Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Summary

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Abstract

Granulowane rusztowania hydrożelowe mają znaczący potencjał w medycynie regeneracyjnej, funkcjonując albo jako nośniki do dostarczania komórek, albo jako interfejsy do integracji tkanek. W tym artykule przedstawiono dwa nowatorskie podejścia do ilościowego określania migracji komórek w obrębie i do granulowanych hydrożeli, podkreślając różne zastosowania tych rusztowań. Po pierwsze, przedstawiono test interfejsu jednowarstwowego komórki, który symuluje wzrost tkanki do granulowanych hydrożeli w celu integracji. Po drugie, opisano test oparty na sferoidach, zaprojektowany do śledzenia ruchu komórek w matrycy hydrożelowej, specjalnie przystosowany do zastosowań związanych z dostarczaniem komórek. Obie metody umożliwiają precyzyjne i kontrolowane pomiary migracji komórek, zapewniając kompleksowy zestaw narzędzi dla badaczy wykorzystujących granulowane rusztowania hydrożelowe. Motywacją do opracowania tych metod jest potrzeba dostosowanej kontroli migracji komórek w obrębie rusztowania w celu dostosowania jej do konkretnych zastosowań. Optymalizując i standaryzując te techniki kwantyfikacji, naukowcy mogą iteracyjnie udoskonalać właściwości hydrożelu ziarnistego, zapewniając jego skuteczność w różnych kontekstach medycyny regeneracyjnej. Ten solidny zestaw narzędzi ilościowych oferuje nowe możliwości ulepszania granulowanych rusztowań hydrożelowych, zwiększając ich zastosowanie zarówno w zastosowaniach związanych z dostarczaniem komórek, jak i integracją tkanek.

Introduction

Biomateriały do zastosowań terapeutycznych coraz częściej ewoluują w kierunku bardziej złożonych i odpowiednich modeli środowisk komórkowych do badania integracji tkanek. Rusztowania z biomateriału zapewniają trójwymiarową (3D) strukturę wzrostu komórek i mają na celu naśladowanie pożądanej tkanki^1,2. Trójwymiarowe modele hodowli komórkowych obejmują naturalne matryce i syntetyczne rusztowania, które zapewniają komórkom dalszą złożoność za pomocą wskazówek haptotaktycznych lub chemotaktycznych^3,4. Tradycyjne rusztowania hydrożelowe są sieciowane masowo, co daje nanoporowatą siatkę, która umożliwia dyfuzję małych cząsteczek^5,6, ale wymaga degradacji w celu migracji w skali komórkowej do obszaru tkanki wymagającego naprawy⁷. Granulowane hydrożele są podzbiorem biomateriałów, które mają wysoki potencjał do translacji klinicznej ze względu na ich biokompatybilność, zdolność do dostosowywania się do nieregularnych kształtów oraz, w wielu przypadkach, ich wstrzykiwalność^8,9. Ich blokowy charakter zapewnia przewagę porowatości w skali komórkowej w celu zwiększenia infiltracji tkanek i angiogenezy, a także modułowości, która pozwala na dodanie heterogenicznych wskazówek dotyczących zachowania komórek^10,11,12. Zrozumienie reakcji i ruchu komórek w rusztowaniu 3D ma kluczowe znaczenie fizjologiczne we wszystkich zastosowaniach wykorzystujących biomateriały do integracji tkanek.

Badanie wrastania tkanek w trzech wymiarach okazało się jednak trudne do osiągnięcia z dokładnością ilościową. Zwiększona złożoność środowiska 3D wymaga modeli migracji komórek in vitro, które mogą nie tylko zapewnić wgląd w zachowanie komórek, ale także zoptymalizować warunki materialne. Wcześniej opublikowane raporty na temat migracji komórek granulowanego rusztowania 3D wykorzystywały miejscowe wysiewanie do zbadania zachowania komórek, zgłaszając infiltrację do porowatej struktury i morfologii komórki¹³ i inne kiełkowanie sferoidów^14,15, mierząc długość wzrostu i liczbę pędów. Na długości migracji wysiewu miejscowego mogą mieć nierównomierny wpływ siły grawitacji, a ze względu na ograniczenia mikroskopowe wyniki nie mogą być podłużne. Metoda kiełkowania sferoidów została ograniczona do kwantyfikacji 2D poprzez projekcję maksymalną, która nie jest w stanie uchwycić mechanizmu kontrolowanej inwazji. Obie metody są mierzone w płaszczyźnie xy, która nie ma niuansów niezbędnych do pełnego podsumowania ruchu komórkowego 3D i infiltracji rusztowania.

Ten protokół opisuje dwa podejścia do ilościowego określania migracji komórek, takie jak infiltracja in vitro do porowatych rusztowań hydrożelowych 3D granulowanych, w szczególności przy użyciu rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP)^16,17,18,19. Celem poniższych metod jest badanie zachowania komórek w ziarnistych żelach poprzez kontrolowanie kierunkowości ich migracji w celu analizy trójwymiarowej. Pierwsze, oparte na monowarstwie podejście do badania migracji rosnącej (MAMA) jest uproszczonym modelem endogennej integracji komórek, który ilustruje jednolite interakcje komórka-materiał i służy jako platforma do reprezentowania początkowego środowiska, w którym komórki łączą się z ziarnistymi hydrożelami, a także do izolowania indywidualnych zachowań przed infiltracją rusztowania. Druga, zwana metodą równoległej warstwowej zewnętrznej migracji sferoidów (PLOSMA), to test migracji sferoidalnej komórek 3D, który bada ruch komórek, gdy jest w pełni otoczony złożonym środowiskiem rusztowania i modeluje ruch komórki po dostarczeniu, a także ruch po tym, jak komórki w pełni weszły do ziarnistego żelu.

