresu stężeń supra-MIC. Dodać 10 μl każdego rozcieńczenia do poszczególnych probówek.
  3. Zmierz OD600 w nocnej hodowli, aby potwierdzić zmętnienie w fazie stacjonarnej. Seryjnie rozcieńczyć 10 μl kultury i umieścić rozcieńczenia na odżywczych płytkach agarowych - takich jak agar LB, agar CA-MHB lub TSA - w celu określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) przed antybiotykotraktacją.
  4. W przypadku leczenia antybiotykami należy dozować 1 ml porcji kultury do probówek zawierających 10 μl o 100-krotnym stężeniu antybiotyku. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 250 obr./min, przez czas wystarczający do zabicia osobników nieprzetrwałych w populacji, pozostawiając przetrwałe komórki jako jedyne komórki tworzące kolonie.
    UWAGA: Czas trwania leczenia może się różnić w zależności od eksperymentu i testowanego szczepu bakteryjnego. Zazwyczaj S. aureus jest leczony przez 5 godzin lub 7 godzin, a P. aeruginosa przez 7 godzin lub 24 godziny. Ogólnie rzecz biorąc, można zastosować dowolny punkt czasowy w drugiej fazie testu przeżycia zależnego od czasu, ponieważ oczekuje się, że komórki pozostające w drugiej fazie będą trwałe.
  5. Po antybiotykoterapii przenieść 100 μl komórek z probówek do probówek mikrowirówkowych zawierających 900 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 21 000 x g przez 3 minuty. Usunąć 900 μl supernatantu i ponownie zawiesić osad w 900 μl sterylnego PBS. Powtórz etap płukania co najmniej jeszcze raz, aby zredukować resztki antybiotyków do poziomu sub-MIC.
  6. Seryjnie rozcieńczyć kulturę 10-krotnie (sześć razy) i umieścić 10 μl każdego rozcieńczenia na odżywczych płytkach agarowych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Do seryjnego rozcieńczania należy używać nieprzetworzonych, okrągłodennych 96-dołkowych płytek i komórek płytkowych na kwadratowych płytkach agarowych za pomocą pipety wielokanałowej.
  7. Następnego dnia policz kolonie przy każdym stężeniu antybiotyku. Wykreślić frakcję przeżycia (jtk na koniec leczenia/jtk przed poddaniem działaniu substancji) w zależności od stężenia w skali logarytmiczno-liniowej. Aby wybrać stężenie leku do przyszłych testów trwałości, wybierz stężenie w drugiej fazie krzywej dwufazowej (Rysunek 3).

