Artykuł metodologiczny

Podejścia biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydu C w mikrobiocie jelitowej człowieka

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ostatnie badania podkreślają rolę enzymów mikroflory jelitowej człowieka w metabolizowaniu glikozydów C. W tym miejscu przedstawiamy kompleksową metodologię integrującą techniki chemii analitycznej (LC-MS/MS i NMR) z podejściami biologii strukturalnej w celu systematycznego charakteryzowania strukturalnych i enzymatycznych łańcuchów reakcji tych enzymów metabolizujących glikozydy C.

Streszczenie

Mikrobiota jelitowa stała się kluczowym modulatorem zdrowia gospodarza, szczególnie ze względu na jej zdolność do metabolizowania glikozydów w diecie. Podczas gdy glikozydy C wykazują lepszą stabilność chemiczną i odporność na rozszczepianie enzymatyczne w porównaniu z O-glikozydami, wyspecjalizowane bakterie jelitowe mogą je selektywnie metabolizować, poprawiając ich biodostępność. Od czasu zidentyfikowania mikrobiologicznych enzymów C-glikozydazy, dokładne mechanizmy reakcji pozostają nie w pełni poznane, a ustandaryzowane metodologie badania tych procesów nadal nie są dobrze ugruntowane. Aby wypełnić tę lukę, wprowadziliśmy zintegrowane multidyscyplinarne podejście łączące biologię strukturalną, enzymologię i techniki analityczne, w tym chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), aby systematycznie scharakteryzować te aktywności enzymatyczne. To kompleksowe podejście umożliwia precyzyjną charakterystykę metabolizmu glikozydów C na poziomie molekularnym, enzymatycznym i metabolicznym.

Wprowadzenie

Ostatnio mikrobiota jelitowa człowieka zyskała duże zainteresowanie ze względu na swoją kluczową rolę we wspieraniu zdrowia gospodarza1,2. Te społeczności mikrobiologiczne metabolizują związki pochodzące od gospodarza, wytwarzając biologicznie aktywne metabolity1,2,3. Na przykład flawonoidy, jedne z najobficiej występujących naturalnych związków w naszej codziennej diecie, występują głównie w postaci glikozydów O- lub C, które same w sobie są słabo wchłaniane w ludzkich jelitach4. Jednak mikrobiota jelitowa może przekształcać te glikozydy w bardziej bioaktywne pochodne, takie jak glikozydy wtórne lub aglikony, zmniejszając ich rozpuszczalność i zwiększając wchłanianie, poprawiając w ten sposób ich bioaktywność w porównaniu z ich rodzimymi formami5,6.

Historycznie rzecz biorąc, mechanizmy hydrolizy O-glikozydów były szeroko badane7,8. Glikozydy C, charakteryzujące się wiązaniami glikozydowymi C-C, wykazują większą stabilność chemiczną i odporność na rozszczepianie9,10. Mimo to niektóre bakterie jelitowe wykształciły zdolność do deglikozydu C-glikozydów11,12. W 1988 roku Hattori i wsp. po raz pierwszy wykazali, że niektóre bakterie jelitowe mogą usuwać grupy glikozylowe z glikozydów C13. W kolejnych badaniach wyizolowano pierwszy szczep bakteryjny zdolny do tej aktywności, umożliwiając dalsze badania mechanizmów rozszczepiania glikozydu C14. Do tej pory jednak zidentyfikowano i scharakteryzowano tylko ograniczoną liczbę szczepów bakterii jelitowych i enzymów metabolizujących glikozydy C14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ostatnie badania wykazały, że enzymy deglikozylacji pueraryny (glukozyd daidzeiny-8-C) (DgpA/B/C) w szczepie PUE są w stanie rozszczepić puerarynę na daidzeinę i glukozę w dwuetapowych procesach: DgpA, oksydoreduktaza z rodziny Gfo/Idh/MocA, utlenia puerynę do 3''-okso-pueraryny, która następnie ulega reakcji eliminacji β, w której pośredniczy kompleks DgpB/C, aby uzyskać aglikon i glukozę10, 26. Niemniej jednak, strukturalne i funkcjonalne cechy enzymów metabolizujących glikozydy C, w szczególności układu DgpA/B/C, pozostają nie w pełni poznane i istnieje potrzeba bardziej zaawansowanych metodologii, w szczególności integracji strategii biologicznych i chemicznych, aby posunąć naprzód badania w tej dziedzinie24.