Obie metody są kwantyfikowalne za pomocą analizy obrazu 3D i mogą być stosowane do badania i optymalizacji interakcji materiał-komórka za pomocą podłużnych punktów czasowych dla zastosowań medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej, gdzie promowanie lub ograniczanie ruchu komórek mieści się w kryteriach projektowania. Ponadto metody te wykorzystują wirowanie płytek w celu równomiernego przygotowania testów wielodołkowych.

Protocol

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Preparat granulowanego hydrożelu

UWAGA: Cząstki MAP używane w tym protokole to 3,2% wag. w/v żel z 45,88 mg/mL PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMal¹⁹, oraz 5,62 mg/ml MMP-2 degradowalny środek sieciujący. Sztywność mechaniczna żelu wynosi 15-20 kPa, aby dopasować się do sztywności skórnej¹⁷.

1. Wygeneruj ziarniste cząsteczki hydrożelu i przygotuj się do hodowli komórkowej w normalny sposób.
   UWAGA: Protokół ten opisuje sterylne przygotowanie żelu z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi cząstkami, którego produkcja jest szczegółowo opisana przez Roosa et al.¹⁸.
2. Przygotuj ziarniste cząsteczki hydrożelu do użycia in vitro, sterylizując trzema płukaniami 70% alkoholu izopropylowego, a następnie trzema płukaniami sterylnego 1x PBS.
3. Przygotować sterylny 0,2 mM fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) w roztworze pożywki, rozpuszczając proszek LAP w ultraczystej wodzie i przepuszczając roztwór przez sterylny filtr 0,22 μm. Dodać ten roztwór w stosunku 1:1 v/v z ilością żelu niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu.
4. Inkubować roztwór 0,2 mM LAP, żelu i pożywki w temperaturze 37 °C na rotatorze probówkowym przy 20 obr./min przez co najmniej 30 minut przed przystąpieniem do dyfuzji LAP w mikrocząstkach.
5. Po upływie 30 minut odwirować zawiesinę cząstek o stężeniu 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Odessać supernatant.
   UWAGA: Ogólna suchość cząstek MAP może się różnić ze względu na różnice w składzie chemicznym, hydrofilowości i wielkości cząstek. Aby zapewnić spójność, najlepszą praktyką jest odwirowanie zawiesiny cząstek zgodnie z opisem, wymieszanie cząstek w probówce za pomocą pipety wyporowej, a następnie powtórzenie etapu wirowania.

2. Metoda jednowarstwowego testu migracji wstępującej (MAMA): hodowla komórkowa i obrazowanie

UWAGA: Komórki zostały zobrazowane za pomocą kanału FITC (488 nm). Barwnik użyty do ogniw miał wzbudzenie przy 492 nm i emisję przy 517 nm. 10-krotne powiększenie zapewnia większą szczegółowość w porównaniu z 4-krotnym powiększeniem, ale można użyć dowolnej z nich.

1. Rozmrozić ludzkie fibroblasty skóry (HDF) zgodnie z protokołem producenta. Przejście w razie potrzeby, aż do osiągnięcia pożądanego przejścia; ogólnie rzecz biorąc, komórki pierwotne utrzymują skład genetyczny i fenotypowy poprzez P5.
2. Płytka 120 000 komórek/^cm2 dla co najmniej n = 6 w płytce 96-dołkowej lub płytki o pożądanym rozmiarze, używając zalecanej objętości pożywki na studzienkę do zawiesiny, delikatnie zasysając przed każdym dodaniem. Pozwól komórkom przyczepić się przez noc, jak pokazano na Rysunek 1A, co spowoduje około 80% konfluencji następnego dnia.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, studzienki środkowej kolumny i rzędów są najlepsze do optymalnego rozprowadzania żelu. Autorzy używają do 24 dołków na płytkę 96-dołkową (rzędy B-G i kolumny 5-8).
3. Przygotować warunki żelowe, jak wspomniano powyżej, i podczas inkubacji w LAP usunąć pożywkę za pomocą aspiratora lub pipety z płytki dołka komórek. Uważaj, aby nie naruszyć dolnej części talerza.
4. Dodaj barwnik śledzący komórki do studzienek zgodnie z instrukcjami producenta, przedstawionymi w Rysunek 1B. Upewnij się, że żel jest całkowicie przygotowany zgodnie z opisem w kroku 1 przed zasysaniem barwnika śledzącego komórki z dołków.
5. Dodać 20 μl każdego żelu do studzienek za pomocą pipety wyporowej, nie dotykając dna płytki.
   UWAGA: Najlepsze warunki do oznaczania występują, gdy żel jest pipetowany bezpośrednio do środka studzienki.
6. Używając nasadki wirówkowej z wirnikiem wirowym w temperaturze 25 °C, wirować z prędkością 100 x g przez 15 s z przyspieszeniem i opóźnieniem 8 w celu spłaszczenia żelu. Obróć płytkę o 180° i ponownie wiruj z prędkością 100 x g przez 15 sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki, jak widać na Rysunek 1C.
7. Aseptyczne sieciowanie foto żelu od góry (Rysunek 1D) poprzez przyłożenie skupionego światła (365 nm, 34,4 mW/cm²) do próbki przez 30 sekund w celu wyżarzania rusztowania, dodając 200 μl pożywki do każdej studzienki komórek po uformowaniu wszystkich rusztowań. Pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić im przyłączenie się do rusztowania ziarnistego przed obrazowaniem.
8. Aby uchwycić zachowanie migracyjne podsumowane w Rysunek 1E, zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Znajdź najniższy punkt ostrości dla obszaru płytki, w którym komórki zlewają się w co najmniej 80%, i ustaw go jako dolną krawędź stosu z.
   1. Znajdź najwyższy punkt sygnału fluorescencyjnego komórki i ustaw go jako górną krawędź stosu z. Użyj kroku o rozmiarze 5 μm lub mniejszym, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość.
9. Zobrazuj co najmniej trzy studzienki, aby reprezentować monowarstwę komórki i wysokość komórek niemigrujących. Punkt czasowy t = 0 jest pokazany zarówno z widoku z góry, jak i z boku w Rysunek 2A. Inkubować przez noc po zakończeniu obrazowania.
   UWAGA: Komórki te zostały zobrazowane za pomocą obiektywu 4x, a ekspozycja była spójna dla wszystkich dołków.
10. W t = 24 h komórki zaczną wznosić się przez granularne rusztowanie, jak widać na Rysunek 2B z góry i z boku. Powtórz czynności obrazowania, jak dla t = 0 h, stosując te same parametry. Użyj poprzedniej wysokości stołu montażowego jako odniesienia lub znajdź komórki, które nie zostały jeszcze przeniesione, i ustaw ją jako dolną krawędź stosu z.
11. Powtórz kroki dla wszystkich odwiertów, upewniając się, że każdy studzienka jest zapisana jako osobny obraz w celu ułatwienia analizy.
    UWAGA: Punkty czasowe mogą być obrazowane dla dłuższych punktów czasowych w zależności od ograniczeń eksperymentalnych i metody śledzenia fluorescencji komórek.
12. Rusztowania mogą być mocowane i barwione w celu uzyskania dodatkowych wskaźników. W pożądanym końcowym punkcie czasowym odessać pożywkę ze studzienek za pomocą pipety i wyrzucić. Delikatnie umyj każdą studzienkę 200 μl sterylnego PBS dwa razy przez 5 minut każda. Dodać 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut, a następnie odessać i wyrzucić. Studzienki można natychmiast zabarwić lub przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x PBS przez okres do tygodnia.

