Method Article

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

DOI:

10.3791/67656

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie ekspresji genów jest niezbędne do rozszyfrowania funkcji komórkowych. Jednak metody analizy ekspresji wielu genów in situ w danej tkance pozostają ograniczone. Opisany tutaj protokół EASI-FISH został przystosowany do wykrywania ekspresji kilkudziesięciu genów w nienaruszonym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) dorosłego dorosłego Drosophila przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Protokół ten obejmuje nową formułę żelu, która zwiększa odporność żelu, umożliwiając wiele rund hybrydyzacji i umożliwiając osadzenie wielu mózgów w jednym żelu. To ulepszenie zwiększa przepustowość, ułatwia optymalne porównanie warunków eksperymentalnych i zmniejsza koszty odczynników. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu systemu GAL4-UAS do jednoczesnego wykrywania białka zielonej fluorescencji (GFP), ekspresja genów może być wizualizowana w określonych typach komórek neuronalnych lub glejowych. Warto zauważyć, że wysoka rozdzielczość uzyskana dzięki mikroskopii ekspansywnej, w połączeniu z czułością metody, pozwala na wykrycie pojedynczych transkryptów RNA. Takie podejście skutecznie integruje wysoką jakość obrazu z wysoką przepustowością, co czyni go potężnym narzędziem do badania ekspresji genów w nienaruszonym mózgu muchy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH został po raz pierwszy użyty u Drosophila ponad 40 lat temu do mapowania genów na chromosomach politenowych1,2. Obecnie jednocząsteczkowe FISH jest złotym standardem w przestrzennej lokalizacji i ilościowym określaniu transkryptów mRNA w nienaruszonej tkance3. Jednak ze względu na problemy z integralnością próbki i utratą RNA, techniki FISH z pojedynczą cząsteczką w całym montażu u Drosophila zostały ograniczone tylko do kilku genów, które można analizować w tej samej próbce4,5,6,7. Podczas gdy niedawny rozwój kodów kreskowych (np. 8,9,10) zwiększa liczbę transkryptów, które można wykryć do kilkuset nawet w grubej tkance11,12, ustanowienie takich protokołów wymaga znacznych inwestycji zasobów, co może stanowić przeszkodę w wdrożeniu. Rzeczywiście, wiele nowatorskich technik transkryptomicznej przestrzeni nigdy nie rozprzestrzeniło się poza swoje instytucje pochodzenia13. W związku z tym prosta i stosunkowo niedroga metoda wykrywania ekspresji dziesiątek genów w tym samym nienaruszonym mózgu ułatwiłaby osiągnięcie różnych celów badawczych: walidacji danych sekwencyjnych RNA i atlasu komórkowego, mapowania typów komórek molekularnych w OUN, ilościowego określania różnic w ekspresji genów specyficznych dla rozwoju, płci lub gatunku lub pomiaru zmian w ekspresji genów wywołanych przez dużą różnorodność zaburzeń genetycznych lub środowiskowych dostępnych u Drosophila.

