Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

DOI:

10.3791/67633

⸱

7 lutego 2025

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja neuronalna odbywa się za pośrednictwem transmisji synaptycznej, która zależy przede wszystkim od uwalniania neuroprzekaźników przechowywanych w pęcherzykach synaptycznych (SVs) w odpowiedzi na potencjał czynnościowy (AP). Ponieważ SV są poddawane recyklingowi lokalnie na końcu presynaptycznym, koordynacja egzocytozy SV i endocytozy jest ważna dla trwałej transmisji synaptycznej. Wrażliwe na pH białko zielonej fluorescencji, zwane pHluorin, stanowi potężne narzędzie do monitorowania egzo/endocytozy SV poprzez skierowanie go na światło SV. Jednak śledzenie recyklingu SV sterowanego przez AP za pomocą sond opartych na pHluorin jest nadal w dużej mierze ograniczone do preparatów do hodowli in vitro, ponieważ wprowadzenie sond kodowanych genetycznie i późniejsze obrazowanie optyczne jest na ogół wyzwaniem technicznym dla modeli zwierzęcych in vivo lub preparatów tkankowych. Danio pręgowany to system modelowy oferujący cenne cechy, w tym łatwość manipulacji genetycznej, przejrzystość optyczną i szybki rozwój zewnętrzny. Niedawno wygenerowaliśmy transgenicznego danio pręgowanego, który wykazuje wysoką ekspresję sondy znakowanej pHluoryną na końcach neuronów ruchowych i opracowaliśmy protokół monitorowania egzo/endocytozy SV sterowanej przez AP w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ), dobrze ugruntowanym modelu synaps, który tworzy się in vivo. W tym artykule pokazujemy, jak przygotować preparat NMJ larw danio pręgowanego odpowiedni do obrazowania pHluorin. Pokazujemy również, że preparat umożliwia obrazowanie poklatkowe pod konwencjonalnym pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym, zapewniając opłacalną platformę do analizy funkcji NMJ.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmisja synaptyczna, w której pośredniczy uwalnianie neuroprzekaźników z pęcherzyków synaptycznych (SVs) na końcu presynaptycznym, jest podstawowym procesem leżącym u podstaw funkcji nerwów1. We wczesnych badaniach przekaźnictwo synaptyczne mierzono przede wszystkim za pomocą technik elektrofizjologicznych, które wykrywają odpowiedź postsynaptyczną wywoływaną przez neuroprzekaźniki i ich receptory. Jednak w ciągu ostatnich kilku dekad opracowano kilka rodzajów technik obrazowania, które bezpośrednio wizualizują funkcję presynaptyczną2. Jedną z najczęściej używanych sond jest wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne o nazwie pHluorin3,4.

Recykling pęcherzyków synaptycznych (SV) na końcu presynaptycznym jest kluczowym procesem dla trwałego przekazywania neuroprzekaźników5. Po uwolnieniu neuroprzekaźników przez egzocytozę SVs, których światło jest na ogół utrzymywane na kwaśnym pH6,7, błona i białka SV są natychmiast pobierane z błony plazmatycznej przez endocytozę. Nowo powstałe SV są następnie ponownie zakwaszane, a neuroprzekaźniki są ponownie ładowane. Gdy pHluorin jest kierowana do światła SV poprzez fuzję z białkiem SV, wykazuje minimalną fluorescencję w stanie spoczynku. Jednak w egzocytozie SV jest on wystawiony na działanie neutralnego pH w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co powoduje jasną fluorescencję. Następnie fluorescencja stopniowo zmniejsza się po ponownym zakwaszeniu SV. Dlatego fluorescencja pHluorin umożliwia monitorowanie procesów recyklingu SV.

W pionierskich badaniach, synaptobrevin/VAMP 2, pęcherzykowe białko SNARE (rozpuszczalny receptor białka przyłączającego NSF) odpowiedzialne za fuzję pęcherzyków synaptycznych w synapsach przodomózgowia8 i najobficiej występujące wśród białek SV9, zostało wybrane jako partner fuzji dla pHluorin, a powstałe białko fuzyjne zostało oznaczone jako synaptopHluorin (SpH)3,4. Jednak SpH wykazywał niski stosunek sygnału do szumu (S/N) ze względu na znaczną ekspresję powierzchni sondy. W związku z tym inne białka SV zostały przetestowane jako partnerzy nośnikowi10,11,12. Do tej pory wykazano, że transportery pęcherzykowe wykazują najniższą powierzchnię wyrażenia13,14,15. Zastosowanie tych sond zostało początkowo ustalone w hodowanych neuronach ssaków do śledzenia recyklingu SV sterowanego przez AP8,9,10,11,12,13 i zostało rozszerzone na inne preparaty, w tym wypreparowane tkanki i zwierzęta in vivo16,17,18,19,20,21,22.