4. Obrazowanie komórek podczas antybiotykoterapii lub rekonwalescencji

  1. Przygotuj płatki agarozowe i próbki komórek do obrazowania poklatkowego
    UWAGA: Poniższy protokół przygotowania próbki został opracowany jako przyjazna dla użytkownika, opłacalna alternatywa dla tradycyjnych metod "kanapkowych" agarozy14,16. Użycie wymiennego naczynia do szkiełek nakrywkowych pozwala uniknąć konieczności stosowania brudnego tłuszczu lub lakieru do paznokci w celu uszczelnienia próbki, co mogłoby dodatkowo ograniczyć napowietrzanie próbki. Agaroza jest umieszczana w wymiennym naczyniu nakrywkowym z już założonym szkiełkiem nakrywkowym, tworząc niezawodnie płaskie powierzchnie agarozy w porównaniu z preparatami z wacikami agarozowymi z wolnej ręki. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta pozwoliła na obrazowanie próbek z lepszą ostrością w całym polu widzenia i przez dłuższy czas dzięki stabilnemu nawilżaniu. Opisana tutaj metoda służy do wizualizacji bakterii podczas antybiotykoterapii (Rysunek 4, Dodatkowe wideo 3 i Dodatkowe wideo 4). Aby zobrazować osoby utrzymujące się podczas reanimacji i budzenia się po leczeniu antybiotykami (Ryc. 5, Dodatkowe wideo 5 i Dodatkowe wideo 6), przygotuj płatki agarozowe ze świeżymi pożywkami hodowlanymi zamiast zużytych pożywek i nie dodawaj antybiotyków do podpasek (z wyjątkiem tych dodanych w celu utrzymania plazmidu/wyboru antybiotyków).
    1. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm (grubość #1.5) na dnie podstawy ze stali nierdzewnej wymiennego naczynia nakrywkowego ("komory"). Delikatnie wkręć wkładkę poliwęglanową w podstawę tak, aby szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm stanowiło podstawę komory, a następnie uszczelnij ją na miejscu, ściskając dołączony silikonowy O-ring. Powtórz ten krok, aby przygotować zduplikowaną komorę.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie duplikatów dla każdego eksperymentu w przypadku, gdy przygotowanie jednej z komór jest nieoptymalne. Niestandardowa przegroda wydrukowana w 3D jest umieszczana na 30-milimetrowym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu ruchliwych komórek, takich jak P. aeruginosa, i zapewnić punkty orientacyjne dla lokalizacji próbek. Plik STL do druku 3D jest dostępny w pliku uzupełniającym 1.
    2. Przygotuj 1,5% agarozy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, używając wybranego podłoża. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.
      UWAGA: Do obrazowania komórek w fazie stacjonarnej podczas poddawania działaniu substancji, jako pożywkę bazową stosuje się bezkomórkową pożywkę zużytą z hodowli nocnej w fazie stacjonarnej. Zazwyczaj pożywkę agarozową przygotowuje się jako 0,105 g agarozy w 7 ml pożywki do przygotowania dwóch komór; każda komora wymaga 2 ml pożywki agarozowej, a nadmiar jest pomocny w unikaniu pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
    3. Umieść stożek o pojemności 50 ml w szklanej zlewce lub uchwycie nadającym się do kuchenki mikrofalowej (upewnij się, że nakrętka jest luźna). Kuchenka mikrofalowa na wysokich obrotach, zatrzymując się co 3-4 s, aby zawirować i wymieszać. Rób przerwy i często mieszaj, aby mieszanina agarozy nie bulgotała.
      1. Po ~1 minutach całkowitego czasu podgrzewania sprawdź, czy w mieszaninie nie pozostała widoczna agaroza, która się nie stopiła. Jeśli mieszanina jest jednolicie klarowna, przed dodaniem jakichkolwiek dodatkowych leków lub barwników pozwól pożywce agarozowej na krótko ostygnąć do ~60 °C. Delikatnie mieszać, aby wymieszać i uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
        UWAGA: Jodek propidyny (16 μM dla P. aeruginosa lub 1,6 μM dla S. aureus) można dodać w celu wizualizacji, kiedy komórki tracą żywotność.
    4. Poruszając się szybko, aby zapobiec zestaleniu się podłoża agarozowego, należy odpipetować 2 ml podłoża agarozowego do komory za pomocą szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm. Delikatnie połóż sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm (grubość #1,5) na pożywce agarozowej w górnym otworze komory; Pomaga to zapobiegać odwodnieniu podkładki agarozowej i zapewnia płaską górną powierzchnię agarozy dla optymalnego obrazowania z kontrastem fazowym. Pozostaw podkładkę do zestalenia się na 1-2 godziny.
    5. Po zestaleniu się podkładki przygotuj komórki do obrazowania, rozcieńczając je do odpowiednio rzadkiej gęstości w PBS w celu wizualizacji pojedynczych komórek. Tutaj komórki rozcieńcza się do OD600 0,01-0,05.
    6. Na szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm należy użyć markera permanentnego z cienką końcówką, aby zaznaczyć lokalizacje/tożsamość każdej próbki wysianej na podkładce. Odwróć komorę tak, aby pierścień podstawy ze stali nierdzewnej był skierowany do góry i ostrożnie przytrzymaj wkładkę poliwęglanową pod spodem podczas odkręcania podstawy. Umieść podstawę ze stali nierdzewnej na boku. Ostrożnie zsuń 30-milimetrowy szkiełko nakrywkowe z podkładki i wyrzuć je.
      UWAGA: Usuń szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm, przesuwając je poziomo i uważaj, aby nie wciąć powierzchni agarozy. Unikaj również pracy na odsłoniętej powierzchni agarozy: wszelki kurz, który na nią spadnie, wpłynie na jakość obrazu i może potencjalnie zanieczyścić podkładkę.
    7. Korzystając ze znaczników na szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm, narysuj 5 μl rozcieńczonych komórek w odpowiednich miejscach na waciku agarozowym. Dodaj trzy plamki 5 μl (dostosuj to w razie potrzeby, np. 4 x 4 μl plamki itp.). Gdy plamy całkowicie wyschną, delikatnie umieść nowe, sterylne 30 mm szkiełko nakrywkowe wyśrodkowane na podkładce.