Mikroskopia ekspansywacyjna to technika, która pozwala badaczom obserwować tkanki w wyższej rozdzielczości poprzez rozszerzanie ich w pęczniejącym hydrożelu14. EASI-FISH łączy w sobie mikroskopię ekspansywną i RNA FISH15, który wykorzystuje reakcję łańcuchową hybrydyzacji (HCR), nieenzymatyczną technikę wykrywania wiązania sondy oligogologicznej16. EASI-FISH został po raz pierwszy opracowany jako alternatywne podejście do cienkich tkanek FISH do mapowania wzorców ekspresji dziesiątek genów w grubych (300 μm) warstwach tkanek bocznego podwzgórza myszy 17. Metoda ta jest idealna do zastosowania na mózgach dorosłych much, biorąc pod uwagę, że tkanka ta ma grubość mniejszą niż 300 μm, a prototypowy protokół EASI-FISH dla much został niedawno opisany 18. W tym przypadku wypreparowane i utrwalone mózgi Drosophila są osadzone w pęczniejącym hydrożelu, w którym mRNA i białka są kowalencyjnie zakotwiczone w polimerze żelowym za pomocą odpowiednio środków alkilujących Melphalan-X i Acryloyl-X (Ac-X). Po trawieniu białek, które pozwala na izotropową ekspansję mózgu, specyficzne dla genu sondy oligonukleologiczne DNA są hybrydyzowane z mRNA w tkance w celu zlokalizowania interesujących transkryptów. Fluorescencyjnie znakowane spinki do włosów DNA są następnie dodawane w drugim etapie hybrydyzacji. Wiele cząsteczek spinki do włosów polimeryzuje w reakcji HCR, tworząc metastabilne polimery DNA. Prowadzi to do wzmocnienia sygnału dla poszczególnych transkryptów, które można wykryć jako jasne punkty za pomocą arkusza świetlnego lub mikroskopii konfokalnej.

Kowalencyjne zakotwiczenie mRNA i białka w matrycy żelowej oraz proteolityczne trawienie białek po utworzeniu żelu tworzy środowisko, w którym transkrypty mRNA są względnie stabilne i potencjalnie bardziej dostępne do wiązania sondy. Stabilność mRNA i żelu pozwala na wiele rund ponownego sondowania i obrazowania, z usuwaniem sond DNA i produktu HCR przez inkubację z enzymem DNase1 między rundami15,17. Co więcej, rozszerzanie próbki zmniejsza autofluorescencję i rozpraszanie światła poprzez molekularne usuwanie stłoczeń i skutecznie zwiększa rozdzielczość obrazu14. W związku z tym poszczególne transkrypty mRNA mogą być łatwiej rozdzielone.

GFP podtrzymuje procedurę na tyle, aby pozostać wykrywalnym przez fluorescencję lub wiązanie przeciwciał po ekspansji. W związku z tym ten reporter może być używany do oznaczania i segmentowania typów komórek będących przedmiotem zainteresowania. W połączeniu z wieloma specyficznymi dla neuronów liniami sterownika split-GAL4 (np. 19,20), otwiera to możliwość uzyskania dalszego wglądu w tożsamość molekularną typu neuronu lub identyfikacji podtypów molekularnych, których nie można łatwo odróżnić na podstawie ich anatomii.

Opisana tutaj jest zaktualizowana wersja prototypu protokołu EASI-FISH dla much18, która charakteryzuje się doskonałym zatrzymywaniem mRNA, usuwaniem problemów technicznych i większą wytrzymałością żelu. Modyfikacje obejmują zwiększenie stężenia PFA, obniżenie temperatury wiązania i ułatwienie przygotowania próbki poprzez zamontowanie mózgów przed inkubacją z Melphalan-X i Ac-X. Protokół ten zawiera również nową recepturę żelu w celu zwiększenia jego wytrzymałości, co skutecznie zmniejsza uszkodzenia żelu podczas wykonywania wielu rund FISH i obrazowania. Modyfikacje te sprawiają, że protokół jest prostszy do wykonania, skracając zarówno czas przetwarzania, jak i zużycie odczynników, a także zwiększając pewność spójnych wyników. Co ważne, możliwości multipleksowania są zwiększone w taki sposób, że dziesiątki genów mogą być badane w tym samym mózgu przez okres kilku miesięcy. Ilustrują to wzorce ekspresji kilku genów neuronalnych w mózgu dorosłego Drosophila na różnych poziomach ekspresji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został przeprowadzony na dorosłych (5-6 dniowych) samicach Drosophila melanogaster, ale każda płeć lub gatunek Drosophila ma zastosowanie. Receptury kotwy żelowej znajdują się w tabeli uzupełniającej 1; dla receptury żelu, tabela uzupełniająca 2; oraz dla innych odczynników EASI-FISH, tabela uzupełniająca 3. Przewodnik po codziennych materiałach i odczynnikach znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 4. Uchwyt żelu do mikroskopu z lekkim arkuszem znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Rysunek 1A-C przedstawia schematyczne przedstawienie osadzania mózgów w żelach przed ekspansją i hybrydyzacją sondy (kroki od 2.1 do 3.8). Rysunek 1D to fotografia osadzonych mózgów, Rysunek 1E pokazuje uchwyt żelowy do mikroskopii z użyciem lekkiego arkusza, a Rysunek 1F przedstawia oś czasu typowego eksperymentu. Szczegóły handlowe dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Sekcja i fiksacja mózgu muchy