Larwalna danio pręgowany to modelowy system o cennych cechach, takich jak łatwość manipulacji genetycznej, przejrzystość optyczna i szybki rozwój zewnętrzny. Transgeniczny danio pręgowany eksprymujący pHluorynę sprzężoną z synaptofizyną, zwany SypHy, został wygenerowany i zastosowany w wielu konfiguracjach eksperymentalnych, np. monitorowaniu spontanicznej fuzji SV neuronów rdzeniowych in vivo21, niezależny od AP recykling SV w synapsach wstęgowych in vivo20,22 lub w izolowanych komórkach23,24,25. Jednak zastosowanie obrazowania pHluorin w recyklingu SV napędzanego przez AP w modelu danio pręgowanego jest nadal ograniczone.

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) służy jako atrakcyjny model do badania fizjologii synaptycznej26, a kilka badań z powodzeniem przeprowadziło obrazowanie kontrolowanego przez AP recyklingu SV z SpH w mouse18,19. Zastosowanie NMJ do recyklingu SV u danio pręgowanego zostało zapoczątkowane przez Wen et al.16. Ostatnio wygenerowaliśmy zebry Tg, które wykazują wysoką ekspresję pHluoryny oznaczonej pęcherzykowym transporterem GABA (VGAT) szczególnie w neuronach ruchowych27. Ta sonda zawiera również HaloTag w tandemie z pHluorin w ogonie świetlnym VGAT i dlatego nazywa się VpHalo. Chociaż VGAT nie ulega endogennej ekspresji w cholinergicznych neuronach ruchowych, potwierdziliśmy, że VpHalo lokalizuje się we wszystkich pulach SV i jest odpowiednio przetwarzany w odpowiedzi na AP, łącząc zapis elektrofizjologiczny, zależne od aktywności znakowanie SV za pomocą ligandów HaloTag i obrazowanie na żywo pHluorin27. Ze względu na wysoki poziom ekspresji i minimalny udział powierzchniowy VpHalo, preparat NMJ z tej ryby Tg umożliwił monitorowanie recyklingu SV napędzanego przez AP z dobrym stosunkiem sygnału do szumu. Co więcej, rzadkie rozmieszczenie NMJ w przezroczystym korpusie sprawia, że konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa nie jest potrzebna do tego celu. Chociaż monitorowanie recyklingu SV sterowanego przez AP u nienaruszonych danio pręgowanych jest pożądanym kierunkiem na przyszłość, niezwykle ważne jest ustalenie preparatu NMJ, który jest odpowiedni do walidacji użycia sondy na bazie pHluoryny w dobrze kontrolowanych warunkach, tak jak to miało miejsce w preparatach hodowlanych3,4,10,11,12,13,14,15. W tym miejscu opisujemy protokół preparacji w celu przygotowania próbki NMJ larw danio pręgowanego, która może być wykorzystana do wielu rodzajów eksperymentów, np. Rejestrowanie prądów na płycie końcowej za pomocą zacisku krosowego, znakowanie HaloTag przetworzonych SV i obrazowanie na żywo pHluorin, jak omówiono powyżej. Ponadto skupiliśmy się na obrazowaniu na żywo pHluorin przy użyciu tego preparatu NMJ pod konwencjonalnym mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w urządzenie do stymulacji elektrycznej i system perfuzji roztworu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt na Uniwersytecie Medycznym i Farmaceutycznym w Osace. Danio pręgowany hodowano i utrzymywano w cyklu ciemnym trwającym od 14 godzin do 10 godzin. Zarodki i larwy utrzymywano w temperaturze 28-30 °C w wodzie jajecznej zawierającej 0,006% soli morskiej i 0,01% błękitu metylenowego. Doświadczenia przeprowadzono w 4-7 dni po zapłodnieniu (dpf). Zaleca się, aby ryby były karmione dwa razy dziennie od 5 dpf wzwyż, gdy doświadczenia są przeprowadzane po 6 dpf. Pożywkę należy zmieniać przed każdym karmieniem.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 200 ml roztworu zewnątrzkomórkowego (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,3-7,4). Wymieszaj 6,4 ml 3,5 M NaCl, 0,4 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 1 M CaCl2, 0,2 ml 1 M MgCl2 i 360 mg glukozy i dodaj ultraczystą wodę do 200 ml. Jeśli pH wykracza poza zakres 7,3-7,4, dostosuj je za pomocą 1 M NaOH. Do każdego eksperymentu używaj świeżo przygotowanego roztworu zewnątrzkomórkowego.
  2. Przygotuj 100 ml roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 3 μM D-tubokurarynę (D-TBC). Dodać 20 μl 15 mM ROZTWORU PODSTAWOWEGO D-TBC do 100 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.
    UWAGA: Roztwór podstawowy D-TBC przygotowuje się w wodzie i przechowuje w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z proszkiem D-TBC należy nosić rękawice i przygotowywać się w kapturze. Rękawice są również zalecane podczas pracy z roztworem D-TBC.
  3. Przygotuj 25 ml roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,02% tricainy (MS-222). Dodać 0,5 ml 1% roztworu podstawowego tricainy do 25 ml roztworu zewnątrzkomórkowego.
    UWAGA: Roztwór podstawowy trikainy przygotowuje się w wodzie i przechowuje w temperaturze 4 °C. Trikainę stosuje się wyłącznie do preparacji, a nie podczas obrazowania.

