Artykuł metodologiczny

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67641

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Soft Tissue Engineering and Mechanobiology, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology, 3Institute for Bioengineering of Catalonia, The Barcelona Institute of Science and Technology, 4Faculty of Science and Engineering, Cell Biology, Åbo Akademi University

W tym artykule

Podsumowanie

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Streszczenie

Angiogeneza kiełkowania to tworzenie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i ma ogromne znaczenie dla procesów fizjologicznych, takich jak wzrost i naprawa tkanek oraz procesy patologiczne, w tym rak i przerzuty. Wieloetapowy proces kiełkowania angiogenezy jest procesem napędzanym molekularnie i mechanicznie. Składa się z indukcji kiełka komórkowego przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych, selekcji komórek lidera / podążającego poprzez sygnalizację Notch, ukierunkowanej migracji komórek śródbłonka oraz fuzji i stabilizacji naczyń. Na przestrzeni lat opracowano różne modele angiogenezy kiełkowania, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw kiełkowania komórek. Pomimo postępów w zrozumieniu molekularnych czynników powodujących angiogenezę kiełkowania, rola sygnałów mechanicznych i mechanicznego czynnika napędzającego angiogenezę kiełkowania pozostaje niedostatecznie zbadana ze względu na ograniczenia w istniejących modelach. W tym badaniu zaprojektowaliśmy model 2,5D ex vivo, który umożliwia nam mechaniczne scharakteryzowanie kiełkowania komórkowego z tętnicy szyjnej świni za pomocą mikroskopii siły trakcji. Model identyfikuje wyraźne wzorce sił w obrębie kiełka, w których komórki liderowe wywierają siły ciągnące, a komórki podążające wywierają siły pchające na matrycę. Wszechstronność modelu pozwala na manipulowanie zarówno chemicznymi, jak i mechanicznymi wskazówkami, takimi jak sztywność matrycy, co zwiększa jego znaczenie dla różnych mikrośrodowisk. Tutaj pokazujemy, że początek kiełkującej angiogenezy jest zależny od sztywności. Zaprezentowany model 2,5D do ilościowego określania sił trakcyjnych komórek w kiełkującej angiogenezie oferuje uproszczoną, ale fizjologicznie istotną metodę, poszerzając naszą wiedzę na temat reakcji komórek na sygnały mechaniczne, co może przyczynić się do postępu w inżynierii tkankowej i strategiach terapeutycznych przeciwko angiogenezie guza.

Wprowadzenie

Angiogeneza to proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych. Proces ten jest niezbędny podczas rozwoju embrionalnego, gojenia się ran i progresji raka, z których wszystkie są związane ze zmianami biomechanicznymi w mikrośrodowisku1,2,3,4. Na początku angiogenezy niedotlenione lub uszkodzone tkanki uwalniają czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który aktywuje komórki śródbłonka sąsiednich naczyń krwionośnych, tworząc kiełki śródbłonka - gdzie dwa odrębne fenotypy lidera i następcy są przyjmowane przez molekularny szlak sygnałowy Notch5. Po utworzeniu kiełków śródbłonka, zjawisku znanym jako angiogeneza kiełkowania, komórki liderowe degradują otaczającą macierz zewnątrzkomórkową, aby wspólnie migrować w kierunku bodźca VEGF bez utraty adhezji komórka-komórka z końcowymi komórkami podążającymi6,7.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano coraz więcej testów angiogenezy kiełkowania, które badają zbiorową migrację komórek za pomocą różnych metodologii, z których każda oferuje różne korzyści i ograniczenia. Testy te oceniają skoordynowany ruch grup komórek, takich jak komórki śródbłonka, przez matryce 3D, umożliwiając badanie zachowań komórkowych, takich jak kiełkowanie, inwazja i migracja zbiorowa w kontrolowanym środowisku8,9,10. Testy angiogenezy kiełkowania in vivo zapewniają kompleksową ocenę w żywym organizmie, wychwytując skomplikowane interakcje, ale są czasochłonne, kosztowne, podatne na dużą zmienność i trudne do określenia ilościowego11,12. Testy angiogenezy kiełkowania in vitro umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych z wysoką odtwarzalnością i precyzyjną kwantyfikacją, ale mogą nie w pełni replikować złożoności in vivo11,12,13. Natomiast testy angiogenezy kiełkowania ex vivo, z których test pierścienia aortalnego jest najczęściej wykonywanym modelem, wykorzystują tkanki na zewnątrz organizmu, zachowując znaczenie fizjologiczne, unikając jednocześnie powikłań in vivo14,15,16. Pomimo tego, że są trudne technicznie i czasami mają problemy z żywotnością tkanek, modele ex vivo oferują cenną równowagę między złożonością a kontrolą, co czyni je obiecującym podejściem do badania angiogenezy kiełkowania. Chociaż modele te były szeroko stosowane do badania molekularnych czynników powodujących angiogenezę kiełkowania, wpływ sygnałów mechanicznych i mechaniczne zachowanie komórek pozostają słabo poznane.

Migracja wielokomórkowa podczas angiogenezy kiełkowania jest wysoce zależna od mechaniki komórkowej, ponieważ siły skurczowe oparte na aktomiozynie regulują inwazję komórek śródbłonka do otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej17,18,19,20. W szczególności zaobserwowano, że silniki miozyny II bez mięśni, główne maszyny kurczliwe oparte na aktynie w obrębie klasy cell21, kontrolują komórkowe siły skurczu podczas angiogenezy kiełkowania22,23. Komórka lidera jest prawdopodobnie dominującym elementem generującym siłę kiełka, ponieważ deformacje otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej 3D są znacznie większe wokół komórki lidera, a konkretnie w pobliżu wypukłości komórkowych bogatych w aktynę23,24, w porównaniu do swoich obserwujących22,23,25. Pomimo rosnących dowodów na znaczenie kurczliwości komórkowej w angiogenezie kiełkowania w 3D, brakuje metody czasoprzestrzennej mechanicznej charakterystyki mechaniki komórkowej angiogenezy kiełkowania.

Ogólnym celem tego badania jest opracowanie metody, która pozwala na mechaniczną charakterystykę migracji komórkowej podczas kiełkowania. Osiągając czasoprzestrzenną charakterystykę sił mechanicznych w biologicznie istotnym kontekście, staramy się dostarczyć nowych informacji na temat tego, jak mechanika komórkowa wpływa na tworzenie się kiełków angiogennych. W tym celu opracowaliśmy system modeli 2,5D, tworząc hydrożel 2D z poliakrylamidu (PAA), umieszczając na nim arkusz tętnicy szyjnej i pokrywając go cienką warstwą żelu kolagenowego typu I, aby stworzyć zlokalizowane środowisko 3D dla komórek. Kiełki wielokomórkowe wyemigrowały z arkusza tętniczego na granicy faz PAA-żel kolagenowy. Zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że hydrożel 2D PAA umożliwia analizy za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych (TFM) - dobrze znanej wszechstronnej techniki, w której komórki przylegają do elastycznego podłoża 2D i deformują substrat pod wpływem komórkowych sił trakcyjnych26. Odkształcenia te można wychwycić, a siły trakcji komórkowej można obliczyć na podstawie właściwości mechanicznych podłoża26. Adaptując TFM do stosowania w żywych tkankach ex vivo, dążymy do wypełnienia luki między kontrolą in vitro a znaczeniem in vivo, zapewniając bardziej kompleksowe zrozumienie sił mechanicznych podczas angiogenezy.

Protokół

Tętnice szyjne świń zostały użyte w tym protokole. Tętnice szyjne świń zostały pobrane od świń mieszańców holenderskich Landrace - w wieku 5-7 miesięcy i wadze (żywej) 80-120 kg - uzyskanych z lokalnej ubojni. Protokoły były zgodne z rozporządzeniami WE 1069/2009 dotyczącymi materiału zwierzęcego rzeźnego do diagnostyki i badań nadzorowanego przez rząd holenderski (holenderskie Ministerstwo Rolnictwa, Przyrody i Jakości Żywności) i zostały zatwierdzone przez powiązane organy prawne ds. dobrostanu zwierząt (Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności i Produktów Konsumenckich). Zgoda etyczna nie była wymagana, ponieważ tkanki były pobierane z produktów ubocznych już zabitych zwierząt. Czas między śmiercią a transportem tkanek wynosi 10-25 minut, w zależności od rzeźni.