  1. Wypreparuj mózgi much lub OUN w zimnym podłożu S2 (aby uzyskać więcej szczegółów na temat sekcji, zobacz odniesienie21)
  2. Aby naprawić mózgi, dodaj do 20 mózgów lub 10 OUN do 2 ml zimnego 4% PFA/PBS i inkubuj przez noc na nutatorze w temperaturze 4°C.
    UWAGA: PFA jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania, działa drażniąco na skórę i oczy oraz może być rakotwórczy.
  3. Przepłukać próbkę (1x) 2 ml zimnego PBT (0,5%, patrz Tabela Uzupełniająca 4), a następnie przepłukać próbkę 2 ml zimnego PBT (4x) przez 15 minut na nutatorze w temperaturze 4 °C.
  4. Przepłukać próbkę (1x) 2 ml zimnego 70% EtOH. Przechowuj mózgi w 2 ml 70% EtOH w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Montowanie mózgów i dodawanie łączników RNA i białek (Dzień 1)

UWAGA: Noś rękawice przez cały czas i konsekwentnie wycieraj sprzęt i miejsce pracy za pomocą RNase Away. Rękawice są wymagane (1) w celu utrzymania RNaz z dala od próbek i (2) jako ochrona przed kilkoma odczynnikami, które stanowią zagrożenie dla zdrowia.

  1. Przygotuj komory żelowe, przecierając nienaładowany szkiełko odczynnikiem do odkażania RNazy. Usuń nieprzezroczystą folię chroniącą klej z uszczelki silikonowej, przyklej uszczelkę (z maksymalnie 4 komorami) do szkiełka i pokryj każdą powierzchnię komory 1 μl polilizyny za pomocą końcówki do pipety P20. Wysuszyć na powietrzu i powtórzyć proces.
    UWAGA: Krok 2.1 można wykonać dzień wcześniej.
  2. Przenieś mózgi do probówki PCR o pojemności 0,2 ml (do 4 mózgów na probówkę) i nawadniaj przez (2x) 5 minut w 150 μl PBT (0,1%) i (2x) przez 5 minut w PBS.
  3. Aby zamontować mózgi, dodaj 40 μl PBS na komorę, a następnie delikatnie przyklej mózgi w rzędzie na środku komory za pomocą cienkiej pęsety, pozostawiając trochę miejsca między mózgami (patrz Rysunek 1D). Możliwy jest montaż do 6 mózgów lub 2 CNS na komorę.
  4. Usuń PBS i natychmiast dodaj 50 μl bufora MOPS o pojemności 20 mM. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Podczas gdy mózgi równoważą się w buforze MOPS, rozmrozić roztwory podstawowe Melphalan-X i Ac-X i przygotować 75 μl roztworu Melphalan-X/Ac-X na komorę (rozcieńczyć Melphalan-X w stosunku 1:1 buforem MOPS i dodać Ac-X w stosunku 1:100). Wiruj i krępuj krótko, aby zebrać roztwór; Czas przygotowania tak, aby roztwór był gotowy pod koniec 30-minutowego czasu inkubacji, nie wcześniej.
    UWAGA: Melphalan-X jest szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu działa drażniąco na skórę i oczy oraz może być rakotwórczy.
  6. Usunąć cały bufor MOPS i dodać 50 μl roztworu Melphalan-X/Ac-X.
  7. Przykryj komorę, umieszczając szkiełko nakrywkowe na górze, ale nie używaj kleju do uszczelek do uszczelniania. Umieść komorę w nawilżonym pudełku i inkubuj chroniony przed światłem przez noc w temperaturze pokojowej.