3. Metoda jednowarstwowego testu migracji rosnącej (MAMA): analiza obrazu 3D

1. W przypadku konwersji wsadowej otwórz oprogramowanie IMARIS Image Conversion. Przeciągnij i upuść obrazy mikroskopowe do oprogramowania do konwersji i wybierz folder w oprogramowaniu Arena do zaimportowania. Naciśnij przycisk Rozpocznij wszystko. Przekonwertowane obrazy pojawią się na Arenie jako pliki .ims.
   UWAGA: Jeśli rozmiar woksela nie jest uwzględniony w metadanych obrazu, zapoznaj się z indywidualnymi specyfikacjami obrazowania konfokalnego, aby znaleźć wartość. Alternatywnie, rozmiar woksela można przybliżyć jako rozmiar kroku używany podczas obrazowania.
2. Otwórz oprogramowanie, klikając dwukrotnie ikonę IMARIS Arena na pulpicie i wybierając obraz z Areny.
3. Obraz jest automatycznie ładowany do zakładki analizy "Widok 3D" widocznej w panelu ikon paska narzędzi u góry. Kliknij zakładkę Image Proc na głównym pasku narzędzi.
4. W lewym górnym rogu panelu bocznego kliknij menu rozwijane dla Kanału 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk Ok u dołu panelu, aby powrócić do "Widoku 3D". Reprezentatywne obrazy dla t = 0 h i t = 24 h znajdują się odpowiednio w Rysunek 2A,B.
5. Na małym pasku narzędzi tuż nad menu panelu bocznego kliknij ikonę z zaokrąglonymi niebieskimi kształtami, Dodaj nowe powierzchnie, aby utworzyć zakładkę edytowalnych obiektów o nazwie "Powierzchnie 1".
6. Interfejs do tworzenia parametrów ustawień algorytmu otworzy się w dolnej części panelu menu. Ręcznie wygeneruj parametry, które mają być używane dla wszystkich replikacji, klikając przycisk niebieskiej strzałki u dołu interfejsu. Upewnij się, że wybrano właściwy kanał źródłowy i zaznacz pole "Gładkie".
   1. Ustaw szczegółowość powierzchni na 0,7 μm i wybierz opcję Odejmowanie tła (kontrast lokalny). Wpisz średnią długość komórki w polu "Średnica największej kuli, która mieści się w obiekcie". Naciśnij tę samą niebieską strzałkę na dole po zakończeniu.
      UWAGA: Wartość tę można oszacować za pomocą zakładki "Wycinek" na pasku narzędzi i mierząc szerokość średnich komórek.
7. W przypadku progowania określ histogram intensywności, w którym tylko najjaśniejsze komórki są podzielone na segmenty. Korzystając z fragmentatora, przesuwaj się w górę i w dół po stosie obrazów, aby upewnić się, że jest on tak dokładny, jak to możliwe.
   1. Wybierz opcję Włącz dla opcji "Podziel stykające się obiekty (rosnący region)" i ustaw średnicę punktów początkowych na tę samą średnicę, która była używana wcześniej. Upewnij się, że wybrano próg "Oparty na intensywności" i kliknij niebieski przycisk strzałki w prawo.
8. Kolejne dwa kroki, Punkty zalążkowe filtru i Powierzchnie filtracyjne, można dostosować za pomocą kilku pomiarów, aby zapewnić dokładność generowanych powierzchni, jednak analiza linii bazowej nie wymaga dodatkowego filtrowania. Gdy zmiana nie jest potrzebna, kliknij przycisk z niebieską strzałką.
   UWAGA: Ostatni krok umożliwia dalszą klasyfikację powierzchni w zależności od pożądanej wydajności. Po wprowadzeniu zmian kliknij przycisk zielonej strzałki, aby zakończyć tworzenie powierzchni.
9. Aby zapisać parametry tworzenia do analizy wsadowej, kliknij ikonę różdżki Tworzenie. Kliknij Przechowuj parametry dla partii i nazwij ją, a następnie kliknij OK. Reprezentatywne przetworzone obrazy dla t = 0 i t = 24 h są pokazane w Rysunki 2C,D, odpowiednio.
   UWAGA: Wszystkie obiekty w obrębie wybranej "Powierzchni" można podzielić na zestawy na podstawie różnych właściwości podanych przez oprogramowanie do konwersji obrazu, takich jak pole powierzchni, objętość, intensywność i odległość od innych utworzonych powierzchni.
10. Właściwości powierzchni można znaleźć, wybierając kartę Statystyka. Aby zebrać wszystkie wysokości komórek, kliknij kartę Szczegółowe i wybierz Określone wartości i Pozycję Z z kolejnych menu rozwijanych. Kliknij pojedynczą ikonę Zapisz, aby zapisać wszystkie pozycje Z i wszelkie klasyfikacje wprowadzone do pliku .xls. Powtórz te czynności dla wszystkich obrazów.
11. Znajdź medianę pozycji z komórek niemigrujących na reprezentatywnym obrazie i dobrze odejmij wszystkie pozycje z poniżej tej liczby z każdego warunku testowego.
    UWAGA: Wartości migracji są podawane jako średnie mediany dla każdego technicznego warunku replikacji powyżej wysokości komórki niemigrującej. Można je przedstawić jako medianę wysokości, widoczną w Rysunek 3A, lub jako zmianę wysokości migracji w żądanym punkcie czasowym w porównaniu do t = 0, widoczną w Rysunek 3B.

