Artykuł metodologiczny

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

DOI:

10.3791/67648

⸱

31 stycznia 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuco jest stale narażone na patogeny i inne szkodliwe bodźce środowiskowe, co czyni je podatnym na uszkodzenia, dysfunkcje i rozwój chorób. Badania wykorzystujące mysie modele infekcji dróg oddechowych, alergii, zwłóknienia i raka miały kluczowe znaczenie dla ujawnienia mechanizmów progresji choroby i zidentyfikowania celów terapeutycznych. Jednak większość badań skoncentrowanych na płucach myszy priorytetowo traktuje izolację komórek odpornościowych lub komórek nabłonkowych, a nie obu populacji jednocześnie. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania kompleksowej zawiesiny pojedynczej komórki zarówno populacji immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, nadającej się do cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Populacje te obejmują komórki nabłonkowe, komórki śródbłonka, fibroblasty i różne podzbiory komórek szpikowych. Protokół ten pociąga za sobą płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, a następnie napompowanie płuc za pomocą dypazy. Płuca są następnie trawione w mieszaninie liberazy. Ta metoda przetwarzania uwalnia wiele różnych typów komórek i skutkuje zawiesiną pojedynczej komórki, która nie wymaga ręcznej dysocjacji od filtra, sprzyjając przeżyciu komórek i uzyskując dużą liczbę żywych komórek do dalszych analiz. W tym protokole definiujemy również schematy bramkowania dla podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych zarówno w płucach nieleczonych, jak i zakażonych grypą. Jednoczesna izolacja żywych komórek immunologicznych i nieimmunologicznych jest kluczem do badania przesłuchów międzykomórkowych i głębszego zrozumienia biologii płuc w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuco składa się z dróg oddechowych, pęcherzyków płucnych i śródmiąższu. Komórki immunologiczne i nieimmunologiczne znajdują się w tych przedziałach, przyczyniając się zarówno do homeostatycznej funkcji płuc (wymiany gazowej), jak i obrony gospodarza przed zniewagami środowiskowymi, takimi jak infekcje wirusowe. Duże i małe drogi oddechowe, czyli oskrzela i oskrzeliki, są wyściełane komórkami nabłonkowymi. Dominującymi komórkami nabłonkowymi w tych regionach są komórki maczugowe i rzęskowe, które są odpowiedzialne za wydzielanie cząsteczek ochronnych i ułatwianie klirensu śluzowo-rzęskowego1. Pęcherzyki płucne są najbardziej dystalnymi strukturami w płucach, wyściełanymi dwoma typami komórek nabłonkowych, komórkami pęcherzyków płucnych typu I (ATI) i komórkami pęcherzyków płucnych typu II (ATII). ATI są odpowiedzialne za wymianę gazową, a ATII wydzielają i poddają recyklingowi środki powierzchniowo czynne, aby zapewnić odpowiednie napięcie powierzchniowe2,3. ATII są samoodnawiające się i mogą również różnicować się w ATI, co jest szczególnie istotne po uszkodzeniu płuc4. Dodatkowo, ATII zapewniają wspierającą niszę dla głównego typu komórek odpornościowych zasiedlającego niszę pęcherzykową, makrofagów pęcherzykowych (AMs)5,6. Poza nabłonkiem fibroblasty, komórki śródbłonka i makrofagi śródmiąższowe (IM) (które mogą być związane zarówno z nerwami, jak i naczyniami) tworzą śródmiąższ7,8,9,10. W odpowiedzi na infekcję i uraz liczne komórki płuc obumierają, a komórki odpornościowe, w tym monocyty i neutrofile, infiltrują do tkanki11,12. Monocyty naciekające płuca różnicują się w makrofagi i mogą przyczyniać się do długoterminowego rozwoju kompartmentu makrofagów13.