Aby wypełnić tę lukę, stosujemy zintegrowane multidyscyplinarne podejścia do badania reakcji metabolicznej ludzkiej mikroflory jelitowej katalizowanej przez DgpA/B/C. W tej reakcji DgpA katalizuje utlenianie glikozydowe glikozydów C, a następnie DgpB i DgpC tworzą kompleks DgpB/C, który specyficznie rozszczepia utlenione produkty glikozydu C10,26,27. Najpierw przeprowadziliśmy rekombinowaną ekspresję i oczyszczanie DgpA i DgpB/C oddzielnie. Oczyszczone białka DgpA i DgpB/C zostały następnie skrystalizowane, a ich trójwymiarowe struktury określono za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Na koniec odtworzyliśmy funkcję rozszczepienia glikozydu C przy użyciu kompletnego systemu enzymatycznego DgpA/B/C, z kompleksową analizą produktu metabolicznego przeprowadzoną za pomocą sprzężonej spektroskopii LC-MS / MS i NMR27. W oparciu o te podejścia badaliśmy metabolizm glikozydów C katalizowany przez układ enzymatyczny DgpA/B/C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie białek

  1. Budowa wyrażenia vector
    UWAGA: W tym badaniu geny DgpA, DgpB i DgpC z ludzkiej mikrobioty jelitowej, szczepu PUE, służą jako system modelowy. Pierwszy etap polega na wykorzystaniu plazmidów ekspresyjnych do produkcji odpowiednich rekombinowanych białek.
    1. Uzyskaj sekwencję klastra genów DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) z NCBI. Następnie komercyjnie zsyntetyzuj DNA DgpA/B/C i indywidualnie sklonuj geny DgpA, DgpB i DgpC do zmodyfikowanego wektora pET-28a, który wytworzy docelowe białko z N-końcowym SUMO i znacznikiem 6×His (znacznik His-SUMO)28.
    2. Przekształć każdy z plazmidów DgpA, DgpB lub DgpC w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3). Następnie hodować bakterie w pożywce LB z 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C.
    3. Dodaj 0,2 mM IPTG do pożywki, gdy gęstość bakterii (OD600) osiągnie 0,6. Hodować bakterie w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.
    4. Odwirować każdą z kultur bakteryjnych DgpA, DgpB i DgpC wykazujących ekspresję w temperaturze 4 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml buforu A (Tabela 1) na każdy 1 l kultury bakteryjnej.
  2. Oczyszczanie białka
    UWAGA: Wysokiej czystości, wystarczające ilości rekombinowanych enzymów są niezbędne do charakterystyki funkcjonalnej i badań biologii strukturalnej. DgpB i DgpC tworzą stabilny kompleks białkowy (spontanicznie tworzą kompleks DgpB/C podczas procedury lizy) dla funkcjonalności10,26. Następnie przeprowadza się oczyszczanie białka DgpA i kompleksu DgpB/C.
    1. Dodać 1 mM PMSF do zawiesiny bakteryjnej. Zmieszać zawiesinę bakteryjną DgpB i DgpC z kroku 1.1.4, a następnie poddać lizie zawiesinę bakteryjną DgpA lub mieszaninę DgpB i DgpC (w celu utworzenia funkcjonalnego kompleksu DgpB/C) za pomocą ultradźwiękowego urządzenia do zaburzania komórek.
    2. Odwirować lizat bakteryjny o stężeniu 48 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant zawierający białko i wyrzucić osad bakteryjny.
    3. Oczyść kompleks DgpA lub DgpB/C z supernatantu za pomocą kolumny do chromatografii powinowactwa niklu (Ni-NTA). Eluować związane białka, stosując gradient stężenia imidazolu 0 - 50% z buforem A i buforem B (tabela 1) w oczyszczaczu ÄKTA.
