Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomiar ilościowych fenotypów lub cech roślin jest niezbędny do zrozumienia reakcji roślin na czynniki środowiskowe, w tym stresy biotyczne i abiotyczne. Jednak tradycyjne metody pomiaru roślin mogą być czasochłonne, niedokładne i destrukcyjne, szczególnie w przypadku indywidualnej oceny cech, takich jak biomasa i wysokość. Analiza oparta na obrazie daje możliwość zmniejszenia nakładu pracy, poprawy dokładności i precyzji oraz umożliwienia powtarzających się pomiarów tego samego zakładu w wielu punktach czasowych. Chociaż wysokowydajne urządzenia do fenotypowania stanowią rozwiązanie, często są one zbyt drogie i mają ograniczoną dostępność na całym świecie. Opisano metodę przechwytywania obrazów roślin przy użyciu tanich komputerów jednopłytkowych i aparatów cyfrowych w konfiguracji studia fotograficznego, której towarzyszy potok analizy obrazu oparty na bezpłatnym pakiecie PlantCV o otwartym kodzie źródłowym. Ta metoda oferuje szybki i dokładny protokół przechwytywania, etykietowania i przesyłania obrazów, a także najlepsze praktyki zapewniające pozyskiwanie obrazów wysokiej jakości. Poprzez analizę obrazu określono ilościowo ponad 10 fenotypów dla wszystkich obrazów w eksperymencie jednocześnie, w tym cechy takie jak wielkość rośliny, wysokość i kolor. Metody te wykorzystano do scharakteryzowania reakcji odmiany B73 wsobnej Zea mays (kukurydza) na upały, suszę oraz warunki stresu abiotycznego związanego z upałami i suszą.
Wprowadzenie
Pomiar cech roślin, czyli fenotypów, jest kluczowy dla odpowiedzi na podstawowe i stosowane pytania w nauce o roślinach. Na przykład badacz chcący zrozumieć wpływ mutacji genetycznej na wielkość rośliny będzie musiał ilościowo zmierzyć wysokość rośliny i powierzchnię liści1. Badacz stosujący stres biotyczny (taki jak infekcja bakteryjna, wirusowa lub grzybicza) lub stres abiotyczny (taki jak susza, upał, zimno lub wyczerpanie składników odżywczych) będzie musiał zbadać wpływ stresu na kolor roślin lub "zieleń", aby zmierzyć chlorozę2,3.
Podczas gdy pomiar tych cech jest niezbędny dla podstawowej biologii roślin, jak również dla stosowanej hodowli roślin, pomiary tych cech ręcznie mogą być czasochłonne, nieprecyzyjne i niedokładne4,5,6,7. Na przykład mierzenie wysokości roślin obejmuje ręczne używanie linijki dla każdej rośliny, często w gorących lub wilgotnych warunkach środowiskowych, i jest obarczone błędem z punktu widzenia osoby mierzącej, a także tego, który punkt jest uważany za "wierzchołek" rośliny. Co więcej, pomiary takie jak zawartość biomasy i pigmentu są destrukcyjne, a ta sama roślina nie może być mierzona pod kątem zmian w czasie ani używana do wielokrotnego pobierania próbek, ponieważ musi zostać zniszczona w procesie dokonywania tych pomiarów4,5,6,7. Czasochłonny, podatny na błędy charakter tych pomiarów utrudnia postęp w ocenie roślin pod kątem ich fenotypowych i fizjologicznych reakcji na stres.
Przechwytywanie obrazów roślin i mierzenie cech ilościowych na podstawie obrazu dostarcza rozwiązań tych problemów4,5,6,7. Analiza obrazu poprawia dokładność i precyzję, jednocześnie skracając czas potrzebny badaczowi na wykonanie pomiarów, a ta sama roślina może być wielokrotnie obrazowana lub wykorzystana do innych próbek dzięki nieniszczącej kwantyfikacji cech4,5,6,7. Co więcej, obrazy mogą być przechowywane i ponownie analizowane długo po zakończeniu eksperymentu i pozbyciu się roślin4,5,6,7. Analizę obrazu można przeprowadzić indywidualnie za pomocą narzędzi do edycji obrazów o niskiej przepustowości, takich jak ImageJ (Fiji)8, lub w przypadku wyższej przepustowości przy użyciu wizji komputerowej i uczenia maszynowego za pomocą platform takich jak PlantCV9. PlantCV to bezpłatna platforma do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, która umożliwia naukowcom najpierw zamaskowanie (lub oddzielenie) rośliny lub innego obiektu od tła obrazu i dokonanie pomiarów rozmiaru, morfologii, koloru i innych parametrów tej rośliny lub obiektu9. Korzystając z modułowego przepływu pracy, badacz najpierw tworzy elastyczny przepływ pracy (lub potok) różnych modułów z przykładowym obrazem, a następnie poddaje pozostałe obrazy przepływowi pracy o wysokiej przepustowości bez interakcji z każdym pojedynczym obrazem9. Cechy ilościowe są wyprowadzane i analizowane pod kątem statystycznie istotnych różnic między grupami. Potoki głębokiego uczenia mogą być opracowywane w celu wydajnej, zautomatyzowanej analizy obrazu po przechwyceniu wystarczającej liczby obrazów i oznaczeniu ich odpowiednimi pomiarami cech lub metadanymi10.
fenotypowanie o wysokiej przepustowości może zwiększyć szybkość i zmniejszyć nakład pracy ludzkiej podczas zbierania danych i/lub podczas analizy danych4,5,6,7. Wysokowydajne urządzenia do fenotypowania umożliwiły automatyzację zbierania obrazów w kontrolowanych środowiskach, w których rośliny przemieszczają się na przenośnikach taśmowych lub za pośrednictwem robotów do stacji obrazowania i są automatycznie oznaczane nazwą (tj. etykietą z metadanymi) powiązaną z zakładem6,11,12,13,14. Chociaż te przenośniki taśmowe lub urządzenia wyposażone w roboty umożliwiają przechwytywanie i etykietowanie dużych ilości obrazów bez interwencji człowieka, jest ich niewiele na świecie, a ich budowa może kosztować miliony dolarów, co czyni je niedostępnymi dla wielu badaczy. Aby zastosować te koncepcje automatycznego obrazowania przy niższych kosztach, Raspberry Pi (tutaj określane jako komputery jednopłytkowe, SBC) to tanie komputery (mniej niż 35 USD za sztukę), które były używane do przechwytywania, nazywania, przechowywania i przesyłania obrazów roślin uprawianych w kontrolowanych środowiskach. Te konfiguracje przechwytują obrazy w zautomatyzowanych, czasowych odstępach czasu przy użyciu tablicy do 72 Raspberry Pi12,15,16. Chociaż są bardziej opłacalne niż systemy przenośników taśmowych, które mogą kosztować miliony dolarów, wcześniej opisane komory wzrostu SBC są najbardziej odpowiednie do widoku z góry na rosnące małe rośliny i nadal wymagają wielu SBC15. W środowiskach polowych portale, bezzałogowe systemy powietrzne (UAS), takie jak drony i satelity, rejestrują obrazy w celu analizy cech roślin17,18. Zarówno systemy terenowe, jak i obiekty o kontrolowanej przepustowości mogą być zaporowe pod względem kosztów początkowych, konserwacji i wiedzy eksperckiej niezbędnej do budowy i konserwacji systemów, a także analizowania obrazów17,18. Telefony komórkowe i aparaty cyfrowe używane samodzielnie do fotografowania roślin stanowią czasochłonne wyzwanie związane z przesyłaniem obrazów i nazywaniem ich za pomocą metadanych, co jest niezbędne do dalszej analizy obrazu.
