Artykuł metodologiczny

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67639

⸱

10 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Depeartment of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 3Department of Pediatrics, Section of Hematology, Oncology, and Bone Marrow Transplant, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 4Quantitative Biosciences and Engineering, Colorado School of Mines

W tym artykule

Podsumowanie

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi

.

Streszczenie

Płytki krwi to komórki krwi, które odgrywają integralną rolę w hemostazie i wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Nadpobudliwość i hipoczynność płytek krwi są związane z zaburzeniami metabolicznymi, zwiększając ryzyko zarówno zakrzepicy, jak i krwawienia. Aktywacja płytek krwi i metabolizm są ze sobą ściśle powiązane, przy czym istnieje wiele metod pomiaru tych pierwszych, ale stosunkowo niewiele w przypadku tych drugich. Aby zbadać metabolizm płytek krwi bez ingerencji innych komórek krwi i składników osocza, płytki krwi muszą być izolowane, co nie jest trywialne ze względu na wrażliwość na ścinanie płytek krwi i zdolność do nieodwracalnej aktywacji. Przedstawiono protokół izolacji (przemywania płytek krwi), w wyniku którego powstają płytki krwi w stanie spoczynku, wrażliwe na stymulację przez agonistów płytek krwi. Kolejne etapy wirowania z dodatkiem inhibitorów płytek krwi stosuje się w celu wyizolowania płytek krwi z krwi pełnej i ponownego ich zawieszenia w kontrolowanym, izosmotycznym buforze. Ta metoda w sposób powtarzalny zapewnia 30%-40% odzysk płytek krwi z krwi pełnej przy niskiej aktywacji, mierzonej za pomocą markerów wydzielania ziarnistości i aktywności integryny. Liczba płytek krwi i stężenie paliwa mogą być precyzyjnie kontrolowane, aby umożliwić użytkownikowi badanie różnych sytuacji metabolicznych.

Wprowadzenie

Płytki krwi to małe (2-4 μm średnicy), bezjądrzaste komórki, które odgrywają ważną rolę w hemostazie, ściśle regulowanym procesie tworzenia skrzepów1. Chociaż płytki krwi są niezbędne dla integralności naczyń krwionośnych, są również zaangażowane w niepożądane zdarzenia zdrowotne. Płytki krwi biorą udział w zakrzepicy żył głębokich (DVT) i zakrzepicy tętniczej (AT), które są skrzepami, które zamykają naczynia krwionośne, prowadząc do miejscowego zmniejszenia dopływu krwi lub, jeśli kawałki skrzepu oderwą się (zatorują), mogą blokować dopływ krwi do płuc, serca lub mózgu2,3,4,5,6,7. Nadreaktywność płytek krwi to choroba współistniejąca z nadciśnieniem, cukrzycą i rakiem, prowadząca do zwiększonej częstości występowania zakrzepicy żył głębokich i AT8,9,10. Aktywacja i metabolizm płytek krwi są ze sobą ściśle powiązane11,12, co prowadzi do wzrostu zainteresowania metabolizmem płytek krwi jako strategią terapeutyczną13,14. Toczy się dyskusja na temat dokładnego przeprogramowania metabolicznego, które następuje po aktywacji, a jest to aktywna dziedzina nauki15. To zwiększone zainteresowanie dysfunkcją płytek krwi w chorobie i jej powiązaniami z metabolizmem podkreśla potrzebę powtarzalnej metody izolowania płytek krwi i badania ich metabolizmu.

Ludzkie płytki krwi są zazwyczaj uzyskiwane przez nakłucie żyły, a następnie izolowane z krwi pełnej. Umyte płytki krwi są oddzielane od pełnej krwi poprzez kolejne etapy płukania i wirowania16. Zostało to pierwotnie zrobione przez grupę Mustarda 17 i nieznacznie zmodyfikowane przez grupę Cazenave'a group18. Inną alternatywą są płytki krwi z filtrem żelowym, które można uzyskać z osocza bogatopłytkowego (PRP) za pomocą chromatografii wykluczania wielkości przy użyciu wypełnionej kolumny kulek żelu agarozowego19. Istnieje wiele protokołów mycia zarówno krwi ludzkiej, jak i gryzoniowej i są zoptymalizowane pod kątem różnych testów20,21,22,23, ale nie do pomiaru metabolizmu płytek krwi.