3. Żelowanie i trawienie proteinazy K (Dzień 2)

  1. Ostrożnie zdjąć szkiełko nakrywkowe i Melphalan-X/Ac-X i umyć założone mózgi (2x) przez 2 minuty 100 μl PBT (0,1%) i (1x) przez 2 minuty 100 μl PBS.
  2. Rozmrozić roztwór TREx-1000, 4HT, TEMED i APS i przechowywać na lodzie.
    UWAGA: TREx-1000 może wytrącać się w temperaturze -20 °C; dobrze wirować, aby całkowicie się rozpuścić po rozmrożeniu.
    UWAGA: Odczynniki te są szkodliwe lub toksyczne po połknięciu lub wdychaniu, a także działają drażniąco na skórę i oczy.
  3. Przygotować roztwór żelu, mieszając TREx-1000 z 4HT, TEMED i APS w stosunku 94:2:2:2. Wiruj i trzymaj na lodzie. Dla każdej komory przygotuj 150 μl roztworu żelu.
  4. Wyjmij PBS z komory za pomocą końcówki pipety i ostrożnie usuń pozostały PBS za pomocą niestrzępiącej się ściereczki. Do każdej komory natychmiast dodaj 40 μl roztworu żelu na wierzch mózgu. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  5. Usunąć roztwór żelu i dodać 40 μl świeżego roztworu żelu, inkubując w temperaturze 4 °C przez kolejne 10 minut.
    UWAGA: Zebrać roztwór odpadowy żelu w probówce mikrowirówki i spolimeryzować przed wyrzuceniem.
  6. Usuń roztwór żelu i zdejmij przezroczystą folię ochronną z kleju powierzchniowego uszczelki. Dodaj ostatnie 45 μl świeżego roztworu żelu, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na komorze i unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza. Ścisnąć szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić komorę i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut (w sumie 30 minut równowagi w temperaturze 4 °C).
  7. Polimeryzować żel w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.
  8. Gdy żele stężeją, pozwól im ostygnąć na ławce przez kilka minut. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe i usuń silikonową uszczelkę za pomocą nowej żyletki. Następnie przytnij żel do prostokąta i wytnij prawy górny róg, aby śledzić orientację próbki.
  9. Usunąć żele ze szkiełka za pomocą cienkiego pędzla zwilżonego niewielką ilością buforu ProK i przenieść je pojedynczo do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml.
  10. Inkubować każdy żel z 500 μl buforu ProK i 5 μl enzymu ProK (1:100) w temperaturze 37 °C przez noc.

4. Trawienie DNA i hybrydyzacja sondy (Dzień 3)

  1. Myj żele (3x) przez 10 minut 1 ml PBS w RT.
    UWAGA: Używaj pipet transferowych z cienką końcówką, aby uniknąć uszkodzenia żelu podczas wymiany roztworów.
  2. Inkubować żele przez 30 minut w 1 ml buforu DNazy1 w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 50 μl enzymu DNazy1 do 450 μl buforu DNazy. Delikatnie wymieszaj, ale nie wiruj. Inkubować każdy żel w 500 μl DNazy1 przez 2 godziny 37 °C. Myć (4x) 15 min 1 ml PBS w temperaturze RT.
    UWAGA: Żele mogą być przechowywane w 5x SSC w temperaturze 4 °C przed lub po trawieniu/płukaniu DNazy przez kilka tygodni.
  4. Rozmrażanie hybrydyzacji (hyb) i bufor do płukania sondy. Inkubować żele w 500 μl buforu hyb bez sond przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Bufor do płukania hybu i sondy zawiera formamid, który podejrzewa się o powodowanie raka.
  5. Rozcieńczyć sondy w stosunku 1:100 w buforze hyb (10 nM), przygotowując 300 μl na żel. Inkubować żele z buforem hyb i sondami przez noc w temperaturze 37 °C. Utrzymywać bufor do płukania sondy i PBS w temperaturze 37 °C.