Obecne metody przygotowania zawiesin jednokomórkowych z płuc myszy są zazwyczaj oparte na kolagenazie i wymagają fizycznej dysocjacji tkanki14. Może to skutkować małą liczbą żywotnych populacji komórek nieodpornych. Niektóre protokoły izolacji komórek nabłonkowych są oparte na dyspazie i dają wyższy odsetek żywych komórek nabłonkowych; Jednak protokoły te na ogół nie badają wydajności i żywotności komórek odpornościowych15,16,17. Cytometria przepływowa jest powszechną metodą stosowaną do rozróżniania populacji komórek w strawionej tkance. Na początku badania bramkowanie metodą cytometrii przepływowej dla AM, IM, monocytów i neutrofili jest wyraźnie zaznaczone. Jednak podczas stanu zapalnego proces bramkowania staje się zmienny i trudny do interpretacji ze względu na kontinuum ekspresji markerów powierzchniowych naciekających monocytów różnicujących się w makrofagi. W związku z tym przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przedstawia również strategie bramkowania w celu identyfikacji interesujących populacji komórek szpikowych po zakażeniu.

Solidna dysocjacja komórek nabłonka płuc i komórek szpikowych jest niezbędna do rozpoznania ich funkcji homeostatycznych i zapalnych. Metoda równoległego izolowania tych przedziałów komórkowych umożliwi dalsze analizy kluczowych typów komórek, które zarówno utrzymują zdrowie, jak i napędzają chorobę. Schematyczny przegląd przepływu pracy tego protokołu można znaleźć w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Harvard Medical School (numery grantów: R35GM150816 i P30DK043351). Do eksperymentów wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 8-12 tygodni. Ten protokół jest również odpowiedni dla samców myszy. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Rozmrozić niezbędne enzymy na lodzie, w tym dyspazę, liberazę i DNAzę.
  2. Przygotuj inne niezbędne odczynniki. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 5 ml 2 mM EDTA w DPBS i wyposaż ją w igłę 27 G. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml DPBS i podłącz cewnik.

2. Zbieranie płuc

  1. Rozpocznij eutanazję myszy od wstrzyknięcia dootrzewnowego mieszaniny 400-500 mg/kg i 25-100 mg/kg ketaminy/ksylazyny (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Kontynuuj sekcję, gdy mysz przestanie reagować na uszczypnięcie poduszki stopy (~5 min).
    UWAGA: Do eutanazji stosuje się mieszaninę ketaminy i ksylazyny zamiast dwutlenku węgla, aby zapobiec krwotokowi wywołanemu uduszeniem i infiltracji komórek odpornościowych, która może zakłócić wyniki. Krok 2.3 służy jako drugorzędna fizyczna metoda eutanazji.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem. Wypreparuj mysz za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy #7. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej za pomocą nożyczek i przetnij bocznie otrzewną.
    1. Wykonaj małe nacięcie w membranie, aby uwolnić podciśnienie. Wytnij przeponę i dolną klatkę piersiową z jamy ciała, aby odsłonić płuca i serce.
  3. Wykonać perfuzję płuc za pomocą 5 ml 2 mM EDTA w DPBS w strzykawce o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 27 G. Perfuzja odbywa się poprzez wejście igły do podstawy serca, skierowaną z lewej komory do prawej komory i powolne dozowanie płynu ze strzykawki18.
    UWAGA: Perfuzja powinna być wykonywana powoli, aby zapobiec pęknięciu układu krwionośnego.
  4. Otwórz klatkę piersiową na mostku, odcinając boki klatki piersiowej, a następnie przetnij pionowo mostek, aby odsłonić tchawicę19. Odetnij jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy #7 bez nakłuwania tchawicy lub płuc.
  5. Owiń tchawicę szwem (rozmiar 2-0) tak, jakby chciał go związać, ale bez zaciskania. Odciąć tchawicę z boku i wprowadzić cewnik. Szczelnie zamocuj szew wokół cewnika, mocno naciągając szew. Nie należy wprowadzać cewnika na więcej niż 1 cm do płuc.
  6. Napompuj płuca 1 ml DPBS. Wyciągnąć DPBS, powoli odciągając strzykawkę. Ponownie napompuj płuca tym samym DPBS i ponownie odciągnij strzykawkę, aby pobrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF).
  7. Odłączyć strzykawkę od cewnika, pozostawiając cewnik włożony. Dozować BALF do probówki do mikrowirówki.
  8. Napełnij tę samą strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml dypazy i ponownie podłącz do cewnika. Dozować strzykawkę, aby napełnić płuca za pomocą dipozy. Podczas wyjmowania cewnika zaciśnij szew wokół tchawicy, aby zapobiec wyciekowi dypasy.
  9. Przeciąć tchawicę bocznie. Usuń płuca z jamy ciała, przecinając tkankę łączną wzdłuż tylnej części klatki piersiowej, używając kleszczy do pociągnięcia płuc i tchawicy do góry.
  10. Usuń serce z płuc. Umieść płuca w 5 ml DPBS na lodzie.
  11. Na tym etapie wziąć oddzielony BALF i wirować w dół przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant może być podany i przechowywany w zależności od potrzeb. Powinna być widoczna osadka komórkowa, którą można zawiesić w 100 μl RPMI.
    UWAGA: Na przystąpienie do trawienia można poczekać do 2 godzin, co pozwala na zebranie wielu myszy jednocześnie.