Techniki badania metabolizmu płytek krwi obejmują pomiary bioenergetyczne za pomocą analizatora Seahorse XF11,24,25,26,27, pomiary strumienia zewnątrzkomórkowego11,13,24, metabolomika14,28, oraz analiza strumienia metabolicznego wspomagana izotopami (13C-MFA)29. W badaniach metabolomicznych celem jest zazwyczaj określenie zmienionych szlaków między dwoma różnymi stanami (na przykład spoczynkowe a aktywowane płytki krwi14). Badania metabolomiczne obejmują zastosowanie chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Badania te można przeprowadzić dla metabolitów wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych i często są one sprzężone z analizą szlaku lub analizą głównych składowych (PCA)14,28. Analiza strumienia metabolicznego wspomagana izotopami (13C-MFA) polega na podawaniu komórkom znakowanego substratu znanego jako znacznik i mierzeniu, w jaki sposób ten znacznik rozprzestrzenia się w sieci reakcyjnej z LC-MS. Technika ta pozwala na obliczanie strumieni przez szlaki metaboliczne z rozdzielczością poziomu reakcji29,30. W krwi pełnej i osoczu bogatopłytkowym (PRP) stężenie paliwa (glukozy, glutaminy, octanu itp.) podlega zmienności między dawcami, a albumina i globulina wiążąca hormony płciowe obecne w osoczu mogą zmieniać aktywne stężenie hormonów, leków i innych biologicznie istotnych cząsteczek31. Płukane płytki krwi oferują metodę zawieszania płytek krwi w środowisku zdefiniowanym przez użytkownika, w tym o znanych stężeniach paliwa, która jest zgodna z 13C-MFA32.

Opisana tutaj jest metoda mycia płytek krwi w celu wytworzenia płytek krwi, które mogą być użyte w testach metabolicznych. W protokole powstają płytki krwi w stanie spoczynku z niskim zanieczyszczeniem krwinek czerwonych i krwinek białych. Stan aktywacji płytek krwi monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej markerów aktywacji płytek krwi. Protokół ten w sposób powtarzalny osiąga co najmniej 30%-40% regeneracji płytek krwi w stosunku do liczby płytek krwi we krwi pełnej. Przemyte płytki krwi uzyskane tą techniką nadają się do technik analizy metabolicznej, a wewnątrzkomórkowa metoda ekstrakcji metabolitów może być dostosowana do analizy wybranej przez użytkownika (LC-MS, GC-MS, test fotometryczny itp.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie otrzymało zgodę Institutional Review Board od University of Colorado Anschutz Medical Campus. Uzyskano pisemną zgodę od wszystkich uczestników badania. Uczestnicy zgłosili, że nie spożywali alkoholu przez ostatnie 48 godzin ani niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) przez ostatnie dziesięć dni. Projekt ten jest wspierany przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer R61HL141794.

1. Pobieranie krwi

  1. Przygotuj się do pobrania krwi. Zaleca się, aby pobieranie krwi było przeprowadzane przez przeszkolonego flebotomistę.
  2. Wykonać nakłucie żyły na wewnętrznej stronie ramienia za pomocą igły 19 G.
  3. Zbierz pierwsze ~ 2 ml do odkurzacza bez dodatków i wyrzuć. Ma to na celu usunięcie chemicznych cząsteczek sygnałowych z uszkodzonych komórek śródbłonka, które mogą aktywować płytki krwi. Po zebraniu początkowych 2 ml zdejmij opaskę uciskową, aby zmniejszyć naprężenia ścinające na płytkach krwi.
  4. Resztę krwi zebrać do antyokoagulacyjnych dekstrozy cytrynianu (ACD-A) w stosunku 14:3 (krew: ACD-A). Delikatnie odwróć każdy odkurzacz po pobraniu krwi, aby wymieszać krew i antykoagulant.