5. Mycie sondy (Dzień 4)

  1. Myć żele (3x) przez 30 minut w 750 μl buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 °C.
  2. Myć żele (3x) przez 30 min, a następnie (3x) przez 1 godzinę 1 ml PBS w temperaturze 37 °C.
  3. Umyj żele w 2 ml PBS w temperaturze pokojowej przez noc lub w temperaturze 4°C przez weekend.

6. Hybrydyzacja Reakcja Łańcuchowa (HCR) z fluorescencyjnymi spinkami do włosów (Dzień 5)

UWAGA: Aby zapoznać się z zasadą HCR, zobacz reference22.

  1. Inkubować żele w 500 μl buforu do amplifikacji (amp) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Podgrzej fluorescencyjne spinki do włosów w temperaturze 95°C przez 90 sekund w maszynie do PCR i szybko schładzaj do 25°C przez 30 minut.
  3. Dla każdej sondy rozcieńczyć pasujące pary spinek do włosów (h1 i h2) w stosunku 1:50 w buforze amperowym, przygotowując 300 μl na żel i wir.
  4. Inkubować żele z mieszanką spinek do włosów przez 3 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Myć żele (2x) przez 15 minut 750 μL 5x SSCT i (2x) przez 30 minut 1 ml 0,5x SSCT w RT.
  6. Jeśli mózg wykazuje ekspresję GFP, wybarwić 500 μl przeciwciała anty-GFP-AF488 (1:500) w PBT (0,1%) zawierającego 5 mg/ml ultraczystego BSA i inkubować przez noc (lub w weekend) w temperaturze 4 °C.

7. Montaż żeli i obrazowanie (Dzień 6)

  1. Po inkubacji przeciwciał raz przepłukać żele i myć (1x) przez 30 minut 1 ml PBT (0,1%), a następnie (3x) przez 30 minut 1 ml PBS.
    UWAGA: Mycie w PBS spowoduje 2-krotne rozszerzenie; dla 3-krotnej ekspansji, umyć 0,05x SSC.
  2. Podczas prania należy dwukrotnie pokryć powierzchnię mocowania żelu uchwytu żelowego mikroskopu z użyciem cienkiego arkusza 1 μl polilizyny, pozostawiając do wyschnięcia w temperaturze 37 °C między warstwami. Podobnie, w przypadku obrazowania konfokalnego, pokryj obszar mocowania żelu naczynia ze szklanym dnem wielokrotnymi aplikacjami polilizyny.
  3. Żele należy barwić przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 1 ml 5 μg/mL DAPI/PBS lub DAPI/0,05x SSC lub alternatywnie barwić przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Aby zamontować żel na uchwycie żelu (mikroskop z lekkim arkuszem) lub szklanym naczyniu dolnym (mikroskop konfokalny), umieść żel na szkiełku nakrywkowym i ostrożnie osusz krawędzie niestrzępiącą się chusteczką. Upewnij się, że żel jest zorientowany tak, aby tkanka znajdowała się najbliżej celu. Za pomocą pędzla delikatnie nałóż żel na powierzchnię polilizyny jednym ruchem. Do obrazowania wykąp żel w PBS (lub 0,05x SSC, jeśli rozszerza się do 3x).
    UWAGA: Po zobrazowaniu żele można delikatnie usunąć z powierzchni polilizyny za pomocą mokrego pędzla i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
  5. W celu natychmiastowego ponownego sondowania przejdź do dnia 7. W przypadku dłuższego przechowywania (od 1 tygodnia do 6 miesięcy) należy przechowywać żele w 1 ml 5x SSC w temperaturze 4 °C. Gotowe do użycia myj żele (3x) przez 10 minut 1 ml PBS przed kontynuacją.
    UWAGA: Zakres rozbudowy jest ogólnie spójny w opisanych (~2x w PBS i ~3x w 0,05x SSC). Aby sprawdzić współczynnik ekspansji, zmierz rozmiar mózgu przed i po ekspansji na obrazach wykonanych pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Aby uwidocznić mózg po ekspansji, krótko zabarwić go DAPI. Przybliżony współczynnik ekspansji to rozmiar po ekspansji podzielony przez rozmiar przed rozszerzeniem.