2. Przygotowanie elektrody bipolarnej z kapilary ze szkła theta

  1. Za pomocą ściągacza do mikropipet należy wyciągnąć kapilary ze szkła theta tak, aby średnica końcówki mieściła się w zakresie 3-10 μm (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zalecamy protokół z dwoma lub więcej krokami w celu pociągnięcia kapilary.
  2. Podłącz szklaną pipetę theta (1,17 mm średnicy wewnętrznej i 0,165 mm grubości przegrody) do izolatora bodźców. Napełnij pipetę roztworem zewnątrzkomórkowym. Włóż cienki platynowy drut (o średnicy 0,1 mm) do każdego otworu kapilary ze szkła theta i podłącz tylny koniec drutu do izolatora bodźca (Rysunek 1B). Uważaj, aby nie zwierać dwóch platynowych przewodów.

3. Przygotowanie próbki

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany do użytku z larwami drobnicy Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) danio pręgowanego27, w którym następujące dwa białka, połączone peptydem rozszczepienia P2A, były bitystronycznie wyrażane specyficznie w neuronach ruchowych: reporterowe czerwone białko fluorescencyjne TagRFP i białko czujnikowe VpHalo, które jest białkiem fuzyjnym pHluorin i HaloTag do części świetlnej VGAT (Rysunek 2A). Promotor hb9 napędza ekspresję tTAad (tetracykliny-controlled transactivator-advanced), który z kolei indukuje ekspresję genów w ramach złożonego promotora elementu odpowiedzi tetracykliny (TRE). System ekspresji indukowany przez Tet zwiększa poziom ekspresji białek. pHluorin umożliwia monitorowanie na żywo recyklingu SV zależnego od aktywności, podczas gdy HaloTag wizualizuje SV poddane recyklingowi w danym okresie poprzez kowalencyjne znakowanie skondensowanego białka (Rysunek 2A). Chociaż obie metody mają unikalne zalety, w tym artykule skupimy się na obrazowaniu pHluorin.

  1. Wlej 25 ml roztworu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,02% trykana do szklanej szalki Petriego.
  2. W celu rozbioru przenieś larwę na szalkę Petriego. Obierz skórę larwy dwoma cienkimi kleszkami. Użyj pierwszych kleszczy, aby przytrzymać larwę na miejscu i uszczypnij skórę po grzbietowej stronie pęcherza pławnego innymi kleszczami (Rysunek 3A).
  3. Usuń pęcherz pławny, narządy wewnętrzne i głowę za pomocą skalpeli. Skóra po obu stronach ciała ryby może być często usunięta jednocześnie, patrz Wideo 1.