Opisane tutaj metody stanowią tanie rozwiązanie do obrazowania roślin dla wyzwań, które nie zostały rozwiązane przez inne systemy. Konfiguracja fotograficzna, w której rośliny są transportowane indywidualnie do studia, pozwala na sprawny pomiar roślin wszystkich rozmiarów w doniczkach. Korzystając z kontrolera SBC podłączonego do aparatu cyfrowego, ta metoda najpierw zapewnia ustandaryzowane przechwytywanie, etykietowanie i przesyłanie obrazów. Używanie klawiatury lub skanera kodów QR/kodów kreskowych do nazywania obrazów w trakcie ich przechwytywania pozwala uniknąć czasochłonnej i podatnej na błędy czynności polegającej na zmianie nazw obrazów za pomocą metadanych po ich przechwyceniu i przechowywaniu. Kompozycja obrazu i zalecane ustawienia kamery są ważne dla umożliwienia dalszej analizy obrazu, a wytyczne są szczegółowo opisane tutaj. Na koniec dostępny jest potok analizy obrazu w PlantCV w celu wyodrębnienia cech ilościowych z przechwyconych obrazów, takich jak powierzchnia liści, wysokość, szerokość i kolor rośliny.
W porównaniu do systemów przenośników taśmowych, ta metoda jest tania i wymaga jednego SBC. Opisana tutaj konfiguracja fenotypowania została skonstruowana w celu wyeliminowania ograniczeń i kosztów związanych z przenośnikiem taśmowym lub systemami zrobotyzowanymi - można zmierzyć instalację o dowolnej wielkości, ponieważ konfigurację można oddzielić od przestrzeni wzrostu, potrzebny jest tylko jeden kontroler SBC i współpracuje z wieloma typami kamer, zapewniając maksymalną elastyczność i przystępność cenową. Podobne podejścia do przedstawionego tutaj obejmują PhenoBox lub PhenoRig12,19. W porównaniu z pomiarami ręcznymi, ta metoda oszczędza czas, zmniejsza liczbę błędów i nie niszczy roślin4,12,15,19.
Protokół
Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu używanego w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie studia fotograficznego
- Zawieś czarną tkaninę klasy fotograficznej na ścianie lub suficie, aby uzyskać widok z boku. Ułóż tkaninę co najmniej 0,5 m na podłodze tak, aby roślina była umieszczona na wierzchu tkaniny (Rysunek 1).
UWAGA: Tkanina powinna być co najmniej 100 cm wyższa i szersza niż roślina, która ma być sfotografowana. - Umieść kartę kolorów na tle, opierając się o obiekt, taki jak pudełko, tak aby był widoczny w ramce (Rysunek 1). W przypadku roślin o wysokości lub szerokości większej niż 30 cm użyj karty kolorów o szerokości co najmniej 20 cm. W przypadku roślin o wysokości lub szerokości mniejszej niż 30 cm użyj karty kolorów o szerokości od 4 do 8 cm.
- Podłącz kartę SD do laptopa lub komputera stacjonarnego. Pobierz Raspberry Pi Imager z sekcji oprogramowania na stronie internetowej (https://www.raspberrypi.com/software/), a następnie pobierz dostarczony plik raspberrypi-image-capture.img.gz (https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper) na laptopa lub komputer stacjonarny.
- Uruchom program Imager, otwierając pobrany plik imagera (.exe). Kliknij przycisk Wybierz system operacyjny i wybierz przycisk Użyj niestandardowego na dole. Wybierz plik image-capture.img.gz.
- Następnie kliknij przycisk Wybierz pamięć i wybierz kartę SD podłączoną do komputera. Kliknij przycisk Zapisz.
UWAGA: Upewnij się, że wybrano właściwą kartę SD, ponieważ ten proces spowoduje usunięcie wszystkich danych zapisanych na karcie.
- Następnie kliknij przycisk Wybierz pamięć i wybierz kartę SD podłączoną do komputera. Kliknij przycisk Zapisz.
- Podłącz najnowszą wersję SBC do klawiatury za pomocą USB, do zewnętrznego monitora za pomocą HDMI oraz do listwy zasilającej za pomocą przewodu zasilającego z przełącznikiem. Podłącz monitor do listwy zasilającej za pomocą przewodu zasilającego dostarczonego z monitorem. Umieść kartę SD w kontrolerze SBC. Zobacz Rysunek 1 dla opisanego schematu konfiguracji.
- Włącz listwę zasilającą, naciskając przełącznik na pasku, włącz monitor za pomocą przycisku na monitorze, a następnie włącz kontroler SBC, przestawiając przełącznik na przewodzie zasilającym na pozycję "on".
- Podłącz kontroler SBC do lokalnego Internetu za pomocą sieci WIFI lub Ethernet.
- Jeśli zdjęcia mają być przesyłane bezpośrednio na serwer lub do magazynu w chmurze:
- Edytuj plik "CAPTURE-PHOTO.py" na kontrolerze SBC, aby zawierał ścieżkę do pliku, aby zakończyć przesyłanie.
- Edytuj plik win-credentials ze ścieżką i hasłem do serwera lub magazynu w chmurze za pomocą następującego polecenia w terminalu: sudo nano /etc/win-credentials.
UWAGA: Skontaktuj się z administratorem systemu internetowego, aby upewnić się, że folder ma uprawnienia do przesyłania plików.
- Podłącz bezprzewodowy skaner kodów kreskowych do kontrolera SBC, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do skanera kodów kreskowych, za pomocą USB lub Bluetooth.
- Wyłącz kontroler SBC, klikając przycisk Raspberry Pi w lewym górnym rogu ekranu, klikając Wyloguj, a następnie klikając Zamknij, aby bezpiecznie wyłączyć kontroler SBC. Po wyłączeniu należy przełączyć wyłącznik zasilania SBC w położenie "włączone", przewód zasilający w pozycję "wyłączoną", a listwę zasilającą w pozycję "wyłączoną".
2. Wzrost roślin i leczenie stresu
UWAGA: Każda roślina nadaje się do tej metody fenotypowania; te metody wzrostu roślin mają zastosowanie do reprezentatywnych wyników przedstawionych tutaj.
- Nasiona witaminy B73 lub innej odmiany kukurydzy należy uzyskać w magazynie.
- Przygotuj podłoża glebowe i warunki wzrostu:
- Napełnij 3,5-calowe doniczki (0,7 l) mieszanką Turface MVP i Berger BM7-35 o objętości 1:1 z 3 funtami / jard sześcienny nawozu o spowolnionym uwalnianiu 14-14-14 (N-P-K). Umieść doniczki na tacy z otworami i dokładnie podlej wodą z odwróconej osmozy (RO).