8. Sondy do zdejmowania izolacji i spinki do włosów do multipleksowania (Dzień 7)

  1. Inkubować żele przez 30 minut w 1 ml buforu DNazy1 w temperaturze 37°C.
  2. Dodać 50 μl DNazy1 do 450 μl buforu DNazy. Delikatnie wymieszaj, ale nie wiruj. Inkubować żele w 500 μl DNazy1 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Myć (4x) przez 15 minut 1 ml PBS w RT. Żele są teraz gotowe do następnej rundy hybrydyzacji (dzień 3, krok 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajność tego zmodyfikowanego protokołu EASI-FISH jest demonstrowana poprzez wykrywanie ekspresji kilku różnych genów związanych z neuroprzekaźnikami i neuropeptydami w mózgu dorosłego Drosophila w wielu rundach. Zazwyczaj zżelowane i rozszerzone mózgi hybrydyzowano z dwiema lub trzema sondami na rundę, a następnie HCR z parami spinek do włosów sprzężonymi z Alexa Fluor (AF) 488 (chyba że wyrażono GFP), AF546 i AF647 lub Janelia Fluor (JF) 669. Obrazowanie wykonywano głównie pod mikroskopem z użyciem cienkiego ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół EASI-FISH dla nienaruszonego układu nerwowego Drosophila umożliwia wykrycie dziesiątek transkryptów w tym samym mózgu lub OUN. Jest solidny, prosty i czuły i można go połączyć z wykrywaniem GFP w celu identyfikacji podzbiorów neuronów lub gleju. Ponieważ metoda ta jest łatwa do wdrożenia, powinna ułatwić badania prowadzone przez laboratoria Drosophila zainteresowane mapowaniem i ilościowym określaniem ekspresji genów w nienaruszonym mózgu muchy.