    4. Weź 10 μl eluowanych próbek i wymieszaj je z 2 μl 5 × barwnika białkowego, następnie wykonaj elektroforezę SDS-PAGE przy napięciu 220 V przez 45 minut przy użyciu pionowego systemu elektroforezy, a następnie barwienie Coomassie Blue w celu uwidocznienia pasm białkowych. Zbierz frakcje zawierające DgpA lub kompleks DgpB/C na podstawie analizy SDS-PAGE do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: DgpA (44 kDa) z pasmem znacznika His-SUMO (17 kDa) migruje z prędkością około 61 kDa (Rysunek 2D), podczas gdy DgpC (33 kDa) ze znacznikiem His-SUMO (17 kDa) migruje około 50 kDa, a DgpB (15 kDa) ze znacznikiem His-SUMO (17 kDa) migruje około 33 kDa (Rysunek 2J)..
    5. Próbki kompleksu DgpA lub DgpB/C należy dializować z etapu 1.2.3 przy użyciu membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej 10 kDa przeciwko buforowi C w celu usunięcia imidazolu oraz za pomocą proteazy podobnej do ubikwityny 1 (ULP1; Tabela materiałów) enzym do usunięcia znacznika His-SUMO29.
    6. Załadować dializowaną próbkę białka do buforu C (tabela 1) przez kolumnę chromatografii jonowymiennej (kolumna Q). Następnie eluować związane białko z kolumny, stosując gradient stężenia chlorku sodu w zakresie od 100 mM do 600 mM, przygotowany z buforem C i buforem D (Tabela 1) w oczyszczaczu ÄKTA.
    7. Przeprowadzić analizę SDS-PAGE kompleksu DgpA i DgpB/C eluowanego z kolumny Q w kroku 1.2.3, zwracając uwagę na masy cząsteczkowe: znacznik His-SUMO (17 kDa), DgpA (44 kDa), pasma oligomeryczne DgpA (powyżej 95 kDa) (rysunek 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), pasma oligomeryczne DgpB i DgpC (między 53 kDa a 95 kDa) (rysunek 2K).
    8. Oczyść białko za pomocą kolumny wykluczającej wielkość (SEC) z buforem E (Tabela 1). Wykonaj analizę SDS-PAGE przy użyciu białek z frakcji elucyjnej, a następnie barwienie Coomassie Blue w celu wizualizacji prążków białkowych. Zebrać frakcje zawierające białko docelowe DgpA lub kompleks DgpB/C po analizie za pomocą SDS-PAGE.
      UWAGA: Pasmo DgpA jest widoczne na poziomie około 44 kDa z oligomeryzowanym pasmem DgpA powyżej 95 kDa (rysunek 2F), podczas gdy DgpC wynosi około 33 kDa, a DgpB jest na poziomie około 15 kDa z oligomeryzowanymi DgpB i DgpC (między 53 kDa a 95 kDa) (Rysunek 2L).
    9. Zmierzyć stężenie białka w kompleksie DgpA lub DgpB/C za pomocą nanokropli o długości fali 280 nm. Następnie należy stężyć kompleks DgpA lub DgpB/C do około 20 mg/ml za pomocą probówek ultrafiltracyjnych, podzielić je na porcje i błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem. Przechowywać kompleks DgpA lub DgpB/C w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
  3. Gromadzenie danych o widmie dichroizmu kołowego (CD)
    UWAGA: Ponieważ utlenianie glikozylu katalizowane przez DgpA służy jako kluczowy etap inicjacji w szlaku metabolicznym, spektroskopia CD została specjalnie zastosowana do sprawdzenia zarówno prawidłowego stanu fałdowania, jak i wtórnej integralności strukturalnej DgpA. Te parametry strukturalne są niezwykle ważne zarówno dla aktywności enzymatycznej, jak i udanej krystalizacji białek.
    1. Rozcieńczyć białko DgpA do 0,2 mg/ml 1 x bufor PBS (pH 7,4) (Tabela 1).
    2. Załaduj 1x bufor PBS (pH 7,4) do kuwety kwarcowej i zarejestruj podstawowe widmo CD powyżej 200 - 260 nm za pomocą spektrometru CD, aby czułie wykryć strukturę drugorzędową i różnice w stanie fałdowania27.
    3. Zastąp kuwetę buforową próbkami białka z ppkt 1.3.1, zapisz widmo CD powyżej 200-260 nm i odejmij linię podstawową buforu, aby uzyskać widmo CD dla próbki białka.
    4. Zbierz trzy skany pod kątem dokładności i przeanalizuj dane pod kątem cech struktury drugorzędowej i stanu fałdowania białek (Rysunek 3G, 3H).