    8. Przytrzymaj wkładkę z poliwęglanu jedną ręką, a drugą powoli ponownie nawlecz podstawę ze stali nierdzewnej z powrotem na nowe szkiełko nakrywkowe. Gwintowanie aż do dokręcenia palcami wystarczy, aby ścisnąć silikonowy O-ring i uszczelnić komorę.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie dokręcić zbyt mocno - jeśli szkiełko nakrywkowe o średnicy 30 mm przylegające do powierzchni próbki zostanie ściśnięte przez podstawę ze stali nierdzewnej i wielokrotnie skręcone, komórki mogą rozprzestrzenić się promieniowo, co może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe próbki.
    9. Po zamknięciu komory należy obserwować, czy agaroza styka się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm; w tym momencie zwykle dochodzi do pewnego, ale nie całkowitego, kontaktu powierzchniowego. Użyj końca pęsety lub podobnego narzędzia, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm, aż agaroza dotknie szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm równomiernie na całej powierzchni.
      UWAGA: Ten krok może spowodować pęknięcie szkiełka nakrywkowego o średnicy 25 mm w przypadku użycia nadmiernej siły.
    10. Gdy agaroza zostanie dobrze dociśnięta do szkiełka nakrywkowego o średnicy 30 mm, tak aby nie pozostały żadne duże pęcherzyki powietrza, podkładka jest gotowa do obrazowania.
  2. Skonfiguruj mikroskop i obraz.
    1. Przygotuj kontrolę środowiska mikroskopu i komory obrazowania. Ustawić temperaturę inkubatora stage-top i inkubatora wielkokomorowego na 37 °C i włączyć nawilżacz komorowy. Umieścić jeden z preparatów z poduszki agarozowej w inkubatorze ze stopniem i zamknąć komorę inkubacyjną, aby próbka mogła się zrównoważyć. Pokrywę nawilżacza inkubatora stage top pozostawia się w tym momencie otwartą, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm.
      UWAGA: Kurczenie się/rozszerzanie padów spowodowane zmianami temperatury może powodować dryf między punktami czasowymi, które wykraczają poza zakres skanowania algorytmu autofokusa. Bardzo ważne jest, aby zrównoważyć podkładkę agarozową do stabilnej temperatury przed obrazowaniem, co zwykle trwa co najmniej 15 minut. Wystarczające ocieplenie zapobiega również kondensacji pary wodnej na górnym szkiełku nakrywkowym po założeniu pokrywy nawilżającej. Elementami sprzętowymi systemu obrazowania były: komora do inkubacji żywych komórek, mikroskop odwrócony z obiektywem Plan-Apochromat 63x/1,40 Oil Ph3 M27, silnik światła LED Spectra 7 oraz kamera sCMOS (rozmiar piksela 6,5 μm). Sterowanie zmotoryzowanymi elementami mikroskopu i akwizycją obrazu odbywa się za pomocą aplikacji do analizy mikroskopowej.
    2. Przygotuj oprogramowanie do akwizycji obrazu. Ustaw wbudowany algorytm autofokusa MetaMorph (oprogramowanie do analizy mikroskopowej) tak, aby używał kanału fazowego podczas akwizycji wielowymiarowej.
      1. Na karcie Stage (Etap) ustaw wiele pozycji stage dla każdej próbki, dążąc do pól widzenia, w których gęstość komórek jest równomiernie rozłożona. W zakładce Timelapse ustaw żądany czas trwania i częstotliwość (interwał czasowy) wykonywanych zdjęć. W zakładkach Wavelength (Długości fal) ustaw żądane kanały do akwizycji i dostosuj czasy ekspozycji dla intensywności sygnału próbek.
        UWAGA: Zdjęcia każdej pozycji są wykonywane co 10 minut przez okres do 24 godzin. Do obrazowania fluorescencyjnego barwników/fluoroforów wymienionych w tym artykule zastosowano następujące ustawienia wzbudzenia silnika świetlnego: jodek propidyny (Cy3; 555/15 nm) i GFP (GFP/FITC; 470/24 nm). Typowy czas ekspozycji na wzbudzenie fluorescencyjne, który jest stosowany, wynosi 100 ms. Stosowany jest zestaw filtrów 15 (Beamsplitter FT580, Emission LP590) dla jodku propidyny oraz zestaw filtrów 44 (Beamsplitter FT500, Emission BP 530/50) dla GFP.
    3. Po rozgrzaniu podkładki agarozowej w komorze dodaj pokrywę nawilżającą do inkubatora stage-top. Pomoże to zapobiec odwodnieniu i przesuwaniu się podkładki podczas obrazowania.
    4. Przy założonej pokrywie nawilżającej zmień kontrast interferencyjny z fazowego na różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) i wyreguluj kondensor i przysłonę mikroskopu, aby uzyskać prawidłowe oświetlenie Köhlera.
    5. Po wyregulowaniu przełącz się z powrotem na fazę. Przejdź do każdej pozycji stolika, dostosuj ostrość i zresetuj pozycję stolika do nowej płaszczyzny ogniskowej. Ustawienia są teraz na miejscu, aby rozpocząć obrazowanie.
      UWAGA: Ważne jest, aby ponownie przyjrzeć się każdej pozycji stage przed rozpoczęciem akwizycji, aby upewnić się, że pad się nie przesunął. Jeśli komórki są nieostre po ponownym odwiedzeniu w danej pozycji etapu, ponownie ustaw na nich fokus i zastąp poprzednią pozycję etapu. Ustawienie algorytmu automatycznego ustawiania ostrości wykorzystuje ogniskową z z ostatniego punktu czasowego ± 3 μm jako zakres wyszukiwania, więc jeśli pad przesunie się o więcej niż 3 μm, algorytm nie będzie w stanie prawidłowo ustawić ostrości.
    6. Rozpocznij wielowymiarową akwizycję, klikając przycisk Nabierz.
    7. Po zakończeniu eksperymentu skompiluj poszczególne obrazy z każdego kanału w stos do oglądania jako wideo lub do innej analizy. Zrób to za pomocą MetaMorph lub ImageJ.
      1. Aby skompilować obrazy w MetaMorph (preferowane), w aplikacji Review Multi Dimensional Data wybierz interesujące Cię kanały/długości fal i wybierz wszystkie punkty czasowe dla danej pozycji etapu. Kliknij przycisk Załaduj obrazy. Dla każdego kanału/długości fali pojawią się okna. Zapisz każdą kompilację z odpowiednią nazwą kanału jako plik .tiff.
      2. Aby skompilować w ImageJ, otwórz pliki dla wszystkich punktów czasowych dla jednej pozycji etapu i jednego kanału. Kompiluj za pomocą obrazów do stosu.