4. Umieszczenie próbki w komorze obrazowania i wprowadzenie elektrody stymulującej

UWAGA: Ponieważ spoczynkowe pH światła SV jest poniżej pH 6,0, fluorescencja pHluoryny w NMJ u żywych ryb jest ledwo zauważalna (Rysunek 2B). Jednakże, gdy światło SV zostało zalkalizowane, zaobserwowano ograniczoną lokalizację VpHalo do NMJ (Rysunek 2C). Warto zauważyć, że konfokalny obraz stosu z NMJ wykazał, że nie nakładają się one na siebie w płaszczyźnie xy, z wyjątkiem krawędzi segmentów ciała (Rysunek 2C). Opierając się na tej obserwacji, postulowaliśmy, że mikroskop epifluorescencyjny ma zastosowanie do obrazowania VpHalo na żywo w larwach danio pręgowanego, co zostało zweryfikowane zgodnie z opisem w poniższym protokole.

  1. Przenieś próbkę do komory obrazowania (Rysunek 3B) za pomocą szklanej pipety Pasteura z polerowaną ogniowo końcówką. Mechanicznie przymocuj próbkę za pomocą nylonowej nici przyklejonej do drutu platynowego w kształcie litery C tak, aby była zorientowana pod kątem w przybliżeniu równoległym do elektrody stymulującej. (Rysunek 3C).
    UWAGA: Drut platynowy w kształcie litery C z nylonową nicią został wyprodukowany w laboratorium. Około 1 cm drutu platynowego o średnicy 0,5 mm zostało uformowane w kształt litery C i stuknięte młotkiem w celu jego spłaszczenia. Nić nylonową można uzyskać z artykułów gospodarstwa domowego. Skleiliśmy nylonową nić, która została uzyskana poprzez demontaż ociekacza kuchennego dostępnego w sklepie spożywczym. Podobne urządzenie fiksujące jest rutynowo używane w eksperymencie z wycinkami mózgu28.
  2. Ciągłą perfuzję próbki roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym 3 μM D-TBC z szybkością około 1,0 ml/min przy użyciu systemu perfuzji grawitacyjnej.
    UWAGA: Zaleca się kontrolowanie temperatury w komorze za pomocą grzałki roztworu w linii.
  3. Włóż elektrodę stymulacyjnej do rdzenia kręgowego. Przytrzymaj elektrodę przygotowaną z pipety ze szkła theta w kroku 2 na uchwycie pipety wyposażonym w zmotoryzowany mikromanipulator. Włóż elektrodę do próbki tak, aby końcówka znajdowała się w pobliżu rdzeniowych neuronów ruchowych, które znajdują się po brzusznej stronie rdzenia kręgowego i mogą być zidentyfikowane jako neurony TagRFP-dodatnie w tej próbce (Rysunek 3D). Przesuń elektrodę pod kątem ukośnym od sąsiedniego segmentu do pozycji docelowej.
    UWAGA: Granica między segmentami ciała jest gęsta i trudna do przebicia, dlatego konieczne jest powolne dociskanie elektrody. Położenie końcówki elektrody jest bardzo ważne. Jeśli jest oddalony od rdzenia kręgowego, stymuluje bezpośrednio sąsiednie mięśnie, co skutkuje dużym obrazem dryfującym w późniejszym obrazowaniu poklatkowym.