4. Metoda testu PLOSMA (Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay): Hodowla komórkowa i hodowla wiszących kropelek dla sferoid 3D

UWAGA: Ten protokół opisuje hodowlę komórkową i hodowlę wiszących kropli zaadaptowaną z protokołu autorstwa Nandi et al.¹⁴.

1. Rozmrażaj HDF zgodnie z protokołem producenta. Przejście w razie potrzeby, aż do osiągnięcia pożądanego przejścia.
2. W aseptycznym kapturze do hodowli komórkowych przygotuj szalkę Petriego, dodając 10 ml PBS do dna i odwracając pokrywkę tak, aby zewnętrzna strona spoczywała na kapturze do hodowli komórkowych.
3. Dodać odpowiednią objętość komórek (określoną na podstawie liczby komórek) do probówki mikrowirówkowej. Dodaj barwnik śledzący komórki rozcieńczony w pożywce. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą podgrzanego podłoża.
   UWAGA: Sferoidy powinny mieć około 8000 komórek na sferoidę, ale mogą się zmieniać w zależności od typu komórki.
4. Inkubować roztwór komórek przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować komórki zgodnie z prędkością zalecaną przez producenta i odessać supernatant.
5. Zawieś komórki w 1:100 metylocelulozy w pożywce.
6. Odpipetować 20 μl kropelek roztworu komórki/pożywki na pokrywkę szalki Petriego.
7. Pewnie, szybko i ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na dolnej połowie szalki Petriego zawierającej PBS.
8. Inkubować kropelki przez co najmniej 24 godziny
   UWAGA: Powstawanie sferoid można monitorować za pomocą mikroskopii jasnego pola.

5. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidów na zewnątrz (PLOSMA): Umieszczanie sferoidów komórkowych na granulowanym hydrożelu

UWAGA: Następujący proces jest podsumowany w Rysunek 4A.

1. Aby skonfigurować metodę PLOSMA opisaną w Rysunek 4A, należy aseptycznie dodać 15 μl żelu za pomocą pipety wyporowej do studzienek na przezroczystej 96-dołkowej płytce.
2. Używając nasadki wirówki z wirnikiem z wirnikiem, wirować z prędkością 1000 x g przez 10 sekund, aby spłaszczyć żel. Obróć płytkę o 180° i ponownie wiruj z prędkością 1000 x g przez 10 sekund, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu na dnie studzienki.
3. Po uzyskaniu równomiernej płaskości należy aseptycznie usieciować żel foto od góry, przykładając skupione światło (365 nm, 33,4 mW/cm²) do próbki przez 30 sekund w celu wyżarzania rusztowania.
4. W asepcie przesunąć szalkę Petriego z wiszącymi kropelkami do aseptycznego kaptura do hodowli tkankowych i odwrócić pokrywę.
5. Używając pipety o pojemności 20 μl, powoli pobieraj kroplę, aż sferoida dostanie się do końcówki pipety. Wyrzuć kropelkę na rusztowanie pośrodku studni.
6. Powtórz poprzednie kroki dla wszystkich studzienek. Upewnij się, że każda studzienka ma sferoidę, potwierdzając ją za pomocą mikroskopii jasnego pola lub fluorescencji.
7. Inkubować płytkę studzienkową w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby umożliwić sferoidom przymocowanie się do rusztowania.
8. Odpipetować dodatkowe 15 μl żelu na wierzch każdej sferoidy. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie żelu, odwiruj płytkę o masie 300 x g przez 15 s w każdym kierunku.
9. Wyżarzać górną warstwę żelu przez 30 s przy użyciu światła UV (365 nm) o mocy 33,4 mW/^cm2. Pipety należy umieścić na każdym rusztowaniu, aby uzyskać całkowitą objętość studzienki do 200 μl.
   UWAGA: W tym momencie rusztowania będą bardzo suche, więc dodaj pożywkę kroplami po boku studni, aby uniknąć oderwania sferoidy.

6. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidalnej na zewnątrz (PLOSMA): Obrazowanie konfokalne sferoid

UWAGA: Łatwość obrazowania zależy od systemu obrazowania. Zlokalizuj sferoidę w studni w czasie niskiej ekspozycji. Komórki zostały zobrazowane za pomocą kanału FITC (488 nm). Barwnik użyty do ogniw miał wzbudzenie przy 492 nm i emisję przy 517 nm. 10-krotne powiększenie zapewnia większą szczegółowość w porównaniu z 4-krotnym powiększeniem.