5. Tworzenie filmów poklatkowych za pomocą Fiji/ImageJ

UWAGA: Fidżi (Fidżi to po prostu ImageJ) to darmowe oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów, które można pobrać tutaj: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. Fiji/ImageJ2 1.54f został użyty do metod przetwarzania obrazu opisanych poniżej.

  1. Skoryguj cień stosu obrazów kanału fazowego za pomocą BaSiC33. Otwórz żądany stos obrazów fazy na Fidżi, a następnie wybierz BaSiC z zakładki Wtyczki. Stos z korektą odcienia pojawi się w osobnym oknie o nazwie Corrected:ImageName.
    UWAGA: BaSiC.jar można pobrać tutaj: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. Postępuj zgodnie z instrukcjami programisty, aby poprawnie zainstalować BaSiC na Fidżi.
  2. Scal stos kanałów fazowych z korekcją zacienienia z dowolnymi innymi kanałami/długościami fal za pomocą opcji Image > Color > Merge Channels. Dostosuj tło i intensywność sygnału za pomocą opcji Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast dla każdego kanału. Zapisz scalony plik jako .tiff.
  3. Następnie ustabilizuj obrazy za pomocą opcji Popraw dryf 3D. Po wybraniu stosu z korekcją odcienia przejdź do sekcji Wtyczki > rejestracje > popraw dryf 3D. W oknie dialogowym, które zostanie otwarte, ustaw kanał do rejestracji na numer kanału odpowiadający stosowi faz. Wynikowy stos po korekcie będzie nosił nazwę zarejestrowane punkty czasowe. Przytnij do żądanego pola widzenia, a następnie zapisz poprawiony plik jako .tiff.
    UWAGA: Jeśli MetaMorph został użyty do stworzenia skompilowanego stosu obrazów, istnieje dodatkowy krok przetwarzania: przejdź do Właściwości > obrazu i zamień liczby w polach Plasterki (z) i Ramki (t). Korekcja dryfu może teraz poprawnie interpretować każdą klatkę jako punkt czasowy, a nie wycinek stosu z. Plik .tiff z korekcją odcienia i dryftem może być używany w kolejnych analizach obrazu. Dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do pomiaru intensywności sygnału fluorescencyjnego, ilościowego określania cech morfologicznych, śledzenia losów poszczególnych komórek i nie tylko. Dwa powszechnie używane programy to wtyczka MicrobeJ dla Fidżi i Oufti34,35.
  4. Dodaj znaczniki czasu i etykiety tekstowe do stosu za pomocą opcji Obraz > Stosy > Etykieta.
  5. Aby dodać pasek skali, najpierw poznaj rozmiar piksela kamery i powiększenie obiektywu mikroskopu. Oblicz stosunek pikseli do mikronów jako rozmiar piksela podzielony przez powiększenie. W oknie dialogowym Analizuj > ustaw skalę wprowadź stosunek pikseli do mikronów w polu znanej odległości. Następnie dodaj podziałkę liniową do stosu za pomocą narzędzi Analizuj > Narzędzia > Pasek skali.
    UWAGA: Dokładna skala mikroskopu powinna być skalibrowana za pomocą mikrometru stage. Jednak zastosowany obiektyw mikroskopu, obiektyw i kamera mogą zapewnić przybliżone oszacowanie skali. Na przykład zastosowana tutaj kamera PCO sCMOS ma rozmiar piksela 6,5 x 6,5 μm>2, a obiektyw 63x został użyty do obrazowania, więc rozmiar piksela podzielony przez powiększenie wynosi 6,5/63 = 0,1032 μm na piksel. Wprowadź wartość 0,1032 w polu znanej odległości w oknie dialogowym Ustawianie skali.
  6. Aby wyeksportować gotowy stos obrazów jako wideo, które można odtworzyć w programie QuickTime Player, Microsoft PowerPoint itp., Zapisz go jako plik .avi.

Wyniki

Pomyślne wprowadzenie plazmidów reporterowych do P. aeruginosa i S. aureus jest sygnalizowane wzrostem na odpowiednich antybiotykach selekcyjnych i może zostać potwierdzone za pomocą kolonijnego PCR i/lub sekwencjonowania. Zmodyfikowane szczepy należy zweryfikować jako reportery fenotypowe, poddając je warunkom, w których wiadomo, że badany gen ulega indukcji; powstałą fluorescencję można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, spektrofotometrii lub mikroskopii epifluorescencyjnej (Rycina 1).

Aby ułatwić dobór dawki(ek) antybiotyku do wykorzystania w kolejnych eksperymentach, należy przeprowadzić testy zależne od stężenia antybiotyku w celu oznaczenia komórek przetrwalnikowych (persisterów) dla badanych szczepów P. aeruginosa lub S. aureus. Testy zależne od stężenia zazwyczaj dają w wyniku krzywą dwufazową z gwałtownym początkowym spadkiem przy niższych stężeniach antybiotyku oraz plateau lub mniejszym nachyleniem przy wyższych stężeniach. Jednakże dla niektórych par antybiotyk-gatunek wyraźna krzywa dwufazowa może nie wystąpić. Na przykład krzywa dla S. aureus i delafloxacyny jest wyraźnie dwufazowa (Rycina 3A), ale krzywa dla P. aeruginosa i lewofloksacyny już nie (Rycina 3B)15. W takim przypadku wybralibyśmy stężenie wynoszące co najmniej 10x MIC (np. 5 µg/mL, co stanowi około 15x MIC dla P. aeruginosa)15. Ponieważ jednak stężenie 15x MIC lewofloksacyny skutkuje przeżyciem tylko ~0,001% P. aeruginosa, stosujemy leczenie lewofloksacyną w stężeniu 1 µg/mL, jeśli chcemy zaobserwować persistery podczas obrazowania komórek podczas ich regeneracji na podkładkach z agarozy wolnej od antybiotyku (Supplementary Video 6); w przeciwnym razie liczba pól widzenia potrzebnych do obrazowania wielu persisterów staje się zbyt duża.

