Ten protokół, przeznaczony dla początkujących użytkowników tkanek ucha wewnętrznego myszy, szczegółowo opisuje etapy przetwarzania uszu wewnętrznego myszy na różnych etapach rozwoju w celu barwienia immunologicznego sekcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół szczegółowo opisuje ogólne metody histologiczne przygotowania próbek ucha wewnętrznego od embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy. Celem tego protokołu jest zapewnienie prostej i ustandaryzowanej metody przetwarzania tkanek ucha wewnętrznego dla badaczy, być może nowych w tej dziedzinie, zainteresowanych pracą ze ślimakiem myszy. Zawarte są tutaj protokoły preparacji, utrwalania, osadzania, kriosekcji i barwienia immunologicznego. Immunologiczne barwienie wycinkowe jest jedną z najlepszych metod badania pojedynczych komórek w kontekście całego ślimaka.
Kluczowe kroki obejmują wypreparowanie ucha wewnętrznego z dala od czaszki, naprawienie tkanki za pomocą 4% paraformaldehydu, zatopienie za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia, kriosekcję i barwienie immunologiczne przeciwciałami skierowanymi przeciwko określonym białkom wyrażanym przez ślimak.
W naszych metodach uwzględniono specjalne uwagi dotyczące ślimaka, biorąc pod uwagę jego
kształt i struktura. Potrzebne są dość dobre umiejętności koncentracji i sekcji, ponieważ uszkodzenie tkanek może wpływać na jakość barwienia immunologicznego i spójność między próbkami. Jednak dzięki opisanym przez nas procedurom większość użytkowników można przeszkolić w ciągu kilku tygodni, aby poczynić piękne przygotowania. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi cenny sposób promowania badań mających na celu zrozumienie rozwoju, funkcji i chorób słuchowych w modelach mysich.
Wprowadzenie
Zrozumienie rozwoju i funkcji słuchu jest kluczowe dla scharakteryzowania i leczenia różnych form ubytku słuchu. Czynników ryzyka utraty słuchu jest wiele i obejmują cukrzycę1,2, nadciśnienie3,4,5, choroby autoimmunologiczne6,7, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych8,9 oraz kilka zaburzeń neurodegeneracyjnych10,11,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Georgetown. Wszystkie myszy w tym badaniu były utrzymywane zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown (protokół #1147). W pierwszym tygodniu po urodzeniu, ponieważ skroniowe struktury kostne nie są w pełni rozwinięte, odwapnienie nie jest wymagane. Jednak ślimaki od myszy w wieku P6 lat i starszych wymagają odwapnienia i innej metody sekcji. W naszym protokole użyto samców i samic myszy NCI Cr: NIH(S) (NIH Swiss) oraz E16.5, P0 i P30. Dla każdej sekcji podajemy w nawiasach, ile czasu ma zająć....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiamy przykłady z naszego laboratorium obrazujące wierzchołek oraz podstawowy zwój ślimaka mysiego w 16,5 dniu embrionalnym (E16.5), a także zwój podstawowy w 0. dniu postnatalnym (P0) i 30. dniu postnatalnym (P30). Próbki te zostały poddane sekcjonowaniu i immunohistochemii z wykorzystaniem markerów dla komórek rzęsistych (Myo7A i Myo6), neuronów zwoju spiralnego (SGNs; Tuj1), glejow i komórek podporowych (Sox2) oraz Pleksyny-B1, która znakuje błonę podstawną wokół przewodu ślimaka i SGNs. Przekroje poprzeczne ś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka kluczowych kroków do udanej kriosekcji i barwienia immunologicznego. Niezbędne jest prawidłowe utrwalenie tkanki ślimaka, a także czas trwania utrwalenia, który może się różnić w zależności od przeciwciała. Podczas gdy większość przeciwciał działa lepiej przy krótszym czasie wiązania, takim jak 45 minut w PFA, niektóre docelowe epitopy mogą tolerować fiksację przez noc. Z naszego doświadczenia wynika, że 45-minutowa fiksacja zapewnia odpowiednią konserwację i jest kompatybilna z większością przeciwciał pie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
M.A.D. i T.M.C. były wspierane przez granty NIH 5R01DC016595-07 (dla T.M.C.) i 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Przykładowe mikrofotografie na rysunku 1A-H zostały wygenerowane przez dr Kaidi Zhang.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BP151-500 | |
| PBS | Corning, Inc. | 46-013-CM | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Sp. z o.o. | 60-00-4 | |
| Sacharoza | VWR International, Inc. | 97061-432 | |
| Azydek sodu | Amresco, Inc. | 0639-250G | |
| Paraformaldehydowa | mikroskopia elektronowa Nauki | 15714 | |
| Etanol | Decon labs, Inc. | v1001 | |
| Dimetylobutan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 19387-AP | |
| Środek do pomiaru optymalnej temperatury cięcia (OCT) | VWR International, Inc. | 25608-930 | |
| Specjalistyczne wyposażenie | |||
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 14-071-459 | |
| Kleszcze preparacyjne | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72700-DZ | |
| Długopis z hydrofobową barierą peroksydazy-antyperoksydazy (PAP) | Vector Laboratories, Inc. | H-4000 | |
| Carl Zeiss Microscopy, LLC. | Mikropipeta LSM 880 | ||
| P20 | Gilson, Inc. | ||
| Nożyczki preparacyjne | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08-951-20 | |
| Szalka Sylgarda | Mikroskopia elektronowa Sciences | 24236-10 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5424R | |
| Materiały montażowe | |||
| Fluoromount | Mikroskopia elektronowa Sciences | 17984-25 | |
| Szkiełka Superfrost plus | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1255015 | |
| Immunostaining Relings | |||
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch, Inc. | 017-000-121 | |
| Odłamki FAB przeciw myszy | Jackson ImmunoResearch, Inc. | 715-007-003 | |
| BlokHen | Aves labs, Inc. | BH-1001 | |
| Tuj1 (beta-III-tubulina) mysie przeciwciało monoklonalne | Biolegend, Inc. | MMS-435P | |
| Kozie przeciwciało poliklonalne Sox2 | R& D Systems, Inc. | AF2018 | |
| Myo6 królicze przeciwciało poliklonalne | Proteus Biosciences | 25– 6791 | |
| Królicze przeciwciało poliklonalne Myo7A | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PA1-936 | |
| Przeciwciało poliklonalne kozy Plexin-B1 | R& D Systems, Inc. | AF3749 | |
| Przeciwciała drugorzędowe (wytwarzane u osła; Alexa-488, Cy3, Cy5) | Jackson ImmunoResearch, Inc. | zobacz katalog |
Bibliografia
- Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
- Baiduc, R. R., Helzner, E. P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
