Artykuł metodologiczny

Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek o dużej objętości z zachowaniem zgodności z GMP do badań klinicznych

DOI:

10.3791/67644

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Southwest Hospital/Southwest Eye Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 2Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing, 3Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 4Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) and Key Laboratory of Tumor Immunopathology, 5Army 953 Hospital, Shigatse Branch of Xinqiao Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 6Jinfeng Laboratory, 7Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Army Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC-sEVs) zostały podkreślone jako metoda leczenia bezkomórkowego z minimalnymi skutkami ubocznymi. Badanie to zapewnia protokół łączący hemodializę z ultrawirowaniem, znacznie skracając czas poświęcony na cały proces i zapewniając zgodność ze standardami dobrej praktyki produkcyjnej (GMP).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV) pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC-sEVs) zostały podkreślone jako metoda leczenia bezkomórkowego z minimalnymi skutkami ubocznymi. Natomiast tradycyjne metody ekstrakcji, takie jak ultrawirowanie i chromatografia wykluczająca rozmiar, są ograniczone przez ich czasochłonność, koszt i skalowalność. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, proponujemy metodę łączącą hemodializator i ultrawirowanie. Podejście to wykorzystuje urządzenie do hemodializy z membraną odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa (MWCO), która selektywnie koncentruje sEV, jednocześnie odfiltrowując mnóstwo białek, zwiększając w ten sposób wydajność i czystość sEV. Po tym wstępnym etapie oczyszczania następuje ultrawirowanie w celu dalszego udoskonalenia preparatu sEV. Integracja tych dwóch technologii nie tylko znacznie skróciła czas poświęcony na cały proces, ale także zapewniła zgodność ze standardami dobrej praktyki produkcyjnej (GMP). Metoda ta wykazuje wysoką skuteczność w izolowaniu sEV z dużej objętości próbek, oferując znaczny postęp w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Protokół ten daje nadzieję na przyspieszenie przełożenia terapii opartych na EV na praktykę kliniczną poprzez zapewnienie skalowalnego, opłacalnego i zgodnego z GMP rozwiązania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC-sEVs) to heterogeniczne pęcherzyki wzbogacone wieloma składnikami, takimi jak mRNA, mikro-RNA, cytokiny, lipidy i metabolity1. W ostatnich latach wiele badań podkreśliło ogromny potencjał terapeutyczny MSC-sEVs jako bezkomórkowej metody leczenia o minimalnych skutkach ubocznych2, obiecując w leczeniu spektrum schorzeń, w tym starzenia się, zwyrodnienia tkanek, raka i zaburzeń zapalnych3,4,5,6. Niemniej jednak nadal istnieje poważne wyzwanie związane z wydobyciem sEV na dużą skalę, przy czym tradycyjne metody okazują się albo pracochłonne, czasochłonne, albo ekonomicznie niewykonalne. Co więcej, zapewnienie odtwarzalności ma kluczowe znaczenie dla klinicznego zastosowania i tłumaczenia terapii opartych na EV7. Naukowcy pilnie potrzebują metody oczyszczania, która jest nie tylko prosta i wydajna, ale także zgodna ze standardami dobrej praktyki produkcyjnej (GMP)8.

Konwencjonalne metody oczyszczania, w tym ultrawirowanie, ultrafiltracja, chromatografia wykluczania wielkości, immunopowinowactwo i wytrącanie polimerów, były szeroko stosowane w poprzednich badaniach9. Ogólnie rzecz biorąc, tradycyjne metody izolacji sEV wykazują ograniczenia, takie jak niska wydajność, obniżona czystość i wyzwania związane ze spełnieniem rygorystycznych norm aseptycznych. Co więcej, wcześniejsze badania wykazały potencjał obiecujących technik, takich jak systemy mikroprzepływowe10,11, izolacja magnetyczna bez znaczników12 i izolacja chemii kowalencyjnej13 w celu osiągnięcia wyjątkowej wydajności. Jednak wymóg specjalistycznego sprzętu sprawia, że zastosowanie tych zaawansowanych technik jest wyzwaniem dla większości zespołów badawczych. Podsumowując, skuteczna metoda izolowania sEV klasy GMP od dużej ilości próbek pozostaje krytyczną przeszkodą, ograniczającą postęp wielu zespołów zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych.