1. Znajdź najniższy poziom stołu montażowego (wysokość z), na którym komórki są nadal aktywne. Ustaw to jako dolną granicę stosu z.
2. Znajdź najwyższy poziom stołu montażowego (wysokość osi z), na którym komórki są nadal aktywne. Ustaw to jako górny limit z-stack.
   UWAGA: Najlepsze wyniki obrazowania obejmują rozmiar kroku mniejszy lub równy 5 μm, aby zachować rozdzielczość skali komórkowej. W zależności od systemu mikroskopu konfokalnego mogą występować kompromisy między szybkością obrazowania a rozdzielczością.
3. Zobrazuj wszystkie sferoidy zgodnie z opisem w t = 0 i 24 h. 48-godzinny punkt czasowy może być również obrazowany w zależności od ograniczeń eksperymentalnych. Reprezentatywne obrazy projekcji maksymalnej t = 0 i t = 24 są widoczne w Rysunek 4B.

7. Metoda równoległego warstwowego testu migracji sferoidalnej na zewnątrz (PLOSMA): analiza obrazu 3D

1. Zaimportuj obrazy do oprogramowania analitycznego zgodnie z opisem w krokach od 3.1 do 3.4. W prawym górnym rogu lewego panelu kliknij menu rozwijane Kanał 1 i wybierz opcję Odejmowanie tła. Naciśnij przycisk OK w dolnej części panelu.
2. Po powrocie do widoku 3D naciśnij przycisk Automatyczna regulacja wszystkich kanałów w wyskakującym oknie Regulacja wyświetlania i popraw w razie potrzeby.
3. Na mniejszym pasku narzędzi tuż nad bocznym menu kliknij ikonę Dodaj nową ramkę odniesienia pokazaną w Rysunek 5A z trzema ortogonalnymi strzałkami, aby dodać nową zakładkę o nazwie "Układ odniesienia 1".
4. Przesuń początek układu współrzędnych do środka sferoidy we wszystkich trzech płaszczyznach, jak pokazano na rysunku Rysunek 5B.
5. Na tym samym pasku narzędzi, co trzy ortogonalne strzałki, kliknij ikonę z pomarańczowymi kulami i dodaj nowe punkty, aby utworzyć zakładkę o nazwie "Miejsca 1". Naciśnij przycisk z niebieską strzałką.
6. W obszarze Wykrywanie punktowe ustaw Szacowana średnica XY na szacowaną średnicę komórek. Naciśnij przycisk z niebieską strzałką.
   UWAGA: W przypadku HDF liczba ta wynosi 15,0 μm.
7. W przypadku progowania dostosuj histogram intensywności tak, aby obejmował tylko najjaśniejsze części. Korzystając z fragmentatora, przesuwaj się w górę i w dół po stosie obrazów, aby upewnić się, że jest on tak dokładny, jak to możliwe. Kliknij niebieską następną strzałkę.
8. Naciśnij zielony przycisk Wykonaj, aby zakończyć analizę.
9. Usuń zaznaczenie opcji Renderuj na fragmentatorze lub kliknij ikonę żółtego kwadratu po prawej stronie panelu konfiguracji.
10. Kliknij zakładkę Statystyki. Z pierwszego menu rozwijanego wybierz opcję Określone wartości. Z drugiego menu rozwijanego wybierz opcję Odległość od układu odniesienia początku. Zostaną wyświetlone wszystkie wartości dla wybranych powierzchni, jak widać na rysunku Rysunek 5C. Kliknij pojedynczą ikonę zapisywania, która pobiera plik .xls.
11. Zapisz zmiany wprowadzone w obrazie i analizach, naciskając ikonę Zapisz na głównym pasku narzędzi. Rysunek 6A przedstawia renderowanie 3D sferoidy zobrazowanej po 24 godzinach, podczas gdy Rysunek 6B przedstawia funkcję IMARIS Spots oznaczającą komórki rozkładowe, oznaczone kolorami zgodnie z odległością od układu odniesienia początkowego.
12. Znormalizuj wyeksportowane dane do obrazów t = 0 i oblicz średnią przebytej odległości komórkowej i wysokości z dla każdej sferoidy, aby uzyskać pojedynczą wartość dla każdej próbki. Rysunek 7A,B przedstawia reprezentatywne wykresy dla każdego wyjścia, odpowiednio.

Results

Ten protokół ma na celu wyszczególnienie niezbędnych kroków dla dwóch nowatorskich szczegółowych testów migracji rusztowań. Metoda MAMA może być wykorzystana do oceny infiltracji komórkowej na granicy faz tkanek. Granulowane hydrożele są bardziej złożonym systemem niż hydrożele luzem i dlatego są z natury bardziej skomplikowane do przetworzenia na potrzeby migracji^9,20. Ważne jest, aby zrozumieć proces krokowy opisany w Rysunek 1. Każdy krok opiera się na następnym i został zoptymalizowany w tym protokole. Wysiewanie HDF o gęstości 120 000 komórek/^cm2 spowoduje co najmniej 80% konfluencji w ciągu nocy (Rysunek 1A), a te niefluorescencyjne komórki najlepiej oznaczyć barwnikiem śledzącym komórki w dniu eksperymentu, aby zmaksymalizować potencjał obrazowania (Rysunek 1B). Protokół ten odpowiada mniejszej sile odśrodkowej stosowanej w pasażowaniu HDF w celu utrzymania żywotności komórek. Ze względu na kąt, który jest wytwarzany dla pojedynczego etapu wirowania, konieczne jest odwrócenie płytki o 180°, aby zapewnić przesunięcie żelu i pełne pokrycie dolnej powierzchni studzienek (Rysunek 1C). Pozostawienie komórek do regeneracji w inkubatorze przez 30 minut po wyżarzaniu ( Rysunek 1D) utrzyma żywotność komórek i spowoduje optymalną migrację ( Rysunek 1E). Duży obszar 96-dołkowej płytki można zobrazować za pomocą obiektywu 4x i dopasować od punktu czasowego 0-24 h (Rysunek 2A,B) w celu szerokiej oceny zachowania komórek. Przetwarzanie wynikowych obrazów z-stack w oprogramowaniu analitycznym zapewnia zaawansowane analizy dla wielu dużych zestawów danych w łatwym w użyciu interfejsie. Ten protokół podsumowuje kroki tworzenia zestawów danych dla wysokości komórki lub pozycji Z w każdym punkcie czasowym wizualizowanym za pomocą reprezentatywnych obrazów w Rysunek 2B, C. Analiza przetworzonych danych jest widoczna w Rysunek 3A, wizualizowany przy użyciu średniej średnich wysokości i ich odchylenia standardowego każdego punktu czasowego, a wysokość zmiany zagięcia z komórek niemigrujących przy t = 0 h jest pokazana w Rysunek 3B. Dane bazowe tej metody mają zazwyczaj rozkład nienormalny, więc mediany są bardziej wiarygodnymi miarami do porównania i dlatego są używane do podsumowywania danych.