- Ustaw komorę wzrostową na następujące warunki środowiskowe: 30 °C w dzień / 20 °C w nocy, 16 godzin w ciągu dnia, 60% wilgotności i 500 mmol.m-2 s-1 światła na poziomie doniczki w ciągu dnia. Ustaw oddzielną komorę wzrostową z tymi samymi warunkami, z wyjątkiem 38 °C w dzień / 28 °C w nocy dla stresu cieplnego.
- Posadź 20 nasion kukurydzy, każde w 3,5-calowej doniczce, umieszczając ~ 2 cm głębokości w glebie i przykrywając ją przemieszczoną ziemią. Dokładnie podlać wodą RO i umieścić w komorze kontrolnej wzrostu. Podlewaj codziennie płynnym nawozem (mieszać zgodnie z instrukcjami producenta; patrz tabela materiałów).
UWAGA: Sadzenie dodatkowych roślin, które są potrzebne do eksperymentu, będzie uwzględniać słabe kiełkowanie i brak jednorodności przed rozpoczęciem aplikacji stresowej. Szybkość kiełkowania będzie się różnić w zależności od odmiany. - Po 21 dniach wzrostu przesadź 16 najbardziej jednorodnych roślin (n = 4 rośliny na zabieg) do doniczek o pojemności 3,79 l wypełnionych tą samą mieszanką ziemi doniczkowej, wstępnie zwilżoną wodą RO. Zwróć rośliny do kontrolnej komory wzrostu.
- W 25 dniu (4 dni po przesadzeniu) przenieś połowę roślin (n = 8) do komory stresu cieplnego w momencie, gdy w komorze zapalą się światła. Przestań podlewać rośliny dotknięte suszą w obu komorach (n = 4 na komorę).
UWAGA: Rośliny narażone na stres suszy mogą wymagać podlewania, aby rośliny przetrwały do końca eksperymentu; Tutaj rośliny suszy były podlewane w 31 i 37 dniu wodą nawozową. - W 38 dniu (13 dni po rozpoczęciu stresu) usuń rośliny z komór wzrostowych w celu obrazowania.
3. Obrazowanie roślin
- Uruchom kontroler SBC (patrz Rysunek 2):
- Włącz listwę zasilającą za pomocą przełącznika na listwie zasilającej.
- Włącz monitor za pomocą przycisku na monitorze.
UWAGA: Jeśli kontroler SBC zostanie włączony przed włączeniem monitora, nie uruchomi się poprawnie. - Ustaw przełącznik na przewodzie zasilającym SBC w pozycji "on".
UWAGA: Spowoduje to włączenie kontrolera SBC i uruchomienie na monitorze; na samym SBC nie ma przełącznika "on", tylko na przewodzie zasilającym.
- Umieść aparat na statywie lub stabilnym stole.
UWAGA: Cała roślina i karta kolorów powinna być widoczna na ekranie aparatu. Kamera powinna być prostopadła do podłoża i mieć bezpośredni view (bez kąta) środka rośliny. Aparat musi być kompatybilny z pakietem gphoto2, a listę można znaleźć tutaj: http://www.gphoto.org/proj/libgphoto2/support.php. - Podłącz zasilanie do aparatu za pomocą przewodu zasilającego dołączonego do aparatu lub baterii. Włącz aparat za pomocą przycisku na aparacie.
- Podłącz aparat do portu USB w kontrolerze SBC za pomocą do przesyłania danych dostarczonego z aparatem.
- Ułóż roślinę w konfiguracji fotograficznej:
- Umieść kawałek ciemnej taśmy na tkaninie fotograficznej, w której zostanie umieszczona doniczka, aby upewnić się, że rozmieszczenie jest takie samo dla każdej rośliny. Upewnij się, że karta kolorów jest wyrównana z kawałkiem taśmy.
UWAGA: Umieść kartę kolorów w odległości co najmniej 10 cm od krawędzi rośliny. Podczas kontroli jakości w przepływie pracy PlantCV (poniżej), obraz powinien być w stanie przyciąć tak, aby zawierał tylko roślinę i doniczkę, ale nie kartę kolorów, aby zapewnić, że próbki kolorów nie zostaną uwzględnione w ostatecznej ekstrakcji cechy. Zobacz Rysunek 2 dla przykładów obrazów o wysokiej i niskiej jakości. - Umieść garnek na kawałku taśmy. W przypadku roślin rosnących w płaszczyźnie, takich jak kukurydza (Zea mays) i sorgo (Sorghum bicolor), skieruj najszerszą roślinę pod najszerszym kątem w stronę aparatu. W przypadku roślin, które nie rosną w płaszczyźnie, uchwyć kąty 0 i 90 stopni rośliny i uśrednij wynikowe pomiary ilościowe po zakończeniu analizy obrazu.
- Umieść kawałek ciemnej taśmy na tkaninie fotograficznej, w której zostanie umieszczona doniczka, aby upewnić się, że rozmieszczenie jest takie samo dla każdej rośliny. Upewnij się, że karta kolorów jest wyrównana z kawałkiem taśmy.
- Na ekranie pulpitu SBC wyświetlonym na monitorze otwórz terminal, klikając przycisk terminala w lewym górnym pasku menu.
- Jeśli zapisujesz bezpośrednio na serwerze lub w chmurze, zamontuj pamięć masową za pomocą następującego polecenia, edytując niezbędną ścieżkę magazynu w chmurze (ścieżka do magazynu w chmurze w poniższym przykładzie) i hasło, wpisując wiersz kodu w otwartym oknie terminala i naciskając Enter na klawiaturze. Jeśli nie zmieni się w stosunku do ustawień fabrycznych, identyfikator użytkownika (UID) będzie brzmiał "pi".
UWAGA:
sudo mount -t cifs -o credentials=/etc/win-credentials,uid=pi //ścieżka-przechowywania-w chmurze /mnt/magazynowanie-w chmurze - Wpisz następujący kod w terminalu i naciśnij Enter na klawiaturze. Pojawi się nowe okno.
./RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh
UWAGA: Plik RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh wywołuje plik CAPTURE-PHOTO.py, który jest wstępnie załadowany do liczby pi, jeśli został załadowany przy użyciu powyższej metody. Alternatywnie, te skrypty zostały udostępnione na GitHub do umieszczenia na istniejącej karcie SD Raspberry Pi. - Otworzy się okno graficznego interfejsu użytkownika. Wpisz nazwę obrazu lub zeskanuj kod kreskowy lub kod QR zakładu za pomocą skanera kodów kreskowych.
- Wybierz opcję zapisania obrazu lokalnie lub na zamontowanym serwerze/w chmurze.
- Kliknij Kliknij tutaj, aby zrobić zdjęcie! guzik.
- Jeśli wybrano pamięć lokalną, otwórz folder ZDJĘCIA na pulpicie, aby sprawdzić obraz. Jeśli wybrano serwer lub magazyn w chmurze, otwórz obraz w tej lokalizacji.
- W razie potrzeby dostosuj ustawienia aparatu, odłączając go od kontrolera SBC, postępując zgodnie z instrukcjami producenta i podłączając go z powrotem do kontrolera SBC.