2. Mycie płytek krwi

figure-protocol-1
Rysunek 1: Kolejne etapy wirowania i ponownego zawieszania związane z płukaniem płytek krwi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Użyj pipet transferowych, aby usunąć pęcherzyki po ich utworzeniu, zwłaszcza przed odwirowaniem. Za każdym razem, gdy probówki z krwią/płytkami krwi są otwierane/zamykane, zaleca się wdychanie do probówki przed zamknięciem nakrętki w celu zwiększenia poziomu CO2.

  1. Podgrzej wirówkę do temperatury 37 °C, aby zmniejszyć wpływ temperatury. Pomiędzy każdym etapem wirowania w protokole należy utrzymywać wirówkę w temperaturze 37 °C.
  2. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Umieść zmodyfikowany bufor Tyrode'a z glukozą w łaźni wodnej.
    UWAGA: zmodyfikowaną recepturę bufora Tyrode'a można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.
  3. Połącz zebraną krew pełną ze wszystkich wakutainerów w stożkowych probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml. Używając końcówki pipety ze skosem naciętej pod kątem 45°, pobrać odpowiednią objętość próbki, aby przeprowadzić zliczanie komórek (patrz Zliczanie komórek).
  4. Usuń wszelkie pęcherzyki powstałe w wyniku ostrożnego zasysania pipetą do przenoszenia o wąskim otworze.
  5. Pozostawić krew w łaźni wodnej na 25 minut w temperaturze 37 °C Dzięki temu płytki krwi w stanie odwracalnie aktywowanym (po usunięciu z organizmu, przeniesieniu z rurki do rurki itp.) mogą powrócić do stanu spoczynku.
  6. Aby zapobiec aktywacji podczas wirowania, dodaj 500 nM prostaglandyny I2 (PGI2) i 0,02 U/ml apyrazy do krwi pełnej i delikatnie wymieszaj, odwracając jeden raz. Usuń wszelkie pęcherzyki powstałe za pomocą pipety transferowej o wąskim otworze.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące prawidłowego przepisu na ChOG2 i apirazę można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.
  7. Odwirować krew pełną w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) (15 minut w temperaturze 250 x g na 42 ml krwi pełnej) bez przerwy (37 °C).
  8. Delikatnie zebrać PRP (górna żółta warstwa nad kożuchową sierścią i czerwoną warstwą krwi) do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o szerokim otworze.
  9. Podczas przenoszenia przechyl czystą stożkową rurkę i delikatnie przesuń PRP w dół boku rurki. Unikaj pęcherzyków powietrza.
  10. Pozostaw około 3 mm PRP, aby uniknąć naruszenia kożucha (warstwa białych krwinek między PRP a krwią czerwoną). Jeśli zostanie to zakłócone, będzie to wyglądało jak nagły wir bieli w pipecie transferowej.
  11. Pobrać liczbę komórek (patrz Liczenie płytek krwi), aby określić objętość zawiesiny do następnego etapu płukania.
  12. Odstawić na 10 minut w temperaturze 37 °C.
  13. Za pomocą końcówki pipety ze skosem pobranej próbki do cytometrii przepływowej (patrz Cytometria przepływowa).
  14. Dodaj 500 nM PGI2 i 0,02 U/ml apyrazy do PRP i wymieszaj, delikatnie odwracając raz.
  15. Wirować przez 10 minut przy 1000 x g w temperaturze 37 °C (przyspieszenie: 0 hamulec: 0). Nie używać hamulca. Pellet nie jest zwarty, a nagłe hamowanie może spowodować ponowne wymieszanie.
  16. Podczas wirowania określić objętość refuzji. Załóżmy, że 75% odzysku. Gęstość komórek wynosi około 3x105 komórek/μL.
  17. Odessać supernatant za pomocą plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze dla objętości objętościowej i pipety o pojemności 1 ml (nieodcięta końcówka) dla pozostałej części cieczy w pobliżu osadu. Unikaj dotykania granulek na dnie tuby.
  18. Dodać 500 nM PGI2 i 0,02 U/ml apyrazy do zmodyfikowanego buforu Tyrode. Powoli dodawaj obliczoną ilość buforu z kroku 16, spływając po boku stożkowej rurki.
  19. Używając końcówki do cięcia skośnego i końcówki do pipety o pojemności 1 ml, delikatnie zawiesić granulki, delikatnie pipetując kilkakrotnie w górę i w dół.
    1. Ustaw objętość na 300 μl, wciśnij tłok do końca, będąc powyżej linii cieczy, a następnie umieść pipetę poniżej cieczy i podejdź do pierwszego zatrzymania. Pozwoli to naukowcowi na ponowne zawieszenie osadu bez przypadkowego tworzenia pęcherzyków powietrza, które mogą aktywować płytki krwi.
    2. Sporadycznie, na dnie osadu znajduje się pierścień widocznych czerwonych krwinek. Unikaj ponownego zawieszania tego.
  20. Po ponownym zawieszeniu osadu użyj pipety do przenoszenia o szerokim otworze, aby przenieść zawieszony osad do nowej stożkowej rurki, pozostawiając wszelkie czerwone krwinki lub widocznie zlepione komórki.
  21. Powtórz kroki 11-20. Upewnij się, że dodałeś 500 nM PGI2 i 0,02 U/ml ze świeżej porcji do zmodyfikowanego bufora Tyrode'a (nie używaj ponownie zmodyfikowanego bufora Tyrode'a z kroku 18, PGI2 jest zbyt niestabilny).
  22. Pobrać próbkę do zliczania komórek. W razie potrzeby dostosować stężenie płytek krwi za pomocą zmodyfikowanego buforu Tyrode.
  23. Użyj końcówki pipety z ukosem naciętym, aby pobrać próbkę do cytometrii przepływowej.
  24. Pozostawić płytki krwi na odpoczynek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby dać czas na ustąpienie inhibitorów i powrót odwracalnie aktywowanych płytek krwi do stanu spoczynku.
  25. Delikatnie wymieszać pipetą o szerokim otworze. Pobrać próbki do cytometrii przepływowej.
  26. Umyte, spoczynkowe płytki krwi są teraz gotowe do wykorzystania do analizy metabolicznej.

