Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source

Summary

Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.

Abstract

Plazmidy odgrywają istotną rolę w biologii syntetycznej, umożliwiając wprowadzanie i ekspresję obcych genów w różnych organizmach, ułatwiając w ten sposób budowę obwodów biologicznych i ścieżek wewnątrz i pomiędzy populacjami komórek. W przypadku wielu zastosowań utrzymanie funkcjonalnych plazmidów bez selekcji antybiotyków ma kluczowe znaczenie. Badanie to wprowadza otwarty, sprzętowy mikroprzepływowy przepływ pracy do analizy retencji plazmidu poprzez hodowlę pojedynczych komórek w mikrokropelkach żelu i ilościowe określanie mikrokolonii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Takie podejście pozwala na równoległą analizę wielu kropel i mikrokolonii, zapewniając większą moc statystyczną w porównaniu z tradycyjnym liczeniem płytek i umożliwiając integrację testu z innymi przepływami pracy mikroprzepływowymi kropel. Stosując plazmidy wyrażające białka fluorescencyjne wraz z niespecyficznym fluorescencyjnym barwieniem DNA, pojedyncze kolonie można zidentyfikować i zróżnicować na podstawie utraty plazmidu lub ekspresji markera fluorescencyjnego. Warto zauważyć, że ten zaawansowany przepływ pracy, zaimplementowany za pomocą sprzętu typu open source, oferuje precyzyjną kontrolę przepływu i zarządzanie temperaturą zarówno próbki, jak i chipa mikroprzepływowego. Funkcje te zwiększają łatwość obsługi, niezawodność i dostępność przepływu pracy. Chociaż badanie koncentruje się na Escherichia coli jako modelu eksperymentalnym, prawdziwy potencjał metody tkwi w jej wszechstronności. Może być przystosowany do różnych badań wymagających kwantyfikacji sygnału fluorescencji z plazmidów lub barwników, a także do innych zastosowań. Przyjęcie sprzętu typu open source poszerza potencjał przeprowadzania wysokoprzepustowych analiz biologicznych przy użyciu dostępnej technologii w różnych warunkach badawczych.

Introduction

Plazmidy są niezbędnymi elementami genetycznymi w komórkach prokariotycznych, znacząco przyczyniając się do ewolucji mikroorganizmów poprzez boczny transfer DNA i szybką adaptację do zmian środowiskowych^1,2. Te pozachromosomalne cząsteczki DNA zawierają geny, które zapewniają korzystne cechy, takie jak oporność na antybiotyki, funkcje metaboliczne i czynniki wirulencji, co czyni je cennymi dla badań mikrobiologicznych, biologii syntetycznej i badań nad ewolucją². Jednak utrzymanie plazmidu w populacjach komórek jest trudne ze względu na obciążenie metaboliczne związane z replikacją i segregacją, często skutkujące utratą plazmidu bez presji selekcyjnej³. Dodatkowo, stabilne dziedziczenie wymaga mechanizmów, takich jak systemy toksyna-antytoksyna i partycjonowanie, co komplikuje utrzymanie plazmidu. Ocena stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i zastosowań praktycznych, które wykorzystują plazmidy jako podstawowy element badań^4,5. Większość obecnych metod oceny stabilności plazmidu ma znaczące ograniczenia: metody oparte na cytometrii przepływowej dostarczają pośrednich danych na poziomie populacji, wymagają drogiego sprzętu i nie mają bezpośredniej wizualizacji kolonii⁶. Masowe metody transkryptomiki i proteomiki są kosztowne, zapewniają tylko średnie odpowiedzi komórkowe i nie mogą bezpośrednio określić ilościowo retencji plazmidu w poszczególnych koloniach⁶. Tradycyjne metody, takie jak seryjne rozcieńczanie i pasażowanie, są proste, ale czasochłonne i brakuje im precyzji i reprezentatywności⁷. Ogólnie rzecz biorąc, ilościowe wnioskowanie lub prognozowanie liczby kolonii, które zachowują określony funkcjonalny plazmid w czasie lub pod presją selekcyjną, pozostaje wyzwaniem.

Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiono nowatorski przepływ pracy mikroprzepływowej wykorzystujący otwarte instrumenty badawcze do ilościowego określania sygnałów fluorescencyjnych w wielu izolowanych koloniach bakterii, używając Escherichia coli jako modelu. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustową i precyzyjną analizę retencji plazmidu w różnych warunkach lub ciśnieniach selekcyjnych. Analiza rozdzielczości pojedynczej komórki zapewnia precyzyjną metodę manipulowania izolowanymi koloniami, dostarczając wrażliwych danych na temat kwantyfikacji plazmidu, które mogą pomóc w ocenie wskaźników retencji i straty⁴.

Mikrofluidyka, szczególnie mikrofluidyka kropelkowa, stała się potężnym narzędziem do hermetyzacji i manipulowania pojedynczymi komórkami w kontrolowanych środowiskach⁸. W szczególności kropelki mikrożelu mogą otaczać pojedyncze komórki w celu uzyskania wysokiej przepustowości i precyzyjnej analizy bez konieczności utrzymywania kropelek zawieszonych w oil⁹, co pozwala na kontrolowane badanie dynamiki plazmidu w określonym mikrośrodowisku. Po enkapsulacji zawiesin komórkowych bezpośrednio z końcówki pipety¹⁰, techniki fluorescencji mogą być stosowane do monitorowania wzrostu mikrokolonii w kropelkach, umożliwiając szczegółową analizę retencji i segregacji plazmidu pod różnymi ciśnieniami selekcyjnymi³.