3. Trawienie płuc

  1. Przygotuj mieszankę do trawienia. Dodać 83 μg/ml liberazy (50 μl roztworu podstawowego) i 100 μg/ml DNAzy (15 μl roztworu podstawowego) w 3 ml RPMI na płuco.
  2. Rozetnij pięć płatów płuc i odrzuć tkankę łączną19,20. Posiekaj płuco nożyczkami przez 1 minutę na szklanym szkiełku.
  3. Przenieść posiekane płuco do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą nożyczek do preparowania. Dodać osad komórkowy odzyskany z BALF i ponownie zawieszony w RPMI do probówki wirówkowej. Dodać 3 ml mieszanki trawiącej do probówki zawierającej próbkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
  4. Pipetować mieszaninę trawienia płuc w górę i w dół 2-3 razy. Umieścić w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min z rurkami wytrawiającymi umieszczonymi pod kątem 45 stopni na 40 min.

4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

  1. Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 50 ml z wytrząsarki orbitalnej i umieść je na lodzie. Pipetować mieszankę trawienia płuc w górę iw dół 5-6 razy. Przefiltruj przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj pozostałe komórki przez filtr i zneutralizuj enzymy za pomocą 10 ml 5% FBS w RPMI.
  2. Wirować przez 5 min w 4 °C przy 600 x g. Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Zawiesić w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek (RBC). Dodaj 9 ml PBS i pipetuj w górę iw dół.
  3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 600 x g. Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Zawiesić w 1 ml buforu FACS (1% FBS w PBS) i przefiltrować przez siatkę 64 μm do probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety p1000.