Podobnie, metoda PLOSMA może być wykorzystana do oceny ruchliwości dostarczonych komórek w granulowanym rusztowaniu hydrożelowym 3D. Rysunek 4A przedstawia kroki do metody PLOSMA, a szczególnie ważne jest zasianie sferoidy w środku studni. Wyśrodkowanie sferoidy w polu view jest zalecane, ale zależy to od możliwości mikroskopu. Rysunek 4B pokazuje reprezentatywne obrazy rozprzestrzeniania się sferoidów dla t = 0 h i t = 24 h wykonane przy 10-krotnym powiększeniu w kanale FITC (488 nm). W oprogramowaniu można utworzyć układ odniesienia początku układu współrzędnych i dostosować go do każdego stosu z (Rysunek 5A,B). Oprogramowanie może śledzić odległość promieniową od tego układu odniesienia początku i eksportować go jako żądany zestaw danych (Rysunek 5C). Rysunek 6A pokazuje reprezentatywny obraz renderingu 3D sferoidy t = 24 h, podczas gdy Rysunek 6B pokazuje funkcję Spots w oprogramowaniu. Przykład przetworzonych danych pokazano w Rysunek 7. Rysunek 7A przedstawia średnią odległość przebytą od centrum znormalizowaną do odległości z dnia 0. Rysunek 7B izoluje odległości przebyte tylko w płaszczyźnie z, ponieważ jest to kierunek, który metoda PLOSMA ma na celu zbadać.

Rysunek 1: Monowarstwowy test migracji rosnącej, hodowla komórkowa i obrazowanie. Schemat głównych etapów przetwarzania komórek i żeli dla MAMA. (A) Komórki są hodowane do konfluencji przez noc, a (B) barwnik śledzący komórki jest dodawany tuż przed dodaniem granulowanego żelu. Rusztowanie jest montowane za pomocą (C) wirowania płytkowego i stabilizowane za pomocą (D) fotosieciowania. Obrazowanie w wielu punktach czasowych umożliwia (E) wizualizację migracji komórek w górę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przetwarzanie obrazu MAMA. Reprezentatywne obrazy przetwarzania obrazu. Porównanie z góry i z boku surowych obrazów konfokalnych przy (A) t = 0 i (B) t = 24 h w kanale FITC przy 4-krotnym powiększeniu. (B) Porównanie wysokości Z pozycji przetwarzanej komórki w widoku z góry i z boku przy (C) t = 0 i (D) t = 24 h. Przetwarzanie przez 24 godziny obejmuje odejmowanie mediany niemigrujących wysokości z. Podziałka = 500 μm. Skróty: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza danych wyjściowych migracji komórek MAMA. (A) Mediana pozycji Z i odchylenie standardowe wysokości komórek w każdej kontrpróbie (n = 6) w punktach czasowych t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) i t = 24 h (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migracja komórek po 24 godzinach znormalizowana do 0 godzin i zgłoszona jako zmiana krotności (1,8 ± 0,4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Hodowla komórek i obrazowanie metodą PLOSMA (Parallel Layer Outward Spheroid Migration Astest). (A) Schemat opisujący etapy warstwowania rusztowania. (B) Projekcje maksymalnej intensywności sferoidy wykonane w godzinach 0 i 24. Obrazy wykonano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w kanale FITC (488 nm) przy 10-krotnym powiększeniu. Podziałka = 200 μm. Skróty: PLOSMA = Test migracji sferoidalnej warstwy równoległej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Tworzenie nowego układu odniesienia do początku. (A) Przycisk nowej układu odniesienia początku układu odniesienia oznaczonego czerwoną ramką. (B) Nowy początek układu współrzędnych jest ustawiony tak, aby znajdował się w środku sferoidy we wszystkich trzech wymiarach. (C) Pokazane metryki wyjściowe to odległości powierzchni komórek od układu odniesienia początku, które opisują, jak daleko komórki migrowały od środka. Podziałka = 120 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Renderowanie 3D osadzonego sferoidu po 24 godzinach. (A) Przetworzony sferoid w przestrzeni 3D. (B) Środek tej samej sferoidy został określony za pomocą funkcji układu odniesienia początku układu odniesienia w IMARIS, a rozkład komórek jest oznaczony kolorem przez odległość od początku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przykładowe dane wyjściowe dla PLOSMA. (A) Przykładowe wyniki PLOSMA pokazujące przebytą odległość w μm. Średnia przebyta odległość wynosiła 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Zmiana fałdu na wysokości Z (t_f/t₀) kiełkowania sferoidów. Średnia zmiana w liczbie fałd wyniosła 3,82 ± 1,495. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten opisuje dwa modele in vitro do charakteryzowania migracji komórek w 3D w celu gojenia ran i integracji tkankowej. Pierwszy model, test migracji oparty na monowarstwie, opiera się na prawidłowo przyłączonych i zlewających się komórkach. Protokół ten został opracowany z wykorzystaniem typu komórek fibroblastów i zoptymalizowany przy gęstości wysiewu 1,20 000 komórek/^cm2. Ta gęstość pozwala komórkom rosnąć z dnia na dzień do co najmniej 80% zbiegu równomiernie na dnie płytki studzienki. Ten krok zapewnia migrację w kierunku z w ciągu co najmniej 24 godzin; Jeśli konfluencja jest zbyt niska po dodaniu warstwy żelu, komórki mogą nadal rozprzestrzeniać się po plastiku hodowli tkankowej, a także do żelu, co powoduje niejednorodny, spowolniony wzorzec migracji, który zaobserwowano podczas optymalizacji. Nierównomierne wysokości migracji można jeszcze zaobserwować na obszarach o mniejszej gęstości komórek, nawet przy 80% zbieganiu. Dobrze replikowane redukują szum związany z tymi zachowaniami komórek. Nadmiernie zlewające się komórki mogą powodować podnoszenie komórek w okresie wirowania i potencjalnie śmierć komórek. Zmienność ta jest rozwiązywana przez rozsiewanie w stałej liczbie komórek i przechwytywanie spójnego obszaru obrazu, aby umożliwić odpowiednie porównania danych. Zgodnie z wiedzą autora, wirowanie płytek nie zostało opublikowane w celu spłaszczania żelu, ale wirowanie jest powszechnie stosowane do pasażowania komórek i przenoszenia biomaterii^21,22. Dostosowanie prędkości do prędkości pasażowania pozwoli utrzymać żywotność komórek w celu dalszego optymalnego przetwarzania komórek.

