Artykuł metodologiczny

Podejścia biologii strukturalnej i chemii analitycznej do charakteryzowania enzymów metabolicznych glikozydu C w mikrobiocie jelitowej człowieka

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ostatnie badania podkreślają rolę enzymów mikroflory jelitowej człowieka w metabolizowaniu glikozydów C. W tym miejscu przedstawiamy kompleksową metodologię integrującą techniki chemii analitycznej (LC-MS/MS i NMR) z podejściami biologii strukturalnej w celu systematycznego charakteryzowania strukturalnych i enzymatycznych łańcuchów reakcji tych enzymów metabolizujących glikozydy C.

Streszczenie

Mikrobiota jelitowa stała się kluczowym modulatorem zdrowia gospodarza, szczególnie ze względu na jej zdolność do metabolizowania glikozydów w diecie. Podczas gdy glikozydy C wykazują lepszą stabilność chemiczną i odporność na rozszczepianie enzymatyczne w porównaniu z O-glikozydami, wyspecjalizowane bakterie jelitowe mogą je selektywnie metabolizować, poprawiając ich biodostępność. Od czasu zidentyfikowania mikrobiologicznych enzymów C-glikozydazy, dokładne mechanizmy reakcji pozostają nie w pełni poznane, a ustandaryzowane metodologie badania tych procesów nadal nie są dobrze ugruntowane. Aby wypełnić tę lukę, wprowadziliśmy zintegrowane multidyscyplinarne podejście łączące biologię strukturalną, enzymologię i techniki analityczne, w tym chromatografię cieczową z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) i magnetyczny rezonans jądrowy (NMR), aby systematycznie scharakteryzować te aktywności enzymatyczne. To kompleksowe podejście umożliwia precyzyjną charakterystykę metabolizmu glikozydów C na poziomie molekularnym, enzymatycznym i metabolicznym.

Wprowadzenie

Ostatnio mikrobiota jelitowa człowieka zyskała duże zainteresowanie ze względu na swoją kluczową rolę we wspieraniu zdrowia gospodarza1,2. Te społeczności mikrobiologiczne metabolizują związki pochodzące od gospodarza, wytwarzając biologicznie aktywne metabolity1,2,3. Na przykład flawonoidy, jedne z najobficiej występujących naturalnych związków w naszej codziennej diecie, występują głównie w postaci glikozydów O- lub C, które same w sobie są słabo wchłaniane w ludzkich jelitach4

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie białek

  1. Budowa wyrażenia vector
    UWAGA: W tym badaniu geny DgpA, DgpB i DgpC z ludzkiej mikrobioty jelitowej, szczepu PUE, służą jako system modelowy. Pierwszy etap polega na wykorzystaniu plazmidów ekspresyjnych do produkcji odpowiednich rekombinowanych białek.
    1. Uzyskaj sekwencję klastra genów DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) z NCBI. Następnie komercyjnie zsyntetyzuj DNA DgpA/B/C i indywidualnie sklonuj geny DgpA, DgpB i DgpC do zmodyfikowanego wektora pET-28a, który wytworzy docelowe białko z N-końcowym SUMO i znacznikiem 6×His (znacznik His-SUMO)28.
    2. Pr....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w Rysunek 1, najpierw wyraziliśmy geny DgpA, DgpB i DgpC w komórkach E. coli BL21(DE3). Ponieważ DgpB i DgpC tworzą stabilny kompleks enzymatyczny (kompleks DgpB/C)10,26,27,34, komórki wyrażające te dwa białka zostały połączone w celu wspólnego oczyszczania. Po lizie komórek supern.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie charakterystyka strukturalna i funkcjonalna enzymów metabolizmu glikozydów C w tej dziedzinie pozostaje niejasna, brakuje też odpowiednich metod badawczych 10,24,26. Wykorzystując znaczące zalety połączonej chemii i biotechnologii 40,41,42,43,44,45, w badaniu zaproponowano metodologię badawczą, która wykorzystuje biologię strukturalną, enzymologię i inne techniki biotechnologiczne wraz z technologiami .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie jest finansowane z programu Startup Fund na Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) dla W.M., programu funduszu awaryjnego przeciwko COVID-19 w BUCM (1000061223476) do W.M., zespołu innowacji i programu kultywowania talentów krajowej administracji tradycyjnej medycyny chińskiej (ZYYCXTD-C-202006) dla W.M. oraz niezależnego projektu badawczego dla absolwentów BUCM(ZJKT2023012) dla H.P. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Wenfu Ma za pomocną dyskusję.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,6-dichloroindofenol (DCPIP)Solarbio Nauka i technologiaD6350
2-merkaptoetanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 &razy; Białko Ładowanie BarwnikSangon BiotechC508320
Kwas octowyShanghai MACKLINA111247
AcetonitrylThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Spektrometr NMR Bruker Avance III HD 700 MHz BrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzWirówka BrukerAVANCE III 400 MHz
5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus spektrometr CDFotofizyka stosowanaChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) kompetentne komórkiThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-glukozydShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlukozaSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9OprogramowanieGraphPadWersja? Pryzmat 9Obliczać parametry kinetyczne Km i kcat
HiLoad Superdex 200 pg preparatywne kolumny SECCytiva28989335
HisTrap HP Kolumny oczyszczające białka His tagCytiva17524802
Kolumna chromatografii anionowej wymiennej HiTrap Q FFCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  wersja 723
Kolumna HPLC TC-C18(2), 170Å, 5 &mikro; m, 4,6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LaktozaSigma-Aldrich17814
LC-20AT, wysokosprawna chromatografia cieczowaShimadzuLC20AT
MaltozaSigma-Aldrich47288
MaltotriozaSigma-Aldrich443713
Chlorek manganuShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MetanolThermo Fisher Scientific™? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX12OLYMPUS SZX7
fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixZespół programistów Phenix1.21.2Phenix to kompleksowy pakiet oprogramowania do oznaczania struktury kryształów białek, łączący metody SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) i MR (Molecular Replacement) z oprogramowaniem Phaser.
Preparatywny wysokosprawny chromatograf cieczowyWaters2545/2998
Zestaw do przesiewania kryształów białekHampton ResearchHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Inkubator z wytrząsaniemShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
Skóra węża&handel; Membrana do dializy, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Skrobia rozpuszczalnaSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Wirówka SuperspeedThermo Fisher Naukowo-handlowa;
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax i3xURZĄDZENIA MOLEKULARNESpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop Spektrofotometr mikroobjętościowy Dane techniczneURZĄDZENIA MOLEKULARNEQuickDrop
SacharozaSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep Kolumna Wody186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Proteaza podobna do ubikwityny 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
Zamrażarka niskotemperaturowaThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Próżniowy koncentrator odśrodkowyBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Bibliografia

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolizm C glikozyd wenzymy mikrobioty jelitowejkrystalografia bia ekanaliza LC MSspektroskopia NMRkinetyka enzymatycznaoczyszczanie chromatograficznemetabolizm flawonoid w

Powiązane artykuły