UWAGA: Tabela materiałów podsumowuje szczegóły dotyczące materiałów, sprzętu i odczynników używanych w tym protokole. Protokoły dla próbek 2D i 3D są opisane w pliku uzupełniającym 1.

1. Przygotowanie podłoży 2D z poliakrylamidu (PAA)

  1. W dygestorium przygotować roztwór silanu wiążącego, mieszając etanol absolutny w proporcji 12:1:1 (do syntezy), kwas octowy i silan wiążący odpowiednio o stężeniach odpowiednio 4286 μl, 357 μl i 357 μl. Inkubować 120 μl/studzienkowy roztwór silanu wiążącego na 12-dołkowej płytce ze szklanym dnem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Alkohol etylowy jest wysoce łatwopalną cieczą i parami (H225) i powoduje poważne podrażnienie oczu (H319). Kwas octowy jest łatwopalną cieczą i parami (H226) i powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu (H314). Nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
  2. W dygestorium umyć 12-dołkową płytkę ze szklanym dnem 3x absolutnym etanolem (przemysłowym) za pomocą butelki z rozpylaczem. Wyrzuć etanol.
  3. Osuszyć 12-dołkową płytkę ze szklanym dnem za pomocą gazowego azotu. Jeśli na szklanym dnie pojawi się biała glace, oznacza to, że mycie nie było wystarczające. Ponownie umyj szklaną dolną płytkę 12-dołkową.
  4. Przygotować mieszaninę żelu PAA zgodnie ze stosunkami podanymi w tabeli 1.
    1. Dodaj PBS do probówki mikrowirówkowej i ponownie zawieś 40% akrylamidu, 2% bis-akrylamidu i markerów fluorescencyjnych w mieszaninie żelu. Roztworu należy rozprowadzić w wirze tuż przed przygotowaniem żelu.
    2. Tak szybko, jak to możliwe, dodaj 10% APS i TEMED do roztworu i wiruj po dodaniu każdego pierwiastka. Odpipetować kroplę 11,5 μl mieszaniny żelu na szklane dno każdej studzienki i delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm na wierzchu kropli.
    3. Delikatnie postukaj i zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę żelu pod szkiełkiem nakrywkowym. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, usuń je, delikatnie podnosząc szkiełko nakrywkowe. Pozostaw żele do polimeryzacji na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sprawdź polimeryzację przy użyciu pozostałej mieszaniny żelu w probówce. Spolimeryzowane żele PAA w płytce 12-dołkowej będą wyświetlać wewnętrzne halo.
      UWAGA: Akrylamid jest szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu (H302 + H332), działa drażniąco na skórę (H315), może powodować reakcję alergiczną skóry (H317), może powodować poważne działanie drażniące na oczy (H319), może powodować wady genetyczne (H340), może powodować raka (H350), podejrzewa się, że działa szkodliwie na płodność (H361f) oraz powoduje uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie w przypadku połknięcia (H372). APS może nasilać działanie ognia (utleniacz, H272), działać szkodliwie po połknięciu (H302), działać drażniąco na skórę (H315), powodować reakcję alergiczną skóry (H317), powodować poważne podrażnienie oczu (H319), może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w przypadku wdychania (H334) oraz może powodować podrażnienie dróg oddechowych (H335). TEMED jest wysoce łatwopalną cieczą i parami (H225), działa szkodliwie po połknięciu (H302), powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu (H314) oraz jest toksyczny w przypadku wdychania (H331). Nosić środki ochrony osobistej.
  5. Po polimeryzacji dodaj PBS do studzienki. Za pomocą pęsety i/lub wygiętej igły delikatnie podnieś i usuń szkiełko nakrywkowe. Umyj żele raz w PBS.
  6. Aby ułatwić powlekanie kolagenem żeli PAA, żele muszą być funkcjonalizowane za pomocą środka sieciującego Sulfo-SANPAH. Dodać 75 μl 1 mg/ml sulfo-SANPAH rozpuszczonego w ultraczystej wodzie do żelu PAA i inkubować przez 5 minut w świetle UV 365 nm.
    UWAGA: Utrzymuj Sulfo-SANPAH przed światłem i dodaj ultraczystą wodę tuż przed inkubacją UV. Przebarwienie jest widoczne od jasnoczerwonego (przed inkubacją światła UV) do ciemnoczerwonego (po inkubacji w świetle UV).
    UWAGA: Sulfo-SANPAH powoduje poważne podrażnienie oczu (H319).
  7. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przeprowadzić szybkie sterylne płukanie PBS sulfo-SANPAH na żelach. W związku z tym umyj funkcjonalizowane żele PAA 2x w sterylnym PBS przez 10 min.
    UWAGA: Począwszy od tego punktu w protokole, wszystkie kroki będą wykonywane w sterylnych warunkach.
  8. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 0,1 mg/ml roztwór kolagenu typu IV w PBS na lodzie. Odmierzyć pipetę 50 μl kropli kolagenu typu IV o stężeniu 0,1 mg/ml na funkcjonalizowany żel PAA i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Umyj żele 2x w sterylnym PBS. Wyjmij PBS i pozostaw żele do wyschnięcia na 5 minut.
  10. Odpipetować 50 μl kropli pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EKG) na żele i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Inkubacja żeli w pożywce EKG poprawia przyczepy komórek i tkanek do żeli.

2. Przygotowanie zmodyfikowanego roztworu Krebsa do transportu

UWAGA: Przygotuj zmodyfikowany roztwór Krebsa na świeżo. W tym protokole zmodyfikowany roztwór Krebsa przygotowuje się 1 dzień przed pobraniem tkanek.

  1. Wysterylizuj butelkę transportową przez autoklawowanie. Napełnij szklaną butelkę 90% (315 ml) całkowitej wymaganej objętości transportowej (350 ml) ultraczystej wody. Upewnij się, że temperatura wody wynosi 15-20 °C.
  2. Delikatnie mieszając wodę za pomocą magnesu mieszającego, dodaj 9,6 g/l (3,36 g) buforu Krebs-Henseleit i mieszaj aż do rozpuszczenia. Za pomocą pipety Pasteura przepłukać łódkę wagową niewielką objętością roztworu, aby uwzględnić w roztworze wszystkie śladowe ilości proszku. Nie podgrzewaj roztworu.
  3. Mieszając, dodać 0,373 g/l (130,55 mg) chlorku wapnia (CaCl2) do roztworu i mieszać aż do rozpuszczenia. Przepłukać łódkę wagową niewielką objętością roztworu.
    UWAGA: H319 działa drażniąco na oczy.
  4. Mieszając, dodać 2,1 g/l (0,63 g) wodorowęglanu sodu (NaHCO3) do roztworu i mieszać aż do rozpuszczenia. Przepłukać łódkę wagową niewielką objętością roztworu.
  5. Mieszając, dodaj 1 x 10-1 mM (13,15 mg) papaweryny do roztworu i mieszaj aż do rozpuszczenia. Przepłukać łódkę wagową niewielką objętością roztworu.
    UWAGA: Papaweryna jest środkiem zwiotczającym mięśnie gładkie, stosowanym w celu zapobiegania nadmiernemu zwężeniu naczyń krwionośnych spowodowanemu cięciem i obchodzeniem się z naczyniem podczas zbioru.
    UWAGA: H301 jest toksyczny po połknięciu.
  6. W dygestorii dodać 0,05 mM (1,2 μl) 2-merkaptoetanolu do roztworu i wymieszać.
    UWAGA: 2-merkaptoetanol służy do utrzymywania niskiego poziomu rodników tlenowych.
    UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny w przypadku połknięcia lub wdychania (H301 + H331), jest śmiertelny w kontakcie ze skórą (H310), działa drażniąco na skórę (H315), może powodować reakcję alergiczną skóry (H317), powoduje poważne uszkodzenie oczu (H318), może powodować uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie w przypadku połknięcia (H373) oraz jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, powodując długotrwałe skutki (H410). Nosić środki ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem.
  7. Podczas mieszania dostosować pH do 7,2, dodając 1 N (1 M) HCl lub 1 N (1 M) NaOH. Ostateczne docelowe pH to 7,4, ale pH może wzrosnąć o 0,1-0,3 jednostki pH podczas filtracji.
    UWAGA: HCl zawiera gaz pod ciśnieniem; może eksplodować po podgrzaniu (H280), spowodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu (H314), a także jest toksyczny w przypadku wdychania (H331). Nosić środki ochrony osobistej.
  8. Kontynuuj pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj 10% ultraczystej wody, aby doprowadzić roztwór do końcowej objętości.
  9. Roztwór należy natychmiast wysterylizować przez filtrację za pomocą membrany o porowatości 0,22 μm. Dozować sterylny roztwór bezpośrednio do sterylnej butelki. Dodać 7 ml 2% penicyliny/streptomiocyny (P/S) do roztworu.
    UWAGA: Podczas transportu do podłoża dodaje się 2% P/S w celu usunięcia wszystkich bakterii. Podczas hodowli tkankowej do podłoża dodaje się 1% P/S.
  10. Zmodyfikowany roztwór Krebsa należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu pobrania tkanek.

3. Pobieranie tkanek

  1. W zależności od rzeźni ogłuszyć świnie poprzez porażenie prądem lub CO2 . Następnie powiesić świnie na tylnej kończynie, wykrwawić i uznać za martwe.
  2. Przed przystąpieniem do czystego procesu uboju prosiąt należy sparzyć w celu usunięcia włosów, przypalić w celu usunięcia ostatnich włosów i wysterylizować zewnętrzną część tuszy.
  3. Wypatroszyć świnie, wykonując nacięcie w linii środkowej wzdłuż brzucha i ostrożnie usuwając narządy wewnętrzne. W zależności od rzeźni tętnica szyjna była nadal przymocowana do tuszy świni lub tętnica szyjna była już usuwana z tuszy przez wyrwanie narządów klatki piersiowej.
  4. Za pomocą ostrego noża pobierz tętnicę szyjną z pozostałą otaczającą tkanką z tuszy lub tkanki okolicy gardła, nie dotykając tętnicy ani nie obciążając mechanicznie.
  5. Umieścić tkankę zawierającą tętnicę szyjną w butelce transportowej zawierającej sterylny zmodyfikowany roztwór Krebsa, otwierając na krótko butelkę. Odwróć butelkę jeden raz, aby upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem Krebsa. Przenieś tkanki na lodzie do laboratorium. Transport trwa około 30-45 min.

4. Sekcja tkanek

  1. Sterylizuj sprzęt do preparacji: pęseta chirurgiczna (nieostrożna obsługa), pęseta z okrągłą końcówką pokrytą żywicą epoksydową (precyzyjna obsługa), skalpel, szczypce i szkiełka nakrywkowe przez autoklawowanie.
  2. Przygotuj komorę bezpieczeństwa biologicznego przed pobraniem/transportem tkanek. Przykryj obszar sekcji prześcieradłem chirurgicznym. Zamontuj sprzęt do preparacji (w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml), ostrza chirurgiczne i sterylne szkiełka nakrywkowe. Napełnij dwie duże szalki Petriego sterylnym PBS, aby przygotować tacę do sekcji. Inkubować kulturę tkankową na jednej małej szalce Petriego z pożywką EKG w temperaturze 37 °C.
  3. Po przetransportowaniu tkanek, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przenieś tętnicę szyjną z butelki transportowej (wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Krebsa) na dużą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS za pomocą pęsety chirurgicznej.
  4. Usuń nadmiar tkanki otaczającej tętnicę szyjną za pomocą pęsety chirurgicznej i skalpela, aby uzyskać wyraźny widok tętnicy szyjnej.
  5. Usuń 2-3 cm z obu końców tętnicy szyjnej, aby wyeliminować obszary w pobliżu rozwidleń tętnic, przecinając skalpelem. Usuń powięź tętniczą otaczającą tętnicę szyjną za pomocą cienkiej pęsety z okrągłą końcówką.
    UWAGA: Odnowienie ostrza skalpela pomaga bardziej precyzyjnie przeciąć powięź.
  6. Przenieś tętnicę szyjną na nową, dużą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS. Usuń pozostałą cienką warstwę powięzi tętniczej tak bardzo, jak to możliwe.
    UWAGA: Im dłużej tętnica szyjna znajduje się w PBS, tym więcej kawałków powięzi ma tendencję do poluzowywania. Usunięcie powięzi jest ważne, ponieważ będzie ona utrudniać widzenie podczas mikroskopii.
  7. Przetnij czystą tętnicę szyjną na pierścienie o szerokości około 2 mm. Przenieść pierścienie tętnicy szyjnej na rozgrzaną małą szalkę Petriego wypełnioną pożywką EKG i utrzymywać w temperaturze 37 °C.

5. Siew tkanek

UWAGA: Przyczepienie tkanki zostało przetestowane poprzez dodanie bez szkiełka nakrywkowego, sterylnego nietraktowanego szkiełka nakrywkowego lub sterylnego szkiełka nakrywkowego poddanego działaniu pluronu (1% w/v pluronu w PBS, szkiełka nakrywkowe inkubowane przez noc i myte w sterylnej ultraczystej wodzie przed użyciem) o różnych rozmiarach na wierzchu arkusza tętniczego po wysianiu na hydrożelu PAA.

  1. Usuń średnie kropelki EKG z żeli. Przenieść pierścień tętnicy szyjnej na czystą pożywkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.
  2. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką i skalpela przetnij pierścień na pół. Rozetnij pół pierścienia na arkusze o szerokości około 2 mm, aby utworzyć arkusze tętnicze o wymiarach 2 x 2 mm. Zwróć uwagę na orientację śródbłonkowej strony arkusza tętniczego. Krzywizna i część pozostałej powięzi arkusza tętniczego mogą pomóc w określeniu tej orientacji.
    UWAGA: Rozmiar pierścieni tętnicy szyjnej może się różnić. Duże pierścienie dają około 6-8 arkuszy, podczas gdy małe pierścienie dają 3-4 arkusze. Duże pierścienie mają lepsze mocowanie ze względu na mniejszą krzywiznę arkusza tętniczego.
  3. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką chwyć arkusz tętniczy z tyłu arkusza (na zewnątrz ściany naczynia) i umieść arkusz na krawędzi żelu PAA z wewnętrzną wyściółką śródbłonka skierowaną w stronę podłoża PAA, aby uniknąć uszkodzenia podłoża PAA podczas umieszczania arkusza.
  4. Za pomocą pęsety lub szczypiec bardzo delikatnie przesuń arkusz tętniczy do środka hydrożelu PAA, nie dotykając żelu. Umieść arkusz tętniczy na krawędzi żelu (tkanka może przykleić się do pęsety lub szczypiec).
    UWAGA: Małe pozostałości powięzi tętniczej na zewnątrz ściany naczynia tworzą łatwy uchwyt do chwytania arkusza tętniczego, podczas gdy wewnętrzna wyściółka śródbłonka ściany naczynia jest bardzo gładka.
  5. Dodać 50 μl pożywki EKG na wierzch arkusza tętniczego umieszczonego na podłożu PAA. Ty, aby utrzymać kroplę pożywki EKG na wierzchu żelu.
  6. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką umieść suche szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm na arkuszu tętniczym na podłożu PAA w podłożu. Użyj wewnętrznej krawędzi szklanego dna, aby delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe, aż dotknie kropli podłoża, a podłoże rozprzestrzeni się pod nim.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe o średnicy 13 mm są korzystne, ponieważ ściśle odpowiadają rozmiarowi wewnętrznej ścianki szklanej dolnej płyty studzienki. Jeśli zbyt szybko opuścisz szkiełko nakrywkowe, chusteczka przesunie się do krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  7. Pozostaw tkankę do przyłączenia w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 godzin przed dodaniem 1 ml pożywki EKG do każdej studzienki. Umieścić arkusz tętniczy na podłożu PAA w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

6. Tworzenie modelu 2.5D

  1. Umieść w autoklawie pęsetę z okrągłą końcówką do usuwania szkiełek nakrywkowych. Przygotować 1 M NaOH w ultraczystej wodzie, wysterylizować przez filtrację przez filtr o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: 1 M NaOH może być ponownie wykorzystany w przyszłych eksperymentach.
  2. Za pomocą sterylnej ostrej igły z wygiętą końcówką bardzo delikatnie podnieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm z arkusza tętniczego i usunąć szkiełko nakrywkowe. Użyj wewnętrznego pierścienia szklanego dna jako podpory, aby podnieść i usunąć szkiełko nakrywkowe. Każdy ruch na boki zwiększa ryzyko oderwania się arkusza tętniczego od podłoża PAA.
  3. W sterylnej probówce do mikrowirówek przygotować mieszaninę kolagenu typu I zgodnie z tabelą 2 na lodzie. Po dodaniu kolagenu typu I i NaOH do roztworu, bardzo dobrze zawiesić i raz odwrócić probówkę, aby upewnić się, że mieszanina jest jednorodnie wymieszana.
    UWAGA: Po dodaniu kolagenu typu I do mieszaniny, jasnoróżowa mieszanina staje się bezbarwna. Po dodaniu NaOH bezbarwna mieszanina zmienia kolor na jasnoróżowy.
  4. Usuń pożywkę ze studni za pomocą próżniowego systemu ssącyego. Usunąć podłoże otaczające tkankę tak bardzo, jak to możliwe, nie dotykając tkanki.
    UWAGA: Zbyt duża ilość podłoża otaczającego arkusz tętniczy zapobiegnie otoczeniu żelu kolagenowego typu I.
  5. Dodać 10 μl kropli mieszaniny żelu kolagenu typu I na wierzch każdego arkusza tętniczego i pozostawić żel kolagenu typu I do polimeryzacji na 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Bardzo delikatnie dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki EKG do każdej studzienki i umieść próbki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

7. Obrazowanie żywych komórek

UWAGA: Obrazowanie żywych komórek zostało wykonane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego Leica DMi8 lub Nikon Ti2 Eclipse wyposażonego w kontrolę termiczną, CO2 i wilgotności oraz kontrolowanego za pomocą oprogramowania Leica lub NIS. Adaptacyjna kontrola ostrości (Leica) i system doskonałego ustawiania ostrości (Nikon) służyły do utrzymania ostrości w czasie.

  1. Po 24 godzinach hodowli w systemie 2,5D należy sprawdzić, czy nie ma angiogenezy kiełkowania. Niektóre arkusze tętnicze zaczynają tworzyć kiełki komórkowe już po 24 godzinach hodowli, podczas gdy inne arkusze potrzebują trochę więcej czasu, aby zainicjować kiełkowanie śródbłonka.
  2. Jeśli zainicjowano angiogenezę kiełkowania, odświeżyć pożywkę EKG i umieścić 12-dołkową płytkę w uchwycie stage w wstępnie ogrzanym komorze inkubacyjnej mikroskopu o temperaturze 37 °C.
  3. Wybierz interesujący Cię cel. W tym badaniu zastosowano różne cele, użyj celu 10x, aby stworzyć globalny przegląd powstawania kiełków komórkowych i celu 20x, aby wykonać TFM.
  4. Zdefiniuj interesujące Cię kanały. Dla celów TFM wizualizuj kiełki komórkowe za pomocą kontrastu fazowego i wizualizuj markery fluorescencyjne (ciemnoczerwone) w podłożu PAA za pomocą kanału fluorescencyjnego o długości fali 660 nm.
  5. Wybierz (wiele) interesujących Cię regionów i znajdź płaszczyznę ostrości. Włącz system ustawiania ostrości (adaptacyjne sterowanie ostrością w Leica DMi8 lub system idealnego ustawiania ostrości w Nikon Ti2 Eclipse), aby zapewnić stabilną ostrość podczas obrazowania poklatkowego.
  6. Zdefiniuj interesujący Cię timelapse, wybierając przedział czasu i długość timelapse. W tym badaniu wykorzystano różne przedziały czasowe (5-20 min) i długości timelapse (4-24 h).
  7. Dla celów TFM, po obrazowaniu poklatkowym, usuń wyrastające komórki, dodając kilka kropel 5% SDS w ultraczystej wodzie i odczekaj kilka minut. Dla każdej wybranej pozycji należy wziąć stos z (zdefiniowano wysokość z 2 μm z rozmiarem kroku 0,2 μm) markerów fluorescencyjnych w podłożu PAA, aby uzyskać stan zrelaksowany markerów fluorescencyjnych jako obraz referencyjny.
    UWAGA: Obrazowanie stosu Z jest wykonywane, ponieważ komórki mogą ciągnąć lub popychać markery fluorescencyjne w kierunku z.

8. Analiza mikroskopii siły pociągowej

  1. Wyrównywaj i przycinaj obrazy poklatkowe względem najlepszego obrazu referencyjnego w celu precyzyjnej analizy.
  2. Aby zmierzyć przemieszczenia markerów fluorescencyjnych w hydrożelu PAA, należy wykonać Particle Image Velocimetry (PIV) między dowolnym obrazem poklatkowym a obrazem referencyjnym przy użyciu niestandardowych kodów MatLab. W ramach analizy PIV podziel obrazy na okna przesłuchań o wymiarach 32 na 32 piksele z nakładaniem się 0,5.
  3. Oblicz siły trakcyjne na podstawie przemieszczeń markerów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii trakcyjnej opartej na transformacji Fouriera nieskończonego żelu o skończonej grubości żelu, używając równania Boussinesqa27.

Wyniki

Za pomocą opisanego protokołu możemy indukować angiogenezę kiełkowania ex vivo z porcine carotid artery na powierzchni 2D hydrożelu PAA pokrytego cienką warstwą żelu z kolagenu typu I, tworząc w ten sposób model angiogenezy kiełkowania ex vivo 2,5D. Model ten pozwala na przeprowadzenie konwencjonalnej TFM i pomiar komórkowych sił trakcyjnych angiogenezy kiełkowania na granicy żelu PAA w przestrzeni i czasie.

Aby stworzyć model 2.5D, najpierw przygotowano dwuwymiarowy (2D) hydrożel poliakrylamidowy (PAA) z zatopionymi markerami fluorescencyjnymi, a następnie poddano go nocnej inkubacji w celu powlekania kolagenem typu IV (d-1 do d0). W dniu 0 (d0) płat tętnicy szyjnej umieszczono na hydrożelu powleczonym kolagenem IV i pozostawiono do przytwierdzenia na noc (d0 do d1). Następnie na płat tętniczy nałożono cienką warstwę żelu z kolagenu typu I, po czym w dniu 1 (d1) rozpoczęto obrazowanie w celu monitorowania kiełkowania komórek i śledzenia markerów fluorescencyjnych do analizy mechanicznej (d1 do d2). Aby zweryfikować angiogenezę kiełkową w modelu 2.5D, równolegle przeprowadzono konwencjonalną angiogenezę kiełkową ex vivo w trójwymiarowym (3D) żelu z kolagenu typu I. W tym celu przygotowano cienką warstwę żelu z kolagenu typu I, po czym zasiano płat tętnicy szyjnej i przykryto go dodatkową warstwą kolagenu (d0). Kiełkowanie angiogenne monitorowano w czasie. Ponadto podjęto próbę wywołania angiogenezy kiełkowej w 2D, aby dodatkowo zmniejszyć złożoność modelu. Procedura eksperymentalna była analogiczna do modelu 2.5D, przy czym kluczową różnicą był brak górnej warstwy żelu z kolagenu typu I. Przegląd trzech modeli, wraz z opisem procedur eksperymentalnych, przedstawiono na Rysunku 1. Tętnice szyjne pobrano od świń z lokalnej rzeźni i transportowano w sterylnym, świeżym roztworze Krebsa. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usunięto nadmiar tkanek otaczających tętnicę szyjną, aby uniknąć przesłonięcia procesu angiogenezy kiełkowej podczas obrazowania timelapse na żywo (Rysunek 2A-E). Po oczyszczeniu tętnicy z nadmiaru tkanek, przecięto ją na pierścienie o szerokości 2 mm, a pierścienie podzielono na płaty tętnicze o wymiarach 2 x 2 mm (Rysunek 2F).

Aby zapewnić sprouting angiogenezę na powierzchni interfejsu hydrożelu PAA w modelu 2,5D i 2D, osadziliśmy płaty tętnicze tak, aby wewnętrzna strona z komórkami śródbłonka przylegała do hydrożelu PAA pokrytego kolagenem typu IV, i pozostawiliśmy je do przytwierdzenia. W celu optymalizacji przytwierdzenia płata tętniczego do hydrożelu PAA przetestowaliśmy wpływ dodania szklanego zakrycia o średnicy 12 mm z powłoką antyfoulingową na wierzchu płata tętniczego. Po 24 h usunięto zakrycie, a wydajność przytwierdzenia zmierzono jako procent płatów tętniczych przytwierdzonych do hydrożelu PAA. Zaobserwowaliśmy, że dodanie szklanego zakrycia – niezależnie od powłoki antyfoulingowej – zwiększyło wydajność przytwierdzenia płatów tętniczych do hydrożelu PAA w porównaniu do wariantu bez zakrycia (Rysunek 3A-D). Następnie przetestowaliśmy wpływ średnicy (12 lub 13 mm) szklanego zakrycia na wydajność przytwierdzenia płata tętniczego, przy średnicy wewnętrznej studzienki płytki wynoszącej 14 mm. Zaobserwowaliśmy, że zakrycie o średnicy 13 mm zwiększa wydajność przytwierdzenia płatów tętniczych do hydrożelu PAA w porównaniu do zakrycia o średnicy 12 mm (Rysunek 3E-G), ponieważ zminimalizowane zostały siły ścinania podczas usuwania zakrycia. W dalszej części pracy do przytwierdzania płatów tętniczych do hydrożelu PAA w modelach 2,5D i 2D stosowaliśmy nieprzetraktowane zakrycie o średnicy 13 mm.

Po przytwierdzeniu płata tętniczego do hydrożelu PAA, na wierzch płata nałożyliśmy cienką warstwę żelu kolagenu typu I, aby stworzyć środowisko 2,5D. Próbki hodowano przez 5 dni, a następnie badano pod kątem angiogenezy pączkującej. W modelu 3D zaobserwowano tworzenie się pąków komórkowych (Rysunek 4A), co jest zgodne z wcześniej opisaną w literaturze angiogenezą pączkującą ex vivo28,29,30. W modelu 2,5D zaobserwowano podobną organizację pąków komórkowych w porównaniu z modelem 3D (Rysunek 4B). Pąki komórkowe tworzyły się na wielu wysokościach (Wideo 1), w tym na styku z PAA. Ponadto angiogeneza pączkująca charakteryzuje się wysoką proliferacją komórek prowadzących (leader cells) i podążających (follower cells), co zaobserwowaliśmy podczas pączkowania w modelu 2,5D (Wideo 2). W przypadku hodowli płata tętniczego w 2D, komórki o różnym pochodzeniu (Rysunek uzupełniający 1) migrują z tkanki w postaci monowarstw, przez co brakuje organizacji pąków komórkowych (Rysunek 4C). Ponieważ w modelu 2D nie zaobserwowano angiogenezy pączkującej, wykluczyliśmy ten model z dalszych analiz. Podsumowując, płat tętniczy wymaga lokalnego środowiska 3D do indukowania angiogenezy pączkującej, co wykazuje potencjał modelu ex vivo 2,5D do badania angiogenezy pączkującej.

Ponadto system modelowy 2.5D jest wszechstronnym układem, który pozwala użytkownikom badać wpływ sygnałów mechanicznych z mikrośrodowiska komórkowego, np. sztywności macierzy. Sztywność macierzy trójwymiarowego hydrożelu kolagenowego typu I — hydrożelu powszechnie stosowanego do badania angiogenezy kiełkowania ex vivo — zależy od stężenia białek ECM, gdzie wzrost stężenia białka koreluje ze wzrostem sztywności macierzy32. Typowy zakres stężenia kolagenu typu I do sporządzenia tego 3D hydrożelu indukującego angiogenezę kiełkowania wynosi 1-4 mg/mL, co odpowiada sztywności macierzy od 1 Pa do 1 kPa32,33,34. Niższe stężenia mogą być zbyt miękkie, aby zapewnić wsparcie strukturalne, natomiast wyższe stężenia mogą hamować ruch komórek. Fizjologiczna sztywność tkanki śródbłonkowej wynosi 1 kPa35, co można odtworzyć za pomocą 3D hydrożelu kolagenowego typu I. Jednakże tworzenie i progresja nowotworów wiążą się ze sztywnieniem tkanki4, co podkreśla potrzebę zastosowania modelu zdolnego do osiągnięcia wyższej sztywności macierzy w celu badania angiogenezy nowotworowej. Sztywność podłoża hydrożeli PAA — sztywność odczuwaną przez komórki śródbłonka arkusza tętniczego — można łatwo dostroić w zakresie od 1 do kilkunastu kPa. W tym badaniu analizowano wpływ sztywności podłoża PAA na początek angiogenezy kiełkowania, określając procent próbek, w których rozpoczęło się tworzenie kiełków komórkowych w dniu następującym po dodaniu warstwy kolagenu typu I. Zaobserwowano, że więcej arkuszy tętniczych wykazywało wczesne oznaki tworzenia kiełków komórkowych podczas hodowli na fizjologicznym, miękkim (1 kPa) hydrożelu PAA w porównaniu do patologicznego, sztywnego (12 kPa) hydrożelu PAA (Rysunek 5), co wykazuje potencjał tego modelu w badaniu wpływu sztywności macierzy na angiogenezę kiełkowania. Oprócz regulowanej sztywności podłoża, substraty te pozwalają na systematyczną modulację innych sygnałów mechanicznych (np. składu i gęstości macierzy), a także sygnałów chemicznych (np. hamowanie regulatorów molekularnych poprzez kondycjonowanie medium hodowlanego), co demonstruje wszechstronność tego 2.5D modelu angiogenezy kiełkowania ex vivo.

Aby ilościowo ocenić mechanikę komórkową w procesie angiogenezy kiełkowania, przeprowadziliśmy konwencjonalną mikroskopię sił trakcyjnych (TFM) na wypustkach komórkowych powstałych na interfejsie PAA 2D. Jeden dzień po dodaniu warstwy kolagenu typu I wykonaliśmy obrazowanie żywych komórek (Rysunek 6A) oraz markerów fluorescencyjnych osadzonych w hydrożelu PAA. Przesunięcia markerów fluorescencyjnych zmierzono za pomocą wideoanalizy przepływu cząstek (PIV) (Rysunek 6B), a siły trakcyjne komórek obliczono w oparciu o właściwości mechaniczne hydrożelu PAA (Rysunek 6C). Wykorzystując ten model 2.5D ex vivo, zaobserwowaliśmy początkowo siły ciągnące w obrębie wypustek komórki prowadzącej wypustki komórkowej, a następnie siły pchające wzdłuż wypustki komórkowej – zarówno z tyłu komórki prowadzącej, jak i w komórkach naśladowczych (Rysunek 6C).

Modele angiogenezy 2D, 2.5D i 3D; schemat przygotowania podłoża, zasiewu tętniczego oraz analizy.
Rycina 1: Modele i procedury eksperymentalne. (lewa strona) Przetestowane modele eksperymentalne. Model 2.5D przedstawia płat tętniczy umieszczony na płaskim hydrożelu poliakrylamidowym (PAA) pokrytym kolagenem typu IV i przykryty cienką warstwą hydrożelu kolagenu typu I. Model 3D przedstawia płat tętniczy umieszczony pomiędzy dwiema warstwami żelu kolagenu typu I, co jest systemem znanym z indukowania angiogenezy pączkowania36. Model 2D przedstawia płat tętniczy umieszczony na płaskim hydrożelu PAA pokrytym kolagenem typu IV. (prawa strona) Procedury eksperymentalne dla odpowiadających modeli. W przypadku obu modeli, 2D i 2.5D, hydrożel PAA przygotowano dzień przed zasiewem (d-1), a pokrycie kolagenem typu IV wykonano przez noc. Tętnicę szyjną pobrano od świń, pocięto na płaty tętnicze, zasiano na hydrożeluu w dniu 0 (d0) i pozostawiono do przytwierdzenia przez noc (d1). W przypadku próbek 2.5D na wierzchu płata tętniczego umieszczono cienką warstwę żelu kolagenu typu I. Analizę mechaniczną przeprowadzono po rozpoczęciu pączkowania w dniu 2 (d2). W przypadku próbek 2D pożywkę odnowiono w dniu 1 (d1). W modelu 3D warstwę żelu kolagenu typu I przygotowano bezpośrednio przed zasiewem w dniu 0 (d0). Płat tętniczy zasiano na warstwie kolagenu typu I i przykryto drugą warstwą kolagenu typu I. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Przygotowanie tętnicy szyjnej; oczyszczona tkanka, pierścień i arkusz tętnicy; proces sekcji; eksperyment.
Rysunek 2: Etapy sekcji tętnicy szyjnej (d0). (A) Tętnice szyjne o długości około 10 cm pobrano od świń z lokalnej rzeźni. (B) Usunięto nadmiar tkanki oraz około 2 cm krawędzi (aby uniknąć zbyt bliskiego sąsiedztwa punktów rozgałęzień, (B')). (C-E) Tętnicę szyjną oczyszczono z tkanki zewnętrznej (C), namoczono w PBS (D), a następnie usunięto całą pozostałą tkankę, aby zapewnić przejrzystość podczas obrazowania (E). (F) Oczyszczoną tętnicę szyjną pocięto na pierścienie o szerokości około 2 mm. Każdy pierścień rozcięto na 4 arkusze tętnicze o wymiarach około 2 x 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy przygotowania żelu poliakrylamidowego z szkiełkami nakrywkowymi; wykres przedstawia procentową wydajność przywierania.
Rycina 3: Wydajność przywierania płata tętniczego wzrasta przy użyciu szkiełka nakrywkowego o średnicy 13 mm (d1). (A-D) Wpływ szkiełka nakrywkowego na przywieranie płata tętniczego do hydrożelu poliakrylamidowego (PAA). Porównano brak szkiełka nakrywkowego (A), niepoddane działaniu odczynników szkiełko nakrywkowe (B) oraz szkiełko nakrywkowe pokryte warstwą antyadhezyjną z Pluronic F127 (C). Wydajność przywierania mierzono jako liczbę płatów tętniczych, które przywarły do hydrożelu PAA po usunięciu szkiełka, w stosunku do całkowitej liczby próbek: brak szkiełka (4 z 36), szkiełko niepoddane działaniu odczynników (10 z 36) oraz szkiełko z powłoką antyadhezyjną (9 z 36; D). (E-G) Wpływ rozmiaru niepoddanego działaniu odczynników szkiełka nakrywkowego na przywieranie płata tętniczego do hydrożelu PAA. Porównano niepoddane działaniu odczynników szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm (E) i niepoddane działaniu odczynników szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm (F) w dołku o średnicy 14 mm. Wydajność przywierania mierzono jako liczbę płatów tętniczych przywierających do hydrożelu PAA po usunięciu szkiełka w stosunku do całkowitej liczby próbek: szkiełko 12 mm (10 z 36) i szkiełko 13 mm (52 z 72; G). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Modele wzrostu komórek 3D, 2,5D i 2D; obrazy mikroskopowe pokazujące różnice w morfologii.
Rycina 4: Wymiarowość modelu definiuje organizację podczas wzrostu komórek (d2+). W modelu 3D (lewo) komórki migrują z tkanki, tworząc strukturę pączkowatą, podobnie jak w modelu 2,5D (środek). W układzie 2D (prawo) komórki migrują z tkanki, tworząc monowarstwę. Pasek skali odpowiada 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment pączkowania na żelu poliakryloamidowym; obrazy mikroskopowe A, B; wykres słupkowy C; porównanie sztywności.
Rysunek 5: Początek pączkowania śródbłonka w modelu 2.5D zależy od sztywności podłoża z hydrożelu poliakryloamidowego (d2). (A-B) Arkusz tętniczy pokryty cienką warstwą żelu z kolagenu typu I na miękkim (A; 1 kPa) lub sztywnym (B; 12 kPa) hydrożelu poliakryloamidowym (PAA) w 2. dniu protokołu (1 dzień po dodaniu warstwy żelu z kolagenu typu I). (C) Początek pączkowania mierzono liczbą arkuszy tętniczych, które już wykazywały oznaki wzrostu komórkowego, w stosunku do całkowitej liczby próbek: miękkie (7 z 24) oraz sztywne (3 z 24). Pasek skali reprezentuje 1 mm (A, B) lub 500 µm (A', B'). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Time-lapse migracji komórek pokazujący wektory przemieszczenia; analiza danych z mikroskopii w okresie 4 godzin.
Rysunek 6: Charakterystyka siły trakcyjnej podczas wczesnej angiogenezy kiełkowania. W górnym rzędzie przedstawiono obrazowanie komórek w czasie (0-4 h). Odpowiednie przemieszczenia markerów fluorescencyjnych (0-2 µm) oraz trakcje komórkowe (0-50 Pa) na podłożu z hydrożelu PAA o sztywności 1 kPa przedstawiono odpowiednio w środkowym i dolnym rzędzie. Powiększenia trakcji komórkowych w 0 h, 2 h i 4 h zaznaczono kolorem pomarańczowym. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przygotowanie tkanki i proces angiogenezy u świń z wykorzystaniem pierścieni tętniczych i podłoży kolagenowych.
Rycina 7: Metoda 2.5D modelu angiogenezy pączkującej ex vivo, która umożliwia mechaniczną charakterystykę pączków komórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1 kPa12 kPa
PBS (bufor fosforanowy)435 µL373.7 µL
40% akryloamid50 µL93.8 µL
2% bis-akryloamidu7.5 µL25 µL
Marker fluorescencyjny (ciemnoczerwony)5 µL5 µL
10% APS2.5 µL2.5 µL
TEMED0.25 µL0.25 µL

Tabela 1: Stosunki mieszanin żelu PAA.

wzórObjętość na płytkę 12-dołkową (130 µL)
podłoże ECGVEKG=Vfinalny-Vkol1-VNaOH82.16 µL
Kolagen typu IVkolumna1=(Vkońcowy*Costateczny)/Croztwór zapasowy46 µL
NaOHVNaOH=0,04*Vkolumna11.84 µL

Tabela 2: Objętości mieszaniny żelu kolagenowego typu I z zastosowaniem skrótów objętości (V) i stężenia (C).

Wideo 1: Obrazowanie timelapse formowania się wypustek komórkowych w modelu 2.5D. Komórki obrazowano za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym przez okres 22 godzin w odstępach czasowych wynoszących 17,5 minuty. Wypustki komórkowe formowały się na różnych wysokościach w obrębie warstwy żelu z kolagenu typu I, co zaobserwowano w różnych płaszczyznach ogniskowania. Pasek skali reprezentuje 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Wysoki stopień proliferacji komórek w obrębie pączków komórkowych w modelu 2.5D.Komórki obrazowano za pomocą mikroskopii w kontraście fazowym przez okres 22 h z odstępem czasowym 17,5 minuty. Zarówno komórki prowadzące, jak i podążające proliferują podczas obrazowania time-lapse. Pasek skali odpowiada 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Uzupełniająca Rysunek 1: Fenotyp komórkowy w modelu 2D (d2+) w barwieniu immunofluorescencyjnym. (A) Barwienie immunofluorescencyjne (IF) jądra komórkowego (DAPI), markera komórek śródbłonka (CD31) oraz markera fibroblastów (aktyna mięśni gładkich alfa; α-SMA). (B) Barwienie IF jądra komórkowego (DAPI), markera komórek śródbłonka (CD31) oraz markera komórek mięśni gładkich (kalponin). Pasek skali reprezentuje 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Plik uzupełniający 1: Protokół barwienia immunofluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kiełkująca angiogeneza - tworzenie nowych naczyń krwionośnych - jest złożonym procesem regulowanym zarówno przez mechanizmy molekularne, jak i mechaniczne. Podczas gdy wiele modeli 3D zostało opracowanych w ciągu ostatnich dziesięcioleci w celu zbadania czynników molekularnych (np. sygnalizacji VEGF i Notch) kiełkującej angiogenezy, niewiele wiadomo o mechanice komórkowej ze względu na ograniczenia modelu. Mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) jest dobrze znaną techniką ilościowego określania sił komórkowych w przestrzeni i czasie, w której deformacje podłoża 2D są przekształcane w trakcje komórkowe. Dlatego w tym protokole opisujemy model 2,5D ex vivo, co oznacza, że lokalnie zapewniamy komórkom środowisko 3D, zachowując prostotę modelu 2D, który pozwala na ilościowe określenie sił trakcyjnych podczas angiogenezy kiełkowania (ryc. 1). W tym celu przygotowaliśmy i wysialiśmy arkusz tętnicy świńskiej (śródbłonkiem do dołu; Rysunek 2) na wierzchu hydrożelu poliakryloamidowego (PAA) pokrytego kolagenem typu IV zawierającego markery fluorescencyjne. Po przymocowaniu arkusza tętniczego za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 13 mm (ryc. 3) dodajemy cienką warstwę hydrożelu kolagenu typu I, który umożliwia tworzenie kiełków komórkowych (ryc. 4). Korzystając z tego modelu, pokazujemy, że podczas kiełkowania komórkowego 22,23,24,25 komórki liderowe wywierają siły ciągnące (co zaobserwowano w literaturze 19,20,21,22), ale także, że komórki podążające wywierają siły popychające (ryc. 6). Rozdzielczość pola trakcyjnego uzyskana dzięki naszemu protokołowi pozwala na ilościowe analizy kinematyki i dynamiki komórkowej zarówno w czasie, jak i przestrzeni, które są typowe dla prac wykorzystujących mikroskopię sił trakcyjnych na zgodnych podłożach 37,38,39.

Ponadto wykazujemy wszechstronność tego 2,5-wymiarowego modelu angiogenezy kiełkowania ex vivo poprzez zmianę mechanicznych wskazówek mikrośrodowiska (ryc. 5). Podczas gdy angiogeneza kiełkowania zwykle zachodzi przy fizjologicznej sztywności 1 kPa35 - którą można naśladować za pomocą hydrożelu kolagenu 3D typu I, angiogeneza guza zachodzi w usztywnionym mikrośrodowisku40 - co wykracza poza zakres sztywności konwencjonalnych hydrożeli kolagenu 3D typu I. Sztywność podłoża PAA można łatwo regulować, zmieniając stosunek środków sieciujących w celu uzyskania wyższej sztywności podłoża. Korzystając z tego modelu, ujawniamy, że początek angiogenezy kiełkowania jest zależny od sztywności. Podłoża te nie tylko oferują przestrajalną sztywność, ale także umożliwiają systematyczną modulację różnych innych wskazówek mechanicznych, np. składu i gęstości matrycy. Ponadto model ten pozwala nam badać mechanikę komórkową przy jednoczesnym manipulowaniu regulatorami molekularnymi za pomocą warunkowania pożywki (np. wpływ hamowania na sygnalizację Notch na mechanikę komórkową) w celu zrozumienia mechanobiologicznych mechanizmów kiełkowania angiogenezy. Pokazuje to użyteczność tego 2,5-wymiarowego modelu ex vivo angiogenezy kiełkowania w próbce różnych mikrośrodowisk.

Prezentowany przez nas model wykorzystuje konwencjonalny TFM 2D, który oferuje prostszą analizę, wyższą rozdzielczość przestrzenną i łatwiejszą implementację w porównaniu z TFM 3D (lepkosprężysty), dzięki czemu jest bardziej dostępny i opłacalny26,41. Jednak TFM 3D (lepkosprężysty) zapewnia bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko, wychwytując siły trakcyjne we wszystkich trzech wymiarach i uwzględniając złożone właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej, oferując głębszy wgląd w zachowanie komórek w bardziej realistycznym kontekście 42,43,44,45. Ten efekt wymiarowości również wskazuje na ograniczenie tego modelu 2,5D. Używamy TFM 2D przy założeniu, że komórki migrują na podłożu 2D. Chociaż tak jest w przypadku tego modelu 2,5D, komórki znajdują się w lokalnym środowisku 3D, a zatem przylegają do warstwy żelu kolagenu typu I i wywierają siły w tej warstwie żelu. Założenie, które przyjęliśmy w tej analizie, polega na tym, że warstwa żelu kolagenu typu I nie jest mechanicznie sprzężona (brak przenoszenia siły między tymi dwoma hydrożelami) z interfejsem PAA ze względu na różnicę rzędu wielkości w sztywności matrycy, co minimalizuje wpływ sił komórkowych na warstwę kolagenu typu I. To sprawia, że charakterystyka sił przy użyciu modelu 2,5D ex vivo jest uproszczonym odwzorowaniem sił generowanych przez ogniwa. Ponadto protokół ten wymaga precyzji i jest obszerny i obejmuje kilka etapów, w których próbki mogą zostać utracone, np. (i) trudności z widocznością komórek z powodu nadmiernej tkanki otaczającej arkusz tętniczy (ryc. 2), (ii) jedna na trzy próbki nie przyczepia się do substratu PAA (ryc. 3), (iii) nie wszystkie próbki zainicjują tworzenie kiełków komórkowych (ryc. 5), (iv) kiełki komórkowe nie tworzą się na podłożu PAA oraz (v) nieostre markery fluorescencyjne przy użyciu grubego arkusza tętniczego na hydrożelu PAA o niskiej sztywności. Dlatego zoptymalizowaliśmy tę metodę dla płytki 12-dołkowej, aby zapewnić wiele obszarów zainteresowania do przeprowadzenia mechanicznej analizy angiogenezy kiełkowania.

Podsumowując, przedstawione podejście do uproszczonej charakterystyki komórkowych sił trakcyjnych kiełkowania angiogenezy żywej warstwy tętniczej świni przy użyciu modelu 2,5D (Figura 7) może pomóc w tworzeniu dokładniejszych i trwalszych wglądów w interakcje mechaniczne podczas angiogenezy w natywnym kontekście tkankowym, ułatwiając badanie dynamicznych procesów komórkowych o zmniejszonej złożoności i lepszej odtwarzalności w porównaniu z systemami w pełni 3D. Może to poszerzyć naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób komórki reagują na sygnały mechaniczne w bardziej fizjologicznie istotnym środowisku, przy jednoczesnym zachowaniu analitycznej prostoty metod 2D. Wiedza ta może przyczynić się do postępu w dziedzinie inżynierii tkankowej w celu tworzenia naczyń krwionośnych, ale także znalezienia leków terapeutycznych zapobiegających angiogenezie nowotworów w celu ograniczenia wzrostu guza i zmniejszenia przerzutów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy ludziom z LifeTec za zebranie i transport tętnic szyjnych świń z lokalnej rzeźni; Leonowi Hermansowi, Pimowi van den Bersselaarowi i Adrià Villacrosa Ribas (TU/e, ICMS) za owocne dyskusje na temat procedur eksperymentalnych i analizy charakterystyki mechanicznej. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie w postaci grantów od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (771168), Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (024.003.013), Akademii Fińskiej (307133, 316882, 330411 i 337531) oraz Centrów Doskonałości w Mechanostazie Komórkowej Fundacji Uniwersyteckiej åbo Akademi (CellMech).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% bis-akryloamidBio-Rad1610143
2-merkaptoetanolMerck Life Science60-24-2
3-(trimetoksysililo)metakrylan propyluBind-SilaneSigma-Aldrich440159-100ML
40% akryloamidBio-Rad1610140
Aboslute etanol (do analizy)VWR International1.00983.1000
Etanol absolutny (przemysłowy)VWR International83813.41
Kwas octowy, lodowaty 100%Merck1000562500
Przeciwciało nadsiarczanu amonuAPSBio-Rad7727-54-0
(pierwotne) - Przeciwciało kalponinyABCAMAB46794
(pierwotne) - CD31SerotecMCA1746
przeciwciało (pierwotne) - &alfa;-aktyna mięśni gładkich&alfa;SMA PrzeciwciałoDakoM0851
(wtórne) - kozio-anty-mysie-IgG1Sondy molekularnePrzeciwciało A21121
(wtórne) - kozio-anty-mysie-IgG2a Sondy molekularne Alexa 555Przeciwciało A21137
(wtórne) - koza-anty-królicze IgG Alexa 555Sondy molekularneA21428
AutoklawAstell
Dwuwodny chlorek wapniaCaCl2Calbiochem208291-250GM
Kolagen typu I, ogonCorning354236
Kolagen typu IV, łożysko ludzkie MerckLife ScienceC5533-5MG
Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka PodłożeEKGPromocellC-22111
Pęseta z okrągłą końcówką z powłoką epoksydowąpęseta delikatnaRubis PinzetteE78144-2A
Marker fluorescencyjny, ciemnoczerwonyInvitrogenF8807
Szkiełka nakrywkowe, Ø 13 mm, #1EprediaCB00130RA120MNZ0
Szkiełka nakrywkowe, Ø 13 mm, #1.5EprediaCB00120RAC20MNZ0
Kwas chlorowodorkowy, 25%HClMerck1.100316.1000
Bufor Krebs-HenseleitMikroskop Sigma-AldrichK3753
Mikroskop, Nikon Ti2 EclipseMikroskop Nikon
, oprogramowanieNikon
N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diaminaTEMEDMerck Life Science110-18-9
ButelkaThermo Scientific2187-0016
Igła, 21Gx1"Henke Sass WolfHK4710008025
Surowica normalna, koziaGibco10098792
ChlorowodorekSigma61-25-6
Penicylina/Streptomiocyna (10 000 U/mL)P/SGibco15140163
Petriego, duża (145x20mm)Greiner Bio-one639160
szalka Petriego, mała (60x15mm)Greiner Bio-one628160
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiPBSSigmaP4417
Pluronic F-127Merck Life ScienceP2443-250G
Igła do nakłuwania, ostra zamknięta końcówkanieznana
Skalpel, nr 4Swann-Morton
Wodorowęglan soduNaHCO3VWR International144-55-8
6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian sulfosukcynimidyluSulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Ostrze chirurgiczne, nr 20Swann-Morton
PrześcieradłoPęseta chirurgiczna Foliodrape
PęsetaLettix400024
Triton X-100Lampa UV Merck9036-19-5
Analytik Jena95-0042-13 
płytka studzienkowa, 96-dołkowa, F-dolnapłytka dołkowa Greiner Bio-one655180
, szklane dno 12-dołkowaMatTekP12G-0-14-F
Alexa 488 szczura , oprogramowanie Leica Application Suite X, wersja 3.5.7.23225 Mikroskop Leica Microsystems, mikroskop epifluorescencyjny Leica DMi8 Leica Microsystems NIS-Elements AR Nalgene papaweryny szalka chirurgiczne 2775001 chirurgiczna