Podstawowym wyzwaniem w tej metodzie jest maksymalizacja rozdzielczości i głębokości obrazowania przy jednoczesnej minimalizacji czasu obrazowania, aby zapewnić najlepszą analizę. Barwnik śledzący zielone krwinki jest wystarczająco jasny, aby zobrazować 96-dołkowy z krokiem 5 μm lub mniejszym i czasem naświetlania do 1000 ms. Skrócenie czasu ekspozycji skraca czas, w którym komórki nie znajdują się w warunkach inkubacji, ale także zmniejsza rozdzielczość. Parametry te muszą być optymalizowane indywidualnie dla każdego mikroskopu, ale zmienność jest zmniejszana poprzez zapewnienie, że wszystkie obrazy są rejestrowane przy tych samych ustawieniach w ramach jednego badania.

Ważną uwagą dotyczącą analizy MA jest to, że wymaga ona wyeliminowania komórek na lub poniżej wysokości monowarstwy, aby zapewnić, że tylko komórki migrujące są brane pod uwagę w testach statystycznych. W związku z tym mediany dołków replikowanych są zgłaszane ze względu na niegaussowski charakter dystrybucji pozycji komórek po filtrowaniu. Porównanie między grupami można zwizualizować za pomocą histogramu, a mediany można analizować statystycznie za pomocą testu nieparametrycznego.

Pomimo tych wyzwań, metoda migracji w górę oparta na monowarstwie jest, w najprostszym wydaniu, powtarzalnym testem do infiltracji komórek 3D porowatych rusztowań. Aby zbadać mechanistyczne skutki migracji komórek, upewnij się, że parametry pasują do badanego typu komórki. Może to obejmować dodanie składników chemotaktycznych lub haptotaktycznych w żelu lub w pożywce. Kompletne pożywki ludzkiego fibroblastu skórnego obejmują chemokiny wędrowne, ale inne typy komórek, które wykorzystują bardziej specyficzne wskazówki, wymagają odpowiedniej adaptacji testu. Ten test nadaje się do testowania wielu typów zmiennych; Ich zakres nie jest jednak objęty niniejszym Protokołem. MAMA zapewnia fizjologicznie istotne środowisko analogiczne do przemieszczania się komórek z tkanki masowej do wstrzykniętego porowatego hydrożelu in vivo.

W przypadku metody PLOSMA umieszczenie sferoid w środku rusztowania ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania i znaczącej migracji komórek w trzech wymiarach. Dokładne wysiew sferoidy w środku żelu zależy od użytkownika. W tym celu ustabilizowanie pipety na cylindrze niedominującą ręką użytkownika pomaga w centrowaniu, a skuteczność pozycji wysiewu można potwierdzić za pomocą mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej. Sferoida poza środkiem może być naprawiona przez drugą próbę z nową sferoidą, na tym samym rusztowaniu lub na nowym rusztowaniu. Z tego powodu autorzy zalecają stworzenie większej liczby sferoid niż to konieczne i przygotowanie większej ilości żelu MAP niż to konieczne.

Etap wirowania drugiej warstwy zapewnia, że sferoida jest (1) równomiernie pokryta żelem i (2) zdolna do równomiernego rozprowadzania się w górę i w dół w żelu, co ma kluczowe znaczenie dla badania dostarczonych komórek. Wirowanie może również powodować przemieszczanie się sferoidy od środka w kierunku krawędzi studni i chociaż protokół ten ogranicza to zjawisko poprzez optymalizację etapów wirowania i objętości żelu użytego dla każdej warstwy (15 μl) w celu równomiernego rozprowadzenia, nie eliminuje całkowicie jego ruchu. Dokładna prędkość i czas wirowania wymagane do ograniczenia ruchu sferoidalnego mogą wymagać dostosowania zgodnie z modelem wirówki; Jednak specyfikacja opisana w tym protokole może być wykorzystana jako punkt odniesienia dla indywidualnej optymalizacji. Innym podejściem jest pozostawienie sferoidom 2 godzin czasu inkubacji na przyczepienie się do rusztowania przed dodaniem drugiej warstwy żelu. Ruch sferoidalny jest szczególnie dobrze łagodzony, gdy wdrażane są obie strategie. Wreszcie, ze względu na wieloetapowy proces wirowania, metoda ta może nie być odpowiednia dla mniej odpornych linii komórkowych.

