Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67627

⸱

7 marca 2025

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia, 2Department of Chemical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Streszczenie

Granulowane rusztowania hydrożelowe mają znaczący potencjał w medycynie regeneracyjnej, funkcjonując albo jako nośniki do dostarczania komórek, albo jako interfejsy do integracji tkanek. W tym artykule przedstawiono dwa nowatorskie podejścia do ilościowego określania migracji komórek w obrębie i do granulowanych hydrożeli, podkreślając różne zastosowania tych rusztowań. Po pierwsze, przedstawiono test interfejsu jednowarstwowego komórki, który symuluje wzrost tkanki do granulowanych hydrożeli w celu integracji. Po drugie, opisano test oparty na sferoidach, zaprojektowany do śledzenia ruchu komórek w matrycy hydrożelowej, specjalnie przystosowany do zastosowań związanych z dostarczaniem komórek. Obie metody umożliwiają precyzyjne i kontrolowane pomiary migracji komórek, zapewniając kompleksowy zestaw narzędzi dla badaczy wykorzystujących granulowane rusztowania hydrożelowe. Motywacją do opracowania tych metod jest potrzeba dostosowanej kontroli migracji komórek w obrębie rusztowania w celu dostosowania jej do konkretnych zastosowań. Optymalizując i standaryzując te techniki kwantyfikacji, naukowcy mogą iteracyjnie udoskonalać właściwości hydrożelu ziarnistego, zapewniając jego skuteczność w różnych kontekstach medycyny regeneracyjnej. Ten solidny zestaw narzędzi ilościowych oferuje nowe możliwości ulepszania granulowanych rusztowań hydrożelowych, zwiększając ich zastosowanie zarówno w zastosowaniach związanych z dostarczaniem komórek, jak i integracją tkanek.

Wprowadzenie

Biomateriały do zastosowań terapeutycznych coraz częściej ewoluują w kierunku bardziej złożonych i odpowiednich modeli środowisk komórkowych do badania integracji tkanek. Rusztowania z biomateriału zapewniają trójwymiarową (3D) strukturę wzrostu komórek i mają na celu naśladowanie pożądanej tkanki1,2. Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych obejmują naturalne matryce i syntetyczne rusztowania, które zapewniają komórkom dalszą złożoność za pomocą wskazówek haptotaktycznych lub chemotaktycznych3,4. Tradycyjne rusztowania hydrożelowe są sieciowane masowo, co daje nanoporowatą siatkę, która umożliwia dyfuzję małych cząsteczek5,6, ale wymaga degradacji w celu migracji w skali komórkowej do obszaru tkanki wymagającego naprawy7. Granulowane hydrożele są podzbiorem biomateriałów, które mają wysoki potencjał do translacji klinicznej ze względu na ich biokompatybilność, zdolność do dostosowywania się do nieregularnych kształtów oraz, w wielu przypadkach, ich wstrzykiwalność8,9. Ich blokowy charakter zapewnia przewagę porowatości w skali komórkowej w celu zwiększenia infiltracji tkanek i angiogenezy, a także modułowości, która pozwala na dodanie heterogenicznych wskazówek dotyczących zachowania komórek10,11,12. Zrozumienie reakcji i ruchu komórek w rusztowaniu 3D ma kluczowe znaczenie fizjologiczne we wszystkich zastosowaniach wykorzystujących biomateriały do integracji tkanek.

Badanie wrastania tkanek w trzech wymiarach okazało się jednak trudne do osiągnięcia z dokładnością ilościową. Zwiększona złożoność środowiska 3D wymaga modeli migracji komórek in vitro, które mogą nie tylko zapewnić wgląd w zachowanie komórek, ale także zoptymalizować warunki materialne. Wcześniej opublikowane raporty na temat migracji komórek granulowanego rusztowania 3D wykorzystywały miejscowe wysiewanie do zbadania zachowania komórek, zgłaszając infiltrację do porowatej struktury i morfologii komórki13 i inne kiełkowanie sferoidów14,15, mierząc długość wzrostu i liczbę pędów. Na długości migracji wysiewu miejscowego mogą mieć nierównomierny wpływ siły grawitacji, a ze względu na ograniczenia mikroskopowe wyniki nie mogą być podłużne. Metoda kiełkowania sferoidów została ograniczona do kwantyfikacji 2D poprzez projekcję maksymalną, która nie jest w stanie uchwycić mechanizmu kontrolowanej inwazji. Obie metody są mierzone w płaszczyźnie xy, która nie ma niuansów niezbędnych do pełnego podsumowania ruchu komórkowego 3D i infiltracji rusztowania.

Ten protokół opisuje dwa podejścia do ilościowego określania migracji komórek, takie jak infiltracja in vitro do porowatych rusztowań hydrożelowych 3D granulowanych, w szczególności przy użyciu rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP)16,17,18,19. Celem poniższych metod jest badanie zachowania komórek w ziarnistych żelach poprzez kontrolowanie kierunkowości ich migracji w celu analizy trójwymiarowej. Pierwsze, oparte na monowarstwie podejście do badania migracji rosnącej (MAMA) jest uproszczonym modelem endogennej integracji komórek, który ilustruje jednolite interakcje komórka-materiał i służy jako platforma do reprezentowania początkowego środowiska, w którym komórki łączą się z ziarnistymi hydrożelami, a także do izolowania indywidualnych zachowań przed infiltracją rusztowania. Druga, zwana metodą równoległej warstwowej zewnętrznej migracji sferoidów (PLOSMA), to test migracji sferoidalnej komórek 3D, który bada ruch komórek, gdy jest w pełni otoczony złożonym środowiskiem rusztowania i modeluje ruch komórki po dostarczeniu, a także ruch po tym, jak komórki w pełni weszły do ziarnistego żelu.

Obie metody są kwantyfikowalne za pomocą analizy obrazu 3D i mogą być stosowane do badania i optymalizacji interakcji materiał-komórka za pomocą podłużnych punktów czasowych dla zastosowań medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej, gdzie promowanie lub ograniczanie ruchu komórek mieści się w kryteriach projektowania. Ponadto metody te wykorzystują wirowanie płytek w celu równomiernego przygotowania testów wielodołkowych.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Preparat granulowanego hydrożelu

UWAGA: Cząstki MAP używane w tym protokole to 3,2% wag. w/v żel z 45,88 mg/mL PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMal19, oraz 5,62 mg/ml MMP-2 degradowalny środek sieciujący. Sztywność mechaniczna żelu wynosi 15-20 kPa, aby dopasować się do sztywności skórnej17.