5. Cytometria przepływowa i dalsze analizy

  1. Jeśli wykonujesz cytometrię przepływową lub sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją na 96-dołkowej płytce, wybarwij około 1-2 miliony komórek na dołek lub 8% frakcji zawiesiny płuc.
  2. Zakręć komórkami w dół. Wszystkie wirowania w 96-dołkowej płytce powinny być wykonywane przez 2,5 minuty (4 °C) w temperaturze 600 x g. Strząsnąć supernatant i przemyć komórki jeden raz, ponownie zawieszając w 200 μl DPBS. Obróć w dół i przesuń.
  3. Jeśli komórki mają być barwione do analizy cytometrii przepływowej, należy postępować zgodnie z następującą procedurą barwienia.
    1. Ponownie zawiesić komórki w żywym/martwym barwniku Zombie (1:150) i bloku Fc (1:250) w 25 μl DPBS na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    2. Przygotować mieszaninę do barwienia przeciwciał w stężeniu 2x w buforze FACS.
      UWAGA: Mieszanina barwiąca powinna zawierać wszystkie markery w panelu szpikowym (Tabela 1) lub panelu nabłonkowym (Tabela 2) w ich wskazanych stężeniach.
    3. Dodać 25 μl mieszanki barwiącej do 25 μl zawiesiny płucnej w płytce i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Całkowita objętość barwienia powinna teraz wynosić 50 μl, a przeciwciała pierwszorzędowe powinny być na poziomie końcowego stężenia 1x barwienia.
    4. Dodać 150 μl buforu FACS, wirować przez 2,5 minuty w temperaturze 4 °C przy 600 x g i strzepać supernatant. Przemyć dwukrotnie w 200 μl buforu FACS.
    5. Jeśli wymagane jest barwienie wewnątrzkomórkowe, przymocuj komórki za pomocą wewnątrzkomórkowego zestawu do utrwalania. Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, komórki można utrwalić na 20 minut w 4% PFA w DPBS.
    6. Utrwalacz zmyć trzykrotnie 200 μl buforu FACS. Próbki mogą być przechowywane w stanie zawieszonym w 200 μl buforu FACS w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2-3 dni. Przed uruchomieniem próbek można dodać kulki zliczające w celu ilościowego określenia liczby komórek.
  4. Jeśli komórki mają zostać posortowane, postępuj zgodnie z następującą procedurą barwienia.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 1x barwiącej mieszance przeciwciał z blokiem Fc (1:250). Inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności.
    2. Dodać 150 μl buforu FACS, wirować przez 2,5 minuty w temperaturze 4 °C przy 600 x g i strzepać supernatant. Przemyć trzykrotnie 200 μl buforu FACS i ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS przed sortowaniem.
      UWAGA: Zaleca się dodanie do komórek barwnika żywotności, takiego jak DAPI, przed sortowaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne podsumowanie zaowocuje około 20-25 milionami komórek o żywotności 90%-95%. Jeśli około 25 000 kulek do liczenia zostanie dodanych do 8% frakcji płuc, kulki powinny zagrozić 1%-3% zebranych zdarzeń. Po bramkowaniu na singletach około 90%-95% komórek powinno być ujemnych pod względem Zombie Aqua (wskazujących na żywotność) (Rysunek 2A, Rysunek 3A).