Poza logistyką galwanizacji sferoid metodą PLOSMA, istnieją ograniczenia podczas akwizycji obrazu. Sferoidę można obrazować przy użyciu 4-krotnego lub 10-krotnego powiększenia, ale aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj co najmniej 10-krotnego powiększenia i zmniejsz rozmiar kroku z-stacków do 2-5 μm. Powiększenie powinno być spójne przez cały czas trwania badania. Czas obrazowania wydłuża się wraz ze wzrostem rozdzielczości, dlatego należy ograniczyć liczbę próbek w każdej płytce dołka (4-8 dołków na płytkę), aby zminimalizować czas spędzony poza inkubatorem. Konfiguracja obrazowania na żywo może również poprawić śledzenie i zapewnić lepszy wgląd.

Ponieważ granulowane hydrożele mają unikalną topologię i parametry projektowe, które obejmują objętość własną, porowatość, wytrzymałość mechaniczną, a w niektórych przypadkach bioaktywność, konieczne jest badanie zachowania komórek w odniesieniu do tych aspektów z jak największą dokładnością. Metoda PLOSMA ma na celu modelowanie ruchu komórek po porodzie lub po całkowitym wprowadzeniu komórek do granulowanego żelu. Ponieważ komórki są zmuszone do migracji przez pory nieodłącznie związane z geometrią granulowanego hydrożelu, metoda PLOSMA skutecznie izoluje porowatość jako czynnik wpływający na zachowanie komórek. Potencjalne zastosowania tego testu to dostarczanie komórek in situ i integracja tkanek w ziarnistym rusztowaniu, szczególnie w przestrzeni gojenia się ran²³.

Oba protokoły zostały opracowane z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami skóry ze względu na rolę migracji fibroblastów w naprawie i przebudowie tkanek ^4,24, jednak zachowanie migracyjne wszelkich przylegających komórek można mierzyć w odpowiedzi na zmianę porowatego rusztowania - w tym dodanie czynników wzrostu i powierzchniowy/masowy skład żelu. Zmiany te mogą wymagać dostosowania tych testów w celu uzyskania znaczących wyników. Parametry wymagające dalszej optymalizacji obejmują gęstość wysiewu komórek, czas trwania eksperymentu i/lub potok analizy. IMARIS to potężne narzędzie do analizy obrazowej, które jest wykorzystywane do analizy migracji komórek i ma możliwości wykraczające poza to, co zostało tutaj opisane, które obejmują klasyfikację wszystkich obiektów na wybranej "powierzchni" w zestawy na podstawie różnych właściwości, takich jak pole powierzchni, objętość, intensywność i odległość od innych utworzonych powierzchni. Istnieje wiele zasobów internetowych, które pozwalają określić dalsze metody analizy.

Dwie opisane tutaj metody dotyczą nie tylko początkowego stanu wprowadzenia tkanki do materiału ziarnistego w sposób fizjologiczny, ale także późniejszej odpowiedzi komórki po całkowitym osadzeniu w materiale. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów migracji, obecne komórki są zdolne do proliferacji równolegle z ruchem, jednak konstrukcja opisanych testów nie zakłóca proliferacji, a tym samym nie zapewnia nadmiernego wpływu na analizę. Obie metody są kompatybilne z barwieniem końcowym oprócz obrazowania podłużnego, które wykorzystuje utrwalanie PFA do wykrywania takich wskaźników, jak cytoszkielet, odkładanie kolagenu, proliferacja i inne. Zastosowanie przedstawionych metod zmierza w kierunku dokładniejszego czasoprzestrzennego odwzorowania migracji komórek 3D, które wykorzystuje infiltrację komórek jako mierzalny parametr, w przeciwieństwie do poprzednich metod 1,6,14,15,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Phalloidin	ThermoFisher	A22287
Albumina surowicy bydlęcej	VWR International	332
CellTracker Zielony barwnik CMFDS, 1 mg	ThermoFisher	C2925	20 x 50 ug jednostek, 492/517 nm
	ThermoFisher	75016085	Seria ST Plus
Przezroczysta 96-dołkowa płytka	MilliPore Sigma	CLS3997-50EA
Dimetylosulfotlenek	Fisher Scientific	MT-25950CQC	250 ml
Fibroblasty Podłoże podstawowe	ATCC	PCS-201-030	480 ml, zestaw
do wzrostu fibroblastów bez czerwieni fenolowej - Niska surowica	ATCC	PCS-201-041	7,5 mM L-glut, 5 ng / ml rh FGF zasadowy, 5 ug / ml rh Insulina, 1 ug / ml Hydrokortyzon, 50 ug / ml Kwas askorbinowy, 2% FBS
FIJI (ImageJ)	NIH		Publiczny dostęp do pobrania
Ludzkie fibroblasty skórne	ATCC	PCS-201-012	Dorosłe ludzkie fibroblasty skórne
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices		Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z 4-krotnym, 10-krotnym powiększeniem
IMARIS	Oxford Instruments		3/4D Imaged Visualizaiton and Analysis, autorski
inkubator	ThermoFisher	Pipety Finnpipette F2 o zmiennej objętości	Inkubator CO2 HeraCell Vios 160i, 165L
M-20 Wirnik kubełkowy wahadłowy	ThermoFisher	75003624
Metyloceluloza	Fisher Scientific	9004-67-5	Klasa laboratoryjna, w postaci proszku
Probówka do mikrowirówek	Fisherbrand	05-408-129	1,5 ml probówki do mikrowirówek
Paraformaldehyd (4%)	Alfa Aesar	AAJ19943K2	Do mocowania
Szalka Petriego	Corning	08-757-100A	Bakteriologiczne szalki Petriego z pokrywką 35 x 10 mm
Pipety	ThermoFisher	4642080	Finnpipette F2 Pipety o zmiennej objętości
Sterylne PBS	Gibco	10010-023
Triton-X	Fisher Scientific	327371000