  1. Wygeneruj ziarniste cząsteczki hydrożelu i przygotuj się do hodowli komórkowej w normalny sposób.
    UWAGA: Protokół ten opisuje sterylne przygotowanie żelu z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi cząstkami, którego produkcja jest szczegółowo opisana przez Roosa et al.18.
  2. Przygotuj ziarniste cząsteczki hydrożelu do użycia in vitro, sterylizując trzema płukaniami 70% alkoholu izopropylowego, a następnie trzema płukaniami sterylnego 1x PBS.
  3. Przygotować sterylny 0,2 mM fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) w roztworze pożywki, rozpuszczając proszek LAP w ultraczystej wodzie i przepuszczając roztwór przez sterylny filtr 0,22 μm. Dodać ten roztwór w stosunku 1:1 v/v z ilością żelu niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu.
  4. Inkubować roztwór 0,2 mM LAP, żelu i pożywki w temperaturze 37 °C na rotatorze probówkowym przy 20 obr./min przez co najmniej 30 minut przed przystąpieniem do dyfuzji LAP w mikrocząstkach.
  5. Po upływie 30 minut odwirować zawiesinę cząstek o stężeniu 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Odessać supernatant.
    UWAGA: Ogólna suchość cząstek MAP może się różnić ze względu na różnice w składzie chemicznym, hydrofilowości i wielkości cząstek. Aby zapewnić spójność, najlepszą praktyką jest odwirowanie zawiesiny cząstek zgodnie z opisem, wymieszanie cząstek w probówce za pomocą pipety wyporowej, a następnie powtórzenie etapu wirowania.

2. Metoda jednowarstwowego testu migracji wstępującej (MAMA): hodowla komórkowa i obrazowanie

UWAGA: Komórki zostały zobrazowane za pomocą kanału FITC (488 nm). Barwnik użyty do ogniw miał wzbudzenie przy 492 nm i emisję przy 517 nm. 10-krotne powiększenie zapewnia większą szczegółowość w porównaniu z 4-krotnym powiększeniem, ale można użyć dowolnej z nich.

  1. Rozmrozić ludzkie fibroblasty skóry (HDF) zgodnie z protokołem producenta. Przejście w razie potrzeby, aż do osiągnięcia pożądanego przejścia; ogólnie rzecz biorąc, komórki pierwotne utrzymują skład genetyczny i fenotypowy poprzez P5.
  2. Płytka 120 000 komórek/cm2 dla co najmniej n = 6 w płytce 96-dołkowej lub płytki o pożądanym rozmiarze, używając zalecanej objętości pożywki na studzienkę do zawiesiny, delikatnie zasysając przed każdym dodaniem. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc, jak pokazano na Rysunek 1A, co spowoduje około 80% konfluencji następnego dnia.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, studzienki środkowej kolumny i rzędów są najlepsze do optymalnego rozprowadzania żelu. Autorzy używają do 24 dołków na płytkę 96-dołkową (rzędy B-G i kolumny 5-8).
  3. Przygotować warunki żelowe, jak wspomniano powyżej, i podczas inkubacji w LAP usunąć pożywkę za pomocą aspiratora lub pipety z płytki dołka komórek. Uważaj, aby nie naruszyć dolnej części talerza.
  4. Dodaj barwnik śledzący komórki do studzienek zgodnie z instrukcjami producenta, przedstawionymi w Rysunek 1B. Upewnij się, że żel jest całkowicie przygotowany zgodnie z opisem w kroku 1 przed zasysaniem barwnika śledzącego komórki z dołków.
  5. Dodać 20 μl każdego żelu do studzienek za pomocą pipety wyporowej, nie dotykając dna płytki.
    UWAGA: Najlepsze warunki do oznaczania występują, gdy żel jest pipetowany bezpośrednio do środka studzienki.
  6. Używając nasadki wirówkowej z wirnikiem wirowym w temperaturze 25 °C, wirować z prędkością 100 x g przez 15 s z przyspieszeniem i opóźnieniem 8 w celu spłaszczenia żelu. Obróć płytkę o 180° i ponownie wiruj z prędkością 100 x g przez 15 sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki, jak widać na Rysunek 1C.
  7. Aseptyczne sieciowanie foto żelu od góry (Rysunek 1D) poprzez przyłożenie skupionego światła (365 nm, 34,4 mW/cm2) do próbki przez 30 sekund w celu wyżarzania rusztowania, dodając 200 μl pożywki do każdej studzienki komórek po uformowaniu wszystkich rusztowań. Pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić im przyłączenie się do rusztowania ziarnistego przed obrazowaniem.
  8. Aby uchwycić zachowanie migracyjne podsumowane w Rysunek 1E, zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Znajdź najniższy punkt ostrości dla obszaru płytki, w którym komórki zlewają się w co najmniej 80%, i ustaw go jako dolną krawędź stosu z.
    1. Znajdź najwyższy punkt sygnału fluorescencyjnego komórki i ustaw go jako górną krawędź stosu z. Użyj kroku o rozmiarze 5 μm lub mniejszym, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość.
  9. Zobrazuj co najmniej trzy studzienki, aby reprezentować monowarstwę komórki i wysokość komórek niemigrujących. Punkt czasowy t = 0 jest pokazany zarówno z widoku z góry, jak i z boku w Rysunek 2A. Inkubować przez noc po zakończeniu obrazowania.
    UWAGA: Komórki te zostały zobrazowane za pomocą obiektywu 4x, a ekspozycja była spójna dla wszystkich dołków.
  10. W t = 24 h komórki zaczną wznosić się przez granularne rusztowanie, jak widać na Rysunek 2B z góry i z boku. Powtórz czynności obrazowania, jak dla t = 0 h, stosując te same parametry. Użyj poprzedniej wysokości stołu montażowego jako odniesienia lub znajdź komórki, które nie zostały jeszcze przeniesione, i ustaw ją jako dolną krawędź stosu z.
  11. Powtórz kroki dla wszystkich odwiertów, upewniając się, że każdy studzienka jest zapisana jako osobny obraz w celu ułatwienia analizy.
    UWAGA: Punkty czasowe mogą być obrazowane dla dłuższych punktów czasowych w zależności od ograniczeń eksperymentalnych i metody śledzenia fluorescencji komórek.
  12. Rusztowania mogą być mocowane i barwione w celu uzyskania dodatkowych wskaźników. W pożądanym końcowym punkcie czasowym odessać pożywkę ze studzienek za pomocą pipety i wyrzucić. Delikatnie umyj każdą studzienkę 200 μl sterylnego PBS dwa razy przez 5 minut każda. Dodać 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut, a następnie odessać i wyrzucić. Studzienki można natychmiast zabarwić lub przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez okres do tygodnia.