2. Krystalografia białek i oznaczanie ich struktury

UWAGA: Po potwierdzeniu, że DgpA utrzymuje prawidłowe fałdowanie i integralność strukturalną, zastosowano podejścia biologii strukturalnej do określenia trójwymiarowych struktur obu DgpA. Biorąc pod uwagę, że kompetencja katalityczna kompleksu DgpB/C została biochemicznie potwierdzona w poprzednich testach funkcjonalnych10,26,27, etap weryfikacji spektralnej CD został pominięty.

  1. Wzrost i optymalizacja kryształów białek
    1. Zmieszać 0,5 μl oczyszczonego kompleksu DgpA (20 mg/mL) lub kompleksu DgpB/C (20 mg/ml) z równą objętością (0,5 μl) roztworu rezerwuarowego z zestawów do krystalizacji na 48-dołkowych płytkach krystalicznych metodą sitting-drop30. Przenieść płytki kryształowe do temperatury 16 °C w celu wzrostu kryształów.
      UWAGA: Obserwuj te siedzące krople pod mikroskopem, aby określić warunki (w tym stężenie białka i środki strącające, takie jak PEG 3350, mrówczan magnezu itp.) dla wzrostu kryształów kompleksu DgpA lub DgpB/C.
    2. Przeprowadź optymalizację krystalizacji zarówno dla DgpA, jak i kompleksu DgpB/C przy użyciu metody dyfuzji pary w wiszącej kropli30.
    3. W przypadku DgpA należy rozpocząć od warunku określonego w kroku 2.1.1 (20 mM mrówczanu magnezu, 20% PEG3350) i zastosować ortogonalne podejście optymalizacyjne, testując sześć PEG3350 gradientów stężeń (17%, 18%, 19%, 20%, 21% i 22%) w porównaniu z czterema gradientami stężenia mrówczanu magnezu (16 mM, 18 mM, 20 mM i 22 mM)30.
    4. Przygotować krople krystalizacji, mieszając 0,8 μl roztworu białka DgpA (10 lub 20 mg/ml) z 0,8 μl roztworu rezerwuarowego na szkiełkach nakrywkowych ze szkła silanizowanego. Następnie odwrócić szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowych płytkach krystalizacyjnych i inkubować w temperaturze 16 °C w celu uzyskania wzrostu kryształów.
    5. W celu optymalizacji kompleksu DgpB/C postępuj zgodnie z tym samym podejściem: zmieszaj 0,8 μl kompleksu białkowego (10 lub 20 mg/ml) z 0,8 μl roztworu rezerwuarowego zawierającego octan magnezu (16, 18, 20 lub 22 mM) i PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% lub 13%). Podobnie, umieść wiszące krople na silanizowanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowych płytkach i inkubuj w temperaturze 16°C.
    6. Pozostawić kryształy białek kompleksu DgpA i DgpB/C do osiągnięcia pełnej wielkości, aż przestaną rosnąć, a następnie przenieść kryształy do roztworu do namaczania zawierającego bufor rezerwuarowy i 5 mM związków substratowych (glukozy i pueraryny) kompleksu DgpA i DgpB/C w temperaturze 16 °C przez 30 minut.
    7. Przenieść kryształy, w tym DgpA (bez glukozy lub substratu) i kompleks DgpB/C (bez substratu), do roztworu krioprotektantu zawierającego stan buforu nasiąkającego uzupełnionego 25% glicerolem i natychmiast przechowywać je w ciekłym azocie w celu zebrania danych.
      UWAGA: Chociaż zarówno kryształy kompleksu DgpA, jak i DgpB/C były nasączone substratami (glukozą i pueraryną), tylko glukoza została pomyślnie włączona do centrum katalitycznego DgpA. W związku z tym do analizy strukturalnej uzyskano trzy różne formy krystaliczne: DgpA z glukozą (Rysunek 3E); DgpA bez substratu (Rysunek 3B-C); i bezsubstratewiczny kompleks DgpB/C (Rysunek 3D). Roztwór krioprotektantu chroni kryształy białek, zapobiegając tworzeniu się lodu podczas błyskawicznego chłodzenia w ciekłym azocie, zachowując w ten sposób ich integralność strukturalną i minimalizując uszkodzenia wywołane promieniowaniem. Zazwyczaj formułowany przy użyciu ługu macierzystego jako bazy, roztwór jest uzupełniany zoptymalizowanymi stężeniami krioprotektantów (np. glicerolu lub glikolu etylenowego).
  2. Gromadzenie danych i określanie struktury
    1. Zebrać dane dyfrakcji rentgenowskiej kryształu dla DgpA z glukozą lub w postaci wolnej od substratu oraz kompleksu DgpB/C w postaci wolnej od substratu w Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) w Shanghai National Protein Science Facility (NFPS) o długości fali padającej 0,978 A.
    2. Przetwarzaj trzy zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej, w tym kompleks DgpA i DgpB/C, za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych krystalograficznych31. Najpierw załaduj surowe dane, a następnie sekwencyjnie wykonuj funkcje indeksowania, integracji i skalowania, klikając odpowiednie przyciski w oprogramowaniu. Wygeneruj przetworzony plik wyjściowy (output.sca) odpowiedni do późniejszego określenia struktury.
    3. Oznacz struktury DgpA z glukozą lub w formach wolnych od substratów ( Rysunek 3B-C, 3E) i kompleksu DgpB/C w wolnej od substratu ( Rysunek 3D) przy użyciu metody substytucji molekularnej (Tabela materiałów). A następnie udoskonalić struktury i mapy elektronowe, włączając odpowiednie ligandy (takie jak glukoza, Mn2+, H2O itp.)31.