3. Liczenie płytek krwi

  1. Płytki krwi można zliczać za pomocą automatycznego licznika krwinek (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta) lub hemocytometru33.

4. Cytometria przepływowa

  1. preparat
    1. Szczegółowe protokoły i przeglądy najlepszych praktyk w zakresie ustawiania mieszanin przeciwciał i przygotowania cytometru przepływowego do pomiaru aktywacji płytek krwi można znaleźć gdzie indziej34,35.
  2. pobieranie próbek
    1. Pobierając próbkę do cytometrii przepływowej, należy pobrać zawiesinę płytek krwi za pomocą końcówki pipety ze skosem. Powoli dodaj to do probówki mikrowirówkowej z przeciwciałami, a następnie delikatnie strzepnij, aby wymieszać. Pozostawić do inkubacji na 30 s.
    2. Używając skośnie ściętej końcówki pipety, przenieś mieszaninę zawiesiny płytek krwi i przeciwciał do odpowiedniego dołka na płytce 96-dołkowej.
    3. Natychmiast dodaj utrwalacz do studni, aby naprawić komórki.
    4. Uruchomić na cytometrze przepływowym w ciągu 8 godzin od utrwalenia.
  3. Testy wrażliwości agonistów
    1. Po umyciu odłóż na bok 2 stożkowe probówki o pojemności 15 ml, jedną do kontroli spoczynkowej i jedną jako kontrolę aktywowaną trombiną.
    2. Delikatnie odpipetować 100 μl zawiesiny płytek krwi do każdej stożkowej probówki za pomocą skośnie naciętej końcówki pipety. Odstawić w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
    3. Po godzinnym odpoczynku dodać 0,1 j./ml trombiny do jednej probówki (instrukcja przygotowania trombiny znajduje się w pliku uzupełniającym 1), a nośnik do drugiej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    4. Pobrać próbkę cytometrii przepływowej z każdej probówki, aby określić wrażliwość płytek krwi na agonistę.

5. Pobieranie próbek do ilościowej analizy strumienia metabolicznego

  1. Hartowanie
    UWAGA: Wygaszenie metabolizmu jest niezbędnym krokiem do pomiaru dokładnych strumieni metabolicznych. Szybkie schładzanie komórek i utrzymywanie ich temperatury na poziomie 4 °C lub poniżej powoduje spowolnienie metabolizmu na tyle, że można założyć, że został on zasadniczo zatrzymany, tak aby pobrane próbki komórek dokładnie odzwierciedlały metabolizm komórek z masy. Istnieje wiele metod, które można zastosować, ale aby zrównoważyć potrzebę szybkiego schładzania i minimalizacji wycieków, należy użyć zimnej ( -4 °C) soli fizjologicznej ( -4 °C) sol36. Jeśli sól będzie przeszkadzać w późniejszej analizie, można użyć innego płynu (metanol/woda, etanol itp.)37.
    1. Przygotować i zamrozić porcje soli fizjologicznej. Przygotować każdą porcję soli fizjologicznej w ilości 6-krotności objętości żądanej próbki.
      UWAGA: przepis na sól fizjologiczną można znaleźć w pliku uzupełniającym 1.
    2. Mikrowirówkę schładzać wstępnie do temperatury 0 °C.
    3. Zebrać zawiesinę płytek krwi w częściowo zamrożonej soli fizjologicznej (< -4 °C) w stosunku 1:6 (np. Zebrać 150 μl zawiesiny płytek krwi do 750 μl soli fizjologicznej w probówkach do mikrowirówek).
      UWAGA: Nie pozostawiaj roztworu płytek krwi/soli fizjologicznej na lodzie na dłużej niż 15 minut.
    4. Wirować w temperaturze 16 000 x g, 0 °C przez 10 min.
    5. Zachowaj supernatant do analizy metabolitów zewnętrznych, a osad do wewnątrzkomórkowej ekstrakcji i pomiaru metabolitów. Przechowywać oba w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do analizy.
    6. Powtórz ten proces w żądanym przedziale czasu i liczbie punktów czasowych próbki.
  2. Wewnątrzkomórkowa ekstrakcja metabolitów
    1. Do schmielonego osadu dodać 0,5 ml wstępnie schłodzonej wody metanolowej w proporcji 7:3 o temperaturze -20 °C. Wirować energicznie przez 1 min.
    2. Zamrozić w ciekłym azocie, rozmrozić w temperaturze 0 °C, a następnie powtórzyć jeszcze 2 cykle.
    3. Odwirować zawiesiny o sile 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze -4 °C.
    4. Zebrać supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
    5. Użyj osadu z kroku 3 i powtórz protokół ekstrakcji (kroki 1-3) z metanolem w proporcji 50:50 woda. Dodaj drugi zebrany ekstrakt do pierwszego. Suszyć przez noc.
    6. Zawiesić wysuszony ekstrakt w 150 μl wody klasy LC-MS (lub innego rozpuszczalnika odpowiedniego do zamierzonej analizy). Mieszać przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Krótko przetworzyć wirowanie i przenieść do probówek mikrowirówek o wielkości 0,22 μm w celu usunięcia resztek komórek. Wirować przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C.