3. Metoda jednowarstwowego testu migracji rosnącej (MAMA): analiza obrazu 3D

  1. W przypadku konwersji wsadowej otwórz oprogramowanie IMARIS Image Conversion. Przeciągnij i upuść obrazy mikroskopowe do oprogramowania do konwersji i wybierz folder w oprogramowaniu Arena do zaimportowania. Naciśnij przycisk Rozpocznij wszystko. Przekonwertowane obrazy pojawią się na Arenie jako pliki .ims.
    UWAGA: Jeśli rozmiar woksela nie jest uwzględniony w metadanych obrazu, zapoznaj się z indywidualnymi specyfikacjami obrazowania konfokalnego, aby znaleźć wartość. Alternatywnie, rozmiar woksela można przybliżyć jako rozmiar kroku używany podczas obrazowania.
  2. Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę IMARIS Arena na pulpicie i wybierając obraz z Areny.
  3. Obraz jest automatycznie ładowany do zakładki analizy "Widok 3D" widocznej w panelu ikon paska narzędzi u góry. Kliknij zakładkę Image Proc na głównym pasku narzędzi.
  4. W lewym górnym rogu panelu bocznego kliknij menu rozwijane dla Kanału 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk Ok u dołu panelu, aby powrócić do "Widoku 3D". Reprezentatywne obrazy dla t = 0 h i t = 24 h znajdują się odpowiednio w Rysunek 2A,B.
  5. Na małym pasku narzędzi tuż nad menu panelu bocznego kliknij ikonę z zaokrąglonymi niebieskimi kształtami, Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć zakładkę edytowalnych obiektów o nazwie "Powierzchnie 1".
  6. Interfejs do tworzenia parametrów ustawień algorytmu otworzy się w dolnej części panelu menu. Ręcznie wygeneruj parametry, które mają być używane dla wszystkich replikacji, klikając przycisk niebieskiej strzałki u dołu interfejsu. Upewnij się, że wybrano właściwy kanał źródłowy i zaznacz pole "Gładkie".
    1. Ustaw szczegółowość powierzchni na 0,7 μm i wybierz opcję Odejmowanie tła (kontrast lokalny). Wpisz średnią długość komórki w polu "Średnica największej kuli, która mieści się w obiekcie". Naciśnij tę samą niebieską strzałkę na dole po zakończeniu.
      UWAGA: Wartość tę można oszacować za pomocą zakładki "Wycinek" na pasku narzędzi i mierząc szerokość średnich komórek.
  7. W przypadku progowania określ histogram intensywności, w którym tylko najjaśniejsze komórki są podzielone na segmenty. Korzystając z fragmentatora, przesuwaj się w górę i w dół po stosie obrazów, aby upewnić się, że jest on tak dokładny, jak to możliwe.
    1. Wybierz opcję Włącz dla opcji "Podziel stykające się obiekty (rosnący region)" i ustaw średnicę punktów początkowych na tę samą średnicę, która była używana wcześniej. Upewnij się, że wybrano próg "Oparty na intensywności" i kliknij niebieski przycisk strzałki w prawo.
  8. Kolejne dwa kroki, Punkty zalążkowe filtru i Powierzchnie filtracyjne, można dostosować za pomocą kilku pomiarów, aby zapewnić dokładność generowanych powierzchni, jednak analiza linii bazowej nie wymaga dodatkowego filtrowania. Gdy zmiana nie jest potrzebna, kliknij przycisk z niebieską strzałką.
    UWAGA: Ostatni krok umożliwia dalszą klasyfikację powierzchni w zależności od pożądanej wydajności. Po wprowadzeniu zmian kliknij przycisk zielonej strzałki, aby zakończyć tworzenie powierzchni.
  9. Aby zapisać parametry tworzenia do analizy wsadowej, kliknij ikonę różdżki Tworzenie. Kliknij Przechowuj parametry dla partii i nazwij ją, a następnie kliknij OK. Reprezentatywne przetworzone obrazy dla t = 0 i t = 24 h są pokazane w Rysunki 2C,D, odpowiednio.
    UWAGA: Wszystkie obiekty w obrębie wybranej "Powierzchni" można podzielić na zestawy na podstawie różnych właściwości podanych przez oprogramowanie do konwersji obrazu, takich jak pole powierzchni, objętość, intensywność i odległość od innych utworzonych powierzchni.
  10. Właściwości powierzchni można znaleźć, wybierając kartę Statystyka. Aby zebrać wszystkie wysokości komórek, kliknij kartę Szczegółowe i wybierz Określone wartości i Pozycję Z z kolejnych menu rozwijanych. Kliknij pojedynczą ikonę Zapisz, aby zapisać wszystkie pozycje Z i wszelkie klasyfikacje wprowadzone do pliku .xls. Powtórz te czynności dla wszystkich obrazów.
  11. Znajdź medianę pozycji z komórek niemigrujących na reprezentatywnym obrazie i dobrze odejmij wszystkie pozycje z poniżej tej liczby z każdego warunku testowego.
    UWAGA: Wartości migracji są podawane jako średnie mediany dla każdego technicznego warunku replikacji powyżej wysokości komórki niemigrującej. Można je przedstawić jako medianę wysokości, widoczną w Rysunek 3A, lub jako zmianę wysokości migracji w żądanym punkcie czasowym w porównaniu do t = 0, widoczną w Rysunek 3B.

4. Metoda testu PLOSMA (Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay): Hodowla komórkowa i hodowla wiszących kropelek dla sferoid 3D

UWAGA: Ten protokół opisuje hodowlę komórkową i hodowlę wiszących kropli zaadaptowaną z protokołu autorstwa Nandi et al.14.

  1. Rozmrażaj HDF zgodnie z protokołem producenta. Przejście w razie potrzeby, aż do osiągnięcia pożądanego przejścia.
  2. W aseptycznym kapturze do hodowli komórkowych przygotuj szalkę Petriego, dodając 10 ml PBS do dna i odwracając pokrywkę tak, aby zewnętrzna strona spoczywała na kapturze do hodowli komórkowych.
  3. Dodać odpowiednią objętość komórek (określoną na podstawie liczby komórek) do probówki mikrowirówkowej. Dodaj barwnik śledzący komórki rozcieńczony w pożywce. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą podgrzanego podłoża.
    UWAGA: Sferoidy powinny mieć około 8000 komórek na sferoidę, ale mogą się zmieniać w zależności od typu komórki.
  4. Inkubować roztwór komórek przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki zgodnie z prędkością zalecaną przez producenta i odessać supernatant.
  5. Zawieś komórki w 1:100 metylocelulozy w pożywce.
  6. Odpipetować 20 μl kropelek roztworu komórki/pożywki na pokrywkę szalki Petriego.
  7. Pewnie, szybko i ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na dolnej połowie szalki Petriego zawierającej PBS.
  8. Inkubować kropelki przez co najmniej 24 godziny
    UWAGA: Powstawanie sferoid można monitorować za pomocą mikroskopii jasnego pola.

5. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidów na zewnątrz (PLOSMA): Umieszczanie sferoidów komórkowych na granulowanym hydrożelu

UWAGA: Następujący proces jest podsumowany w Rysunek 4A.

  1. Aby skonfigurować metodę PLOSMA opisaną w Rysunek 4A, należy aseptycznie dodać 15 μl żelu za pomocą pipety wyporowej do studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
  2. Używając nasadki wirówki z wirnikiem z wirnikiem, wirować z prędkością 1000 x g przez 10 sekund, aby spłaszczyć żel. Obróć płytkę o 180° i ponownie wiruj z prędkością 1000 x g przez 10 sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki.
  3. Po uzyskaniu równomiernej płaskości należy aseptycznie usieciować żel foto od góry, przykładając skupione światło (365 nm, 33,4 mW/cm2) do próbki przez 30 sekund w celu wyżarzania rusztowania.
  4. W asepcie przesunąć szalkę Petriego z wiszącymi kropelkami do aseptycznego kaptura do hodowli tkankowych i odwrócić pokrywę.
  5. Używając pipety o pojemności 20 μl, powoli pobieraj kroplę, aż sferoida dostanie się do końcówki pipety. Wyrzuć kropelkę na rusztowanie pośrodku studni.
  6. Powtórz poprzednie kroki dla wszystkich studzienek. Upewnij się, że każda studzienka ma sferoidę, potwierdzając ją za pomocą mikroskopii jasnego pola lub fluorescencji.
  7. Inkubować płytkę studzienkową w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić sferoidom przymocowanie się do rusztowania.
  8. Odpipetować dodatkowe 15 μl żelu na wierzch każdej sferoidy. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu, odwiruj płytkę o masie 300 x g przez 15 s w każdym kierunku.
  9. Wyżarzać górną warstwę żelu przez 30 s przy użyciu światła UV (365 nm) o mocy 33,4 mW/cm2. Pipety należy umieścić na każdym rusztowaniu, aby uzyskać całkowitą objętość studzienki do 200 μl.
    UWAGA: W tym momencie rusztowania będą bardzo suche, więc dodaj pożywkę kroplami po boku studni, aby uniknąć oderwania sferoidy.

6. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidalnej na zewnątrz (PLOSMA): Obrazowanie konfokalne sferoid

UWAGA: Łatwość obrazowania zależy od systemu obrazowania. Zlokalizuj sferoidę w studni w czasie niskiej ekspozycji. Komórki zostały zobrazowane za pomocą kanału FITC (488 nm). Barwnik użyty do ogniw miał wzbudzenie przy 492 nm i emisję przy 517 nm. 10-krotne powiększenie zapewnia większą szczegółowość w porównaniu z 4-krotnym powiększeniem.

  1. Znajdź najniższy poziom stołu montażowego (wysokość z), na którym komórki są nadal aktywne. Ustaw to jako dolną granicę stosu z.
  2. Znajdź najwyższy poziom stołu montażowego (wysokość osi z), na którym komórki są nadal aktywne. Ustaw to jako górny limit z-stack.
    UWAGA: Najlepsze wyniki obrazowania obejmują rozmiar kroku mniejszy lub równy 5 μm, aby zachować rozdzielczość skali komórkowej. W zależności od systemu mikroskopu konfokalnego mogą występować kompromisy między szybkością obrazowania a rozdzielczością.
  3. Zobrazuj wszystkie sferoidy zgodnie z opisem w t = 0 i 24 h. 48-godzinny punkt czasowy może być również obrazowany w zależności od ograniczeń eksperymentalnych. Reprezentatywne obrazy projekcji maksymalnej t = 0 i t = 24 są widoczne w Rysunek 4B.

7. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidalnej na zewnątrz (PLOSMA): analiza obrazu 3D

  1. Zaimportuj obrazy do oprogramowania analitycznego zgodnie z opisem w krokach od 3.1 do 3.4. W prawym górnym rogu lewego panelu kliknij menu rozwijane Kanał 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk OK w dolnej części panelu.
  2. Po powrocie do widoku 3D naciśnij przycisk Automatyczna regulacja wszystkich kanałów w wyskakującym oknie Regulacja wyświetlania i popraw w razie potrzeby.
  3. Na mniejszym pasku narzędzi tuż nad bocznym menu kliknij ikonę Dodaj nową ramkę odniesienia pokazaną w Rysunek 5A z trzema ortogonalnymi strzałkami, aby dodać nową zakładkę o nazwie "Układ odniesienia 1".
  4. Przesuń początek układu współrzędnych do środka sferoidy we wszystkich trzech płaszczyznach, jak pokazano na rysunku Rysunek 5B.
  5. Na tym samym pasku narzędzi, co trzy ortogonalne strzałki, kliknij ikonę z pomarańczowymi kulami i dodaj nowe punkty, aby utworzyć zakładkę o nazwie "Miejsca 1". Naciśnij przycisk z niebieską strzałką.
  6. W obszarze Wykrywanie punktowe ustaw Szacowana średnica XY na szacowaną średnicę komórek. Naciśnij przycisk z niebieską strzałką.
    UWAGA: W przypadku HDF liczba ta wynosi 15,0 μm.
  7. W przypadku progowania dostosuj histogram intensywności tak, aby obejmował tylko najjaśniejsze części. Korzystając z fragmentatora, przesuwaj się w górę i w dół po stosie obrazów, aby upewnić się, że jest on tak dokładny, jak to możliwe. Kliknij niebieską następną strzałkę.
  8. Naciśnij zielony przycisk Wykonaj, aby zakończyć analizę.
  9. Usuń zaznaczenie opcji Renderuj na fragmentatorze lub kliknij ikonę żółtego kwadratu po prawej stronie panelu konfiguracji.
  10. Kliknij zakładkę Statystyki. Z pierwszego menu rozwijanego wybierz opcję Określone wartości. Z drugiego menu rozwijanego wybierz opcję Odległość od układu odniesienia początku. Zostaną wyświetlone wszystkie wartości dla wybranych powierzchni, jak widać na rysunku Rysunek 5C. Kliknij pojedynczą ikonę zapisywania, która pobiera plik .xls.
  11. Zapisz zmiany wprowadzone w obrazie i analizach, naciskając ikonę Zapisz na głównym pasku narzędzi. Rysunek 6A przedstawia renderowanie 3D sferoidy zobrazowanej po 24 godzinach, podczas gdy Rysunek 6B przedstawia funkcję IMARIS Spots oznaczającą komórki rozkładowe, oznaczone kolorami zgodnie z odległością od układu odniesienia początkowego.
  12. Znormalizuj wyeksportowane dane do obrazów t = 0 i oblicz średnią przebytej odległości komórkowej i wysokości z dla każdej sferoidy, aby uzyskać pojedynczą wartość dla każdej próbki. Rysunek 7A,B przedstawia reprezentatywne wykresy dla każdego wyjścia, odpowiednio.