3. Monitorowanie aktywności reakcji i wyznaczanie parametrów kinetycznych

UWAGA: System DgpA/B/C pośredniczy w przemianach C-glikozydu poprzez zdefiniowaną dwuetapową kaskadę: DgpA inicjuje katalizę poprzez utlenianie ugrupowania cukrowego, generując produkt pośredni, który kompleks DgpB/C następnie rozszczepia lub izomeryzuje10,26,27. W tym badaniu DgpA/B/C odnosi się do enzymów odpowiedzialnych za tę kaskadę reakcji, przy czym należy zauważyć, że nie zachodzi bezpośrednia interakcja między DgpA a kompleksem DgpB/C. Ta sprzężona aktywność może być rygorystycznie określona ilościowo przy użyciu trzech uzupełniających się podejść: analizy produktu HPLC, sprzężonych z DCPIP testów spektrofotometrycznych monitorujących transfer elektronów lub szczegółowej charakterystyki kinetycznej parametrów reakcji27,32. W szczególności produkty rozszczepienia glikozydu C (daidzeina) generowane przez katalizę DgpA/B/C analizowano za pomocą HPLC (detekcja UV przy 265 nm). Powstawanie produktu określono ilościowo za pomocą standardowej krzywej kalibracyjnej (metoda wyznaczania krzywej standardowej jest szczegółowo opisana w uwadze do kroku 3.3.2.), a parametry kinetyczne określono poprzez dopasowanie szybkości powstawania produktu do modelu Michaelisa-Mentena za pomocą analizy regresji nieliniowej27,32. Test inhibicji mierzący wpływ glukozy na rozszczepienie wiązań C-glikozydowych pueraryny dostarczył dowodów potwierdzających, że sacharydy mogą służyć jako substraty dla DgpA. Następnie test DCPIP monitoruje reakcje utleniania cukru, mierząc redukcję 2,6-dichlorofenolindofenolu o niebieskim zabarwieniu (DCPIP) do bezbarwnego leuko-DCPIP, gdy przyjmuje elektrony z utlenionych cukrów33, odzwierciedlając w ten sposób aktywność katalityczną DgpA.