    7. Wyjąć z wirówki, odpipetować dodatkowe 50 μl optymalnej wody na filtr i ponownie odwirować (5 min, 16 000 x g i 4 °C) w celu przepłukania filtra. Zbieraj do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki w Rysunek 2 przedstawia 6 różnych dawców krwi, w tym 3 mężczyzn i 3 kobiety. Wydajność płytek krwi w stosunku do krwi pełnej pokazano w Rysunek 2A. Ostateczny odzysk płytek krwi wynosił średnio 52% ± 3% (odchylenie standardowe, n=6). Końcową liczbę płytek krwi w porównaniu z zanieczyszczeniem białych krwinek mierzono za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego. Liczba białych krwinek wynosiła mniej niż 0,1% wszystkich komórek (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Płytki krwi są bardzo wrażliwe na środowisko, w tym na naprężenia ścinające i obecność agonistów38,39. To sprawia, że płytki krwi są trudne do opanowania i izolacji, co sprawia, że stosowanie inhibitorów i pipet o szerokim otworze ma kluczowe znaczenie40. Właściwe przechowywanie i przygotowanie ChOG2 ma zasadnicze znaczenie, ponieważ nieprzygotowanie PGI2 w podstawowym PBS spowoduje szybką degradację PGI2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zgłoszenia konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować dr Emily Janus-Bell i Clarisse Mouriaux z laboratorium dr Pierre'a Mangina oraz Katrinie Bark z laboratorium dr Jorge DiPaoli za ich wskazówki i rady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; Filtr M Probówki Spin-XMillapore-SigmaCLS8160Przygotowanie odczynnika
Igła 19 G x 3/4"FlebotomiaMcKesson448406
21 G Igła 1,5 cala z blokadą luer AmazonB0C39PJD23Przygotowanie odczynnika
Płytka 96-dołkowa, półpowierzchniowaGreiner Bio-One675101Cytometria przepływowa
Vaccutainery ACD-A Fisher Scientific364606do flebotomii
McKesson Corporation609
Wacik nasączony alkoholemVWR15648-916Flebotomia
Apiraza z ziemniakówSigmaA6410-100UNPrzygotowanie odczynnika
CD42a Przeciwciało monoklonalneThermo Fisher Scientific48-0428-42Cytometria przepływowa
Chłodzony Mikrowirówka ThermoFisher Scientific75002441Quenching
D-GlucoseSigmaG7021Przygotowanie odczynnika
FITC Przeciwciało anty-fibrynogenoweAbcam4217Cytometria przepływowa
Cytometrprzepływowy Beckman Coulter82922828Cytometria przepływowa
GazaVWR76049-110Flebotomia
GlicerolSigma AldrichG5516Przygotowanie odczynnika
HEPESSigma AldrichH4034Przygotowanie odczynnika
Ludzka alfa-trombinaProlytixHCT-0020Cytometria przepływowa
KClSigma AldrichP9333Przygotowanie odczynnika
KH2PO4Sigma AldrichP5655Przygotowanie odczynnika
MgCl2SigmaM8266Przygotowanie odczynnika
Probówki do mikrowirówekVWR87003-292Ogólne
Na2HPO4SigmaS3264Przygotowanie odczynnika
NaClSigma AldrichS7653Przygotowanie odczynnika
NaHCO3Sigma AldrichS5761Przygotowanie odczynnika
Pipeta do przenoszenia o wąskim otworzeVWR16001-176Mycie płytek krwi
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Cytometria przepływowa
PECy5 Mysz Anti-Human CD62PBD Pharmingen551142Cytometria przepływowa
Pokrywa płytkiThermo Fisher ScientificAB0626Cytometria przepływowa
Probówki stożkowe z polipropylenu 15 mlVWR89039-658Przygotowanie odczynnika
Polipropylen 50 ml probówki stożkoweVWR352070Mycie płytek krwi
Prostaglandyna I2 (sól sodowa)Cayman Chemical18220Przygotowanie odczynnika
SKC Inc. C-Chip Jednorazowe hemocytometryFisher Scientific22-600-100do liczenia komórek
BD Pharmingen14-823-41Przygotowanie
odczynnikaOpaska uciskowaVWR76235-371Flebotomia
Vacutainer Uchwyt na igłęBD364815Flebotomia
VortexerVWR102091-234Przygotowanie odczynnika
Kąpiel wodnaThermo Fisher ScientificTSGP02Mycie płytek
krwi Pipeta transferowa o szerokim otworzeVWR76285-362Mycie płytek krwi
Corporation Adapter do flebotomii Strzykawka