Na początku obrazowania idealnie przygotowana próbka i podkładka agarozowa powinny być płaskie w całym polu widzenia, wolne od dużych zanieczyszczeń, zmarszczek lub pęcherzyków powietrza, a pojedyncze komórki powinny być rozmieszczone równomiernie. Uzyskanie dobrze rozproszonych pojedynczych komórek może wymagać optymalizacji rozcieńczenia lub resuspensji próbki. W przypadku S. aureus komórki mają tendencję do tworzenia małych skupisk i muszą zostać dokładnie wymieszane w wirówce przed naniesieniem na podkładkę agarozową (Rysunek 4 i Rysunek 5). W przypadku P. aeruginosa komórki w zawiesinie mogą tworzyć agregaty zamknięte w lepkawej macierzy zewnątrzkomórkowej; konieczne jest dokładne pipetowanie tych próbek i rozbicie agregatów w celu obrazowania pojedynczych komórek.

Po zakończeniu eksperymentu obrazowania, pomyślnie wykonany time-lapse obrazów będzie ostry, stabilnie oświetlony i z minimalnym dryftem w płaszczyźnie x-y przez cały czas trwania eksperymentu. Supplementary Video 7 przedstawia optymalną akwizycję obrazu: t to kanał fazowy z Supplementary Video 4 przed korekcją cieniowania lub dryftu. Utrata ostrości może wystąpić, jeśli kondensacja (wynikająca z nadmiernego nawilżenia lub niewystarczającego ogrzewania próbki) spowoduje powstanie kropli wody na górnym szkiełku nakrywkowym 25 mm, co zniekształci światło i przesunie płaszczyznę ogniskową poza maksymalny zakres wyszukiwania algorytmu autofocus (Supplementary Video 8). Zmienność oświetlenia zazwyczaj wskazuje na niewystarczającą ilość oleju imersyjnego w momencie obrazowania. Jeśli stolik porusza się zbyt szybko, olej na obiektywie może zostać w tyle i wciąż nadążać w momencie akwizycji obrazów. Można temu zapobiec, dostosowując ustawienia akwizycji w celu spowolnienia prędkości ruchu lub dodając pauzę między ruchem do następnej pozycji a akwizycją obrazu. Znaczny dryft próbki będzie wyglądać jak wiele komórek przesuwających się smugami przez pole widzenia, podczas gdy niektóre pozostaną w miejscu (Supplementary Video 9). Zazwyczaj dzieje się to w późniejszej fazie eksperymentów, ponieważ podkładka z agarozy uległa odwodnieniu z powodu niewystarczającej kontroli wilgotności. Przygotowanie podkładki z agarozy przedstawione w niniejszej pracy zostało zaprojektowane w celu zwiększenia stabilności próbki, jednak właściwe ogrzewanie/nawilżanie próbki i jej otoczenia jest niezbędne do optymalnej akwizycji obrazu.

Mikroskopia komórek persystujących; poziomy ekspresji genów, skupisko fluorescencyjne w czasie; schemat.
Rycina 1: Szczepy z reporterem fluorescencyjnym obrazują ekspresję badanego genu. (A) S. aureus został poddany transdukcji transkrypcyjnym reporterem GFP dla badanego genu zgodnie z Protokołem 1. Szczep reporterowy traktowano przez 24 h antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładkę agarozową przygotowaną z CA-MHB z dodatkiem jodku propidyny (1.6 µM) i chloramfenikolu (10 µg/mL w celu utrzymania plazmidu reporterowego) do obrazowania w fazie regeneracji (Supplementary Video 1). (B) P. aeruginosa został poddany transformacji plazmidem zawierającym translacyjny reporter sprzężony z mScarlet dla badanego białka26. Szczep reporterowy traktowano przez 5 h antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładkę agarozową przygotowaną z BSM z dodatkiem Tet (75 µg/mL; w celu utrzymania plazmidu reporterowego) do obrazowania w fazie regeneracji (Supplementary Video 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost bakterii na płytkach agarowych, seria rozcieńczeń, obserwacja kolonii, przygotowanie eksperymentu mikrobiologicznego.
Rysunek 2: Namnażanie i pozyskiwanie bakteriofagów. (A) Sześć płytek przedstawia sześć różnych ilości rozcieńczonego zapasu fagów na trawnikach S. aureus RN4220. Czerwone obramowania wskazują trzy płytki, które zostaną wykorzystane do pozyskania fagów: od płytki z największym przejaśnieniem (pogrubiona czerwona obwódka; 1 x109 PFU/mL) do dwóch kolejnych rozcieńczeń (1 x108 oraz 1 x 107 PFU/mL). Czarne strzałki wskazują poszczególne plaki. (B) Aby pozyskać fagi z płytek, należy zebrać warstwę miękkiego agaru (lewo), przenieść zawiesinę na kolejną płytkę z rozcieńczeniem (środek), a po połączeniu miękkiego agaru ze wszystkich trzech płytek, przelać go do probówki stożkowej w celu wirowania (prawo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres frakcji przeżycia w funkcji stężenia antybiotyku, S. aureus, P. aeruginosa, analiza skuteczności leku.
Rycina 3Reprezentatywne testy persystencji zależne od stężenia. Zależną od stężenia persistencję fluorochinolonów oceniano w fazie stacjonarnej (A) S. aureus (przeciwko delaflooksacynie) i (B) P. aeruginosa (przeciwko lewofloksacyną). W kolejnych eksperymentach wykorzystano 5 µg/mL delafloxacyna (czerwone koło), ponieważ S. aureus zabijanie osiągnęło plateau przy tym stężeniu. Dawka wynosząca co najmniej 1 µg/mL lewofloksacyna (czerwone koło) zostanie wykorzystana w kolejnych eksperymentach z P. aeruginosaNależy zauważyć, że proces zabijania bakterii nie osiąga plateau dla P. aeruginosaistnieje jednak wciąż mniej stroma „druga faza” krzywej dwufazowej, która wskazuje na obecność trwałej subpopulacji. Panel 3B został zaadaptowany za zgodą Hare et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia poklatkowa S. aureus i P. aeruginosa pokazująca zmiany w komórkach PI+ w czasie. Dołączono schematy.
Rysunek 4: Obrazowanie fenotypów bakteryjnych podczas leczenia antybiotykami. Komórki S. aureus (A) i P. aeruginosa (B) w fazie stacjonarnej naniesiono na podkładki agarowe zawierające antybiotyki z grupy fluorochinolonów i monitorowano w trakcie leczenia: 5 µg/mL delafloxacyny dla S. aureus (Wideo uzupełniające 3) i 5 µg/mL lewofloksacyny dla P. aeruginosa (Wideo uzupełniające 4)15. Do podkładek dodano jodek propidyny (PI; 16 µM dla P. aeruginosa, 1.6 µM dla S. aureus), aby oznakować martwe lub obumierające komórki. Komórki S. aureus pozostają w większości nienaruszone i żywe w obecności FQ, podczas gdy większość komórek P. aeruginosa ulega drastycznym zmianom morfologicznym, w tym tworzeniu okrągłych sferoplastów, przed liza i śmiercią. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia poklatkowa wzrostu Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, proliferacja bakterii.
Rysunek 5: Śledzenie persisterów podczas regeneracji. (A) populacje S. aureus i (B) P. aeruginosa zostały wysiane na podkładki agarozowe zawierające świeżą pożywkę po potraktowaniu fluorochinolonami (5 µg/mL delafloxacyny dla S. aureus i 1 µg/mL lewofloksacyny dla P. aeruginosa), a następnie monitorowano ich regenerację po leczeniu (Supplementary Video 5 oraz Supplementary Video 6). Widoczne persistery są zaznaczone zielonymi strzałkami na dwóch pierwszych klatkach w każdym panelu; pozostały one nienaruszone i żywotne podczas leczenia antybiotykiem. Po początkowym okresie adaptacyjnym persistery zaczęły się dzielić, dając początek nowemu potomstwu (zaznaczonemu zielonymi okręgami). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces przygotowania szkiełka nakrywki i wysiewania komórek, schemat zestawu i komponenty do badania mikroskopowego.
Rysunek 6: Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego. (A) Schemat przepływu pracy podczas przygotowania próbki z użyciem wymiennego naczynia ze szkiełkiem nakrywką („komory”). (B) Zdjęcie rozmontowanej komory i jej poszczególnych komponentów. (C) Zdjęcie w pełni zmontowanej komory. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo uzupełniające 1: S. aureus komórka przetrwalnikowa Plik wideo zawierający obrazy w Rycina 1AW skrócie, S. aureus zawierające reporter transkrypcyjny GFP dla genu zainteresowania, poddano 24-godzinnej inkubacji z antybiotykiem, przemyto PBS, a następnie wysiano na podkładkę agarową przygotowaną z CA-MHB z dodatkiem jodku propidyny (1.6 µM) oraz chloramfenikolem (10 µg/mL) do obrazowania podczas rekonwalescencji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 2: P. aeruginosa komórka persystująca Plik wideo zawierający obrazy w Rycina 1BW skrócie, P. aeruginosa noszącą reporter translacyjny sprzężony z mScarlet dla białka docelowego, poddano 5-godzinnej inkubacji z antybiotykiem, przemyto buforem PBS, a następnie wysiano na podkładkę agarozową przygotowaną z pożywki BSM z dodatkiem Tet (75 µg/mL) do obrazowania podczas rekonwalescencji26. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 3: S. aureus podczas leczenia antybiotykiem. Kulturę S. aureus w fazie stacjonarnej, wyhodowaną w bogatym, chemicznie zdefiniowanym medium, naniesiono na podkładki agarozowe przygotowane z bezkomórkowego medium kondycjonowanego z tej kultury z dodatkiem jodku propidyny (1.6 μM) i delafloxacyny (5 μg/mL). Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 4: P. aeruginosa podczas leczenia antybiotykami. Kultura w fazie stacjonarnej P. aeruginosa wyhodowane w pożywce BSM zasiano na podkładki agarowe wykonane z bezkomórkowego medium warunkującego z hodowli P. aeruginosa hodowane równolegle w pożywce BSM; podkładka agarozowa zawierała również jodek propidyny (16 µM) oraz lewofloksacynę (5 µg/mL). Materiał wideo został opracowany za zgodą Hare i in.15. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające 5: S. aureus podczas rekonwalescencji po antybiotykoterapii. S. aureus hodowano do fazy stacjonarnej w bogatym, chemicznie zdefiniowanym medium. Kultury w fazie stacjonarnej traktowano delafloxaciną w stężeniu 5 µg/mL w probówkach przez 24 h, przemyto PBS, a następnie naniesiono na bezzantybiotykiowe podłoża agarowe CA-MHB zawierające jodek propidyny (1.6 µM) w celu obrazowania. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 6: P. aeruginosa podczas regeneracji po antybiotyku. Kulturę P. aeruginosa w fazie stacjonarnej, hodowaną w pożywce BSM, traktowano w probówkach lewofloksacyną w stężeniu 1 µg/mL przez 7 h, przemyto PBS, a następnie naniesiono na podkładki z agarozy BSM bez antybiotyku zawierające jodek propidyny (16 µM) w celu obrazowania. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 7: Przykład optymalnego pozyskiwania obrazu. To wideo przedstawia kanał fazowy z Wideo uzupełniającego 4 przed przetwarzaniem obrazu jako przykład optymalnego pozyskiwania obrazów w trybie time-lapse. Należy zwrócić uwagę na minimalny dryft, stabilne oświetlenie oraz utrzymanie ostrości przez cały czas trwania eksperymentu. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 8: Przykład suboptimalnej akwizycji obrazu z powodu kondensacji. To wideo przedstawia fragment eksperymentu, w którym na akwizycję obrazu wpłynął słaby fokus, prawdopodobnie z powodu kondensacji pary wodnej w komorze wynikającej z niewłaściwego ogrzewania próbki i/lub nadmiernego nawilżenia środowiska obrazowania. Obrazowaną próbką były bakterie P. aeruginosa traktowane lewofloksacyną podczas regeneracji po antybiotyku na podkładce agarowej BSM. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające 9: Przykład nieoptymalnego pozyskiwania obrazu z powodu dryftu. To wideo przedstawia fragment eksperymentu, w którym na pozyskiwanie obrazu wpłynął dryft próbki, prawdopodobnie spowodowany odwodnieniem oraz kurczeniem się lub odklejaniem podkładki agarozowej od szkiełka nakrywnego. Obrazowaną próbką były bakterie P. aeruginosa na podkładce agarozowej zawierającej lewofloksacynę i jodek propidyny. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Plik uzupełniający 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Odkryliśmy, że sukces eksperymentu z mikroskopią poklatkową zależy od jakości płatków agarozowych i ich stabilności w trakcie obrazowania. Zamknięte w komorze ze stali nierdzewnej podkładki agarozowe są stosunkowo łatwe do przygotowania, co skutkuje konsekwentnie płaskimi próbkami, które można stabilnie obrazować przez dziesiątki godzin. Umożliwia to obrazowanie dziesiątek tysięcy komórek w jednym eksperymencie i zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia rzadkich wariantów fenotypowych, takich jak komórki trwałe, w populacji.

Ta metoda przygotowania padów agarozowych stanowi łatwą do wdrożenia alternatywę dla wcześniej opublikowanych metod. Nasz protokół nie wymaga technicznej precyzji wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych ani zręcznych manipulacji metodami "kanapkowymi" agarozy, co ułatwia osiągnięcie spójnych przygotowań od biegu do biegu 14,16,36. Ponadto system jest ekonomiczny. Komora ze stali nierdzewnej jest sterylizowalna i wielokrotnego użytku (w przeciwieństwie do jednorazowych komór plastikowych), a konfiguracja nie wymaga specjalistycznego sprzętu16,37. Komorę można łatwo dopasować do różnych systemów mikroskopowych za pomocą dostępnych na rynku wkładek stolikowych. Dodatkowo, ponieważ bakterie są unieruchomione na granicy faz agarozy ze szkłem pokrywającym, odnieśliśmy sukces w śledzeniu wysoce ruchliwych bakterii, takich jak P. aeruginosa, jednocześnie pozwalając na zmiany morfologiczne (Figura 4, Dodatkowe wideo 4). Inne techniki obrazowania pojedynczych komórek, takie jak "maszyna matka", ograniczają komórki do kanałów, które uniemożliwiają obserwację zmian morfologicznych innych niż filamentacja36.

Aby odnieść sukces z tym protokołem, należy pamiętać o kilku krytycznych krokach i parametrach. Do przygotowania padu ważne jest, aby dokładnie podgrzać i stopić agarozę, ponieważ wszelkie pozostałe kryształy agarozy spowodują dyfrakcję światła i wpłyną na jakość obrazu. Podobnie należy zadbać o to, aby pipetować agarozę do komory bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Aby zapewnić, że grubość padów agarozowych pozostaje stała i aby ograniczyć dryft próbki, ważne jest, aby przed rozpoczęciem obrazowania umożliwić elektrodę zrównoważenie - zwykle przez 15 minut - w wilgotnej obudowie o kontrolowanej temperaturze. Innym czynnikiem, który może powodować słabą jakość obrazu, jest kontrola wilgotności: niska wilgotność spowoduje odwodnienie i kurczenie się podkładki agarozowej, podczas gdy wysoka wilgotność (lub niewłaściwe ogrzanie próbki w komorze) może spowodować kondensację ciepłego powietrza na próbce i zniekształcenie obrazowania. Przykład nieoptymalnego obrazowania poklatkowego z powodu kondensacji można znaleźć w filmie uzupełniającym 8.

Ograniczeniem obecnej konfiguracji jest to, że pożywki hodowlane nie mogą być wymieniane, co uniemożliwia ciągłe śledzenie poszczególnych bakterii przed, w trakcie i po antybiotykoterapii. Przewidujemy, że sprzężenie podkładki agarozowej z komórkami przepływowymi lub urządzeniami mikroprzepływowymi, które umożliwiają wymianę pożywek hodowlanych, może umożliwić śledzenie populacji podczas zmian żywieniowych lub środowiskowych. Kolejnym parametrem obecnej konstrukcji, który można poprawić, jest napowietrzanie próbek. Uszczelka typu O-ring, przykręcana górna konstrukcja wymiennej czaszy szkiełka nakrywkowego umożliwia lepsze napowietrzanie próbki w porównaniu z konfiguracjami, które wymagają użycia uszczelniacza na bazie wosku lub smaru do uszczelnienia padów16. Jednak napowietrzanie w szczelnie zamkniętej komorze może być nadal ograniczone i może nie sprzyjać wzrostowi obligatoryjnych tlenowców, choć pozostaje to do przetestowania.

Protokół przygotowania próbki do obrazowania poklatkowego, który przedstawiamy w tym artykule, umożliwia śledzenie tysięcy bakterii w trakcie ich reakcji na antybiotykoterapię lub powrotu do zdrowia po antybiotykoterapii. Metoda ta jest również wysoce uogólniona i ma wiele potencjalnych zastosowań poza biologią przetrwałych. Na przykład układ podkładki agarozowej i rozdzielacza pozwala na wysiewanie przestrzennie oddzielonych próbek komórek, a jednocześnie umożliwia komunikację komórka-komórka poprzez dyfuzję przez podkładkę agarozową. Obecnie badamy potencjał tej konfiguracji do testowania, w jaki sposób wymiana wydzielanych produktów wpływa na wzrost komórek w społecznościach wielogatunkowych. Przewidujemy, że protokół ten zapewni niską barierę wejścia do mikroskopii poklatkowej dla nowego badacza i nieograniczone możliwości dla doświadczonego mikrobiologa.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Pani Susan Staurovsky z UConn Health Center for Cell Analysis and Modeling Microscopy Facility za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów mikroskopowych. Dziękujemy dr Mona Wu Orr i Warsztatom Genetyki i Metabolizmu Podstaw Gronkowca za ich protokoły i porady dotyczące klonowania odpowiednio u P. aeruginosa i S. aureus. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health (NIH; DP2GM146456-01 i 1R01AI167886-01A1 do W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 do P.J.H. i 1F31DK136259-01A1 do T.J.L.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu naszych eksperymentów ani w przygotowaniu tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Certyfikowana biologia molekularna AgarozaBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Wymienne naczynie ze szkła nakrywkowegoBioptechs190310-35ICD 35 mm do przygotowania wacików agarozowych; w zestawie szkiełka
nakrywkowe 30 mm (#1,5)Silnik świetlny LED Lumencor Spectra 7 Silnik świetlnyLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7
Urządzenia molekularneMetaMorphWersja Premier 7.10.5
Kamera pco.edge 4.2 bi sCMOSKamera Excelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOS
Komora inkubacyjna na żywo PeCon peConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific Okrągłe szkło nakrywkowe, grubość #1.5, 25 mm, opakowanie 100 sztFisher ScientificNC127277025 mm (#1.5) szkiełka nakrywkowe
Mikroskop Zeiss Axiovert 200MZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlMikroskop odwrócony z obiektywem Plan-Apochromat 63x/1,40 Oil Ph3 M27, silnikiem światła LED Lumencor Spectra 7 i kamerą pco.edge 4.2 bi sCMOS (rozmiar piksela 6,5 mm)
LED .

Bibliografia

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).
  2. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).
  3. Conlon, B. P. Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells. Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).
  4. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  5. Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. Ecology and evolution of antibiotic persistence. Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).
  6. Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication. ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).
  7. Mempin, R., et al. Release of extracellular ATP by bacteria during growth. BMC Microbiol. 13, 301(2013).
  8. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).
  9. Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies. J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).
  10. Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters. FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).
  11. Levin, B. R., Rozen, D. E. Non-inherited antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).
  12. Davis, K. M., Isberg, R. R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).
  13. Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).
  14. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. 53, e3145(2011).
  15. Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin. Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).
  16. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  17. Pang, Y. Y., et al. agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils. J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).
  18. Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).
  19. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).
  20. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  21. Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  22. Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  23. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).
  24. Coe, K. A., et al. Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).
  25. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).
  26. Shee, C., et al. Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. eLife. 2, e01222(2013).
  27. Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance. Pathogens. 10 (2), 165(2021).
  28. Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa. Metab Eng. 41, 67-81 (2017).
  29. Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO. J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).
  30. Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones. mBio. , e0271424(2024).
  31. Power, A. D., Mok, W. W. K. Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance. J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nat Commun. 8, 14836(2017).
  34. Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).
  35. Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  36. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  37. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia time lapseobrazowanie epifluorescencyjnepersistencja antybiotykowaobrazowanie pojedynczych kom rekprzygotowanie podk ad w agarozowychreportery fluorescencyjnebarwienie jodkiem propidiumkom rki persistery

Powiązane artykuły