5. Akwizycja obrazu

  1. Wybierz region obrazowania. Na podstawie obrazu fluorescencji TagRFP na żywo wybierz region obrazowania, który zawiera więcej niż kilka bulionów i wyklucza te na granicy segmentów ciała (Rysunek 2C i Rysunek 4A). Wybierz region w tym samym segmencie ciała elektrody stymulującej, ponieważ unerwienie neuronu ruchowego jest ograniczone w obrębie jednego segmentu ciała29,30. Przełącz filtr fluorescencyjny na fluorescencję GFP/pHluorin.
    UWAGA: W tym eksperymentalnym układzie pHluorin został zobrazowany z filtrami wzbudzenia 470/40 nm i emisji 510/20 nm. TagRFP został zobrazowany z filtrami wzbudzenia 555/20 nm i emisji 595/44 nm. Oprogramowanie Micro-Manager służy do jednoczesnego sterowania akwizycją obrazu za pomocą naukowej kamery cMOS i migawki TTL źródła światła LED. Aby zsynchronizować akwizycję obrazu i stymulację elektryczną, Arduino jest używane jako cyfrowe urządzenie I/O. Inną opcją, która nie wymaga skryptu, jest użycie Digidata i jej oprogramowania firmy Molecular Devices.
  2. Określ ustawienia oprogramowania do akwizycji obrazu i cyfrowego urządzenia I/O, aby akwizycja obrazu i stymulacja elektryczna były zsynchronizowane. Zoptymalizuj ekspozycję i intensywność źródła światła, aby uzyskać wystarczająco jasny obraz w trybie poklatkowym 1 Hz bez nasycenia i wprowadź czas ekspozycji w polu Ekspozycja [ms] głównego okna Micro-Manager.
  3. Określ częstotliwość stymulacji, liczbę potencjałów czynnościowych (AP) oraz czas między rozpoczęciem akwizycji obrazu a dostarczeniem stymulacji, kodując je w skrypcie Arduino. W zależności od parametrów określ liczbę pozyskanych obrazów odpowiadającą całkowitej długości akwizycji obrazu i wprowadź ją w polu Liczba w oknie Akwizycja wielowymiarowa Micro-Managera. Ustaw 1 s w polu Interwał, aby uzyskać obrazowanie poklatkowe 1 Hz. W przypadku stymulacji elektrycznej należy dostarczać impulsy o stałym napięciu 1 ms (70 mV) przez izolator bodźców.
  4. Wykonaj akwizycję obrazu. Wykonaj polecenie digitizera i przeprowadź akwizycję obrazu. Sprawdzić, czy nie występuje niedopuszczalny dryf obrazu i czy można zaobserwować reakcje pHluorin. W przeciwnym razie pozycja elektrody jest nieprawidłowa. Wróć do kroku 4.2.
    UWAGA: Uszkodzenia tkanek, które mogą potencjalnie wpływać na odpowiedź pHluorin, można łatwo zidentyfikować na podstawie obrazu DIC włókien mięśniowych. Jeśli przy braku takiego uszkodzenia nie obserwuje się odpowiedzi pHluorin, położenie elektrod może być nieprawidłowe. Można to zidentyfikować jako duży dryf obrazu, ponieważ niewłaściwe ustawienie elektrod powoduje skurcz mięśni, jak opisano w kroku 4.2. Innym problemem, który czasami prowadzi do niepowodzenia w wywołaniu odpowiedzi pHluorin, jest powietrze uwięzione w kapilarze szkła theta, co prowadzi do izolacji elektrycznej elektrody. Skurcz mięśni spowodowany nieprawidłowym ustawieniem elektrod powoduje dryft obrazu w osi Z, którego nie można skorygować w kolejnych analizach obrazu (patrz krok 6.5). Dlatego zaleca się, aby dane z dużymi odchyleniami obrazu były identyfikowane podczas akwizycji obrazu i wykluczane.
  5. W zależności od celu eksperymentu zmień intensywność stymulacji (tj. częstotliwość i liczbę impulsów) i/lub temperaturę. Obrazy poklatkowe można zapisać jako stos szeregów czasowych obrazów TIFF. Zobacz film 2.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Użyj Fidżi do przeprowadzenia następującego przetwarzania i analizy obrazu. Użyj programu Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby obliczyć wyniki pomiarów. Użyj Igor Pro, aby wykonać dopasowanie krzywej na uzyskanym wyniku.

  1. Utwórz obraz różnicowy, który podkreśla aktywne synapsy, jak opisano poniżej.
    1. Otwórz stos szeregów czasowych obrazów na Fidżi, wybierając pozycję Plik > Otwórz. Jeśli wyświetlane obrazy są przyciemnione, wybierz opcję Obraz >Dostosuj >Jasność/Kontrast >Auto. Nie klikaj przycisku Zastosuj, ponieważ spowoduje to przeskalowanie intensywności sygnału, uniemożliwiając dalszą analizę. Wybierz opcję Analizuj > Ustaw skalę i wprowadź współczynnik kalibracji zdefiniowany w warunkach obrazowania.
    2. Utwórz stos pięciu obrazów wykonanych w okresie przed bodźcem, wybierając opcję Obraz > Duplikuj i wprowadzając odpowiednią liczbę wskazującą zakres sekwencji obrazów (np. 11-15 dla eksperymentu z 15-sekundowym okresem przed bodźcem).
    3. Wybierz opcję Image > Stacks > Z Project (Projekt Z) i wybierz opcję Average Intensity (Średnia intensywność) z menu rozwijanego Projection Type (Typ projekcji). Naciśnij OK, aby utworzyć reprezentatywny obraz okresu przed bodźcem (Rysunek 4B). Proces uśredniania jest ważny dla zmniejszenia wpływu wahań sygnału.
    4. Stwórz średni obraz okresu po bodźcu, korzystając z podobnego przetwarzania (Rysunek 4B). Zduplikuj stos pięciu obrazów natychmiast po zakończeniu stymulacji (np. 26-30ten obraz dla 15-sekundowego okresu przed bodźcem i 10-sekundowego okresu bodźca). Wybierz opcję Process > Image Calculator (Przetwarzaj Kalkulator obrazu) i ustaw uśredniony obraz po bodźcu odpowiednio jako Obraz 1 i Obraz 2 w menu rozwijanych.
    5. Wybierz opcję Odejmij z menu rozwijanego Operacja i naciśnij przycisk OK, aby utworzyć obraz różnicy, który podkreśla aktywne synapsy (Rysunek 4B).
  2. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI), które mają być analizowane.
    1. Wybierz opcję Edytuj > Zaznaczenie > Określ i utwórz kołowy zwrot z inwestycji o średnicy 7 μm na obrazie różnicowym utworzonym w kroku 6.1. Umieść ROI na podświetlonej aktywnej synapsie i naciśnij T, aby dodać ROI w Menedżerze ROI. W reprezentatywnym wyniku pokazanym w Rysunek 4C-D, 6 ROI zostało rozmieszczonych wokół boutonów.
    2. Umieść kolejne 5 ROI o tej samej wielkości w regionach, w których nie obserwuje się wzrostu sygnału. W następnym kroku wykorzystaj ich średnią fluorescencję jako sygnał tła. Zapisz zwrot z inwestycji, wybierając opcję Więcej >Zapisz z menu Menedżer zwrotu z inwestycji.
  3. Zmierz intensywność sygnału i oblicz istotną zmianę fluorescencji.
    1. Wybierz oryginalny stos szeregów czasowych i przenieś do niego zwroty z inwestycji zapisane w kroku 6.2. Zaznacz opcję Analizuj > ustaw pomiary i zaznacz tylko pole wyboru Średnia wartość szarości. Zmierz średnią intensywność fluorescencji w ROI we wszystkich punktach czasowych, wybierając opcję Więcej > wielu pomiarów z menu Menedżer zwrotu z inwestycji.
    2. Skopiuj wszystkie wartości w oknie Wyniki i wklej je do programu arkusza kalkulacyjnego. Oblicz średni sygnał tła z 5 ROI tła i odejmij go od każdego synaptycznego ROI, co zapewnia znaczną zmianę fluorescencji w każdym bouton (Rysunek 4D). Uśrednij wszystkie dane z jednego widoku (w tym przypadku 6 boutonów), liczone jako n = 1 eksperyment. W Rysunek 4E, każdy ślad uzyskany przez uśrednianie jest reprezentowany jako F/F0 poprzez podzielenie wartości we wszystkich punktach czasowych przez średnią wartość w początkowym okresie bazowym.
  4. Oszacuj stałą czasową zaniku fluorescencji (tau) przez dopasowanie krzywej.
    1. Otwórz nową tabelę danych w Igor Pro, wybierając Okno > Nowa tabela. Skopiuj dane punktu czasowego i F/F0 z arkusza kalkulacyjnego i wklej je do tabeli w innym wierszu. Wybierz Okno > Nowy wykres, wybierz dane F/F0 jako Fala Y i dane punktu czasowego jako Fala X, a następnie naciśnij Zrób to, aby utworzyć wykres.
    2. Wybierz Okno > Pokaż informacje i zdefiniuj zakres danych do analizy, umieszczając jeden kursor na piku sygnału, a drugi na końcu ścieżki. Wybierz opcję Analiza > dopasowanie krzywej i wybierz exp_XOffset z menu rozwijanego Funkcja oraz odpowiednie fale X i Y z menu rozwijanego Fala.
    3. Kliknij przycisk Opcje danych i naciśnij przycisk Kursory, aby ustawić zakres dopasowania krzywej. Kliknij opcję Współczynniki, wprowadź wartość 1 w polu Y0 i naciśnij przycisk Zrób to. Dopasowanie krzywej za pomocą tej procedury zapewnia wartość tau, która reprezentuje szybkość zaniku fluorescencji, która odzwierciedla szybkość endocytozy SV i ponownego zakwaszenia.
  5. Wykonaj ręczną korekcję dryftu (opcjonalnie) zgodnie z poniższym opisem.
    1. Jeśli wystąpi dryft obrazu, a wybrany punkt wyjdzie poza obszar zwrotu o średnicy 7 μm w okresie pozyskiwania obrazu, uruchom wtyczkę Manual Drift Correction. Otwórz stos obrazów szeregów czasowych na Fidżi, wybierając pozycję Plik > Otwórz. Wybierz narzędzie Punkt, klikając pasek narzędzi Punkt.
    2. Znajdź najjaśniejszy bouton jako punkt orientacyjny i umieść punkt w jego środku. Naciśnij T, aby dodać punkt do menedżera ROI. Powtórz ten proces dla całej sekwencji obrazów. Wyświetl pierwszy obraz i wybierz Wtyczki > Rejestracja > Ręczna korekcja dryfu. Zapisz poprawiony stos serii obrazów jako nowy plik i użyj go do analizy.
      UWAGA: Chociaż dryft X-Y można skorygować, nadmierny dryft Z nie jest możliwy do skorygowania tą metodą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli wypreparowana próbka zostanie przygotowana bez poważnego uszkodzenia tkanki, a elektroda stymulująca zostanie prawidłowo wprowadzona do rdzenia kręgowego, silna odpowiedź pHluorin może zostać wywołana przez stymulację elektryczną o wysokiej częstotliwości (Rysunek 4D,E). Wyjściowa fluorescencja przed bodźcem była prawdopodobnie spowodowana sondą obecną na powierzchni presynapsy. Wzrost fluorescencji podczas stymulacji odzwierciedla egzocytotyczne uwalnianie sondy na powierzchnię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Larwa danio pręgowanego NMJ jest wyłaniającym się systemem modelowym do badania fizjologii i patologii synaptycznej26,31. Transgeniczny danio pręgowany wyrażający SpH w sposób specyficzny dla neuronów został już stworzony i wykorzystany do analizy mutanta wykazującego wadę lokomotoryczną17. Wen i wsp.17 wykazali około 2-krotny wzrost fluorescencji pHluorin podczas stymulacji 1000 AP przy 100 Hz w kontrolnych NMJ WT....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant 18K06882 dla F. O.; oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant 21K06429 i 24K10020 dla Y.E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40-krotny obiektyw do zanurzenia w wodzieOlympusLUMPLFLN40XW
4-kanałowy system perfuzji grawitacyjnejALAVCPlus-4G
5x obiektywOlympusNPLN5X
Komora obrazowania wykonana w stylu custumklientaPhysiotechakrylowa płytka (średnica 10,7 cm, grubość 3 mm) z dołkiem (średnica 1 cm na dole, 1,5 cm średnica u góry) trzymająca około 0,5 ml perfuzatu.
Cyfrowe urządzenie I/OArduinoUno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydratSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fidżi / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Cienkie kleszczeAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Szkło Pasteur pipetaIWAKIIK-PAS-5PKońcówkę należy przyciąć i wypolerować ogniowo, aż do uzyskania końcowej średnicy 1,5 cala; 2 mm. 
Szklana szalka PetriegoAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Podgrzewacz roztworu inlineWarner InstrumentsSF-28
System oświetlenia LEDX-cyteXYLIS
Methylen blueWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Mini zacisk magnetyczny do rurki perfuzyjnejWarner Instruments64-1553
Mikromanipulator z napędemsilnikowym ScientificaPatchStar
Ruchoma płytka na próbki z napędemsilnikowym ScientificaMMSP
Uchwyt na pipetyNarishigeH-13
Ściągacz do pipetNarishigePC-100
Drut platynowy (φ 0,1 mm)NilacoPT-351165
Drut platynowy (φ 0,5 mm)NiacoPT-351381
SkalpelAsOne8-3086-02 (Pióro #11)
Naukowa kamera cMOSThorlabsCC215MU
Sól morskaNAPQONatychmiastowy ocean
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX7
Izolator bodźcaAMPIISO-FLEX
Rura ssącaWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-324C
Szklana kapilara ThetaInstrument SutterBT-150-10
Tricaine (MS-222)TCIT0941
Mikroskop pionowyOlympusBX51WI
Wykonana z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206(2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245(2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936(2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503(2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie z u yciem pHluorynystymulacja potencja em czynno ciowymmikroskopia epifluorescencyjnaprzeka nictwo synaptyczneegzocytoza i endocytozazako czenia neuron w ruchowych

Powiązane artykuły