Bibliografia

  1. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93 (1), 327-358 (2013).
  2. Webera, M., et al. Enhanced platelet aggregation with trap-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism. Thromb Res. 107, 325-328 (2002).
  3. Herbert, J. M., Bernat, A., Maffrand, J. P. Importance of platelets in experimental venous thrombosis in the rat. Blood. 80 (9), 2281-2286 (1992).
  4. Puurunen, M. K., Hwang, S. J., O'donnell, C. J., Tofler, G., Johnson, A. D. Platelet function as a risk factor for venous thromboembolism in the framingham heart study. Thromb Res. 151, 57-62 (2017).
  5. Montoro-Garcia, S., Schindewolf, M., Stanford, S., Larsen, O. H., Thiele, T. The role of platelets in venous thromboembolism. Semin Thromb Hemost. 42 (3), 242-251 (2016).
  6. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: An update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2017).
  7. Yeung, J., Li, W., Holinstat, M. Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases. Pharmacol Rev. 70 (3), 526-548 (2018).
  8. Ferreiro, J. L., Gomez-Hospital, J. A., Angiolillo, D. J. Platelet abnormalities in diabetes mellitus. Diab Vasc Dis Res. 7 (4), 251-259 (2010).
  9. Buergy, D., Wenz, F., Groden, C., Brockmann, M. A. Tumor-platelet interaction in solid tumors. Int J Cancer. 130 (12), 2747-2760 (2012).
  10. Gkaliagkousi, E., Passacquale, G., Douma, S., Zamboulis, C., Ferro, A. Platelet activation in essential hypertension: Implications for antiplatelet treatment. Am J Hypertens. 23 (3), 229-236 (2010).
  11. Fidler, T. P., et al. Deletion of GLUT1 and GLUT3 reveals multiple roles for glucose metabolism in platelet and megakaryocyte function. Cell Rep. 20 (4), 881-894 (2017).
  12. Fidler, T. P., et al. Glucose metabolism is required for platelet hyperactivation in a murine model of type 1 diabetes. Diabetes. 68 (5), 932-938 (2019).
  13. Kulkarni, P. P., et al. Aerobic glycolysis fuels platelet activation: Small-molecule modulators of platelet metabolism as anti-thrombotic agents. Haematologica. 104 (4), 806-818 (2019).
  14. Ghatge, M., Flora, G. D., Nayak, M. K., Chauhan, A. K. Platelet metabolic profiling reveals glycolytic and 1-carbon metabolites are essential for gp vi-stimulated human platelets-brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (2), 409-416 (2024).
  15. Ravera, S., Signorello, M. G., Panfoli, I. Platelet metabolic flexibility: A matter of substrate and location. Cells. 12 (13), (2023).
  16. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  17. Mustard, J. F., Perry, D. W., Ardille, N. G., Packham, M. A. Preparation of suspensions of washed platelets from humans. British Journal of Haematology. 22, 193-204 (1972).
  18. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  19. Fine, K., Ashbrook, P., Brigden, L., Maldonado, J., Didishelm, P. Gel-filtered human platelets. Ultrastructure, function, and role of proteins in inhibition of aggregation by aspirin. Am J Pathol. 84 (1), (1976).
  20. Weiss, L., et al. An optimized protocol to isolate quiescent washed platelets from human whole blood and generate platelet releasate under clinical conditions. STAR Protoc. 4 (2), 102150(2023).
  21. Burzynski, L. C., Pugh, N., Clarke, M. C. H. Platelet isolation and activation assays. Bio Protoc. 9 (20), e3405(2019).
  22. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. 30 (6), 698-707 (2018).