EASI-FISH ma ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Paulowi Tillbergowi za porady dotyczące dynamiki mikroskopii ekspansyjnej, Christinie Christoforou za pomoc w sekcjach mózgu i Geoffreyowi Meissnerowi za krytyczne opinie. Ponadto dziękujemy Tanyi Wolff i Gerry'emu Rubinowi, a także Geoffreyowi Meissnerowi i Wyattowi Korffowi za umożliwienie nam uwzględnienia wyników, które zostały wygenerowane w ramach dwóch większych badań. Wszystkie prace zostały wykonane w Kampusie Badawczym Janelia i wspierane przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa poprzez fundusze dla Zespołów Projektowych MultiFISH i Fly-eFISH, Gerry'ego Rubina oraz Zasobów Technicznych Projektu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki do PCR 0,2 ml Amerykański Naukowiec 1402-4700
Probówki wirówkowe z nakrętką 0,5 ml, AmberUSA Scientific 1405-9707
0,5 M EDTA, pH 8, bez RNazInvitrogenAM9260G
10M NaOHSigma72068
10x PBS FisherBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40% Akrylamid Bio-Rad1610140
4-Hydroxy-TEMPO (4HT)Sigma176141
5 M NaCl bez RNaz Pipeta transferowa Thermofisher
5 ml - cienka końcówkaGlobal Scientific 134070-S20
6-dołkowa szklana płyta dolna CellvisP06-1.5H-N
Acetonitryl, bezwodny ThermoFisher042311-K7
Kwasakrylowy TCIA0141
Akryl-X ThermoFisherA20770
Nadsiarczan amonu (APS)SigmaA3678
Bufor wzmacniający Instrumenty molekularnehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
bezwodny DMSOInvitrogenD12345
AstA_B2Instrumenty molekularnePRR477
ChAT_B1Instrumenty molekularnePRG115
Crz_B5Instrumenty molekularnePRR480
DAPISigmaD9542
FIJIInstrumenty
FMRFa_B2PRR487
GAD1_B5Instrumenty molekularneRTE581
Przeciwciało poliklonalne GFP, Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
Bufor do hybrydyzacjiInstrumentymolekularne
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris viewerOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
Bufor MOPFisherBP308-100
N,N Metyleno-bis-akrylamid Bio-Rad1610142
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)SigmaT22500
Woda wolna od nukleaz Sondy oligo AmbionAM9932
 Instrumenty molekularnehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Paraformaldehyd (PFA)EMS15710
PBSFisher 
Fotoflo-200 EMS74257
Bromowodorek poli-L-lizyny (polilizyna)SigmaP1524
Bufor do płukania sondyPrzyrządy molekularnehttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Proteinaza K NEBP8107S
QIAquick Zestaw do usuwania nukleotydówQiagen28306
RNase Away ThermoFisher7003, odczynnik
bez RNaz DNase1Qiagen79254
S2 MediumThermoFisher21720024
Uszczelki silikonowe InvitrogenP24743
Tdc2_B5Instrumenty molekularneRTE880
Tk_B5Instrumenty molekularnePRR484
UltaPure 10% SDSThermofisher15553027
Ultrapure BSAThermoFisherAM2616
Niesprzężone i Alexa Spinki do włosów sprzężone z fluoremInstrumentymolekularne
VAChT_B1Instrumenty molekularneRTA904
vGLUT_B2Instrumenty molekularne UchwytRTB212
Zeis Z7 Janelia Pliki CAD dostępne na życzenie
Zeiss LSM 980 konfokalny Mikroskop odwróconyZeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Mikroskop arkuszowy Zeiss Z7Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
AM97060G molekularne https://imagej.net/software/fiji/ open source https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fishBP24384do odkażaniahttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish na żel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  2. Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016).
  3. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).
  4. Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain. Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).
  5. Yang, L., et al. Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains. Methods. 126, 166-176 (2017).
  6. Meissner, G. W., et al. Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization. Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).
  7. Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems. Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).
  8. Eng, C. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).
  9. Zhang, M., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH. Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).
  10. Janssens, J., et al. Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles. eLife. 13, RP92618(2024).
  11. Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. bioRxiv. , (2024).
  12. Fang, R., et al. Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues. eLife. 12, RP90029(2023).
  13. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  14. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  15. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  16. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), 199847(2021).
  17. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. Cell. 184, 6361-6377 (2021).
  18. Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. protocols.io. , (2022).
  19. Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. bioRxiv. , (2024).
  20. Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. bioRxiv. , (2024).
  21. FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2025).
  22. HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: https://www.molecularinstruments.com/technology (2025).
  23. Wolff, T., et al. Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation. eLife. 14, RP104764(2025).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation. eLife. 12, RP92380(2024).
  26. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, e73775(2022).
  27. Xu, S., et al. Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles. Science. 370 (6514), abb2494(2020).
  28. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. GitHub. , (2021).
  29. Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. protocols.io. , (2023).
  30. Bahry, E., et al. RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection. Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).
  31. Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. protocols.io. , (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionDrosophila BrainExpansion MicroscopyIn Situ HybridizationEASI FISHMultiplex DetectionConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyNeuropeptide ExpressionSingle RNA Detection

Related Articles