Spośród komórek CD45+, komórki CD64+F4/80+ są zdef...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa trawienie płuc myszy, które izoluje około 20-25 milionów komórek na mysz z 90%-95% żywotnością. Dodatkowo pozwala na pobieranie BALF do dalszej analizy. Otrzymana zawiesina komórek jest kompatybilna z wieloma technikami laboratoryjnymi, w tym cytometrią przepływową i sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją w celu wyizolowania komórek do sekwencjonowania lub hodowli komórek. Krótko, po perfuzji, zbiera się BALF, a płuca są napełniane dypazą. Płuca są następnie siekane i trawione w roztworze libe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institutes of Health (R35GM150816 i P30DK043351), Fundacji Charlesa H. Hooda i Harvard Stem Cell Institute. Dziękujemy Alexandrowi Mannowi i wszystkim pozostałym członkom laboratorium Franklina za ich pomoc i rady w projektowaniu i udoskonalaniu schematów bramkowania cytometrii przepływowej i analiz. Dziękujemy również Immunology Flow Cytometry Core w Harvard Medical School. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono przy użyciu FlowJo. Schematy rysunkowe zostały stworzone przy użyciu oprogramowania BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml z końcówką ślizgowąVWRBD309659
probówka do mikrowirówek 1,7 mlDOT ScientificRN1700-GMT
Pipety 10 ml (jednorazowe)Fisher Scientific12-567-603
Strzykawka 10 ml z końcówką BD Luer-LokVWR75846-756
123 sztuk eKoraliki Liczenie koralikówThermo Scientific01-1234-42
Pipeta 12-kanałowa (30-300UL)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydVWR100503-917
Igła 23 G ze zwykłym skosemVWR305194
27 G ze zwykłym skosemVWRBD305109
5 ml (jednorazowe)Thermo Fisher Scientific170373
50 mlOlympus 28-108
96-dołkowa okrągła płyta dolnaCorning3797
ACK bufor lizującyGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anty-mysie CD11cBioLegend117311
Anty-F4/80 Szczurze przeciwciało monoklonalne (PE (fikoerytryna)/Cy7)BioLegend123114
APC anty-mysie CD64 (Fcγ RI)BioLegend139306
APC/Cyjanine7 anty-mysie CD45BioLegend103115
BD Insyte Osłonowane osłonione cewniki dożylneVWR381423
Brilliant Violet 421 przeciw myszom I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 przeciw myszy/człowiekowi CD11bBioLegend101235
Brilliant Myszy przeciw myszom Violet 605 Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 przeciw myszom CD45BioLegend103147
C57BL/6J Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Przeciwciało monoklonalne (APA5), PE-cyjanina7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Przeciwciało monoklonalne (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Sitka komórkoweCorning352350
WirówkaEppenodorf5910R
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (DNaza)Milipore SigmaDN25-100MGRozpuszczona w stężeniu 20 mg/ml w DPBS w postaci roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °; C
DispaseVWR76176-668Rozmrożony raz i przechowywany jako 1 ml porcji w temperaturze -20 & deg; C
Kleszcze preparacyjne (Dumont #7)Narzędzia do nauki11297-00
Nożyczki preparacyjneNarzędzia do nauki o naprawie14060-09
DPBSThermo Fisher Zestaw
LifeTechnologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EtanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Rozmrożony raz i inaktywowany termicznie przed długotrwałym przechowywaniem w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni; C
FITC Anti-Mouse CD31 PrzeciwciałoBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Szkiełkapodstawowe Fisher Scientific12-552-3
zbiornik z podziałkąUSA Scientific 1930-2235
Wiadro na lódCorning432128
Wstrzyknięcie hydrocholozydu ketaminy (100 mg / ml)Dechra Mieszaninaeutanazji ketaminy i ksylazyny może być przechowywana w 30 mg / ml chlorowodorku ketaminy i 4,5 mg / ml ksylazyny w sterylnych DPBS przez okres do jednego miesiąca.
LiberaseMillipore Sigma5401119001rozpuszczony w stężeniu 5 mg/ml w DPBS w postaci roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °; C
Pokrywki do płytek 96-dołkowychFisher Scientific07-201-731
Wytrząsarka do inkubatora orbitalnegoBarnstead Lab-LineSHKE4000
pipeta p1000Eppenodorf3123000063
p1000 końcówkiUSA Scientific 1122-1830
pipeta p200końcówki Eppenodorf3123000055
p200USA Scientific 1110-1700
PE anty-mysie CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
Przeciwciało anty-mysie PerCP/Cyjanina5,5BioLegend123614
PerCP/Cyjanina5,5 anty-mysie Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Oczyszczony anty-mysz CD16/32 BioLegend101302Określany jako "blok Fc" w tekście
Butelka ze spryskiwaczemVWR23609-182
Szew (rozmiar 2-0)VWR100190-026
PodkładyVWR56617-014
Xysed (ksylazyna 100mg/mL)PivetalZobacz nuty hydrocholorydu ketaminy powyżej. 
Zestaw do naprawy Zombie Aqua BioLegend423102
Igła Pipety Probówki wirówkowe pięknej do mocowania eBioscience 14190250

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki p uc myszyizolacja kom rek mieloidalnychizolacja kom rek nab onkowychzawiesina pojedynczych kom rekcytometria przep ywowasortowanie kom rekp ukanie oskrzelowo p cherzykowetrawienie p ucizolacja kom rek odporno ciowychbramkowanie populacji kom rek

Powiązane artykuły