Ultrawirowanie jest najczęściej stosowaną metodą izolacji sEV i jest uznawane za złoty standard14,15. Jest to technika, która wykorzystuje różnice w gęstości i wielkości do izolowania sEV. Izolowane sEV są zwykle płukane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu wyeliminowania resztkowych zanieczyszczeń. Następnie, odpowiednia objętość PBS jest zwykle używana do ponownego zaparcia wypłukanych sEV, a różne oczekiwane stężenia sEV mogą być zbierane poprzez kontrolowanie objętości PBS. Ponadto doniesiono, że czystość sEV osocza otrzymanych przez ultrawirowanie wydaje się być lepsza niż czystość sEV w osoczu wyizolowanych metodą chromatografii wykluczającej wielkość (SEC), a sEV otrzymane przez ultrawirowanie mają mniejsze zanieczyszczenia niepęcherzykowymi cząstkami zewnątrzkomórkowymi (NVEP). To również sprawia, że ultrawirowanie jest najczęściej stosowane i trudne do zastąpienia w wielu zabiegach, które wymagają wysokich stężeń sEV. Jednak oprócz jakości i czystości, czynnikiem nie można ignorować również wydajności w przypadku ekstrakcji sEV w dużych ilościach. Do tej pory pojedyncza runda ultrawirowania może obsłużyć objętość próbki do około 600 ml, co oznacza, że trudno jest zaspokoić zapotrzebowanie na ekstrakcję na dużą skalę za pomocą samego ultrawirowania16.

Urządzenie do hemodializy składa się z modułu opartego na membranie, który zawiera tysiące pustych włókien. Krew krąży w tych włóknach w zamkniętej cylindrycznej komorze 17. Składniki krwi mogą selektywnie przechodzić przez te błony w oparciu o ich wielkość cząsteczkową i stężenie jonów. W klinice jest szeroko stosowany jako sztuczna nerka do usuwania produktów przemiany materii i nadmiaru płynów z krwi pacjentów18,19,20. Innymi słowy, hemodializator ma również potencjał do koncentracji próbek o dużej objętości, opierając się na procesie podobnym do filtracji o przepływie stycznym (TFF). W ostatnich wytycznych wydanych przez Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) koncentraty sEV są uważane za odpowiednie do próbek o dużej objętości, takich jak pożywka do hodowli komórkowych. Po dziesięcioleciach rozwoju, hemodializatory zostały szeroko przyjęte w szpitalach, wspierane przez obfitość dojrzałych materiałów eksploatacyjnych i pulę wykwalifikowanych operatorów, co ułatwia utrzymanie sterylności próbki.

To badanie przedstawia metodę oczyszczania sEV opartą na hemodializatorze i ultrawirówce zgodnej z GMP. Tutaj wybieramy dializatory o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO), które, jak wykazano, skutecznie wychwytują sEV i odfiltrowują liczne białka22. Ultrawirowanie stanowi również krok do dalszego oczyszczania. Praca pokazuje, że hemodializator jest równie odpowiedni do stężenia sEV. Protokół ten pozwala naukowcom skutecznie izolować sEV z próbek o dużej objętości. Zarejestrowaliśmy badanie kliniczne w Chińskim Rejestrze Badań Klinicznych (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), które jest nadal w toku i nie zostało jeszcze zakończone. Chociaż dane kliniczne nie są obecnie łatwo dostępne do publikacji, niezawodna, wydajna i zgodna z przepisami metoda wytwarzania sEV, jak podano w tym protokole, jest warunkiem wstępnym do prowadzenia badań przedklinicznych i klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony i przeprowadzony zgodnie z Komisją Etyki Badań Naukowych Szpitala Południowo-Zachodniego.

1. Usuwanie resztek komórkowych z pożywki hodowlanej

UWAGA: Poniższe procedury powinny być stosowane w środowisku zgodnym z GMP, zwłaszcza gdy próbki mogą być bezpośrednio narażone na działanie środowiska.

  1. Biorąc pod uwagę wymóg, że nie zawiera mikrobioty, upewnij się, że filtr i gumowa rurka są sterylizowane w autoklawie w celu skutecznej sterylizacji. Upewnij się, że wszystkie inne materiały eksploatacyjne, które mogą mieć kontakt z podłożem hodowlanym, są sterylne i znajdują się w szczelnie zamkniętym opakowaniu. Wykonaj proces usuwania resztek komórek w komorze z przepływem laminarnym.
  2. Zamontuj membranę filtracyjną 0,45 μm i 0,22 μm do aparatu filtrującego. Podłączyć pompę perystaltyczną (patrz Tabela materiałów) i aparat filtrujący za pomocą gumowej rurki. Umieść membranę 0,45 μm nad membraną 0,22 μm; w przeciwnym razie może to zmniejszyć skuteczność filtracji (Rysunek 1). Zwróć uwagę na rozróżnienie przedniej i tylnej strony membrany mikrofiltracyjnej.
  3. Uruchom pompę perystaltyczną do filtracji. Zasilana przez pompę pożywka bazowa mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCBM) z 5% suplementem (patrz Tabela materiałów) przechodzi przez filtr z jednego końca, a przefiltrowaną pożywkę hodowlaną można uzyskać na drugim końcu filtra, jak pokazano na (Rysunek 1). Zbierz przefiltrowaną pożywkę hodowlaną w worku drenażowym z dwoma kanałami. Zachowaj integralność systemu filtracji, optymalizując prędkość pompy perystaltycznej i wymieniając membranę filtracyjną w razie potrzeby.
  4. Po zakończeniu filtracji zamknij zawór wlotowy na worku drenażowym i dodatkowo uszczelnij go parafilmem (patrz Tabela materiałów). Przejść do następnego kroku lub tymczasowo przechowywać przefiltrowaną pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 4 °C.