Wyniki

Niniejszy protokół ma na celu szczegółowe opisanie niezbędnych etapów dwóch nowych testów migracji w rusztowaniach ziarnistych. Metoda MAMA może być wykorzystana do oceny infiltracji komórkowej na styku tkanek. Żele hydrogrowe ziarniste stanowią bardziej złożony system niż hydrożele lite, a zatem są z natury trudniejsze w procesowaniu pod kątem migracji9,20. Ważne jest zrozumienie procesu etapowego przedstawionego na Rysunku 1. Każdy krok wynika z poprzedniego i został zoptymalizowany w tym protokole. Wysiew HDF z gęstością 120 000 komórek/cm2 doprowadzi do uzyskania co najmniej 80% konfluencji w ciągu nocy (Rysunek 1A), a te niefluorescencyjne komórki najlepiej znakować barwnikiem do śledzenia komórek w dniu eksperymentu, aby zmaksymalizować potencjał obrazowania (Rysunek 1B). Protokół ten stosuje niską siłę odśrodkową, analogiczną do tej używanej podczas pasażowania HDF, aby zachować żywotność komórek. Ze względu na kąt powstający podczas pojedynczego etapu wirowania, konieczne jest obrócenie płytki o 180°, aby zapewnić przesunięcie żelu tak, by całkowicie pokrył dno studni (Rysunek 1C). Pozostawienie komórek do regeneracji w inkubatorze przez 30 min po wyżarzaniu (Rysunek 1D) pozwoli zachować żywotność komórek i doprowadzi do optymalnej migracji (Rysunek 1E). Duży obszar płytki 96-dołkowej można obrazować za pomocą obiektywu 4x i dopasowywać w punktach czasowych od 0 do 24 h (Rysunek 2A,B), aby szeroko ocenić zachowanie komórek. Przetwarzanie otrzymanych obrazów typu z-stack w oprogramowaniu analitycznym umożliwia zaawansowane analizy wielu dużych zbiorów danych w łatwym w obsłudze interfejsie. Niniejszy protokół podsumowuje kroki prowadzące do stworzenia zbiorów danych dla wysokości komórek, lub pozycji Z, w każdym punkcie czasowym, wizualizowane na reprezentatywnych obrazach na Rysunku 2B,C. Analiza przetworzonych danych przedstawiona jest na Rysunku 3A, zwizualizowana za pomocą średniej z median wysokości oraz ich odchylenia standardowego dla każdego punktu czasowego; krotność zmiany wysokości w stosunku do komórek niemigrujących w czasie t = 0 h pokazano na Rysunku 3B. Dane bazowe tej metody zazwyczaj nie mają rozkładu normalnego, dlatego mediany są bardziej odpornymi miarami do porównań i w związku z tym zostały użyte do podsumowania danych.

Podobnie metoda PLOSMA może być wykorzystana do oceny motywności dostarczonych komórek w obrębie ziarnistego rusztowania hydrożelowego 3D. Rycina 4A przedstawia kroki metody PLOSMA; szczególnie istotne jest umieszczenie sferoidu w centrum dołka. Zaleca się centrowanie sferoidu w polu widzenia, choć zależy to od możliwości mikroskopu. Rycina 4B prezentuje reprezentatywne obrazy rozprzestrzeniania się sferoidu dla t = 0 h oraz t = 24 h, wykonane przy powiększeniu 10x w kanale FITC (488 nm). W oprogramowaniu można utworzyć układ odniesienia z punktem początkowym i dopasować go do każdego stosu z-stack (Rycina 5A,B). Oprogramowanie może śledzić odległość promieniową od tego układu odniesienia i eksportować ją jako wymagany zestaw danych (Rycina 5C). Rycina 6A przedstawia reprezentatywny obraz renderowania 3D sferoidu dla t = 24 h, natomiast Rycina 6B pokazuje funkcję Spots w oprogramowaniu. Przykład przetworzonych danych przedstawiono na Rycynie 7. Rycina 7A reprezentuje średnią odległość przebytą od centrum, znormalizowaną do odległości z dnia 0. Rycina 7B izoluje odległości przebyte wyłącznie w płaszczyźnie z, ponieważ jest to kierunek, który metoda PLOSMA ma za zadanie badać.