Zalety tej metody w porównaniu z tradycyjnymi technikami hodowli masowej obejmują zwiększoną precyzję, zmniejszoną zmienność i możliwość przeprowadzania analiz o wysokiej przepustowości. Technologia mikroprzepływów typu open source pokonuje ograniczenia kosztownych systemów własnościowych, takie jak problemy z dostępnością, zdolnością adaptacji i konserwacją, które często utrudniają postęp badań^11,12,13. Demonstrując, jak zastosować zaawansowany eksperymentalny przepływ pracy analizy retencji plazmidu w mikrożelach za pomocą oprzyrządowania typu open source, zapewniono dostępną i niezawodną metodę badań w zakresie biologii plazmidowej, zastosowań biologii syntetycznej i technik analizy kropel mikroprzepływowych.

Podsumowując, ten artykuł przedstawia przystępną metodę ilościowej oceny retencji plazmidu u E. coli o wysokiej mocy statystycznej. Możliwości tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem do pogłębiania wiedzy na temat biologii plazmidów i ulepszania zastosowań biologii syntetycznej.

Protocol

Rysunek 1przedstawia schematyczny przegląd oceny stabilności plazmidu u E. coli. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów. Surowe dane i skrypty wizualizacji są dostępne na stronie https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK.

Rycina 1: Protokół dzień po dniu do oceny stabilności plazmidu u E. coli. Niebieskie strzałki wskazują kroki w ciągu dnia, a fioletowe strzałki wskazują inkubację przez noc. Każdą inkubację cieczy i agaru przeprowadzano w temperaturze 37 °C wraz z oddzielną probówką/płytką do kontroli ujemnej. Należy zauważyć, że przygotowanie i pasaże hodowli komórkowej nie są potrzebne w przypadku rzeczywistych próbek, w których mogła już dojść do utraty plazmidu, dlatego protokół powinien zostać skrócony do jednego lub dwóch dni, jeśli dołączona jest hodowla referencyjna na płytce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie chipów mikroprzepływowych

UWAGA: W tym protokole, różne komercyjne lub niestandardowe projekty chipów mogą być używane do enkapsulacji komórek, które są w stanie generować kropelki wody w oleju o średnicy mniejszej niż 100 μm w reżimie kapania. Na potrzeby tego badania chip został zaprojektowany i wyprodukowany (patrz artykuł https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK danych) zgodnie z tą samą metodą projektowania i produkcji, jak opisano w wcześniej opublikowanym raporcie¹⁴.  

1. Uzyskaj lub przygotuj chip mikroprzepływowy PDMS na szkle za pomocą formy głównej przeznaczonej do generowania mikrokropelek żelu.
2. Wstrzyknij roztwór hydrofobowy (fluoroalkilosilan) do chipa, aby wewnętrzne mikrokanaliki stały się hydrofobowe. Wlej roztwór do wlotów i upewnij się, że wszystkie kanały są wypełnione płynem. Pozostaw wypełnione kanały na około 30–60 s.
3. Usuń roztwór z urządzenia, wypychając powietrze do wewnętrznych mikrokanalików. Użyj pustej strzykawki powietrznej, aby przepłukać powietrze i chłonnej chusteczki na pozostałe porty, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
4. Piecz poddane działaniu urządzenia w temperaturze 65 °C przez 15 minut na płycie grzejnej, aby odparować nadmiar roztworu. Alternatywnie przechowuj urządzenie w lodówce (4 °C) przez noc.
   UWAGA: Chip mikroprzepływowy jest gotowy do użycia. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie próbki

1. Pobieranie komórek
   UWAGA: Hodowla komórkowa w kropelkach może dostarczyć istotnych danych na temat dynamiki plazmidu. Jako eksperymentalny model bakterii, szczep E. coli TOP10 jest używany z plazmidowym pCA_Odd1 (patrz zdeponowane dane https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), który koduje superfolder białka zielonej fluorescencji (sfGFP) i oporności na kanamycynę¹⁵. Bakterie, plazmid i pożywki wzrostowe mogą się różnić w zależności od systemu eksperymentalnego.
   1. Przygotować Luria Bertoni (LB)-Agar, rozpuszczając 25 g wstępnie zmieszanego LB i 12 g agaru w 800 ml wody destylowanej (dH₂O). Należy również przygotować płynną pożywkę LB, rozpuszczając 25 g wstępnie zmieszanego LB w 800 ml dH₂O. Roztwory należy sterylizować w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia do około 60 °C. Przenieść do sterylnego środowiska, takiego jak okap przepływowy, aby wykonać kolejne czynności.
      UWAGA: Wstępnie zmieszany proszek LB zawiera 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl. Można również użyć samodzielnie zmieszanych pożywek LB-agar
   .
   2. Dodać 50 μl kanamycyny (przygotowanej w stężeniu 100 mg/ml) do 50 ml płynnego LB-Agaru (końcowe stężenie: 100 μg/ml). Wymieszaj roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę.
   3. Wlej około 15 ml płynnego LB-agaru na szalkę Petriego (90 mm x 15 mm). Przygotować dwie płytki: jedną do kontroli ujemnej (monitorowanie skażenia) i jedną do hodowli doświadczalnej. Pozwól roztworowi LB-agar ostygnąć i zestalić się, aż kolor zmieni się z ciemnego na przezroczysty na obu płytkach.
   4. Użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić szczep E. coli na płytce hodowlanej przy użyciu techniki płytki smugowej. Natychmiast po użyciu umieścić glicerolową E. coli z powrotem w temperaturze –80 °C. Zamknąć obie płytki i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C (dzień 1).
   5. W drugim dniu sprawdzić, czy na płytce kontroli ujemnej nie ma żadnej kolonii jako sygnału zanieczyszczenia (jeżeli tak, należy powtórzyć czynności opisane w ppkt 2.1.4.). Zidentyfikuj pojedyncze kolonie fluorescencyjne na płytce E. coli za pomocą transiluminatora światła niebieskiego, aby przygotować płynny bulion hodowlany.
   6. W sterylnych warunkach otwórz płytkę i za pomocą sterylnej pętli lub końcówki pipety o pojemności 200 μl wybierz wybraną kolonię i przenieś ją do probówki hodowlanej z 5 ml świeżej płynnej pożywki LB i 5 μl kanamycyny (przygotowanej w stężeniu 100 mg/ml). Przygotować probówkę kontroli ujemnej bez inokulacji do monitorowania zanieczyszczenia. Inkubować probówki hodowlane w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
   7. Próbkę należy przepuszczać przez dodatkowe 3 dni w pożywce bez antybiotyków, aby zasymulować warunki, w których może dojść do utraty plazmidu. W dniach 3, 4 i 5 przenieś 50 μl nocnej hodowli do nowej probówki hodowlanej zawierającej 5 ml płynnego LB bez antybiotyków. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Powtarzaj ten krok do 6 dnia, uzyskując końcową hodowlę 5 ml po czterech całkowitych pasażach.
   8. Przenieść 50 μl z końcowej hodowli przez noc do nowej probówki hodowlanej zawierającej 2 ml płynnego LB. Pozwól, aby kultura osiągnęła gęstość optyczną (OD600) 0,3 za pomocą spektrofotometru (około 3–4 godziny).
      UWAGA: Świeża kultura powinna być użyta przed wzrostem OD600, aby upewnić się, że bakterie są w logarytmicznej fazie wzrostu. Jeżeli pożądane stężenie nie zostanie osiągnięte, powtórzyć czynności od kroku 2.1.8.
2. Mieszanina komórkowo-agarozowa do kapsułkowania
   UWAGA: Kontrola stężenia jest niezbędna, aby zapewnić hermetyzację kropel jednokomórkowych. Wymagane stężenie komórek można obliczyć dla docelowej szybkości enkapsulacji i określonej objętości kropli, jak pokazano w poniższym przykładzie:
   Objętość kropli (_kropla V): Jeśli generowane są kropelki 50 μm
   