  23. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. J Vis Exp. (147), (2019).
  24. Aibibula, M., Naseem, K. M., Sturmey, R. G. Glucose metabolism and metabolic flexibility in blood platelets. J Thromb Haemost. 16 (11), 2300-2314 (2018).
  25. Ravi, S., et al. Metabolic plasticity in resting and thrombin-activated platelets. PLoS One. 10 (4), e0123597(2015).
  26. Nayak, M. K., et al. an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinases, inhibits platelet aggregation and arterial thrombosis. Blood Advances. 2, (2018).
  27. Hadley, J. B., et al. Hormones, age, and sex affect platelet responsiveness in vitro. Transfusion. 62 (9), 1882-1893 (2022).
  28. Paglia, G., et al. Comprehensive metabolomic study of platelets reveals the expression of discrete metabolic phenotypes during storage. Transfusion. 54 (11), 2911-2923 (2014).
  29. Sake, C. L., et al. Isotopically nonstationary (13)c metabolic flux analysis in resting and activated human platelets. Metab Eng. 69, 313-322 (2022).
  30. Antoniewicz, M. R. A guide to metabolic flux analysis in metabolic engineering: Methods, tools and applications. Metab Eng. 63, 2-12 (2021).
  31. Larsen, M. T., Kuhlmann, M., Hvam, M. L., Howard, K. A. Albumin-based drug delivery: Harnessing nature to cure disease. Mol Cell Ther. 4 (3), (2016).
  32. Balduini, C. L., Noris, P. P. latelet count and aging. Haematologica. 9 (6), 953-955 (2014).
  33. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. , (2023).
  34. Spurgeon, B. E. J., Naseem, K. M. Platelet flow cytometry: Instrument setup, controls, and panel performance. Cytometry B Clin Cytom. 98 (1), 19-27 (2020).
  35. Van Velzen, J. F., Laros-Van Gorkom, B. A., Pop, G. A., Van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  36. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  37. Sapcariu, S. C., et al. Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture. MethodsX. 1, 74-80 (2014).
  38. Rana, A., Westein, E., Niego, B., Hagemeyer, C. E. Shear-dependent platelet aggregation: Mechanisms and therapeutic opportunities. Front Cardiovasc Med. 6, 141(2019).
  39. Ding, J., et al. Quantification of shear-induced platelet activation: High shear stresses for short exposure time. Artif Organs. 39 (7), 576-583 (2015).
  40. Ardlie, N., Perry, D., Packham, M., Mustard, J. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), (1971).
  41. Rao, G. H. R., Reddy, K. R., Hagert, K., White, J. G. Influence of ph on the prostacyclin (pg12) mediated inhibition of platelet function. Prostaglandins Medicine. 4, 263-273 (1980).
  42. Navred, K., et al. A simplified flow cytometric method for detection of inherited platelet disorders-a comparison to the gold standard light transmission aggregometry. PLoS One. 14 (1), e0211130(2019).
  43. Aldrighi, J. M., et al. Platelet activation status decreases after menopause. Gynecol Endocrinol. 20 (5), 249-257 (2005).
  44. Bausset, O., et al. Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product. Biores Open Access. 1 (3), 115-123 (2012).
  45. Nayak, M. K., et al. The metabolic enzyme pyruvate kinase m2 regulates platelet function and arterial thrombosis. Blood. 137 (12), 1658-1668 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja p ytek krwiMetabolizm p ytek krwiAktywacja p ytek krwiCytometria przep ywowaObr bka trombinProtok przemywania p ytek krwiOdzysk p ytek krwiAgoni ci p ytek krwi

Powiązane artykuły