Schemat testu migracji wznoszącej opartego na monowarstwie; wzrost komórek, aplikacja barwnika, wirowanie hydrożelu.
Rycina 1: Hodowla komórkowa i obrazowanie w teście migracji wznoszącej opartego na monowarstwie. Schemat głównych etapów przetwarzania komórek i żelu w metodzie MAMA. (A) Komórki są hodowane do osiągnięcia konfluencji przez noc, a (B) barwnik do śledzenia komórek jest dodawany tuż przed dodaniem żelu ziarnistego. Rusztowanie jest formowane poprzez (C) wirowanie płytki i stabilizowane za pomocą (D) sieciowania fotochemicznego. Obrazowanie w wielu punktach czasowych umożliwia (E) wizualizację migracji komórek w górę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii konfokalnej, widoki z góry i z boku wzrostu komórek w czasie 0h i 24h, analiza fluorescencyjna.
Rysunek 2: Przetwarzanie obrazów MAMA. Reprezentatywne obrazy z procesu przetwarzania obrazów. Porównanie widoku z góry i z boku surowych obrazów konfokalnych w czasie (A) t = 0 i (B) t = 24 h w kanale FITC przy powiększeniu 4x. (B) Porównanie widoku z góry i z boku przetworzonych wysokości Z pozycji komórek w czasie (C) t = 0 i (D) t = 24 h. Przetwarzanie dla 24 h obejmuje odjęcie mediany wysokości z niemigrujących komórek. Paski skali = 500 µm. Skróty: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe analizy migracji komórek; pozycja medianowa, krotność zmiany w czasie; dane statystyczne.
Rysunek 3: Analiza wyników migracji komórek MAMA. (A) Pozycja medianowa Z i odchylenie standardowe wysokości komórek w każdym powtórzeniu (n = 6) w punktach czasowych t = 0 (27.0 µm ± 1.4 µm) i t = 24 h (46.6 µm ± 10.8 µm). (B) Migracja komórek po 24 h znormalizowana do 0 h i przedstawiona jako krotność zmiany (1.8 ± 0.4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat metody PLOSMA, hodowla komórkowa, warstwa MAP, sferoid komórkowy; obrazy mikroskopowe t0 i t24.
Rysunek 4Test migracji sferoidów na zewnątrz w warstwach równoległych (PLOSMA) – hodowla komórek i obrazowanie. (ASchemat opisujący etapy warstwowania rusztowania.BMaksymalne projekcje intensywności sferoidów wykonane w 0. i 24. godzinie. Obrazy zostały wykonane poprzez konfokalna mikroskopia fluorescencyjna w kanale FITC (488 nm) przy powiększeniu 10x. Paski skali = 200 µmSkróty: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay (test migrowania sferoid na zewnątrz w warstwach równoległych). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza wizualizacji objętościowej 3D przy użyciu systemu spektroskopowego; tabela danych emisyjnych; interfejs symulacji.
Rycina 5: Tworzenie nowego układu odniesienia początku współrzędnych. (A) Przycisk nowej ramy odniesienia początku współrzędnych zaznaczony czerwoną ramką. (B) Nowy początek współrzędnych został ustawiony w centrum sferoidu we wszystkich trzech wymiarach. (C) Wyświetlone metryki wyjściowe to odległości powierzchni komórek od układu odniesienia początku współrzędnych, co opisuje, jak daleko komórki zmigrowały z centrum. Pasek skali = 120 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna 3D pokazująca lokalizację białek w komórkach, schemat badania obrazowania komórkowego.
Rysunek 6: Renderingi 3D osadzonego sferoidu po 24 h. (A) Przetworzony sferoid w przestrzeni 3D. (B) Środek tego samego sferoidu został wyznaczony za pomocą funkcji układu odniesienia początku współrzędnych w programie IMARIS, a rozprzestrzenienie komórek zostało zakodowane kolorystycznie w zależności od odległości od punktu początkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe przebytej odległości i krotności zmiany wysokości Z; wyniki analizy statystycznej danych.
Rycina 7: Przykładowe wyniki dla PLOSMA. (A) Przykładowe wyniki PLOSMA przedstawiające przebytą odległość w µm. Średnia przebyta odległość wyniosła 240.8 µm ± 36.87 µm. (B) Krotność zmiany wysokości Z (tf/t0) podczas kiełkowania sferoidów. Średnia krotność zmiany wyniosła 3.82 ± 1.495. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Protokół ten opisuje dwa modele in vitro do charakteryzowania migracji komórek w 3D w celu gojenia ran i integracji tkankowej. Pierwszy model, test migracji oparty na monowarstwie, opiera się na prawidłowo przyłączonych i zlewających się komórkach. Protokół ten został opracowany z wykorzystaniem typu komórek fibroblastów i zoptymalizowany przy gęstości wysiewu 1,20 000 komórek/cm2. Ta gęstość pozwala komórkom rosnąć z dnia na dzień do co najmniej 80% zbiegu równomiernie na dnie płytki studzienki. Ten krok zapewnia migrację w kierunku z w ciągu co najmniej 24 godzin; Jeśli konfluencja jest zbyt niska po dodaniu warstwy żelu, komórki mogą nadal rozprzestrzeniać się po plastiku hodowli tkankowej, a także do żelu, co powoduje niejednorodny, spowolniony wzorzec migracji, który zaobserwowano podczas optymalizacji. Nierównomierne wysokości migracji można jeszcze zaobserwować na obszarach o mniejszej gęstości komórek, nawet przy 80% zbieganiu. Dobrze replikowane redukują szum związany z tymi zachowaniami komórek. Nadmiernie zlewające się komórki mogą powodować podnoszenie komórek w okresie wirowania i potencjalnie śmierć komórek. Zmienność ta jest rozwiązywana przez rozsiewanie w stałej liczbie komórek i przechwytywanie spójnego obszaru obrazu, aby umożliwić odpowiednie porównania danych. Zgodnie z wiedzą autora, wirowanie płytek nie zostało opublikowane w celu spłaszczania żelu, ale wirowanie jest powszechnie stosowane do pasażowania komórek i przenoszenia biomaterii21,22. Dostosowanie prędkości do prędkości pasażowania pozwoli utrzymać żywotność komórek w celu dalszego optymalnego przetwarzania komórek.

Podstawowym wyzwaniem w tej metodzie jest maksymalizacja rozdzielczości i głębokości obrazowania przy jednoczesnej minimalizacji czasu obrazowania, aby zapewnić najlepszą analizę. Barwnik śledzący zielone krwinki jest wystarczająco jasny, aby zobrazować 96-dołkowy z krokiem 5 μm lub mniejszym i czasem naświetlania do 1000 ms. Skrócenie czasu ekspozycji skraca czas, w którym komórki nie znajdują się w warunkach inkubacji, ale także zmniejsza rozdzielczość. Parametry te muszą być optymalizowane indywidualnie dla każdego mikroskopu, ale zmienność jest zmniejszana poprzez zapewnienie, że wszystkie obrazy są rejestrowane przy tych samych ustawieniach w ramach jednego badania.

Ważną uwagą dotyczącą analizy MA jest to, że wymaga ona wyeliminowania komórek na lub poniżej wysokości monowarstwy, aby zapewnić, że tylko komórki migrujące są brane pod uwagę w testach statystycznych. W związku z tym mediany dołków replikowanych są zgłaszane ze względu na niegaussowski charakter dystrybucji pozycji komórek po filtrowaniu. Porównanie między grupami można zwizualizować za pomocą histogramu, a mediany można analizować statystycznie za pomocą testu nieparametrycznego.