   
   Pożądane komórki na kroplę (C_pd): Średnio jedna komórka na pięć kropelek (0,2 komórki/kroplę)
   
   Współczynnik rozcieńczenia: Początkowe stężenie komórek uzyskuje się w kroku 2.1.8
   
   W tym przypadku generowane są kropelki o wielkości 50 μm lub 100 μm (bez rozszczepiania kropel) (65–520 ml), w których zamknięta jest około jedna komórka na pięć kropel lub 1,6 komórki na kroplę bez rozszczepienia. W przypadku E. coli należy użyć współczynnika konwersji 1 jednostki OD600 ≈ 7,8 x 10⁸ komórek/mL¹⁶. Pomnóż wartość OD600 z kroku 2.1.8 przez współczynnik konwersji, aby uzyskać początkowe stężenie (komórki/ml) w hodowli.
   1. Ponownie zawiesić E. coli z przygotowanego materiału hodowlanego w płynnym LB bez kanamycyny w stężeniu 6,2e+6 komórek/ml (stężenie docelowe dla kropelek o średnicy 50 μm). Zawiesinę bakterii należy przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu zmieszania z agarozą.
      UWAGA: Antybiotyki hamują tworzenie negatywnych mikrokolonii, dlatego konieczne jest wykluczenie ich z pożywki w przypadku eksperymentów z utratą plazmidu.
   2. Przygotować agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania, podgrzewając ją do 90 °C w płynnym LB o stężeniu 2% (w/v). Potrząsaj mieszaniną przez 10 minut w shakerze o kontrolowanej temperaturze.
   3. Zmniejszyć temperaturę wytrząsarki do 39 °C, aby schłodzić roztwór agarozy. Równolegle umieść rurkę z zawiesiną bakterii w wytrząsarce termicznej na 4 minuty, aby podgrzać ją do 39 °C.
   4. Wymieszać bakterie i zawiesiny agarozy w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie agarozy 1% (w/v) z zawiesiną komórkową o stężeniu 3,1e + 6 komórek/ml. Przygotować roztwór kontroli ujemnej (monitorowanie zanieczyszczenia) o tym samym stężeniu agarozy, używając ciekłego LB zamiast zawiesiny bakterii.
      UWAGA: Zawiesinę agarozowo-komórkową należy zużyć szybko, aby uniknąć zmian stężenia spowodowanych rozwojem bakterii. Utrzymuj wytrząsarkę termiczną w temperaturze 39 °C, aby utrzymać płyn agarozowy do momentu włożenia do grzałki końcówki w celu wytworzenia kropel.