2. Zagęszczanie przefiltrowanej pożywki hodowlanej za pomocą hemodializatora

UWAGA: Powstrzymaj się od używania Zmodyfikowanego Podłoża Orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego czerwień fenolową w hodowli komórkowej, ponieważ detektor wycieku krwi w hemodializatorze zostanie aktywowany lub wyłączy detektor wycieku krwi w ustawieniu hemodializatora.

  1. Przygotuj materiały eksploatacyjne.
    1. Przed zatężeniem przygotuj linie krwi, wysokostrumieniowe membrany polisulfonowe MWCO o wysokim strumieniu 100 kDa, dializator krwi, zestaw infuzyjny, roztwór soli fizjologicznej, worek infuzyjny, roztwór jodu i waciki bawełniane (patrz tabela materiałów).
  2. Włącz system i przeprowadź autotest.
    1. Sprawdź podłączenie zasilającego hemodializatora i włącz główne zasilanie.
    2. Poczekaj, aż urządzenie zakończy całą procedurę autodiagnostyki.
  3. Zainstaluj linie krwi i dializator.
    1. Sprawdź daty ważności jednorazowych linii krwi i dializatora krwi, upewniając się o integralności ich zewnętrznego opakowania i sprawdzając, czy linie nie są uszkodzone.
    2. Zamontuj rurkę w tym samym kierunku, w którym przepływ krwi w obwodzie pozaustrojowym, sekwencyjnie zamykając zawory rozgałęzione, aby utworzyć cyrkulację w pętli zamkniętej.
  4. Rozpocznij procedurę płukania.
    1. Za pomocą zestawu infuzyjnego podłączyć roztwór soli fizjologicznej (bez heparyny) z rurki przed pompą do obwodu dializacyjnego. Podłączyć miejsce zbiórki żylnej do worka na zużyte płyny.
      UWAGA: Sól fizjologiczna nie powinna zawierać heparyny ani żadnych innych antykoagulantów.
    2. Podłączyć przewody zasilające/powrotne dializatu do dializatora.
    3. Uruchom hemodializator i ustaw natężenie przepływu na 80-100 ml/min. Usuń całe powietrze z obwodu dializacyjnego i dializatora, aby upewnić się, że cały system rurek jest wypełniony płynem.
    4. Ustaw płaszczyznę płynu w komorze tętniczej i żylnej do około 2/3 napełnienia. Sól fizjologiczna sekwencyjnie przepływa przez linię tętniczą, dializator, linię żylną i worek na odpady.
  5. Rozpocznij stężenie ultrafiltracji.
    1. Po zakończeniu procedury płukania zawiesić worek drenażowy zawierający przefiltrowaną pożywkę hodowlaną na stojaku infuzyjnym, zdezynfekować kanał wyjściowy wacikami nasączonymi jodem i podłączyć kanał wyjściowy worka drenażowego do portu pompy wstępnej za pomocą zestawu infuzyjnego.
    2. Dołącz do portu tętniczego i portu żylnego linii krwi. Ustanowić izolowany obwód dializy ultrafiltracji (ISO-UF, ultrafiltracja bez przepływu dializatu) (Rysunek 1).
    3. Dostosuj docelową objętość ultrafiltracji w maszynie do dializy tak, aby odpowiadała całkowitej objętości płynu znajdującego się w worku drenażowym. Ustaw czas dializy ultrafiltracji na minimalny czas pracy systemu. Po pomyślnym ustawieniu parametrów rozpocznij ultrafiltrację.
      UWAGA: Ze względu na obliczenia systemu hemodializy, czas dializy nie będzie zbyt krótki, ale będzie utrzymywany w bardziej umiarkowanym tempie.
  6. Uzyskać skoncentrowany płyn.
    1. Po osiągnięciu docelowej objętości odwodnienia zamknij zacisk tętniczy i podłącz port żylny do sterylnego worka infuzyjnego.
    2. Otwórz port pompy wstępnej jednorazowych przewodów krwiopochodnych wyposażonych w filtr powietrza. Aktywuj pompę krwi z prędkością około 50 ml/min, umożliwiając ponowne krążenie płynu w liniach krwionośnych z linii tętniczej do linii żylnej. Pobrać cały skoncentrowany płyn, około 158 ml, z obwodu z powrotem do sterylnego worka infuzyjnego.
    3. W późnym etapie zatężania należy zebrać zmarnowany płyn z przewodu powrotnego dializatu. Zastosować kolejne procesy identyczne z tymi, które zastosowano w stężonej pożywce hodowlanej, do próbki zmarnowanego płynu w celu monitorowania wszelkich przypadkowych strat sEV, które mogły wystąpić podczas zagęszczania.
    4. Zamknij wszystkie zawory i wyjmij worek infuzyjny, dializator i wszystkie przewody. Wyłącz zasilanie i zdezynfekuj urządzenie, wycierając je.