UWAGA: Ustawienia, takie jak ekspozycja, jasność, kontrast itp., mogą wymagać dostosowania w zależności od oświetlenia w pomieszczeniu i fotografowanego obiektu. Częstym błędem jest prześwietlanie obrazów. Aby sprawdzić naświetlenie obrazu testowego, należy przejść przez proces analizy obrazu PlantCV, który obejmuje kontrolę jakości ekspozycji. Dostosuj ustawienia aparatu zgodnie z potrzebami, aby zmniejszyć lub zwiększyć ekspozycję, aż histogramy zostaną odpowiednio rozłożone. - Po przechwyceniu wszystkich obrazów przenieś je z kontrolera SBC do komputera lokalnego lub pamięci masowej w chmurze, korzystając z preferowanej metody, takiej jak pamięć USB, przeglądarka internetowa lub transfer SSH.
4. Wyodrębnianie cech z obrazów
- Pobierz następujące pliki na komputer lokalny lub serwer: "photo-studio-SV-notebook.ipynb", "workflow.py" i "photo-studio-SV-config.json". Wszystkie pliki są dostępne na GitHubie (https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper).
- Zainstaluj PlantCV na lokalnym komputerze lub serwerze, wykonując czynności opisane (https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/).
- Otwórz plik photo-studio-SV-notebook.ipynb przy użyciu preferowanego edytora kodu, takiego jak JupyterLab lub Visual Studio Code.
- Uruchom każdy blok kodu, edytując go w razie potrzeby, biorąc pod uwagę parametry opisane w bloku kodu, aby uzyskać czystą maskę tylko rośliny na obrazie.
- Gdy analiza przykładowego obrazu jest zadowalająca, otwórz plik workflow.py w preferowanym edytorze kodu. Edytuj ten plik z dowolnymi parametrami zmienionymi w "photo-studio-SV-notebook.ipynb" i zapisz go.
- Otwórz plik photo-studio-SV-config.json i edytuj ścieżki plików, aby kierować do folderu obrazów wejściowych, żądanego folderu wyjściowego itp., Jak oznaczono w pliku.
- Otwórz terminal i uruchom następujący kod, aby aktywować PlantCV. Aby to zrobić, wpisz kod conda activate plantcv w terminalu i naciśnij enter na klawiaturze.
- Zmień następujący wiersz kodu na ścieżkę pliku "photo-studio-SV-config.json" (jest to jedyna zmiana, którą należy wprowadzić w poniższym kodzie).
- W terminalu wpisz edytowany kod i naciśnij enter na klawiaturze. Spowoduje to uruchomienie przepływu pracy na wszystkich obrazach przechwyconych w eksperymencie.
UWAGA:
plantcv-run-workflow --config /użytkownicy/NAZWA_UŻYTKOWNIKA/photo-studio-SV-config.json
- W terminalu wpisz edytowany kod i naciśnij enter na klawiaturze. Spowoduje to uruchomienie przepływu pracy na wszystkich obrazach przechwyconych w eksperymencie.
- Sprawdź obrazy wyjściowe, aby określić, czy kod jest odpowiedni dla wszystkich obrazów.
UWAGA: Niebiesko-różowy kontur rośliny powinien znajdować się wokół krawędzi rośliny, a na obrazie nie powinno być żadnych innych obiektów. W razie potrzeby wróć do "photo-studio-SV-analysis.ipynb" i przetestuj problematyczne obrazy oraz edytuj kod, w szczególności kroki maskowania i redukcji szumów, aby uzyskać pożądane rezultaty. Zobacz Rysunek 3, aby zobaczyć przykłady segmentacji obrazów o wysokiej, akceptowalnej i niskiej jakości. - Plik wyjściowy będzie miał postać pliku .json. Wróć do terminala (upewnij się, że conda activate plantcv została już uruchomiona), wpisz następujący kod i naciśnij enter na klawiaturze, aby przekonwertować plik na .csv do dalszej analizy statystycznej, zmieniając ścieżkę pliku na plik "results-photo-studio.json".
plantcv-utils json2csv -j /Użytkownicy/NAZWA_UŻYTKOWNIKA/results-photo-studio.json -c /Użytkownicy/NAZWA_UŻYTKOWNIKA/results-photo-studio.csv
UWAGA: Aby przekonwertować pomiary z pikseli na standardową jednostkę miary, taką jak cm, skorzystaj z konwersji dostarczonej przez funkcję find_color_card w przepływie pracy PlantCV. - Przeprowadź analizę statystyczną wyjściowych cech ilościowych w celu określenia różnic w fenotypach roślin ze względu na różne gatunki roślin, odmiany, zabiegi i punkty czasowe.
UWAGA: Pakiet pcvr w R Studio został sformułowany do analizowania danych wyjściowych z PlantCV pod kątem istotności statystycznej i wykreślania wyników20. Zobacz podsumowanie i wizualną reprezentację cech zebranych w Rysunek 4.
Wyniki
W celu opracowania tej metody oceniono fenotypy ilościowe roślin kukurydzy B73 w temperaturach kontrolnych i podwyższonych, w warunkach odpowiedniego nawodnienia oraz suszy, a także w ich kombinacjach, co łącznie dało cztery warianty traktowania. B73 jest dobrze znaną linią inbredową kukurydzy z bogatymi danymi genetycznymi21.
Analiza obrazu w programie PlantCV pomyślnie skorygowała kolory zdjęć, przypisała wyniki ilościowe do metadanych roślin oraz przeprowadziła segmentację (innymi słowy, oddzielenie) rośliny od tła, co przedstawiono na Rysunku 3. Nieudana analiza dostarczyłaby obrazy wynikowe, na których nie widać niebieskiego obrysu ani różowego kształtu wokół rośliny, lecz występuje dodatkowy szum lub brakujące fragmenty rośliny (Rysunek 3, przykład niskiej jakości). Aby uwzględnić w masce jak największą część rośliny, konieczne było zastosowanie progu dwukanałowego (alternatywne strategie jednokanałowe opisano w pliku „photo-studio-SV-notebook.ipynb”). Niemniej jednak, u niektórych roślin, szczególnie tych z łodygami o fioletowym zabarwieniu, segmentacja nie była idealna, lecz okazała się wystarczająca do dalszej analizy (Rysunek 3).
Analiza w programie PlantCV dostarczyła 16 ilościowych cech o pojedynczej wartości, przedstawionych podsumowująco na Rysunku 4. Cecha o pojedynczej wartości dostarcza jednej wartości na roślinę – na przykład powierzchni liścia, wysokości, szerokości oraz średniej kołowej odcienia. Powierzchnię liścia określono przy użyciu funkcji „analyze.shape” (Rysunek 4), uwzględniając całą roślinę. Wysokość i szerokość określono natomiast za pomocą funkcji „analyze.bound_horizontal”, z linią ograniczającą wyznaczoną na poziomie linii gleby. Wynika to z faktu, że rośliny zwisające poza krawędź doniczki miałyby większą wysokość, gdyby traktować roślinę jako obiekt w całości; zamiast tego pomiar powinien być prowadzony wyłącznie od podstawy rośliny w miejscu jej styku z glebą. Oprócz cech o pojedynczej wartości, PlantCV generuje cechy wielowartościowe w formie histogramów, w szczególności dla wartości kolorów, reprezentujących każdy piksel rośliny. Średnia kołowa odcienia jest cechą o pojedynczej wartości, która stanowi średnią wartość odcienia dla całej rośliny.