3. Wysokowydajna uprawa pojedynczej kolonii

1. Konfiguracja eksperymentalna
   1. Zbuduj lub uzyskaj pełną platformę przepływu typu open source (patrz https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), w tym sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Alternatywnie, zbuduj prostszy sprzętowy stolik mikroskopowy o otwartym kodzie źródłowym z stroboskopem (zobacz instrukcje budowania https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ i repozytorium projektu https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage).
      UWAGA: Można również użyć tradycyjnej konfiguracji mikrofluidycznej z komercyjnym mikroskopem, szybką kamerą i możliwością podgrzewania próbki.
   2. Zintegruj system regulatora ciśnienia i przepływu oparty na Raspberry Pi typu open source zgodnie z dokumentacją w wyznaczonym repozytorium (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller).
      UWAGA: Kontrolka modułu jest zilustrowana i zarchiwizowana w repozytorium danych (https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK. Alternatywnie można zastosować tradycyjne regulatory ciśnienia lub pompy strzykawkowe o wysokim momencie obrotowym.
   3. Dołącz szklane szkiełko i grzałki końcówek pipet (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring) do zestawu, aby kontrolować temperaturę próbki agarozy w momencie jej wprowadzania do chipa.
      UWAGA: Te grzałki, zilustrowane w repozytorium danych (https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform i https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK, są ważną cechą systemu sterownika typu open source, która umożliwia pracę z agarozą i może nie być dostępna w innych systemach komercyjnych.
2. Hermetyzacja pojedynczych komórek
   1. Umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopii stroboskopowej, upewniając się, że widoczne jest złącze generowania kropel (przecięcie fazy wodnej i olejowej).
   2. Ustaw grzałkę końcówki pipet i szklaną grzałkę szkiełka na 40 °C za pomocą interfejsu oprogramowania sterującego.
   3. Za pomocą strzykawki z rurką i zatyczką PDMS załadować 1% mieszaninę agarozy z zawiesiną komórek do końcówki pipety o pojemności 200 μl. Włóż końcówkę do grzałki końcówki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę końcówki PDMS na uszczelkę podłączoną do rurki systemu kontroli przepływu i rozpocznij infuzję zawiesiny komórek.
   4. Włóż końcówkę rurki wylotowej do rurki odpływowej i ustaw natężenia przepływu lub ciśnienia dwóch faz na interfejsie użytkownika, aby powoli dostarczać płyn do kanału mikroprzepływowego. Stosować 200 μl/h (180 mbar) dla fazy wodnej i 1700 μl/h (320 mbar) dla fazy olejowej. Odczekaj 1 minutę na ustabilizowanie się wytwarzania kropel.
      UWAGA: Wartości ciśnienia zależą od rozmiarów kanałów w konstrukcji chipa, a wartości przepływu mogą wymagać dostosowania do różnych konstrukcji złączy do generowania kropel.
   5. Gdy wytwarzanie kropel się ustabilizuje, przenieś rurki odpływowe i zbiorcze do probówki zbiorczej. Kontynuowanie zbierania kropel aż do opróżnienia zbiornika próbki. Powtórzyć kroki 3.2.3-3.2.5 w celu hermetyzacji roztworu kontroli ujemnej z kroku 2.2.4.
      UWAGA: Pobieranie próbki powinno zostać zakończone w ciągu 15 minut.
   6. Przechowywać probówki zbiorcze na lodzie podczas wytwarzania kropel lub umieścić je w temperaturze 4 °C po doświadczeniu przez 1 godzinę, aby agaroza mogła zżelować się wewnątrz kropel.
      UWAGA: Chip mikroprzepływowy może być ponownie użyty, jeśli mikrokanaliki pozostają niezatkane i załadowana jest ta sama zawiesina. Wyrzuć końcówkę pipety po zakończeniu wytwarzania emulsji (kroki 3.2.3–3.2.5).
3. Wzrost kolonii i uwalnianie z emulsji
   1. Przenieść mikrokropelki żelu zawierające bakterie i kontrolę ujemną w kropelkach do komory inkubacyjnej ustawionej na 37 °C.
   2. Inkubuj mikrokropelki przez co najmniej 4 godziny lub przez noc, aby umożliwić wystarczający wzrost kolonii. Potwierdzić, że kontrola ujemna nie wykazuje oznak zanieczyszczenia za pomocą mikroskopii w jasnym polu.
   3. Aby uwolnić kolonie z emulsji, należy usunąć jak najwięcej oleju spod żelowej emulsji mikrokropelkowej za pomocą pipety lub strzykawki z igłą (tutaj użyto igły o rozmiarze 21 G).
   4. Przenieść 50 μl mikrokropelek żelu do nowej mikroprobówki i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszej analizy kropel. Do pozostałej emulsji dodać mieszaninę oleju fluorowanego w stosunku 1:1 z 1H,1H,2H,2H-perfluoro-1-oktanolem (PFO) w objętości równej objętości emulsji.
   5. Dodać około 200 μl buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub 0,9% buforu NaCl w/v na wierzch emulsji. Zwiruj mieszaninę i krótko odwiruj ją w wirówce o stałej prędkości.
   6. Ostrożnie usuń fazę olejową z dolnej części interfejsu cieczy i wyrzuć 100 μl PBS z góry. Powtórz kroki 3.3.4–3.3.5, aby uzyskać przemyte mikrożele w buforze PBS z minimalnymi lub żadnymi pozostałościami oleju.
      UWAGA: Mikrożele osadzają się na granicy faz cieczy; Unikaj usuwania ich wraz z fazą olejową.

4. Analiza pojedynczej kolonii

1. Barwienie komórek
   UWAGA: W przypadku tego protokołu działa wiele różnych kombinacji plam. Zasadniczo należy wybrać barwnik DNA lub ściany komórkowej, który ma kolor inny niż białko fluorescencyjne kodowane przez plazmid i który można analizować przy użyciu dostępnych kombinacji filtrów w mikroskopie fluorescencyjnym. W tym przypadku DNA komórek zostało wybarwione jodkiem propidyny (PI) w celu odróżnienia jego fluorescencji od zielonego białka fluorescencyjnego zakodowanego na plazmidach, ale można użyć wielu innych barwień DNA.
   UWAGA: PI jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Barwnik należy utylizować w sposób bezpieczny i zgodny z lokalnymi przepisami.
   1. Odwirować umyte mikrożele w stężeniu około 80 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
   2. Przenieś 50 μl mikrożeli do nowej mikroprobówki, aby służyła jako kontrola ujemna do obróbki etanolem.
      UWAGA: Barwnik PI dostaje się tylko do komórek z uszkodzonymi błonami, takimi jak te dotknięte obróbką etanolem.
   3. Dodaj równą objętość 70% etanolu do pozostałych mikrożeli i krótko wymieszaj z wirem. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby przeniknąć błony bakteryjne do barwienia PI. Powtórz krok 4.1.1.
   4. Dodaj równą objętość 0,9% w/v NaCl do mikrożeli i krótko wiruj. Powtórz krok 4.1.1.
   5. Dodać 2 μl PI (1 mg/ml) do obu próbek z mikroprobówek. Dokładnie wymieszać i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 min.
      UWAGA: Jeśli kontrola ujemna wykazuje jakikolwiek sygnał czerwonej fluorescencji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, integralność kolonii mogła zostać naruszona podczas ich ekspozycji na inne roztwory w poprzednich etapach.
2. Mikroskopia
   UWAGA: Kropelki i mikrożele są obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu epi-fluorescencyjnego w celu uzyskania rozkładu wielkości kropelek i fluorescencji kolonii bakteryjnych w mikrożelach (Rysunek 2). W tym przypadku platforma mikroskopii odwróconej o otwartym kodzie źródłowym (https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform)¹⁷ jest używana z obiektywem 10x 0,3NA, białą matrycą LED do oświetlenia jasnego pola i diodą LED 470 nm do wzbudzenia. Komercyjne mikroskopy epifluorescencyjne mogą być używane do obrazowania kropelek i mikrożeli. Kalibracja jest wymagana, ponieważ oświetlenie i filtry różnią się w zależności od modelu, marki i zastosowanych białek fluorescencyjnych.
   1. Przenieś 2 μl mikrokropelek żelu do szkiełka do komory obrazowania i dodaj 5 μl oleju fluorowanego, aby pomóc utworzyć monowarstwę kropel dla optymalnego obrazowania.
      UWAGA: Komory do liczenia komórek lub proste komory mikroprzepływowe mogą pomóc w cienkim rozprowadzeniu emulsji i spowolnieniu procesu suszenia.
   2. W mikroskopie aktywuj białe podświetlenie matrycy LED od góry, aby uzyskać obrazowanie w jasnym polu. Zamontuj przygotowane szkiełko, skup się na próbce i zlokalizuj monowarstwę kropel. Uchwyć obraz w jasnym polu.
   3. Nie przesuwając próbki, uchwyć obraz fluorescencyjny kolonii, przełączając się na diodę LED 470 nm w celu wzbudzenia. Dostosuj koło filtrów, aby wyrównać się z zielonym filtrem długości fali do obrazowania sfGFP. Zeskanuj wszystkie obszary zawierające monowarstwy kropel i powtórz kroki 4.2.2–4.2.3, aby zapewnić statystyczną solidność analizy kropel.
   4. Przenieś 2 μl barwionych mikrożeli do chipa komory obrazowania i 5 μl 0,9% w/v NaCl, aby pomóc w utworzeniu monowarstwy mikrożeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania.
      UWAGA: Parowanie może wpływać na kolokalizację etykiet fluorescencyjnych. Komory mikroprzepływowe są zalecane do długotrwałego obrazowania.
   5. Powtórz kroki 4.2.2–4.2.3. Dostosuj czerwony filtr interwału długości fali do obrazowania PI i uchwyć odpowiednie obrazy.
   6. Po zakończeniu obrazowania w jednym miejscu znajdź następny odpowiedni obszar na szkiełku z monowarstwą mikrożeli i powtórz proces obrazowania, aby zapewnić solidność statystyczną i kompleksową analizę próbki.

Rysunek 2: Obrazy mikroskopowe i ich analiza. Obrazowanie fluorescencyjne i analiza kolonii w mikrożelach. (A–C) Kanały obrazu uzyskane za pomocą mikroskopii jasnego pola i fluorescencji z mikroskopem odwróconym. Złożony obraz (D) pokazuje obecność ujemnej kolonii (tylko czerwona fluorescencja) w mikrożelach. (E–H) Wyniki procesu roboczego analizy obrazu. Generując ROI, kolonie można zidentyfikować na kanałach czerwonym i zielonym, a sygnały można określić ilościowo w celu określenia obecności ujemnych kolonii. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Analiza obrazu
   UWAGA: Aby przeanalizować sygnały fluorescencyjne z zamkniętych kolonii i zidentyfikować rzadkie zdarzenia, obrazy z obrazowania jasnego pola i fluorescencji można przetwarzać za pomocą Fiji/ImageJ (Rysunek 3). Kroki te można zaimplementować w skrypcie makra, a wartości parametrów mogą się różnić w zależności od konfiguracji optycznej.
   1. Otwórz obrazy z kanałów zielonego i czerwonego. Zdefiniuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) rozpoczynający się od współrzędnych (500, 500) o szerokości i wysokości 2000 pikseli każdy.
      UWAGA: Te parametry dotyczą obrazów o rozdzielczości 3000 x 3000 pikseli, a zwrot z inwestycji określa obszar o lepszym oświetleniu.
   2. Przytnij obraz do zdefiniowanego prostokątnego ROI. Odejmij stałą wartość 10 od intensywności każdego piksela i zastosuj filtr wygładzający do obrazu, aby zredukować szum tła i uczynić interesujące obiekty bardziej wyrazistymi.
      UWAGA: Tylko ten region będzie używany do dalszej analizy.
   3. Zduplikuj obraz z kanału czerwonego i przekształć go w maskę binarną, aby zidentyfikować rzadkie zdarzenia związane z plazmidem. Ustaw wartości progowe z zakresu od 10 do 255. Piksele w tym zakresie będą traktowane jako pierwszy plan (obiekty zainteresowania), podczas gdy inne będą traktowane jako tło.
   4. Wykonuj operacje morfologiczne, aby zamknąć małe luki i wypełnić wszelkie w obiektach zainteresowania. Zastosuj algorytm działu wodnego, aby oddzielić nakładające się obiekty w masce binarnej.
   5. Przeanalizuj cząstki w masce binarnej. Uwzględniaj tylko cząstki o rozmiarze większym niż 30 pikseli i kołowości od 0,50 do 1,00. Wyniki są podsumowywane i dodawane do tabeli wyników. Zapisz zestaw ROI wykrytych przez analizę cząstek w celu dalszej wizualizacji.
   6. Wyświetl zapisane ROI na obrazach z kanału zielonego i czerwonego. Zmierz intensywność lub inne właściwości ROI na tych obrazach. Zapisz pomiary w tabeli wyników i zapisz je w osobnych plikach CSV do dalszej analizy statystycznej.

Rysunek 3: Proces analizy obrazu w celu identyfikacji ujemnych kolonii. Rysunek ilustruje krok po kroku proces automatycznego przetwarzania i oceny obrazów fluorescencyjnych. Przepływ pracy opiera się na kolokalizacji etykiet fluorescencyjnych, a także na analizie cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Test porównawczy płytek agarowych

UWAGA: Aby porównać metodę kropelkową z tradycyjnym testem płytkowym, w kroku 2.1.8 przeprowadzono kwantyfikację kolonii fluorescencyjnych tego samego szczepu E. coli. za pomocą szalek Petriego. Posłużyło to jako analogowa metoda kontrolna do pomiaru stabilności plazmidu sfGFP. Zobacz również ilustrację metody w Rysunek 1.

1. Przygotować LB-agar (bez antybiotyku) zgodnie z opisem w kroku 2.1.1 w sekcji Pobieranie komórek. Schłodzić agar poniżej 60 °C i homogenizować.
2. W sterylnym środowisku wlej 15 ml podłoża agarowego do każdej szalki Petriego. Pozwól płytkom zastygnąć z częściowo otwartymi pokrywkami, aż będą gotowe do użycia.
3. Zaszczepić trzy płytki po 10 μl każdej kultury E. coli w pożywce LB o stężeniu OD600 0,007 ± 0,002. Rozprowadź równomiernie za pomocą rozsiewacza w kształcie litery L. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, zamknięte i odwrócone. W tych samych warunkach przygotuj płytkę kontrolną bez bakterii.
4. Po 24 godzinach wykonaj obrazy fluorescencyjne płytek za pomocą FluoPi, systemu obrazowania fluorescencji typu open source (https://github.com/RudgeLab/FluoPi)¹⁵.
   UWAGA: FluoPi składa się z kamery Raspberry Pi z niebieskim światłem wzbudzenia o długości fali wyśrodkowanej na 470 nm oraz akrylowych filtrów wzbudzenia i emisji.
5. Ręcznie policz fluorescencyjne i niefluorescencyjne kolonie na każdej płytce, korzystając z przechwyconych obrazów.

Results

Walidacja enkapsulacji komórek i tworzenia mikrokolonii

Enkapsulacja komórek może być wizualnie potwierdzona, wykonując mikroskopię jasnego pola na mikrokropelkach żelu przed rozbiciem emulsji i umyciem mikrożeli. Reprezentatywny wynik emulsji na tym etapie jest pokazany na Rysunek 4.

Rysunek 4: Przekrój obrazu nakładki z mikroskopii fluorescencyjnej. Po całonocnej inkubacji reprezentatywne mikrokolonie sfGFP wykazujące ekspresję kolonii E. coli wewnątrz mikrokropelek żelu. Użyto obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 10x i narazie 0,30. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki analizy obrazu

Po wybarwieniu mikrożeli i uzyskaniu jasnego pola, a także kanałów fluorescencyjnych w kilku pozycjach, można wizualizować kolonie zidentyfikowane jako negatywne na oryginalnych obrazach (zobacz Rysunek 5A). Dane wyodrębnione ze wszystkich obrazów jednego eksperymentu można wykreślić, aby pokazać stosunek fluorescencji różnych kolonii, podkreślając te, które utraciły fluorescencję kodowaną plazmidem (patrz Rysunek 5B). Wyniki wskazują, że 100 kolonii utraciło swoją funkcję plazmidu lub plazmidu z łącznej liczby 2785 analizowanych mikrokolonii, co odpowiada 3,6%.

Rysunek 5: Kwantyfikacja ujemnych mikrokolonii. (A) Przekrój obrazu nakładki z mikroskopii fluorescencyjnej. Po usunięciu oleju i barwieniu, reprezentatywne kolonie w mikrożelach wyrażających sfGFP i dwie ujemne kolonie wykazały czerwoną fluorescencję barwienia DNA (zakreślone na czarno). Podziałka skali: 100 μm. (B) Wykres rozrzutu wartości fluorescencji poszczególnych mikrokolonii wyekstrahowanych z 16 obrazów mikroskopii wielokanałowej. Kolonie bez zielonej fluorescencji zostały policzone jako ujemne, jak pokazano na wykresie na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kwantyfikacja płytki agarowej

Obrazy potrójnych płytek są pokazane w Rysunek 6, z niefluorescencyjnymi koloniami oznaczonymi białymi strzałkami. Pierwsza tabliczka (Rysunek 6A) pokazywała w sumie 213 kolonii, z których 1 nie była fluorescencyjna. Druga tablica (Rysunek 6B) zawierała w sumie 49 kolonii, bez żadnych kolonii niefluorescencyjnych. Trzecia tablica (Rysunek 6C) pokazała w sumie 252 kolonie, z których 6 nie było fluorescencyjnych. Wyniki te odpowiadają średniemu wskaźnikowi utraty plazmidu kolonii wynoszącemu 2,3%, z dużym odchyleniem standardowym wynoszącym 3,2.

Rysunek 6: Identyfikacja ujemnych kolonii na płytkach. (A–C) Fluorescencyjne i niefluorescencyjne kolonie E. coli na płytkach LB-agar (średnica: 90 mm, wysokość: 15 mm). Inokulum, pochodzące od E. coli z sfGFP z zapasem -80 °C, zostało przesiane w dniu 1, wyhodowane antybiotykiem w dniu 2 i rozcieńczone w stosunku 1:100 dziennie od 3 do 6 dnia, aby umożliwić utratę plazmidu. Kolonie inkubowano w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i obrazowano w komorze FluoPi. Niefluorescencyjne kolonie zostały wzmocnione za pomocą GIMP-a i oznaczone białymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wykazano, że metoda oparta na mikrokropelkach w żelu skutecznie identyfikuje i określa ilościowo kolonie z ekspresją genetyczną białek fluorescencyjnych kodowaną plazmidem i bez niej. Kolonie, które nie wykazują wystarczającej ekspresji produktu plazmidowego, są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika DNA (tutaj jodku propidyny), który barwi wszystkie kolonie i ma inną długość fali emisyjnej. Ta integracja mikrofluidyki kropelkowej, żelowania i mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystująca technologię open source, umożliwia realizację zaawansowanego przepływu pracy w wielu warunkach badawczych^11,13. Pomyślne wygenerowanie mikrokropelek żelu umożliwia zaawansowane procesy pracy pojedynczej komórki w biologii molekularnej, w tym lizę komórek, amplifikację pojedynczego genomu, badania przesiewowe interakcji metabolicznych komórek, wymianę pożywek i wiele innych ^8,9. Te zalety są wykorzystywane w tym protokole do hodowli, barwienia i analizowania mikrokolonii w bardziej skalowalny sposób niż w tradycyjnych testach opartych na płytkach.