Pomimo tych wyzwań, metoda migracji w górę oparta na monowarstwie jest, w najprostszym wydaniu, powtarzalnym testem do infiltracji komórek 3D porowatych rusztowań. Aby zbadać mechanistyczne skutki migracji komórek, upewnij się, że parametry pasują do badanego typu komórki. Może to obejmować dodanie składników chemotaktycznych lub haptotaktycznych w żelu lub w pożywce. Kompletne pożywki ludzkiego fibroblastu skórnego obejmują chemokiny wędrowne, ale inne typy komórek, które wykorzystują bardziej specyficzne wskazówki, wymagają odpowiedniej adaptacji testu. Ten test nadaje się do testowania wielu typów zmiennych; Ich zakres nie jest jednak objęty niniejszym Protokołem. MAMA zapewnia fizjologicznie istotne środowisko analogiczne do przemieszczania się komórek z tkanki masowej do wstrzykniętego porowatego hydrożelu in vivo.

W przypadku metody PLOSMA umieszczenie sferoid w środku rusztowania ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania i znaczącej migracji komórek w trzech wymiarach. Dokładne wysiew sferoidy w środku żelu zależy od użytkownika. W tym celu ustabilizowanie pipety na cylindrze niedominującą ręką użytkownika pomaga w centrowaniu, a skuteczność pozycji wysiewu można potwierdzić za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej. Sferoida poza środkiem może być naprawiona przez drugą próbę z nową sferoidą, na tym samym rusztowaniu lub na nowym rusztowaniu. Z tego powodu autorzy zalecają stworzenie większej liczby sferoid niż to konieczne i przygotowanie większej ilości żelu MAP niż to konieczne.

Etap wirowania drugiej warstwy zapewnia, że sferoida jest (1) równomiernie pokryta żelem i (2) zdolna do równomiernego rozprowadzania się w górę i w dół w żelu, co ma kluczowe znaczenie dla badania dostarczonych komórek. Wirowanie może również powodować przemieszczanie się sferoidy od środka w kierunku krawędzi studni i chociaż protokół ten ogranicza to zjawisko poprzez optymalizację etapów wirowania i objętości żelu użytego dla każdej warstwy (15 μl) w celu równomiernego rozprowadzenia, nie eliminuje całkowicie jego ruchu. Dokładna prędkość i czas wirowania wymagane do ograniczenia ruchu sferoidalnego mogą wymagać dostosowania zgodnie z modelem wirówki; Jednak specyfikacja opisana w tym protokole może być wykorzystana jako punkt odniesienia dla indywidualnej optymalizacji. Innym podejściem jest pozostawienie sferoidom 2 godzin czasu inkubacji na przyczepienie się do rusztowania przed dodaniem drugiej warstwy żelu. Ruch sferoidalny jest szczególnie dobrze łagodzony, gdy wdrażane są obie strategie. Wreszcie, ze względu na wieloetapowy proces wirowania, metoda ta może nie być odpowiednia dla mniej odpornych linii komórkowych.

Poza logistyką galwanizacji sferoid metodą PLOSMA, istnieją ograniczenia podczas akwizycji obrazu. Sferoidę można obrazować przy użyciu 4-krotnego lub 10-krotnego powiększenia, ale aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj co najmniej 10-krotnego powiększenia i zmniejsz rozmiar kroku z-stacków do 2-5 μm. Powiększenie powinno być spójne przez cały czas trwania badania. Czas obrazowania wydłuża się wraz ze wzrostem rozdzielczości, dlatego należy ograniczyć liczbę próbek w każdej płytce dołka (4-8 dołków na płytkę), aby zminimalizować czas spędzony poza inkubatorem. Konfiguracja obrazowania na żywo może również poprawić śledzenie i zapewnić lepszy wgląd.

Ponieważ granulowane hydrożele mają unikalną topologię i parametry projektowe, które obejmują objętość własną, porowatość, wytrzymałość mechaniczną, a w niektórych przypadkach bioaktywność, konieczne jest badanie zachowania komórek w odniesieniu do tych aspektów z jak największą dokładnością. Metoda PLOSMA ma na celu modelowanie ruchu komórek po porodzie lub po całkowitym wprowadzeniu komórek do granulowanego żelu. Ponieważ komórki są zmuszone do migracji przez pory nieodłącznie związane z geometrią granulowanego hydrożelu, metoda PLOSMA skutecznie izoluje porowatość jako czynnik wpływający na zachowanie komórek. Potencjalne zastosowania tego testu to dostarczanie komórek in situ i integracja tkanek w ziarnistym rusztowaniu, szczególnie w przestrzeni gojenia się ran23.

Oba protokoły zostały opracowane z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami skóry ze względu na rolę migracji fibroblastów w naprawie i przebudowie tkanek 4,24, jednak zachowanie migracyjne wszelkich przylegających komórek można mierzyć w odpowiedzi na zmianę porowatego rusztowania - w tym dodanie czynników wzrostu i powierzchniowy/masowy skład żelu. Zmiany te mogą wymagać dostosowania tych testów w celu uzyskania znaczących wyników. Parametry wymagające dalszej optymalizacji obejmują gęstość wysiewu komórek, czas trwania eksperymentu i/lub potok analizy. IMARIS to potężne narzędzie do analizy obrazowej, które jest wykorzystywane do analizy migracji komórek i ma możliwości wykraczające poza to, co zostało tutaj opisane, które obejmują klasyfikację wszystkich obiektów na wybranej "powierzchni" w zestawy na podstawie różnych właściwości, takich jak pole powierzchni, objętość, intensywność i odległość od innych utworzonych powierzchni. Istnieje wiele zasobów internetowych, które pozwalają określić dalsze metody analizy.