  1. Monitorowanie aktywności DgpA/B/C za pomocą HPLC
      Przeprowadzić katalizowaną przez DgpA/B/C reakcję rozszczepienia lub izomeryzacji glikozydu C w 500 μl buforu F (Tabela 1) zawierającego 20 μM kompleksu DgpA i DgpB/C (z kroku 1.2.7) i 0,1 mM albo: pueraryny lub glukozydu genisteiny-8-C dla reakcji rozszczepienia lub daidzyny lub genistyny dla reakcji izomeryzacji27.
    1. Przeprowadzać reakcje w temperaturze 37 °C przez 8 godzin i zakończyć je przez dodanie 1,5 ml metanolu do mieszaniny reakcyjnej.
    2. Odwirować roztwór reakcyjny o stężeniu 16 000 × g przez 15 minut w celu usunięcia osadu białkowego powstałego w wyniku denaturacji enzymów indukowanej metanolem. Przefiltrować supernatant za pomocą membrany filtracyjnej 0,22 μm.
    3. Przeprowadzić analizę HPLC z elucją gradientową, przy natężeniu przepływu 1 ml/min przy objętości wstrzyknięcia 10 μl i długości fali detekcji UV 265 nm.
      UWAGA: Faza ruchoma składała się z acetonitrylu (faza ruchoma A) i 0,1% wodnego roztworu kwasu octowego (faza ruchoma B) z elucją. Gradient elucji fazy ruchomej jest następujący: 5%-20% A w 0-5 min, 20%-45% A w 5-15 min, 45%-52% A w 15-18 min, 52%-55% A w 18-19 min, 55%-5% A w 19-21 min i 5% A w 21-23 min. System enzymatyczny DgpA/B/C wykazuje wyraźnie różną skuteczność katalityczną w stosunku do substratów, takich jak daidzyna i genistyna, co skutkuje znacznymi różnicami w tempie tworzenia ich produktów. Aby ilościowo ocenić kinetykę konwersji substratu i dynamikę akumulacji produktu, przeprowadzono kompleksową analizę przebiegu w czasie przy użyciu HPLC w odstępach 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 i 48 godzin.
  2. Monitorowanie aktywności DgpA za pomocą testu 2,6 -dichlorofenolu indofenolu (DCPIP)
    UWAGA: Test DCPIP monitoruje utlenianie cukrów poprzez pomiar redukcji niebieskiego DCPIP do bezbarwnego leuco-DCPIP, ponieważ akceptuje elektrony z utlenionych cukrów33. W tym przypadku test reporterowy DCIPIP został wykorzystany do zarejestrowania aktywności utleniania DgpA w stosunku do różnych związków glikozylowanych, cukrów prostych, disacharydów lub polisacharydów. Użyto Wildtype DgpA i jego wadliwych mutantów wiążących cukier, w tym D182A, Δ(308-316) i Δ(311-316)27.
    1. Inkubować 0,8 mM DCPIP, białko 50 μM, w tym DgpA typu dzikiego i jego trzy wadliwe mutanty wiążące cukier (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) lub DgpA Δ(311-316)), z 10 mM substratami, w tym pueraryną, witeksyną, genistyną, rozpuszczalną skrobią, maltotriozą, laktozą, sacharozą, glukozą lub maltozą w 1x buforze PBS (pH 7,4).
    2. Po 20 godzinach reakcji zapisać zmianę absorbancji DCPIP przy 600 nm za pomocą czytnika mikropłytek33.
  3. Oznaczanie szybkości inhibicji glukozy w reakcji rozszczepienia wiązania C-glikozydowego pueraryny
    UWAGA: DgpA należy do rodziny enzymów oksydoreduktazy cukrowej, zdolnych do utleniania ugrupowania cukrowego C-glikozydów. Rysunek 3E pokazuje, że glukoza jest związana z centrum katalitycznym DgpA, a protokół określania struktury DgpA jest szczegółowo opisany w kroku 2.2.3. W celu zbadania konkurencyjnego wiązania DgpA między glukozą a pueryną C-glikozydu przeprowadzono następujące eksperymenty.
    1. Przeprowadzić reakcję w buforze 1 × PBS (pH 7,4). Dodać różne stężenia glukozy (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM i 100 mM) do układu reakcji rozszczepienia glikozydu C (pueraryny), jak opisano w kroku 3.1. Przeprowadzać reakcję w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
    2. Przeprowadzić analizę ilościową produktu (daidzeiny) przy użyciu krzywej kalibracyjnej HPLC dla związku odniesienia (wzorca daidzeiny). Obliczyć szybkość inhibicji, określając najpierw różnicę w wydajności produktu między reakcjami zawierającymi różne stężenia glukozy a niehamowanymi reakcjami rozszczepienia glikozydów C (bez glukozy), a następnie dzieląc tę różnicę przez wydajność produktu z reakcji niehamowanej.
      UWAGA: Aby wygenerować krzywą kalibracyjną do ilościowej analizy HPLC, należy przygotować seryjne rozcieńczenie wzorca odniesienia (np. pueraryny lub daidzeiny) w całym zakresie stężeń (np. 0,1-1 mM, w krokach co 0,1 mM). Przeanalizować każde stężenie za pomocą HPLC, zapisać obszary pików i wykreślić je w stosunku do odpowiednich stężeń wzorcowych. Wykonaj analizę regresji liniowej (y = mx + b, gdzie y = powierzchnia piku, x = stężenie), aby ustalić krzywą standardową. Równanie regresji można następnie wykorzystać do interpolacji nieznanych stężeń próbek z ich zmierzonych obszarów pików.
  4. Wyznaczanie parametrów kinetycznych
    UWAGA: Parametry kinetyczne są powszechnie uznawane za krytyczne złote standardy do ilościowej oceny wydajności katalitycznej enzymatyki. W celu ilościowej oceny reakcji katalizowanych DgpA/B/C określono parametry kinetyczne reakcji rozszczepienia pueraryny glikozydu C katalizowanych przez DgpA/B/C.
    1. Przygotować gradienty stężenia substratu C-glikozydów (pueraryny) (w zakresie od 0,01 do 4 mM w 2-krotnych przyrostach) dla katalizowanej przez DgpA/B/C reakcji rozszczepienia glikozydów C.
    2. Przeprowadzać reakcję w temperaturze 37 °C przez 8 godzin zgodnie z metodą opisaną w kroku 3.1. Przeprowadzić analizę ilościową produktu (daidzeiny) przy użyciu krzywej kalibracyjnej HPLC wzorcowej daidzeiny. Następnie oblicz szybkość reakcji (szybkość tworzenia produktu), dzieląc ilościową ilość przez czas reakcji.
    3. Określ parametry kinetyczne Km i kcat, dopasowując obliczoną szybkość reakcji i stężenie substratu do modelu Michaelisa-Mentena za pomocą oprogramowania statystycznego (tabela materiałów).