Kroki krytyczne

Proces enkapsulacji jest krytyczną i delikatną częścią protokołu. Precyzyjna kontrola stężeń składników, natężeń przepływu i ciśnień jest wymagana do wytworzenia jednolitych mikrożeli w określonym zakresie wielkości i kontrolowania średniej liczby komórek na kroplę. Ponadto utrzymanie stężenia i temperatury mieszanki komórkowo-agarozowej zapobiega zbrylaniu się lub przedwczesnemu żelowaniu. Kontrola temperatury ciekłej zawiesiny agarozowo-komórkowej w końcówce pipety jest szczególnie korzystną implementacją naszej sprzętowej stacji roboczej mikrofluidyki typu open source, która zapewnia znacznie łatwiejsze i bardziej niezawodne wytwarzanie mikrożelu w porównaniu z wysiłkami zmierzającymi do kontrolowania temperatury pomp strzykawkowych i przewodów. Ponieważ komórki są mieszane z pożywką wzrostową agarozy przed enkapsulacją i hodowlą, mikrożele agarozy muszą być wytwarzane szybko, aby uniknąć poważnych zmian stężenia komórek. W tym celu zoptymalizowano konstrukcję mikroprzepływowego chipa rozdzielającego kropelki, zainspirowaną przez Abate i wsp.¹⁸.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Konieczne było kilka kalibracji i modyfikacji, aby udoskonalić oryginalny protokół. Kapsułkowanie agarozy jest znacznie trudniejsze niż zwykłe kropelki wody w oleju, co wymaga zaprojektowania systemu utrzymującego agarozę w stanie ciekłym przy jednoczesnym zapewnieniu, że przepływ fazy wodnej osiąga jednorodny zakres wielkości cząstek. Zmiany lepkości agarozy spowodowane żelowaniem wpływają na szybkość przepływu, prowadząc do większych rozmiarów cząstek. Mikroskopia wymaga starannego doboru filtrów i źródeł światła, aby zapewnić nienakładające się na siebie sygnały wzbudzenia i emisji w celu wyraźnego rozróżnienia. Początkowo DAPI został wybrany do barwienia bakterii, ale jego sygnał emisyjny pokrywał się z sfGFP, co spowodowało, że sfGFP został wykryty w niebieskim kanale detekcji. Przeszliśmy na PI, ponieważ jego emisja jest dobrze oddzielona od sfGFP na długich falach (czerwone światło).

Podczas gdy utratę plazmidu określono ilościowo przy użyciu proponowanej metody, zastosowany plazmid sfGFP był nieoczekiwanie stabilny, nie wykazując prawie żadnych przypadków utraty plazmidu w pierwszym pokoleniu komórek hodowanych bez antybiotyków, nawet w warunkach stresowych, takich jak pożywka pH9 i inkubacja w temperaturze 40 °C. Obserwacja ta jest zgodna z ustaleniami innych grup badawczych ^1,19. Stabilność plazmidu ograniczyła demonstrację pełnych możliwości kwantyfikacji metody dla początkowych generacji kultur komórkowych, ale wykazała, że metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć nawet niewielkie różnice w retencji plazmidu. Obserwacja stabilności wysokoplazmidowej u wczesnych generacji ma ważne implikacje dla kropelkowych badań przesiewowych mikroprzepływowych przy użyciu testu selekcji negatywnej, takiego jak hamowanie bakterii docelowych. Oznacza to, że utrata plazmidu celów selekcyjnych jest niskim źródłem fałszywie dodatnich wyników selekcji. Ze względu na to, że kropelkowe przesiewacze mikroprzepływowe zazwyczaj przewyższają inne sita o wysokiej przepustowości, takie jak przepływy pracy robotów pipetujących, o rzędy wielkości pod względem przepustowości, te rzadkie zdarzenia muszą być oceniane i brane pod uwagę.

Ograniczenia

Pomimo swoich zalet, prezentowana metoda ma swoje ograniczenia. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych wymaga specjalistycznej wiedzy i skrupulatnej dbałości o szczegóły, a także ścisłej eksperymentalnej kontroli natężenia przepływu w celu zapewnienia deterministycznej wydajności enkapsulacji. Te aspekty mogą wymagać optymalizacji dla różnych konfiguracji eksperymentalnych. Chociaż metoda ta opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania sygnałów, co wymaga dostępu do odpowiedniego sprzętu do obrazowania, sprzęt ten można wytwarzać przy użyciu sprzętu typu open source, co czyni go bardziej dostępnym. Co więcej, mikrożele mogą być przetwarzane w komercyjnej cytometrii przepływowej za pomocą dużych dysz, co jeszcze bardziej poprawia dostępność i przepustowość eksperymentalną. Do tej analizy cytometrycznej można również użyć sortowników kropelkowych.