Aby określić, które cechy są najistotniejsze, obliczono wariancję wyjaśnioną przez czynnik traktowania dla każdej cechy, a także korelację między poszczególnymi cechami, wykorzystując funkcję „frem” w pakiecie pcvr dla środowiska R Studio.20 (Rysunek 5A). Do dalszych analiz wybrano powierzchnię liścia, wysokość, szerokość oraz średnią kołową odcienia, ponieważ parametry te wyjaśniały ponad 50% wariancji wynikającej z zastosowanej próby i stanowią istotne miary wzrostu roślin (powierzchnia, wysokość i szerokość) oraz ich stanu zdrowotnego (odcień). Reprezentatywne zdjęcia roślin o największej i najmniejszej powierzchni liścia obrazują zróżnicowanie fenotypów zebranych w tym eksperymencie (Rycina 5B,C, odpowiednio). Roślina o największej powierzchni liści wykazywała również najwyższą średnią wartość odcienia i była rośliną linii B73, dobrze nawodnioną i poddaną stresowi termicznemu (Rycina 5B). Najmniejsza powierzchnia liścia charakteryzowała się najniższą średnią barwą (Rysunek 5C), i była to roślina odmiany B73 poddana stresowi suszy oraz stresowi cieplnemu.
Obróbka wodna miała istotny wpływ na powierzchnię liścia (F(1,13) = 226.5, p = 1.32 x 10-9), wysokość (F(1,13) = 21.1, p = 0.0005), szerokość (F(1,13) = 75.5, p = 8.92 x 10-7) oraz średnią kołową barwy (F(1,13) = 27.8, p = 0.0002), co określono za pomocą modelu regresji liniowej dla efektu obróbki oraz dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w programie R Studio (pełne wyniki w Tabeli 1). Obróbka temperaturą miała istotny wpływ na wysokość (F(1,13) = 5.94, p = 0.03), lecz nie na powierzchnię liścia, szerokość ani średnią kołową barwy (p > 0.05, Tabela 1). Interakcja między temperaturą a stanem wodnym nie była istotnym czynnikiem dla żadnej z mierzonych cech (p > 0.05, Tabela 1).
Następnie poszczególne warianty zabiegów porównano z grupą kontrolną oraz między sobą, wykorzystując regresję liniową i test post-hoc (szacowane średnie marginalne) z korektą Sidaka dla porównań wielokrotnych (Rycina 6). Powierzchnia liści, wysokość rośliny, szerokość rośliny oraz średnia kołowa odcienia były znacząco zredukowane u roślin poddanych stresowi suszy w porównaniu do roślin dobrze podlanych w obu warunkach temperaturowych (p < 0,05, Rycina 6). Stres cieplny przy odpowiednim podlewaniu spowodował jedynie zmniejszenie wysokości rośliny (p < 0,05, Rycina 6), lecz nie wpłynął znacząco na powierzchnię liści, szerokość rośliny ani średnią kołową odcienia. Różnice w odcieniu można dokładniej zbadać poprzez analizę wielowartościowej cechy koloru – odcienia, przedstawionego w formie histogramu na Rycynie 7, zamiast opierać się wyłącznie na średniej. Obniżenie średniego odcienia spowodowane suszą wynikało z przesunięcia z pikseli zielonych na żółte, co jest znane jako chloroza (Rycina 7). Choć w przypadku wysokiej temperatury nie odnotowano znaczącej różnicy w średnim odcieniu, zaobserwowano zarówno redukcję, jak i wzrost wartości wynikające z żółknięcia (chlorozy) oraz ciemnienia koloru zielonego (Rycina 7).
Po obrazowaniu rośliny odcięto w miejscu przejścia korzenia w pęd, a następnie odnotowano masę części nadziemnej. Korzenie delikatnie przemyto i osuszono ręcznikiem, a następnie zważono, aby obliczyć całkowitą biomasę rośliny (zwaną również masą) w celu porównania z opisaną metodą fenotypowania opartą na analizie obrazu. Powierzchnia liści zmierzona poprzez analizę obrazu była silnie skorelowana z biomasą rośliny (R2 = 0,84, Rycina 8).
Rysunek 1: Zdjęcie układu studia fotograficznego z opisanymi elementami służącymi do gromadzenia obrazów roślin. (A) tkanina klasy fotograficznej, (B) karta kolorów, (C) linia z taśmy do jednorodnego rozmieszczania doniczek, (D) aparat cyfrowy, (E) komputer jednopłytkowy, (F) monitor wyświetlający proces przechwytywania obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Przegląd procesu obrazowania. Przedstawiono reprezentatywny obraz o „wysokiej jakości” oraz „niskiej jakości”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Przegląd przepływu pracy analizy obrazu w PlantCV. Przedstawiono reprezentatywne obrazy segmentacji o jakości „wysokiej”, „akceptowalnej” i „niskiej”; cechy PlantCV są reprezentowane za pomocą różowego obrysu kształtu całej rośliny oraz niebieskiego obrysu obszaru rośliny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Podsumowanie i wizualna reprezentacja cech kształtu uzyskanych z analizy. Funkcja kształtu w PlantCV. Fioletowe pola reprezentują cechy, które nie wykorzystują innych cech w swoich obliczeniach. Pomarańczowe pola reprezentują cechy, które wykorzystują inne cechy w swoich obliczeniach; strzałki wskazują, które cechy są użyte w tych obliczeniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Fenotypowanie oparte na obrazowaniu rejestruje wariancję fenotypową i cechy skorelowane. (A) Wariancja cech wyjaśniona przez zabieg (po prawej) oraz korelacja cech między sobą (po lewej). Każda cecha jest oznaczona, a następnie podano jej jednostkę pomiaru; „NA” oznacza pomiar bezjednostkowy. (B) Obraz rośliny, która miała największą powierzchnię liści i najwyższą kołową średnią barwy (stopnie). (C) Obraz rośliny, która miała najmniejszą powierzchnię liści i najniższą kołową średnią barwy (stopnie). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Porównanie wpływu zabiegów na fenotypy roślin za pomocą wykresu pudełkowego. Porównano powierzchnię liścia (A), wysokość (B), szerokość (C) oraz średnią kołową odcienia (D) pod kątem wpływu suszy, wysokiej temperatury oraz stresu kombinowanego. n = 4. Litery oznaczają statystycznie istotne różnice między zabiegami (p < 0.05); zabiegi porównano za pomocą regresji liniowej i testu post-hoc (estymowane średnie marginalne) z korektą Sidaka dla porównań wielokrotnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 7: Histogramy sumy kolorów (odcienia) wszystkich pikseli dla każdej kombinacji zabiegów, znormalizowane przez całkowitą liczbę pikseli w danej kombinacji. Histogramy są zabarwione zgodnie z wartością koloru dla danego stopnia odcienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Korelacja powierzchni liści zmierzonej z obrazów z biomasą całej rośliny. Każdy czarny punkt reprezentuje jedną roślinę. Różowa linia przedstawia liniową korelację między powierzchnią liści (X) a biomasą (Y). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Cecha | Czynnik | stopnie swobody | wartość F | wartość p |
| powierzchnia liścia (cm^2) | Temperatura | 1 | 0.5372 | 0.4766 |
| powierzchnia liścia (cm^2) | Woda | 1 | 226.5318 | 1.32E-09 |
| powierzchnia liścia (cm^2) | Temperatura:Woda | 1 | 2.1526 | 0.1661 |
| powierzchnia liścia (cm^2) | Reszty | 13 | ||
| wysokość (cm) | Temperatura | 1 | 5.9426 | 0.0298935 |
| wysokość (cm) | Woda | 1 | 21.107 | 0.0005029 |
| wysokość (cm) | Temperatura:Woda | 1 | 2.1752 | 0.1640545 |
| wysokość (cm) | Reszty | 13 | ||
| szerokość (cm) | Temperatura | 1 | 2.2495 | 0.1575 |
| szerokość (cm) | Woda | 1 | 75.5474 | 8.92E-07 |
| szerokość (cm) | Temperatura:Woda | 1 | 0.0839 | 0.7766 |
| szerokość (cm) | Reszty | 13 | ||
| średnia kołowa barwy (stopnie) | Temperatura | 1 | 0.9154 | 0.3561432 |
| średnia kołowa barwy (stopnie) | Woda | 1 | 27.7988 | 0.0001509 |
| średnia kołowa barwy (stopnie) | Temperatura:Woda | 1 | 3.4792 | 0.0848724 |
| średnia kołowa barwy (stopnie) | Reszty | 13 |
Tabela 1: Wyniki modelu regresji liniowej i analizy dwuczynnikowej ANOVA badających wpływ traktowania wodą, temperatury oraz ich interakcji na cechy roślin.
Dyskusja
Fenotypowanie oparte na obrazie zapewnia dokładne, szybkie i ilościowe pomiary fenotypów roślin 4,5,6,7. Ta metoda jest znacznie szybsza, bardziej precyzyjna, dokładniejsza i zapewnia większą liczbę pomiarów niż ręczne użycie linijki do zapisu wysokości rośliny lub jakościowych pomiarów cech kolorystycznych roślin, które mogą odnosić się do zdrowia 4,5,6,7. Zaobserwowano, że powierzchnia liści jest silnie skorelowana z biomasą roślinną (Rysunek 8), co sugeruje, że ta miara może niezawodnie zastąpić czasochłonny, destrukcyjny i podatny na błędy proces ręcznego ważenia biomasy całej rośliny. Podczas gdy do rejestrowania obrazów można było użyć samej kamery, dodanie niedrogiego kontrolera SBC zwiększyło przepustowość dzięki automatyzacji zbierania obrazów i etykietowania obrazów za pomocą niezbędnych metadanych15. Ta metoda jest odpowiednia dla jednej do ~300 roślin, które są obrazowane raz dziennie (lub rzadziej). W przypadku większej liczby roślin w eksperymencie bardziej odpowiedni jest system obrazowania oparty na przenośniku, suwnicy bramowej lub zrobotyzowany, ponieważ czas na indywidualne przemieszczanie roślin w celu obrazowania może być dłuższy niż dzień roboczy11,13. W przypadku częstszych punktów czasowych (na przykład obraz co godzinę, a nie raz dziennie lub rzadziej), konfiguracje kamer wewnątrz komory wzrostowej są bardziej odpowiednie, ponieważ rejestrują obrazy automatycznie, ale są ograniczone wielkością roślin i wymagają dodatkowego SBC15.
Podczas gdy PlantCV jest tutaj prezentowany jako opcja analizy obrazu, istnieje inne oprogramowanie. ImageJ (Fiji) to darmowy pakiet oprogramowania do analizy obrazów, który może być również używany do tworzenia obrazów roślin za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI)8; Nie jest on jednak szczególnie opracowany do analizy obrazu całej rośliny, jest mniej elastyczny do obliczeń o wysokiej przepustowości i jest trudniejszy do powtórzenia niż już działające potoki, takie jak te w PlantCV, które można łatwo zastosować do nowych obrazów9. Metody głębokiego uczenia (takie jak BioDock, patrz Tabela materiałów) i Segment Anything22) są atrakcyjne ze względu na ich zdolność do łatwej segmentacji roślin z tła i mogą być wykorzystywane do opisanych tutaj zadań segmentacji. Jednak te modele głębokiego uczenia nie zapewniają opisanych tutaj pomiarów fenotypuroślin10, a wykonanie tych bardziej złożonych pomiarów ilościowych fenotypów może wymagać dużej ilości obrazów treningowych (często większej niż 10 000) i mocy obliczeniowej wykraczającej poza podstawowy laptop lub komputer stacjonarny10. Modele te wymagają również znacznej ilości pamięci komputerowej i mocy obliczeniowej, które są niedostępne dla wielu badaczy10.
Najważniejszym krokiem protokołu jest zorganizowanie konfiguracji obrazowania rośliny i upewnienie się, że w pobliżu rośliny nie ma żadnych obiektów (takich jak inne rośliny, karta kolorów lub szczątki rośliny)14. Jeśli obrazy nie są odpowiednio ustawione lub nie jest używana karta kolorów, nie będzie można ich później przeanalizować, ponieważ nie ma mechanizmu standaryzacji. Chociaż w tym protokole nie są wymagane żadne kroki kalibracji, korekcja kolorów i standaryzacja rozmiaru podczas przetwarzania są niezbędne. Zawsze upewnij się, że cała karta kolorów znajduje się w ramce, ale nie nakłada się na roślinę (Rysunek 2). Inną częstą pułapką jest nierównomierne oświetlenie, które może powodować cienie lub jasne ujęcia; zalecamy stosowanie jasnego, rozproszonego światła górnego i zasłanianie okien w pomieszczeniu, aby zapobiec nierównomiernemu oświetleniu (Rysunek 2). Dodatkowe lampy można dodać pod kątem skierowanym do instalacji, jeśli światła górne powodują cienie. Rodzaj żarówki nie jest problemem, biorąc pod uwagę, że kolor zostanie skorygowany na obrazie za pomocą karty kolorów. Rozmyte obrazy nie są dopuszczalne do analizy — użyj automatycznego ustawiania ostrości w aparacie lub instrukcji producenta dotyczących ręcznego ustawiania ostrości, aby upewnić się, że obrazy są wyraźne.