4. Przygotowanie i wykrywanie produktu pośredniego reakcji

UWAGA: Poza aktywnością rozszczepienia C-glikozydów, DgpA/B/C katalizuje również izomeryzację O-glikozydów do C-glikozydów. Dlatego, gdy O-glikozydy są stosowane jako substraty dla DgpA/B/C, produkty pośrednie będą wytwarzane jako izomeryzowane C-glikozydy. Aby scharakteryzować produkt pośredni (puerarynę), związek pośredni oczyszczono, a następnie przeanalizowano przy użyciu narzędzi chemii analitycznej, w tym spektroskopii LC-MS/MS i NMR.

    Przygotowanie produktu pośredniego reakcji w katalizowanej przez DgpA/B/C reakcji izomeryzacji C-glikozydów 27
    1. Przygotować katalizowaną przez DgpA/B/C reakcję izomeryzacji glikozydu do C, używając 0,2 mM O-glikozydu (daidzyny) jako substratów i 20 μM kompleksów DgpA i DgpB/C w objętości reakcyjnej 90 ml, zgodnie z protokołem opisanym w powyższym kroku 3.1.
    2. Oczyścić produkt pośredni C-glikozyd (puerarynę) za pomocą preparatywnej HPLC przy strategii elucji gradientowej (UWAGA).
      UWAGA: Faza ruchoma składała się z acetonitrylu (faza ruchoma A) i 0,1% wodnego roztworu kwasu octowego (faza ruchoma B) z elucją. Gradient elucji fazy ruchomej jest następujący: 5%-20% A w 0-5 min, 20%-45% A w 5-15 min, 45%-52% A w 15-18 min, 52%-55% A w 18-19 min, 55%-5% A w 19-21 min i 5% A w 21-23 min.
    3. Obliczyć stężenie oczyszczonego produktu pośredniego przy użyciu standardowej krzywej kalibracyjnej HPLC w kroku 3.3.2, uzyskać około 6 mg pueraryny w układzie reakcyjnym 90 ml w kroku 4.1.1, a następnie wysuszyć oczyszczone produkty pośrednie za pomocą próżniowego koncentratora odśrodkowego do wykorzystania w przyszłości.
  2. Charakterystyka produktu pośredniego reakcji z LC-MS/MS
    1. Zebrać suszone produkty pośrednie z kroku 4.1.3. Odważyć 100 μg produktów pośrednich pochodzących z daidzyny, a następnie rozpuścić je w 2 ml metanolu do uzyskania końcowego stężenia 50 μg/ml. Wirować przy 13 500 x g przez 10 minut i zebrać supernatant do analizy LC-MS/MS.
    2. Użyć tego samego programu elucji gradientowej HPLC z kroku 4.1.2 do analizy LC-MS/MS z objętością wtrysku wynoszącą 5 μl.
  3. Charakterystyka produktu pośredniego reakcji za pomocą NMR
    1. Rozpuścić 4 mg oczyszczonych produktów pośrednich z reakcji daidzyny w 340 μl dimetylosulfotlenku d-d 6 do spektroskopii 1H i 13C NMR. Ustaw parametry przyrządu w następujący sposób: temperatura na 298 K, podkładka 3 razy, szerokość impulsu 18 μs, opóźnienie relaksacji 1,5 s, 48 skanów, z innymi parametrami na ustawieniach domyślnych27.
    2. Zbierz widma NMR 1H i 13C za pomocą przyrządu NMR 600 MHz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z procedurami opisanymi na Rysunku 1, w pierwszej kolejności wyeksprymowano geny DgpA, DgpB i DgpC w komórkach E. coli BL21(DE3). Ponieważ DgpB i DgpC tworzą stabilny kompleks enzymatyczny (kompleks DgpB/C)10,26,27,34, komórki ekspresyjne tych dwóch białek połączono w celu kowspółoczyszczania. Po lizie komórek super...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie charakterystyka strukturalna i funkcjonalna enzymów metabolizmu glikozydów C w tej dziedzinie pozostaje niejasna, brakuje też odpowiednich metod badawczych 10,24,26. Wykorzystując znaczące zalety połączonej chemii i biotechnologii 40,41,42,43,44,45, w badaniu zaproponowano metodologię badawczą, która wykorzystuje biologię strukturalną, enzymologię i inne techniki biotechnologiczne wraz z technologiami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie jest finansowane z programu Startup Fund na Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) dla W.M., programu funduszu awaryjnego przeciwko COVID-19 w BUCM (1000061223476) do W.M., zespołu innowacji i programu kultywowania talentów krajowej administracji tradycyjnej medycyny chińskiej (ZYYCXTD-C-202006) dla W.M. oraz niezależnego projektu badawczego dla absolwentów BUCM(ZJKT2023012) dla H.P. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Wenfu Ma za pomocną dyskusję.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,6-dichloroindofenol (DCPIP)Solarbio Nauka i technologiaD6350