Dwie opisane tutaj metody dotyczą nie tylko początkowego stanu wprowadzenia tkanki do materiału ziarnistego w sposób fizjologiczny, ale także późniejszej odpowiedzi komórki po całkowitym osadzeniu w materiale. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów migracji, obecne komórki są zdolne do proliferacji równolegle z ruchem, jednak konstrukcja opisanych testów nie zakłóca proliferacji, a tym samym nie zapewnia nadmiernego wpływu na analizę. Obie metody są kompatybilne z barwieniem końcowym oprócz obrazowania podłużnego, które wykorzystuje utrwalanie PFA do wykrywania takich wskaźników, jak cytoszkielet, odkładanie kolagenu, proliferacja i inne. Zastosowanie przedstawionych metod zmierza w kierunku dokładniejszego czasoprzestrzennego odwzorowania migracji komórek 3D, które wykorzystuje infiltrację komórek jako mierzalny parametr, w przeciwieństwie do poprzednich metod 1,6,14,15,25,26,27.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowanie tej pracy było częściowo wspierane przez US National Institutes of Health High Priority, Short-Term Project Award (1R56DK126020-01) oraz filantropijny dar od Kurtin Trust. J.T. został ufundowany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship. Schematy rysunkowe stworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermoFisherA22287
Albumina surowicy bydlęcejVWR International332
CellTracker Zielony barwnik CMFDS, 1 mgThermoFisherC292520 x 50 ug jednostek, 492/517 nm
ThermoFisher75016085Seria ST Plus
Przezroczysta 96-dołkowa płytkaMilliPore SigmaCLS3997-50EA
DimetylosulfotlenekFisher ScientificMT-25950CQC250 ml
Fibroblasty Podłoże podstawoweATCCPCS-201-030480 ml, zestaw
do wzrostu fibroblastów bez czerwieni fenolowej - Niska surowicaATCCPCS-201-0417,5 mM L-glut, 5 ng / ml rh FGF zasadowy, 5 ug / ml rh Insulina, 1 ug / ml Hydrokortyzon, 50 ug / ml Kwas askorbinowy, 2% FBS
FIJI (ImageJ)NIHPubliczny dostęp do pobrania
Ludzkie fibroblasty skórneATCCPCS-201-012Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne
ImageXpress Micro ConfocalMolecular DevicesMikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z 4-krotnym, 10-krotnym powiększeniem
IMARISOxford Instruments3/4D Imaged Visualizaiton and Analysis, autorski
inkubatorThermoFisherPipety Finnpipette F2 o zmiennej objętościInkubator CO2 HeraCell Vios 160i, 165L
M-20 Wirnik kubełkowy wahadłowyThermoFisher75003624
MetylocelulozaFisher Scientific9004-67-5Klasa laboratoryjna, w postaci proszku
Probówka do mikrowirówekFisherbrand05-408-1291,5 ml probówki do mikrowirówek
Paraformaldehyd (4%)Alfa AesarAAJ19943K2Do mocowania 
Szalka PetriegoCorning08-757-100ABakteriologiczne szalki Petriego z pokrywką 35 x 10 mm
PipetyThermoFisher4642080Finnpipette F2 Pipety o zmiennej objętości
Sterylne PBSGibco10010-023
Triton-XFisher Scientific327371000

Bibliografia

  1. Jerka, D., et al. Unraveling endothelial cell migration: Insights into fundamental forces, inflammation, biomaterial applications, and tissue regeneration strategies. ACS Appl Bio Mater. 7 (4), 2054-2069 (2024).
  2. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  3. Yamada, K. M., Sixt, M. Mechanisms of 3D cell migration. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (12), 738-752 (2019).
  4. Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biol. 13 (5), 264-269 (2003).
  5. Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv Mater. 22 (31), 3484-3494 (2010).
  6. Solbu, A. A., et al. Assessing cell migration in hydrogels: An overview of relevant materials and methods. Mater Today Bio. 18, 100537(2023).
  7. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Tuning bulk hydrogel degradation by simultaneous control of proteolytic cleavage kinetics and hydrogel network architecture. ACS Macro Lett. 7 (11), 1302-1307 (2018).
  8. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
  9. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomater Biosyst. 1, 100008(2021).
  10. Tanner, G. I., Schiltz, L., Narra, N., Figueiredo, M. L., Qazi, T. H. Granular hydrogels improve myogenic invasion and repair after volumetric muscle loss. Adv Healthc Mater. 25, e2303576(2024).
  11. Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Ann Biomed Eng. 42 (7), 1508-1516 (2014).
  12. Roosa, C. A., et al. Conjugation of IL-33 to microporous annealed particle scaffolds enhances type 2-like immune responses in vitro and in vivo. Adv Healthc Mater. 13 (25), 2400249(2024).
  13. Jaberi, A., et al. Engineering microgel packing to tailor the physical and biological properties of gelatin methacryloyl granular hydrogel scaffolds. Adv Healthc Mater. 13 (25), 2402489(2024).
  14. Nandi, S., Brown, A. C. Characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments. J Vis Exp. 126, e56099(2017).
  15. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Adv Mater. 34 (12), 2109194(2022).
  16. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nat Mater. 14 (7), 737-744 (2015).
  17. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Adv Funct Mater. 31 (35), 2104337(2021).
  18. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. J Vis Exp. (184), e64119(2022).
  19. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomater Sci Eng. 7 (2), 422-427 (2021).
  20. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: Emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Curr Opin Biotechnol. 60, 1-8 (2019).
  21. Jo, C. H., Roh, Y. H., Kim, J. E., Shin, S., Yoon, K. S. Optimizing platelet-rich plasma gel formation by varying time and gravitational forces during centrifugation. J Oral Implantol. 39 (5), 525-532 (2013).
  22. Mironov, V., et al. Fabrication of tubular tissue constructs by centrifugal casting of cells suspended in an in situ. crosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogel. Biomaterials. 26 (36), 7628-7635 (2005).
  23. Vu, L. T., Jain, G., Veres, B. D., Rajagopalan, P. Cell migration on planar and three-dimensional matrices: A hydrogel-based perspective. Tissue Eng Part B Rev. 21 (1), 67-74 (2015).
  24. Cialdai, F., Risaliti, C., Monici, M. Role of fibroblasts in wound healing and tissue remodeling on Earth and in space. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958381(2022).
  25. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomater Sci Eng. 8 (4), 1427-1442 (2022).
  26. Shaik, R., et al. Cardiac matrix-derived granular hydrogel enhances cell function in 3D culture. ACS Appl Mater Interfaces. 16 (43), 58346-58356 (2024).
  27. Puiggalí-Jou, A., Asadikorayem, M., Maniura-Weber, K., Zenobi-Wong, M. Growth factor-loaded sulfated microislands in granular hydrogels promote hMSCs migration and chondrogenic differentiation. Acta Biomater. 166, 69-84 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hydro ele granularnemigracja tr jwymiarowarusztowania hydro elowetest sferoid winterfejs monowarstwy kom rkowejmikroskopia konfokalnaintegracja tkankowadostarczanie kom rekanaliza obrazu
Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.