Bibliografia

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1, 27-30 (1995).
  3. Kretschmer, M., Rüdiger, D., Zahler, S. Mechanical aspects of angiogenesis. Cancers. 13 (19), 4987(2021).
  4. Bordeleau, F., et al. Matrix stiffening promotes a tumor vasculature phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (3), 492-497 (2017).
  5. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), a006569(2013).
  6. Adams, R. H., Alitalo, K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 464-478 (2007).
  7. Carmeliet, P., De Smet, F., Loges, S., Mazzone, M. Branching morphogenesis and antiangiogenesis candidates: tip cells lead the way. Nat Rev Clin Oncol. 6, 315-326 (2009).
  8. Salam, N., et al. Assessment of migration of human mscs through fibrin hydrogels as a tool for formulation optimisation. Materials. 11 (9), 1781(2018).
  9. Solbu, A. A., et al. Assessing cell migration in hydrogels: An overview of relevant materials and methods. Materials Today Bio. 18, 100537(2023).
  10. Cao, W., Li, X., Zuo, X., Gao, C. Migration of endothelial cells into photo-responsive hydrogels with tunable modulus under the presence of pro-inflammatory macrophages. Regenerat Biomater. 6 (5), 259-267 (2019).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J Exp Path. 85, 233-248 (2004).
  13. Ngo, T. X., et al. In Vitro models for angiogenesis research: A review. Int J Tissue Regenerat. 5, 37-45 (2014).
  14. Tomita, Y., et al. An ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis. J Vis Exp. (162), e61677(2020).
  15. Kapoor, A., Chen, C. G., Iozzo, R. V. A simplified aortic ring assay: A useful ex vivo method to assess biochemical and functional parameters of angiogenesis. Matrix Biol Plus. 6-7, 100025(2020).
  16. Stiffey-Wilusz, J., Boice, J. A., Ronan, J., Fletcher, A. M., Anderson, M. S. An ex vivo angiogenesis assay utilizing commercial porcine carotid artery: Modification of the rat aortic ring assay. Angiogenesis. 4 (1), 3-9 (2001).
  17. Kniazeva, E., Putnam, A. J. Endothelial cell traction and ECM density influence both capillary morphogenesis and maintenance in 3-D. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (1), C179-C187 (2009).
  18. Davidson, C. D., Wang, W. Y., Zaimi, I., Jayco, D. K. P., Baker, B. M. Cell force-mediated matrix reorganization underlies multicellular network assembly. Sc Rep. 9 (1), 12(2019).
  19. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. BioArchitecture. 2 (6), 220-227 (2012).
  20. Kniazeva, E., et al. Quantification of local matrix deformations and mechanical properties during capillary morphogenesis in 3D. Integrat Biol. 4 (4), 431-439 (2012).
  21. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  22. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19 (3), 260-265 (2009).
  23. Yoon, C., et al. Myosin IIA–mediated forces regulate multicellular integrity during vascular sprouting. Mol Biol Cell. 30 (16), 1974-1984 (2019).
  24. Du, Y., et al. Three-dimensional characterization of mechanical interactions between endothelial cells and extracellular matrix during angiogenic sprouting. Sci Rep. 6, 21362(2016).
  25. Vaeyens, M. M., et al. Matrix deformations around angiogenic sprouts correlate to sprout dynamics and suggest pulling activity. Angiogenesis. 23 (3), 315-324 (2020).
  26. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  27. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nat Phys. 5 (6), 426-430 (2009).
  28. Santos-Oliveira, P., et al. The force at the tip - modelling tension and proliferation in sprouting angiogenesis. PLoS Comput Biol. 11 (8), e1004436(2015).
  29. Boreddy, S. R., Sahu, R. P., Srivastava, S. K. Benzyl isothiocyanate suppresses pancreatic tumor angiogenesis and invasion by inhibiting HIF-α/VEGF/Rho-GTPases: Pivotal role of STAT-3. PLoS One. 6 (10), 0025799(2011).
  30. Teng, R. J., Eis, A., Bakhutashvili, I., Arul, N., Konduri, G. G. Increased superoxide production contributes to the impaired angiogenesis of fetal pulmonary arteries with in utero pulmonary hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (1), L184-L195 (2009).
  31. Costa, G., et al. Asymmetric division coordinates collective cell migration in angiogenesis. Nature Cell Biol. 18 (12), 1292-1301 (2016).
  32. Slater, K., Partridge, J., Nandivada, H. Corning tuning the elastic moduli of Corning Matrigel and collagen I 3D matrices by varying the protein concentration. , Corning Incorporated, Life Sciences, MA USA. (2019).
  33. Lee, J., et al. Effect of chain flexibility on cell adhesion: Semi-flexible model-based analysis of cell adhesion to hydrogels. Sci Rep. 9 (1), 2463(2019).
  34. Motte, S., Kaufman, L. J. Strain stiffening in collagen i networks. Biopolymers. 99 (1), 35-46 (2013).
  35. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
  36. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Prot Cell Biol. 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  37. Labernadie, A., et al. A mechanically active heterotypic E-cadherin/N-cadherin adhesion enables fibroblasts to drive cancer cell invasion. Nat Cell Biol. 19 (3), 224-237 (2017).
  38. Bazellières, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
  39. Uroz, M., et al. Traction forces at the cytokinetic ring regulate cell division and polyploidy in the migrating zebrafish epicardium. Nat Mater. 18 (9), 1015-1023 (2019).
  40. Dong, C., Nastaran, Z., Konstantopoulos, K. Biomechanics in oncology. , Springer Nature. Switzerland, AG. (2018).
  41. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  42. Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
  43. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 881-886 (2013).
  44. Steinwachs, J., et al. Three-dimensional force microscopy of cells in biopolymer networks. Nat Meth. 13 (2), 171-176 (2016).
  45. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS One. 6 (3), e17833(2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia si trakcyjnychmodel ex vivot tnica szyjna wimechanika kom rkowasztywno macierzykom rki r db onkahodowla p ata t tniczegoobrazowanie kulek fluorescencyjnychin ynieria tkankowa
Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.