2-merkaptoetanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 &razy; Białko Ładowanie BarwnikSangon BiotechC508320
Kwas octowyShanghai MACKLINA111247
AcetonitrylThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Spektrometr NMR Bruker Avance III HD 700 MHz BrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzWirówka BrukerAVANCE III 400 MHz
5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus spektrometr CDFotofizyka stosowanaChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) kompetentne komórkiThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glukozydShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlukozaSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9OprogramowanieGraphPadWersja? Pryzmat 9Obliczać parametry kinetyczne Km i kcat
HiLoad Superdex 200 pg preparatywne kolumny SECCytiva28989335
HisTrap HP Kolumny oczyszczające białka His tagCytiva17524802
Kolumna chromatografii anionowej wymiennej HiTrap Q FFCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  wersja 723
Kolumna HPLC TC-C18(2), 170Å, 5 &mikro; m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LaktozaSigma-Aldrich17814
LC-20AT, wysokosprawna chromatografia cieczowaShimadzuLC20AT
MaltozaSigma-Aldrich47288
MaltotriozaSigma-Aldrich443713
Chlorek manganuShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MetanolThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX12OLYMPUS SZX7
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixZespół programistów Phenix1.21.2Phenix to kompleksowy pakiet oprogramowania do oznaczania struktury kryształów białek, łączący metody SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) i MR (Molecular Replacement) z oprogramowaniem Phaser.
Preparatywny wysokosprawny chromatograf cieczowyWaters2545/2998
Zestaw do przesiewania kryształów białekHampton ResearchHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Inkubator z wytrząsaniemShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
Skóra węża&handel; Membrana do dializy, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Skrobia rozpuszczalnaSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Wirówka SuperspeedThermo Fisher Naukowo-handlowa;
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax i3xURZĄDZENIA MOLEKULARNESpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop Spektrofotometr mikroobjętościowy Dane techniczneURZĄDZENIA MOLEKULARNEQuickDrop
SacharozaSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep Kolumna Wody186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Proteaza podobna do ubikwityny 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
Zamrażarka niskotemperaturowaThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Próżniowy koncentrator odśrodkowyBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Bibliografia

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolizm C glikozyd wenzymy mikrobioty jelitowejkrystalografia bia ekanaliza LC MSspektroskopia NMRkinetyka enzymatycznaoczyszczanie chromatograficznemetabolizm flawonoid w

Powiązane artykuły