3. Oddzielanie sEV za pomocą ultrawirówki

  1. Przenieś skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do probówek ultrawirówek, a następnie zrównoważ je.
  2. Odwirować w ultrawirówce klasy klinicznej (patrz tabela materiałów) przy 110 000 × g przez 70 minut, następnie przemyć osad sterylnym roztworem soli fizjologicznej i kontynuować drugie wirowanie przy 110 000 × g przez kolejne 70 minut.
  3. Zawiesić granulowane sEV w odpowiedniej ilości sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
  4. Przenieś sEVs do sterylnej probówki w celu dalszych testów lub przechowuj je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

4. Charakterystyka otrzymanych sEV

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć otrzymane sEVs (1 μL) PBS (1 ml) (patrz Tabela Materiałów). Dostosuj liczbę sEV widocznych w bieżącym polu widzenia, aby wynosiła od 50 do 200.
    2. Ostrożnie wstrzyknąć rozcieńczoną próbkę do dołka próbki, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    3. Pomiar należy wykonać, gdy liczba cząstek w polu widzenia jest jak największa i stabilna dla wszystkich pozycji. Parametry analizy są następujące: Maksymalny obszar: 1000, Minimalny obszar: 10, Min Jasność: 30, Długość ścieżki: 15, Temperatura: 25 °C, Czułość: 75.
    4. Zmierzyć każdą próbkę co najmniej trzy razy.
  2. Analiza Western blot
    1. Rozcieńczyć roztwór sEVs w PBS. Użyj zestawu do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym (BCA) (patrz tabela materiałów), aby zmierzyć stężenie białka.
    2. Gotować sEV w buforze próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
    3. Przygotować 12% żel do elektroforezy w żelu z dodecylosiarczanem sodu i poliakrylamidem (SDS-PAGE) (patrz tabela materiałów). Zmontuj aparat do elektroforezy żelowej. Załadować równe ilości białka z każdej próbki do studzienek żelowych SDS-PAGE. Ustaw napięcie elektroforezy na 80 V dla koncentracji i 100 V dla separacji.
    4. Aktywować membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) (patrz tabela materiałów) metanolem przez 1 minutę, a następnie zanurzyć membranę PVDF w buforze transferowym przed przystąpieniem do transferu pod napięciem 100 V przez 1 godzinę.
    5. Zanurzyć membranę PVDF w buforze TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20) zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; patrz Tabela Materiałów), a następnie zablokować na 30 minut.
    6. Inkubować błonę PVDF z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Stosowane podstawowe przeciwciała są następujące: ludzki anty-CD63 (rozcieńczenie 1:1000), ludzki anty-CD9 (rozcieńczenie 1:1000) i ludzki anty-HSP70 (rozcieńczenie 1:1000) (patrz tabela materiałów).
    7. Następnego dnia przemyć membranę PVDF roztworem TBST pięć razy przez 5 minut każdy, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:10000) (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
    8. Po pięciokrotnym przemyciu TBST użyj odczynnika do wykrywania chemiluminescencji do obrazowania w systemie chemiluminescencyjnym.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
    1. Dodać kroplę próbki rozcieńczoną 20 μl PBS do bibuły woskowanej. Następnie umieść miedzianą siatkę (patrz Tabela materiałów) na kropli, tak aby kropla próbki mogła przykryć miedzianą siatkę i pozostaw ją w temperaturze RT na 20 minut.
    2. Nadmiar płynu wchłonąć bibułą filtracyjną. Następnie utrwal próbki w 20 μl roztworu 2% paraformaldehydu, 2% aldehydu glutarowego i 0,05 M roztworu fosforanu na 2 minuty.
    3. Przepłukać kratkę miedzianą trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną, a następnie zabarwić 20 μl 2% kwasu fosfowolframowego (PTA) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    4. Wchłonąć nadmiarową ciecz za pomocą bibuły filtracyjnej. Wysuszyć siatki przez noc przed analizą za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Zalecane ustawienia dla TEM są następujące: Ekspozycja: 1.0 s, Napięcie HT 100.00 kV, Prąd wiązki: 50 μA, Rozmiar plamki: 1, Tryb: TEM. Ustawienia te mogą ulec zmianie zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Spis materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka morfologiczna sEVs