Podobnie, upewnienie się, że obrazy nie są prześwietlone (częsty błąd) pozwala na odpowiednią analizę (rysunek 2); Prześwietlone obrazy nie mogą być naprawione w korekcji kolorów podczas analizy obrazu, ponieważ wartości pikseli znajdują się poza zakresem wykrywania kamery przy bieżących ustawieniach14. Aby zapobiec prześwietleniu, należy ocenić histogramy kolorów lub wartości RGB dla obrazu testowego, korzystając z opisanego tutaj przepływu pracy PlantCV (Rysunek 3) i zmniejszyć ustawienie jasności w aparacie, jeśli test ekspozycji wykaże, że obraz jest prześwietlony. Wartości RGB (a tym samym histogramy) nie powinny mieć wartości na poziomie 0 lub 255, co jest zakresem wartości, ponieważ możliwe jest, że te wartości są powyżej lub poniżej zakresu wykrywania i mogą rejestrować tylko wartość minimalną lub maksymalną, a nie prawdziwą. Obraz testowy powinien być zawsze oceniany przy użyciu tych metod pod kątem prześwietlenia (Rysunek 2 i Rysunek 3); sugerujemy wykorzystanie kontroli jakości ekspozycji PlantCV przedstawionej w tej publikacji jako kontroli, która określa, że obraz o jakości ma mniej niż 5 procent pikseli przy 0 lub 255 dla każdego koloru. Z reguły kamery i oprogramowanie analityczne zapewniają histogramy, które powinny mieć równe i pełne ogony histogramu; Wartości odcięte poniżej 0 (niedoświetlenie) lub powyżej 255 (prześwietlenie) należy ponownie wykonać przy dostosowanych ustawieniach aparatu. Sugerujemy wybór miejsca z jasnym, równomiernym, sztucznym oświetleniem bez okien do oświetlania, ponieważ okna mogą być zbyt jasne, nierówne i często zmieniać ekspozycję światła na przestrzeń. Obrazy powinny być równomiernie oświetlone, a szare kwadraty karty kolorów nie powinny wydawać się białe, co sugeruje prześwietlenie.
W przypadku kodu przechwytywania obrazu może być konieczne rozwiązywanie problemów w zależności od adresu IP i ustawień zabezpieczeń instytucji użytkownika. Aby rozwiązać problem, skontaktuj się z działem IT w przypadku problemów z łącznością internetową i przesyłaniem plików. Częstym błędem jest użycie karty SD o niewłaściwym rozmiarze dla kontrolera SBC lub włączenie kontrolera SBC przed włączeniem podłączonego monitora. Aby rozwiązać problem, postępuj dokładnie zgodnie z powyższym protokołem i ponownie załaduj oprogramowanie SBC. Fora internetowe są doskonałym źródłem rozwiązywania problemów i znajdowania rozwiązań dla konkretnego aparatu wybranego podczas korzystania z gphoto2. Aby rozwiązać problem z analizą obrazu PlantCV i użyć najbardziej aktualnej wersji, skorzystaj ze strony dokumentacji (https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/) lub opublikuj problem na GitHub (https://github.com/danforthcenter/plantcv/issues). W szczególności, jeśli metoda progowania w tym protokole nie oddziela wystarczająco rośliny od tła, należy skorzystać z alternatywnych metod progowania dostępnych w "photo-studio-SV-notebook.ipynb" lub na stronie dokumentacji.
Metodę tę można zastosować do dowolnego gatunku roślin i zabiegu, który można przetransportować do opisanego zmontowanego zestawu fototograficznego. Na przykład nie ma zastosowania do roślin rosnących na polu, ponieważ nie można ich przetransportować do stanowiska fotograficznego bez wykopania rośliny. W tej sytuacji rośliny mogłyby zostać ścięte, a następnie zobrazowane za pomocą protokołu, chociaż pomiar byłby destrukcyjny. Na jednym obrazie można uchwycić wiele roślin i je przeanalizować, ale użytkownik powinien uważać, aby rośliny nie stykały się ze sobą (ilustracja 2), a rośliny są umieszczane za każdym razem w tym samym miejscu na tle, aby zapewnić automatyczne uruchamianie przepływu pracy na całym zestawie obrazów. Jeśli w przypadku roślin takich jak Arabidopsis thaliana konieczny jest widok z góry, użyj statywu, aby przesunąć aparat na szczyt roślin umieszczonych na tkaninie fotograficznej; Pozostałe metody przechwytywania i analizy obrazu pozostają takie same.
Jak wykazano w przypadku kukurydzy, metoda ta jest ważna zarówno dla hodowli roślin, jak i dla fundamentalnych informacji na temat tego, jak rośliny tolerują stresy abiotyczne, takie jak upały i susza. Stres związany z upałami i suszą przyczynia się do utraty plonów kukurydzy na całym świecie o 15%-20% rocznie23. Oczekuje się, że straty w plonach wzrosną wraz z globalnymi zmianami klimatycznymi, ponieważ oczekuje się, że temperatury wzrosną o 1,4-4,4°C do roku 210024. Ocena różnorodności kukurydzy pod kątem tolerancji na stres, a także określenie fenotypowych, fizjologicznych i molekularnych mechanizmów tolerancji na stres abiotyczny, są kluczowymi celami badawczymi dla globalnego bezpieczeństwa żywnościowego25. Aby odpowiedzieć na te pytania, naukowcy ze wszystkich pokrewnych dziedzin – fizjolodzy, genetycy, hodowcy, biolodzy molekularni itd. – muszą być w stanie szybko, skutecznie i często niedestrukcyjnie ocenić fenotypy roślin kukurydzy w warunkach stresu abiotycznego25. Przedstawiona tutaj metoda i przykładowe wyniki odpowiadają na tę potrzebę i są ważnym narzędziem dla naukowców w rozwiązywaniu rzeczywistych wyzwań związanych z rolnictwem.
Zaobserwowane tutaj fenotypy były hipotezami, biorąc pod uwagę bogactwo wcześniejszych badań - stres związany z suszą zmniejsza rozmiar roślin i zieleń (mierzoną za pomocą średniej okrągłej odcienia)26 (Rysunek 6, Rysunek 7 i Tabela 1). Fenotyp stresu cieplnego z nieoczekiwanym podlewaniem nie zmniejszył znacząco powierzchni liści, chociaż przy większej liczbie powtórzeń zależność tę można było lepiej ocenić statystycznie, a wysokość została zmniejszona zgodnie z oczekiwaniami (ryc. 6). Podczas gdy średnia kołowa barwy nie uległa zmianie z powodu ciepła, profil kolorów został rzeczywiście zmieniony, aby uwzględnić zarówno więcej żółtych, jak i ciemniejszych zielonych pikseli, co pokazuje, że ocena samego średniego odcienia jest niewystarczająca i należy wziąć pod uwagę histogram koloru o wielu wartościach (Rysunek 7). Te zmiany fenotypowe opisują reakcję rośliny na środowisko, a dodatkowe techniki, takie jak pomiary wymiany gazowej, obrazowanie mikroskopowe i inne, mogą być wykorzystane do oceny zmian fizjologicznych, które zachodzą w odpowiedzi na stres. Wynik ten pokazuje moc precyzyjnych, ilościowych pomiarów, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte przy użyciu ręcznych lub jakościowych pomiarów zdrowia roślin. Spostrzeżenia te mają kluczowe znaczenie dla hodowli i inżynierii upraw odpornych na zmiany klimatyczne, które znacznie zmniejszają globalne plony i przewiduje się, że w przyszłych latach będą się pogarszać.
Podziękowania
Ta praca została przeprowadzona w Phenotyping Core Facility, Donald Danforth Plant Science Center (RRID: SCR_019049), który zapewnił wsparcie finansowe dla K.M.M. i J.G.D. Prace te były wspierane przez Donald Danforth Plant Science Center Enterprise Rent-A-Car Research Institute Grant. Projekt D.S. został sfinansowany z grantu blokowego Taylor Geospatial Institute oraz grantu (ED21HDQ0240072) przyznanego przez US Economic Development Administration Center for AgTech and Applied Location Science and Technology (CATALST). Dziękujemy Kevinowi Reilly'emu i Krisowi Hainesowi (Integrated Plant Growth Facility, Donald Danforth Plant Science Center, RRID: SCR_024902) za ich wiedzę i pomoc we wzroście roślin. Dziękujemy Noah Fahlgrenowi, Malii Gehan i Haley Schuhl za ich porady dotyczące PlantCV.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zasilacz USB-C 15 W | CanaKit | DCAR-RSP-3A5-C | |
| 25604 UC-E6 USB | Nikon | 18208256044 | |
| 3,5-calowe doniczki | Hummert International | 13006000 | |
| Berger BM7 35% Bark HP | Hummert International | 10121500 | |
| Biodock 2024 | Platforma oprogramowania AI | www.biodock.ai. | |
| Oprogramowanie do edycji kodu | Jupyter | https://jupyter.org/install | |
| Oprogramowanie do edycji kodu | Visual Studio Code | https://code.visualstudio.com/download | |
| Karta kolorów ColorChecker Klasyczna | Calibrite | CCC | |
| ColorChecker Passport | Calibrite | CCPP2 | |
| Komora wzrostu Conviron | BDW80 model | ||
| Dell 22 Monitor | Dell | SE2222H | |
| EH-67 Zasilacz sieciowy | Nikon | AZ185 | |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | PlantCV | https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/ | |
| Jack's Water Soluble Fertilizer 15-5-15 | Hummert International | 7590200 | płynny nawóz |
| Klawiatura i mysz | Bezprzewodowa klawiatura i mysz Logitech 1440638 MK270 | ||
| Nasiona kukurydzy | USDA-ARS Sieć informacyjna zasobów plazmy zarodkowej (GRIN) | B73 | https://www.ars-grin.gov/ |
| Micro HDMI do HDMI | Aparat Amazon | B07KSDB25X | |
| Nikon Coolpix B500 | Aparat Nikon | ||
| Nikon D7200 | Nikon | ||
| Osmocote 14-14-14 | Hummert International | 7630000 | |
| Tkanina klasy fotograficznej | Yayoya Tkanina | poliestrowa Czarne tło fotograficzne do studia fotograficznego Televison | |
| Raspberry Pi 4 Model B Rev 1.1 | Raspberry Pi Foundation | RP4B4GB_BP | |
| Raspberry Pi 4 PiSwitch (USB-C) | CanaKit | RSP-PISWITCH-USBC | |
| Oprogramowanie Raspberry Pi | Raspberry | https://www.raspberrypi.com/software/ | |
| Oprogramowanie do analizy statystycznej | Rstudio | https://posit.co/downloads/ | |
| Statyw | K& F Concept | T255A3 + BH-28L | |
| Turface MVP | Hummert International | 10240000 | |
| Bezprzewodowy skaner kodów kreskowych | Netumscan | B08X4NMX2M | Skaner kodów kreskowych 1D i 2D |
Bibliografia
- Xiao, Q., Bai, X., Zhang, C., He, Y. Advanced high-throughput plant phenotyping techniques for genome-wide association studies: A review. J Adv Res. 35, 215-230 (2022).
- Mutka, A. M., et al. image-based phenotyping methods provide insight into spatial and temporal dimensions of plant disease. Plant Physiol. 172 (2), 650-660 (2016).
- Mutka, A. M., Bart, R. S. Image-based phenotyping of plant disease symptoms. Front Plant Sci. 5, 734(2014).
- Fahlgren, N., Gehan, M. A., Baxter, I. Lights, camera, action: High-throughput plant phenotyping is ready for a close-up. Curr Opin Plant Biol. 24 (2), 93-99 (2015).
- Das Choudhury, S., Samal, A., Awada, T. Leveraging image analysis for high-throughput plant phenotyping. Front Plant Sci. 10, 508(2019).
- Yang, W., et al. Crop phenomics and high-throughput phenotyping: Past decades, current challenges, and future perspectives. Mol Plant. 13 (2), 187-214 (2020).
- Omari, M. K., et al. Digital image-based plant phenotyping: A review. Korean J Agric Sci. 47 (1), 119-130 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biolFiogical-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Gehan, M. A., et al. PlantCV v2: Image analysis software for high-throughput plant phenotyping. PeerJ. 5, e4088(2017).
- Murphy, K. M., Ludwig, E., Gutierrez, J., Gehan, M. A. Deep learning in image-based plant phenotyping. Annu Rev Plant Biol. 75 (1), 771-795 (2024).
- Fahlgren, N., et al. A versatile phenotyping system and analytics platform reveals diverse temporal responses to water availability in Setaria. Mol Plant. 8 (3), 1520-1535 (2015).
- Yu, L., et al. Development of a mobile, high-throughput, and low-cost image-based plant growth phenotyping system. bioRxiv. , (2023).
- Atefi, A., Ge, Y., Pitla, S., Schnable, J. Robotic technologies for high-throughput plant phenotyping: Contemporary reviews and future perspectives. Front Plant Sci. 12, 611940(2021).
- Berry, J. C., Fahlgren, N., Pokorny, A. A., Bart, R. S., Veley, K. M. An automated, high-throughput method for standardizing image color profiles to improve image-based plant phenotyping. PeerJ. 6, e5727(2018).
- Tovar, J. C., et al. Raspberry Pi-powered imaging for plant phenotyping. Appl Plant Sci. 6, e1031(2018).
- Jolles, J. W. Broad-scale applications of the Raspberry Pi: A review and guide for biologists. Methods Ecol Evol. 12 (5), 1562-1579 (2021).
- Watt, M., et al. Phenotyping: New windows into the plant for breeders. Annu Rev Plant Biol. 71 (1), 689-712 (2020).
- Xie, C., Yang, C. A review on plant high-throughput phenotyping traits using UAV-based sensors. Comput Electron Agric. 178, 105731(2020).
- Czedik-Eysenberg, A., et al. The "PhenoBox", a flexible, automated, open-source plant phenotyping solution. New Phytol. 219 (4), 808-823 (2018).
- Sumner, J., Fahlgren, N., Murphy, K. M. PCVR: An R package and tutorials for guided statistical analysis of plant phenotyping data. Authorea Preprints. , (2023).
- Schnable, P. S., et al. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science. 326 (5956), 1112-1115 (2009).
- Segment Anything. Kirillov, A., et al. 2023 IEEE/CVF Int Conf Comput Vision, , 3992-4003 (2023).
- Gabaldón-Leal, C., et al. Modelling the impact of heat stress on maize yield formation. Field Crops Res. 198 (3), 226-237 (2016).
- Intergovernmental Panel on Climate Change. SYNTHESIS REPORT OF THE IPCC SIXTH ASSESSMENT REPORT (AR6). , https://report.ipcc.ch/ar6syr/pdf/IPCC_AR6_SYR_LongerReport.pdf (2023).
- Quiñones, A., et al. Optimized methods for applying and assessing heat, drought, and nutrient stress of maize seedlings in controlled environment experiments. Cold Spring Harb Protoc. , (2024).
- Murphy, K. M., et al. Maize abiotic stress treatments in controlled environments. Cold Spring Harb Protoc. , (2024).
Przedruki i uprawnienia