Co więcej, chociaż metoda ta ma na celu wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych z plazmidów, barwników lub innych markerów, ogranicza się do komórek, które można znakować fluorescencyjnie, co może nie mieć zastosowania do wszystkich szczepów bakteryjnych lub warunków eksperymentalnych. Metodę tę można jednak dostosować do innych rodzajów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub mikroskopia jasnego pola, co pozwala na zastosowania fenotypowania wykraczające poza fluorescencję. Dodatkowo można go łączyć z technikami spektroskopowymi, takimi jak FTIR lub spektroskopia Ramana, rozszerzając jego możliwości w zakresie analizy składu chemicznego i informacji strukturalnych zamkniętych komórek. Adaptacje te poszerzają zakres jego zastosowania, czyniąc go wszechstronnym narzędziem dla różnych środowisk badawczych.

Znaczenie i zastosowania

Tradycyjne testy utraty plazmidu¹⁹ nie pozwalają na dobre określenie ilościowe stosunku komórek, które utraciły swoją ekspresję, informacje, które mogą być bardzo ważne w projektowaniu metod eksperymentalnych i różnych zastosowaniach biologicznych. Zazwyczaj typy kolonii są wyliczane w testach na płytkach agarowych, w których można uzyskać dobrze zdefiniowane izolowane kolonie, jak pokazano na rysunku 4. Jednak nakładające się na siebie kolonie są trudne do zidentyfikowania z całą pewnością; W naszych rękach nie zawsze uzyskujemy optymalną gęstość kolonii, a wiele płytek jest niezbędnych do uzyskania dobrych statystyk zdarzeń utraty plazmidów o niskiej częstotliwości. Proponowana metoda oferuje bardziej niezawodne podejście do dokładnego ilościowego oznaczania sygnałów fluorescencyjnych pochodzących z izolowanych kolonii o większej liczbie kolonii niż metody analogowe z płytką agarową, ponieważ w mikrokropelkach kolonie rozwijają się oddzielnie, są mniejsze i można je łatwo załadować do komór obrazowania, umożliwiając ilościowe określanie liczby dużych kolonii w oparciu o mikroskopię lub cytometrię przepływową. Może to znacznie poprawić statystyczną reprezentację metody i umożliwić integrację z innymi przepływami pracy z mikrokroplami żelu.

Wykorzystanie sprzętu typu open source^11,20 pozwala naukowcom dostosować projekt mikroprzepływowej stacji roboczej i precyzyjnie dostosować szczura przepływu; W związku z tym wielkość cząstek obsługuje różne typy komórek i warunki eksperymentalne. Elastyczność ta rozciąga się na potencjalne włączenie innych typów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub spektroskopia, co rozszerza możliwości zastosowania tej metody. Zdolność metody do oceny stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie dla zastosowań wymagających retencji plazmidu bez selekcji antybiotyków, w określonych warunkach stresu lub różnych generacjach kultur. Wszechstronność i zdolność adaptacji prezentowanej metody sprawiają, że jest ona cenna dla różnorodnych zastosowań badawczych w dziedzinach takich jak biologia syntetyczna, monitorowanie środowiska i diagnostyka kliniczna².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-oktanol	Sigma-Aldrich	370533-25G	Do rozbijania emulsji
70% etanolu			Do przenikania komórek
Agar-Agar	Winkler	9002-18-0
Dziurkacz			0,75 mm i 1,8 mm
Niebieski transiluminator LED	IO Rodeo
Probówka do hodowli
Eksykator			Z pompą próżniową
Jednorazowy kubek			Do mieszania PDMS
Jednorazowy widelec			Do mieszania PDMS
E. coli Szczep
Mikroskop FluoPi	https://github.com/wenzel-lab/FluoPi		Zielony system obrazowania fluorescencyjnego do analizy płytek
Olej fluorowany	3M		Novec 7500
Szklana grzałka ślizgowa	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring		Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & stopni; C z chipem mikroprzepływowym
Szkiełka szklane
Płyta grzejna	Mechaniczna		Do odparowywania Aquapel
Oprogramowanie do analizy obrazu	Fiji/ImageJ		2.14.0/1.54f
Inkubator	Mundo Lab		MLAB Scientific / Do inkubacji płytek i mikrożeli
Izopropanol			Do czyszczenia szkiełek Stężenie
Kanamycyny			100 ug/ml
Rozsiewacz			Do rozprowadzania bakterii na płytkach agarowych
Forma			Wzór chipa na wafli silikonowej lub szklanej
Mikroprobówki			2 ml
roztworu			Sód chlorek 0,9% w/v
https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platformStolik		mikroskopii stroboskopowej o otwartym kodzie źródłowym	Do mikroskopii w jasnym polu
Szalka Petriego	Citotest	2303-1090	90 x 15 mm
Grzałka końcówki do pipet	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring		Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & deg; C końcówki pipety
Myjka plazmowa	Diener Electronic	117056	Do klejenia PDMS za pomocą szkiełka
Plazmid pCA_Odd1			Koduje oporność na sfGFP i kanamycynę
Rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE)	Adtech Polymer Engineering Ltd
Wstępnie zmieszane medium Luria Bertoni	US Biological Life Science	L1520
Propidium jodek (PI)			Do barwienia
System regulatora ciśnienia i przepływu oparty na Raspberry Pi	https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller		Do kontrolowania ciśnienia i natężenia przepływu
Podstawa elastomeru silikonowego	Zestaw Sylgard		PDMS - 184 Zestaw elastomerów
silikonowych Utwardzacz z elastomeru silikonowego	Sylgard		PDMS kit - 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Spektrofotometr			Do pomiaru absorbancji
Mikroskop SQUID	https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform		System obrazowania multifluorescencyjnego do analizy barwionych komórek
Sterylna pętla			Do zbierania kolonii i powlekania smugami
Środek powierzchniowo czynny	Fluidics		Sphere Pico-Surf
Strzykawki	NIPRO		Z filtrami i rurkami
Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą	Pęseta
Ultra-niska temperatura żelowania agaroza	Sigma-Aldrich	A2576-5G	Do generowania kulek hydrożelowych
			mikrokanały urządzenia PDMS