W końcowym etapie zagęszczania zużyty płyn został również zebrany zgodnie z opisem. Zagęszczoną pożywkę i zmarnowany płyn poddano odpowiednio ultrawirowaniu. Zebraliśmy dane o wytrąceniach do analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Zgodnie z przewidywaniami, znaczną liczbę nanowączek w kształcie miseczki zaobserwowano w grupie skoncentrowanych pożywek (Rysunek 2A,B). Jednak typowe cz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody izolacji sEV obejmują ultrawirowanie różnicowe, chromatografię wykluczania wielkości i wytrącanie PEG, z których każda ma swoje zalety i wady. Podczas gdy połączenie tych różnych technik może zwiększyć wydajność lub czystość sEV, dodatkowe kroki często stwarzają więcej możliwości zanieczyszczenia próbki. Na rynku pojawiły się zintegrowane systemy, które twierdzą, że masowo wydobywają sEV i przestrzegają standardów GMP21. Jednak ich powszechne przyjęcie stanowi poważne wyzwanie ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze z National Science Foundation of China (822101167, do BB) i Natural Science Foundation of Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0020 do BB), Chongqing PhD "Through Train" Scientific Research Project of China (CSTB2022BSXM-JCX0031 do BB) oraz National Science Foundation of China (82271132 do YL). Jesteśmy wdzięczni za pomoc Zakładowi Nefrologii, Pierwszemu szpitalowi afiliowanemu, Trzeciemu Wojskowemu Uniwersytetowi Medycznemu (Wojskowemu Uniwersytetowi Medycznemu) oraz Instytutowi Patologii i Południowo-Zachodniemu Centrum Onkologii, Szpitalowi Południowo-Zachodniemu, Trzeciemu Wojskowemu Uniwersytetowi Medycznemu (Wojskowemu Uniwersytetowi Medycznemu) za sprzęt i wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 rozcieńczenie
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 rozcieńczenie
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-HSP70A-11:1000 rozcieńczenie
Zestaw do oznaczania białek kwasu bicunchoninowegoBeyotimeP0012
Linie krwiFresenius Medical PielęgnacjaAP16641
Albumina surowicy bydlęcej 5%Solarbio9048-46-8
Suplement do hodowli komórkowychHeliosHPCPLCGL055% (v/v) w pożywkach do hodowli komórkowych
Siatka miedzianaPrecyzyjnaRGRS  GP-SMPG-1
DializatorHelixoneFX8100 kDa MWCO
Worek drenażowyCZRUIDEYLD-01
Koza  Anty-Królik  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 rozcieńczenie
Koza  Anty-Królik  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 rozcieńczenie
Koza  Anty-Królik  HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 rozcieńczenie
Mezenchymalne podłoże bazowe komórek macierzystych (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Membrana mikrofiltracyjnashanghaixingyaWKLM-50-100,45 μ m oraz 0,22 μ m 
ParafilmFisher Scientific 1337416
Pompa perystaltycznaLongerPumpYZ1515x
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaSolarbioP1022-500ml
Membrana PVDF Immun-BlotBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Zestaw do szybkiego przygotowania żeluBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Bufor do ładowania próbekBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
Bufor TBSTSolarbioT1081
Probówki ultrawirówkowe 38,5 mlBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP System obrazowaniaBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Analiza śledzenia nanocząstekZetaViewPMX120Do pomiaru wielkości cząstek
i stężenia cząstek
Transmisyjna mikroskopia elektronowaJEOLJEM-1400PLUSZalecane ustawienia? Ekspozycja: 1,0 s, HT Voltafe 100,00 kV, Prąd wiązki: 50 μ A, Rozmiar plamki: 1, Tryb: TEM.
UltrawirówkaBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti Rotor wahliwy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17(2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199(2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605(2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179(2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522(2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871(2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907(2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237(2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296(2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128(2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932(2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892(2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hemodialyzer IsolationUltracentrifugationSize ExclusionEV PurificationCell Free Therapy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły