Dostępny przepływ pracy mikroprzepływów o otwartym kodzie źródłowym jest prezentowany do równoległej analizy retencji plazmidu u bakterii. Dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia obecności plazmidu w mikrokoloniach jednokomórkowych w mikrokropelkach żelu, metoda ta stanowi precyzyjną, dostępną i skalowalną alternatywę dla tradycyjnego liczenia płytek.
Artykuł metodologiczny
Analiza stabilności plazmidu za pomocą mikrofluidyki kropelkowej typu open source
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plazmidy odgrywają istotną rolę w biologii syntetycznej, umożliwiając wprowadzanie i ekspresję obcych genów w różnych organizmach, ułatwiając w ten sposób budowę obwodów biologicznych i ścieżek wewnątrz i pomiędzy populacjami komórek. W przypadku wielu zastosowań utrzymanie funkcjonalnych plazmidów bez selekcji antybiotyków ma kluczowe znaczenie. Badanie to wprowadza otwarty, sprzętowy mikroprzepływowy przepływ pracy do analizy retencji plazmidu poprzez hodowlę pojedynczych komórek w mikrokropelkach żelu i ilościowe określanie mikrokolonii za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Takie podejście pozwala na równoległą analizę wielu kropel i mikrokolonii, zapewniając większą moc statystyczną w porównaniu z tradycyjnym liczeniem płytek i umożliwiając integrację testu z innymi przepływami pracy mikroprzepływowymi kropel. Stosując plazmidy wyrażające białka fluorescencyjne wraz z niespecyficznym fluorescencyjnym barwieniem DNA, pojedyncze kolonie można zidentyfikować i zróżnicować na podstawie utraty plazmidu lub ekspresji markera fluorescencyjnego. Warto zauważyć, że ten zaawansowany przepływ pracy, zaimplementowany za pomocą sprzętu typu open source, oferuje precyzyjną kontrolę przepływu i zarządzanie temperaturą zarówno próbki, jak i chipa mikroprzepływowego. Funkcje te zwiększają łatwość obsługi, niezawodność i dostępność przepływu pracy. Chociaż badanie koncentruje się na Escherichia coli jako modelu eksperymentalnym, prawdziwy potencjał metody tkwi w jej wszechstronności. Może być przystosowany do różnych badań wymagających kwantyfikacji sygnału fluorescencji z plazmidów lub barwników, a także do innych zastosowań. Przyjęcie sprzętu typu open source poszerza potencjał przeprowadzania wysokoprzepustowych analiz biologicznych przy użyciu dostępnej technologii w różnych warunkach badawczych.
Wprowadzenie
Plazmidy są niezbędnymi elementami genetycznymi w komórkach prokariotycznych, znacząco przyczyniając się do ewolucji mikroorganizmów poprzez boczny transfer DNA i szybką adaptację do zmian środowiskowych1,2. Te pozachromosomalne cząsteczki DNA zawierają geny, które zapewniają korzystne cechy, takie jak oporność na antybiotyki, funkcje metaboliczne i czynniki wirulencji, co czyni je cennymi dla badań mikrobiologicznych, biologii syntetycznej i badań nad ewolucją2. Jednak utrzymanie plazmidu w populacjach komórek jest trudne ze względu na obciążenie metaboliczne związane z replikacją i segregacją, często skutkujące utratą plazmidu bez presji selekcyjnej3. Dodatkowo, stabilne dziedziczenie wymaga mechanizmów, takich jak systemy toksyna-antytoksyna i partycjonowanie, co komplikuje utrzymanie plazmidu. Ocena stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i zastosowań praktycznych, które wykorzystują plazmidy jako podstawowy element badań4,5. Większość obecnych metod oceny stabilności plazmidu ma znaczące ograniczenia: metody oparte na cytometrii przepływowej dostarczają pośrednich danych na poziomie populacji, wymagają drogiego sprzętu i nie mają bezpośredniej wizualizacji kolonii6. Masowe metody transkryptomiki i proteomiki są kosztowne, zapewniają tylko średnie odpowiedzi komórkowe i nie mogą bezpośrednio określić ilościowo retencji plazmidu w poszczególnych koloniach6. Tradycyjne metody, takie jak seryjne rozcieńczanie i pasażowanie, są proste, ale czasochłonne i brakuje im precyzji i reprezentatywności7. Ogólnie rzecz biorąc, ilościowe wnioskowanie lub prognozowanie liczby kolonii, które zachowują określony funkcjonalny plazmid w czasie lub pod presją selekcyjną, pozostaje wyzwaniem.
Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiono nowatorski przepływ pracy mikroprzepływowej wykorzystujący otwarte instrumenty badawcze do ilościowego określania sygnałów fluorescencyjnych w wielu izolowanych koloniach bakterii, używając Escherichia coli jako modelu. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustową i precyzyjną analizę retencji plazmidu w różnych warunkach lub ciśnieniach selekcyjnych. Analiza rozdzielczości pojedynczej komórki zapewnia precyzyjną metodę manipulowania izolowanymi koloniami, dostarczając wrażliwych danych na temat kwantyfikacji plazmidu, które mogą pomóc w ocenie wskaźników retencji i straty4.
Mikrofluidyka, szczególnie mikrofluidyka kropelkowa, stała się potężnym narzędziem do hermetyzacji i manipulowania pojedynczymi komórkami w kontrolowanych środowiskach8. W szczególności kropelki mikrożelu mogą otaczać pojedyncze komórki w celu uzyskania wysokiej przepustowości i precyzyjnej analizy bez konieczności utrzymywania kropelek zawieszonych w oil9, co pozwala na kontrolowane badanie dynamiki plazmidu w określonym mikrośrodowisku. Po enkapsulacji zawiesin komórkowych bezpośrednio z końcówki pipety10, techniki fluorescencji mogą być stosowane do monitorowania wzrostu mikrokolonii w kropelkach, umożliwiając szczegółową analizę retencji i segregacji plazmidu pod różnymi ciśnieniami selekcyjnymi3.
Zalety tej metody w porównaniu z tradycyjnymi technikami hodowli masowej obejmują zwiększoną precyzję, zmniejszoną zmienność i możliwość przeprowadzania analiz o wysokiej przepustowości. Technologia mikroprzepływów typu open source pokonuje ograniczenia kosztownych systemów własnościowych, takie jak problemy z dostępnością, zdolnością adaptacji i konserwacją, które często utrudniają postęp badań11,12,13. Demonstrując, jak zastosować zaawansowany eksperymentalny przepływ pracy analizy retencji plazmidu w mikrożelach za pomocą oprzyrządowania typu open source, zapewniono dostępną i niezawodną metodę badań w zakresie biologii plazmidowej, zastosowań biologii syntetycznej i technik analizy kropel mikroprzepływowych.
Podsumowując, ten artykuł przedstawia przystępną metodę ilościowej oceny retencji plazmidu u E. coli o wysokiej mocy statystycznej. Możliwości tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem do pogłębiania wiedzy na temat biologii plazmidów i ulepszania zastosowań biologii syntetycznej.
Protokół
Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd oceny stabilności plazmidu w E. coli. Szczegóły dotyczące użytych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów. Surowe dane oraz skrypty do wizualizacji są dostępne pod adresem https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK.
Rycina 1: Dzień po dniu – protokół oceny stabilności plazmidu w E. coli. Niebieskie strzałki wskazują etapy wykonywane w ciągu dnia, a fioletowe strzałki wskazują inkubację nocną. Każda inkubacja w cieczy i na agarze była przeprowadzana w 37 °C wraz z oddzielną probówką/płytką kontrolną ujemną. Należy pamiętać, że przygotowanie hodowli komórkowej i pasażowanie nie są wymagane w przypadku próbek rzeczywistych, w których mogło już dojść do utraty plazmidu, zatem protokół należy skrócić do jednego lub dwóch dni, jeśli uwzględniono hodowlę referencyjną na płytce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
1. Przygotowanie chipa mikroprzepływowego
UWAGA: W niniejszym protokole do enkapsulacji komórek można zastosować różne komercyjne lub niestandardowe konstrukcje chipów, które w reżimie kropelkowym są w stanie generować krople wody w oleju o średnicy mniejszej niż 100 µm. Na potrzeby niniejszego badania chip został zaprojektowany i wykonany (patrz dane artykułu https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK) zgodnie z metodą projektowania i produkcji opisaną w poprzedniej publikacji14.
- Należy pozyskać lub przygotować mikroprzepływowy chip PDMS na szkle, wykorzystując matrycę zaprojektowaną do generowania mikrokropelek żelu.
- Do chipa należy wstrzyknąć roztwór hydrofobowy (fluoroalkilosilan), aby nadać wewnętrznym mikrokanałom właściwości hydrofobowe. Roztwór należy wprowadzić przez wloty, upewniając się, że wszystkie kanały są wypełnione cieczą. Wypełnione kanały należy pozostawić na około 30–60 s.
- Roztwór należy usunąć z urządzenia, wtłaczając powietrze do wewnętrznych mikrokanałów. Należy użyć pustej strzykawki z powietrzem do wypłukania kanałów oraz chłonnej chusteczki nad pozostałymi portami, aby zapobiec rozchlapywaniu.
- Przetworzone urządzenie należy wygrzać na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 15 min, aby odparować nadmiar roztworu. Alternatywnie urządzenie można przechowywać w lodówce (4 °C) przez noc.
UWAGA: Chip mikroprzepływowy jest gotowy do użycia. W tym miejscu protokół można przerwać.
2. Przygotowanie próbek
- Pozyskiwanie komórek
UWAGA: Hodowla komórkowa w kropelkach może dostarczyć istotnych danych na temat dynamiki plazmidów. Jako eksperymentalny model bakteryjny wykorzystano szczep E. coli TOP10 z plazmidem pCA_Odd1 (patrz dane złożone: https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), który koduje superfolder zielone białko fluorescencyjne (sfGFP) oraz oporność na kanamycynę15. Bakterie, plazmid i pożywki wzrostowe mogą się różnić w zależności od systemu eksperymentalnego.- Przygotować agar Luria Bertoni (LB), rozpuszczając 25 g gotowej mieszanki LB i 12 g agaru w 800 mL wody destylowanej (dH2O). Przygotować również płynną pożywkę LB, rozpuszczając 25 g gotowej mieszanki LB w 800 mL dH2O. Roztwory poddać autoklawowaniu i pozwolić im ostygnąć do około 60 °C. Przenieść próbki do środowiska sterylnego, np. do komory z laminarnym przepływem powietrza, w celu wykonania kolejnych kroków.
UWAGA: Gotowy proszek LB zawiera 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl. Można również stosować samodzielnie przygotowaną pożywkę agarową LB. - Dodać 50 µL kanamycyny (przygotowanej w stężeniu 100 mg/mL) do 50 mL płynnego agaru LB (stężenie końcowe: 100 µg/mL). Wymieszać roztwór, kilkukrotnie odwracając probówkę.
- Wlać około 15 mL płynnego agaru LB na każdą płytkę Petriego (90 mm x 15 mm). Przygotować dwie płytki: jedną dla kontroli negatywnej (monitorowanie kontaminacji) i jedną dla hodowli eksperymentalnej. Pozostawić roztwór agaru LB do ostygnięcia i zestalenia, aż kolor na obu płytkach zmieni się z ciemnego na przejrzysty.
- Za pomocą sterylnej pętli wysiać szczep E. coli na płytce hodowlanej, stosując metodę pasową. Zamrożony w glicerolu stok E. coli natychmiast po użyciu umieścić z powrotem w temperaturze –80 °C. Zamknąć obie płytki i inkubować przez noc w 37 °C (dzień 1).
- W dniu 2. sprawdzić płytkę kontrolną pod kątem obecności jakichkolwiek kolonii jako sygnału kontaminacji (w takim przypadku powtórzyć kroki od 2.1.4.). Zidentyfikować pojedyncze kolonie fluorescencyjne na płytce z E. coli za pomocą transiluminatora światła niebieskiego w celu przygotowania płynnego stoku hodowli.
- W warunkach sterylnych otworzyć płytkę i za pomocą sterylnej pętli lub końcówki pipety 200 µL pobrać wybraną kolonię i przenieść ją do probówki z 5 mL świeżej płynnej pożywki LB i 5 µL kanamycyny (przygotowanej w stężeniu 100 mg/mL). Przygotować probówkę kontrolną negatywną bez szczepienia do monitorowania kontaminacji. Inkubować probówki z hodowlą przez noc w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 220 rpm.
- Prowadzić pasaż próbki przez dodatkowe 3 dni w pożywce bez antybiotyków, aby zasymulować warunki, w których może dojść do utraty plazmidu. W dniach 3, 4 i 5 przenieść 50 µL hodowli nocnej do nowej probówki zawierającej 5 mL płynnego LB bez antybiotyków. Inkubować przez noc w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 220 rpm. Powtarzać ten krok aż do dnia 6., uzyskując końcową hodowlę 5 mL po czterech pasażach.
- Przenieść 50 µL z końcowej hodowli nocnej do nowej probówki zawierającej 2 mL płynnego LB. Pozwolić hodowli osiągnąć gęstość optyczną (OD600) na poziomie 0,3, monitorując ją spektrofotometrem (około 3–4 h).
UWAGA: Świeżą hodowlę należy wykorzystać przed dalszym wzrostem OD600, aby zapewnić, że bakterie znajdują się w logarytmicznej fazie wzrostu. Jeśli nie uda się osiągnąć pożądanej koncentracji, powtórzyć od kroku 2.1.8.
- Przygotować agar Luria Bertoni (LB), rozpuszczając 25 g gotowej mieszanki LB i 12 g agaru w 800 mL wody destylowanej (dH2O). Przygotować również płynną pożywkę LB, rozpuszczając 25 g gotowej mieszanki LB w 800 mL dH2O. Roztwory poddać autoklawowaniu i pozwolić im ostygnąć do około 60 °C. Przenieść próbki do środowiska sterylnego, np. do komory z laminarnym przepływem powietrza, w celu wykonania kolejnych kroków.
- Mieszanina komórek z agarozą do enkapsulacji
UWAGA: Kontrola stężenia jest niezbędna, aby zapewnić enkapsulację pojedynczych komórek w kropelkach. Wymagane stężenie komórek można obliczyć dla docelnego stopnia enkapsulacji i konkretnej objętości kropelki, jak pokazano w poniższym przykładzie:
Objętość kropelki (Vdrop): W przypadku generowania kropelek o rozmiarze 50 µm
Pożądana liczba komórek na kropelkę (Cpd): Średnio jedna komórka na pięć kropelek (0,2 komórki/kropelka)
Współczynnik rozcieńczenia: Początkowe stężenie komórek uzyskuje się w kroku 2.1.8
W tym przypadku generowane są kropelki o średnicy 50 μm lub 100 μm (bez podziału kropelki) (65–520 pL), w których enkapsulowana jest około jedna komórka na pięć kropelek, lub 1,6 komórki na kropelkę bez podziału. Dla E. coli należy zastosować przelicznik: 1 jednostka OD600 ≈ 7,8 x 108 komórek/mL16. Pomnożyć wartość OD600 z kroku 2.1.8 przez ten przelicznik, aby uzyskać stężenie początkowe (komórki/mL) hodowli.- Resuspender E. coli z przygotowanego stoku hodowli w płynnym LB bez kanamycyny do stężenia 6,2e+6 komórek/mL (stężenie docelowe dla kropelek o średnicy 50 μm). Przechowywać zawiesinę bakteryjną w temperaturze pokojowej aż do zmieszania z agarozą.
UWAGA: Antybiotyki będą hamować tworzenie się mikrokolonii negatywnych, dlatego niezbędne jest wyeliminowanie ich z pożywki w eksperymentach dotyczących utraty plazmidu. - Przygotować agarozę o bardzo niskiej temperaturze żelowania, podgrzewając ją do 90 °C w płynnym LB w stężeniu 2% (w/v). Mieszać mieszaninę przez 10 min w wytrząsarce z kontrolą temperatury.
- Obniżyć temperaturę w wytrząsarce termicznej do 39 °C, aby schłodzić roztwór agarozy. Równolegle umieścić probówkę z zawiesiną bakterii w wytrząsarce termicznej na 4 min, aby ogrzać ją do 39 °C.
- Zmieszać zawiesinę bakterii i zawiesinę agarozy w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie agarozy 1% (w/v) z zawiesiną komórek o stężeniu 3,1e+6 komórek/mL. Przygotować roztwór kontrolny negatywny (monitorowanie kontaminacji) o tym samym stężeniu agarozy, używając płynnego LB zamiast zawiesiny bakterii.
UWAGA: Zawiesinę agaroza-komórki należy zużyć szybko, aby uniknąć zmian stężenia wynikających z wzrostu bakterii. Utrzymywać temperaturę w wytrząsarce termicznej na poziomie 39 °C, aby agaroza pozostała w stanie ciekłym aż do umieszczenia w podgrzewaczu końcówek do generowania kropelek.
- Resuspender E. coli z przygotowanego stoku hodowli w płynnym LB bez kanamycyny do stężenia 6,2e+6 komórek/mL (stężenie docelowe dla kropelek o średnicy 50 μm). Przechowywać zawiesinę bakteryjną w temperaturze pokojowej aż do zmieszania z agarozą.
3. Wysokoprzepustowa hodowla pojedynczych kolonii
- Układ eksperymentalny
- Zbuduj lub zdobądź pełną platformę przepływową open-source (patrz https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), obejmującą sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Alternatywnie zbuduj prostszy sprzęt open-source w postaci stolika mikroskopowego z funkcją stroboskopową (instrukcje budowy dostępne pod adresem https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ oraz repozytorium projektu pod adresem https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage).
UWAGA: Można również zastosować tradycyjny układ mikroprzepływowy z komercyjnym mikroskopem, szybką kamerą oraz możliwością podgrzewania próbek. - Zintegrować system sterowania ciśnieniem i przepływem oparty na Raspberry Pi z otwartym kodem źródłowym, zgodnie z dokumentacją zawartą w wyznaczonym repozytorium (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller).
UWAGA: Sterowanie modułem zostało zilustrowane i zarchiwizowane w repozytorium danych (https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK). Alternatywnie można zastosować tradycyjne kontrolery ciśnienia lub pompy strzykawkowe o wysokim momencie obrotowym. - W układzie należy uwzględnić podgrzewacze do szkiełek przedmiotowych i końcówek pipet (https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring), aby kontrolować temperaturę próbki komórek w agarozie podczas wprowadzania jej do chipa.
UWAGA: Grzałki te, przedstawione w repozytorium danych (https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform oraz https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), stanowią istotny element otwartoźródłowego systemu sterowania, który umożliwia pracę z agarozą, i mogą być niedostępne w innych systemach komercyjnych.
- Zbuduj lub zdobądź pełną platformę przepływową open-source (patrz https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK), obejmującą sterowniki ciśnienia gazu i czujniki przepływu. Alternatywnie zbuduj prostszy sprzęt open-source w postaci stolika mikroskopowego z funkcją stroboskopową (instrukcje budowy dostępne pod adresem https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ oraz repozytorium projektu pod adresem https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage).
- Enkapsulacja pojedynczych komórek
- Umieść chip mikrofluidyczny na stole mikroskopu z funkcją stroboskopową, upewniając się, że widoczny jest węzeł generowania kropli (miejsce przecięcia się fazy wodnej i olejowej).
- Ustaw grzałkę końcówek pipet oraz grzałkę do szkiełek przedmiotowych na 40 °C przy użyciu interfejsu oprogramowania sterującego.
- Użyj strzykawki z drenem i korkiem z PDMS, aby wprowadzić mieszaninę 1% agarozy z zawiesiną komórkową do 200 μL końcówka do pipety. Wprowadź końcówkę do grzałki i umieść ją na wlocie fazy wodnej w chipie mikroprzepływowym. Wymień uszczelkę PDMS końcówki na taką, która jest połączona z przewodami systemu sterowania przepływem, i rozpocznij infuzję zawiesiny komórkowej.
- Włóż końcówkę przewodu wylotowego do probówki na odpady i ustaw na interfejsie użytkownika natężenia przepływu lub ciśnienia dla obu faz, aby powoli doprowadzać ciecz do kanału mikrofluidycznego. Użyj 200 µL/h (180 mbar) dla fazy wodnej i 1700 µL/h (320 mbar) dla fazy olejowej. Odczekać 1 min na stabilizację procesu generowania kropel.
UWAGA: Wartości ciśnienia zależą od rozmiarów kanałów w konstrukcji chipa, a wartości przepływu mogą wymagać dostosowania do różnych konstrukcji złączy generujących kropelki. - Po ustabilizowaniu procesu generowania kropli przenieś przewody odpływowe i zbierające do probówki odbiorczej. Kontynuuj zbieranie kropli aż do opróżnienia zbiornika z próbką. Powtórz kroki od 3.2.3 do 3.2.5, aby enkapsulować roztwór kontroli negatywnej z kroku 2.2.4.
UWAGA: Pobieranie próbek powinno zostać zakończone w ciągu 15 min. - Przechowywać probówki zbiorcze w lodzie podczas generowania kropel lub umieścić je w 4 °C po eksperymencie przez 1 h, aby agaroza żelowała wewnątrz kropelek.
UWAGA: Chip mikrofluidyczny może być użyty ponownie, jeśli mikrokanały nie są zapchane i zostanie załadowana ta sama zawiesina. Końcówkę pipety należy wyrzucić po zakończeniu generowania emulsji (kroki 3.2.3–3.2.5).
- Wzrost kolonii i uwalnianie z emulsji
- Przenieś mikrokrople żelowe zawierające bakterie oraz krople kontroli negatywnej do komory inkubacyjnej ustawionej na 37 °C.
- Inkubuj mikrokrople przez co najmniej 4 h lub przez noc, aby zapewnić wystarczający wzrost kolonii. Potwierdź, że w kontroli negatywnej nie występują oznaki kontaminacji. poprzez mikroskopia w polu jasnym
- Aby uwolnić kolonie z emulsji, należy usunąć za pomocą pipety lub strzykawki z igłą (w tym przypadku użyto igły o rozmiarze 21 G) jak największą ilość oleju znajdującego się poniżej emulsji mikrokropel żelowych.
- Transfer 50 µL mikrokropel żelu do nowej mikroprobówki i przechowywać w 4 °C do dalszej analizy kropel. Do pozostałej emulsji dodać mieszaninę olejku fluorowanego z 1H,1H,2H,2H-perfluorooktanolem (PFO) w stosunku 1:1 w objętości równej objętości emulsji.
- Dodać około 200 µL buforu fosforanowo-solnego (PBS) lub buforu NaCl 0,9% m/v na powierzchnię emulsji. Mieszaninę wymieszać w wstrząsarzu wortex i krótko odwirować w wirówce o stałej prędkości.
- Ostrożnie usuń fazę olejową z dołu granicy faz cieczowych i odrzuć ją. 100 µL PBS od góry. Powtórzyć kroki 3.3.4–3.3.5, aby otrzymać wypłukane mikrhożele w buforze PBS z minimalną ilością pozostałości oleju lub całkowicie bez nich.
UWAGA: Mikrogale osadzają się na granicy faz cieczy; należy unikać ich usuwania wraz z fazą olejową.
4. Analiza pojedynczych kolonii
- Barwienie komórek
UWAGA: W ramach niniejszego protokołu można zastosować wiele różnych kombinacji barwień. W zasadzie należy wybrać barwnik do DNA lub ścian komórkowych o kolorze odmiennym od koloru białka fluorescencyjnego kodowanego przez plazmid, który może być analizowany przy użyciu dostępnych kombinacji filtrów w mikroskopie fluorescencyjnym. W tym przypadku DNA komórek zabarwiono jodkiem propidyny (PI), aby odróżnić jego fluorescencję od zielonego białka fluorescencyjnego kodowanego na plazmidach, jednak można zastosować wiele innych barwników do DNA.
OSTRZEŻENIE: PI jest potencjalnym kancerogenem i należy go obchodzić, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej. Barwnik należy utylizować w bezpieczny sposób, zgodnie z lokalnymi przepisami.- Odwiruj przemyte mikrogale z prędkością około 80 x g g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odpiłować supernatant za pomocą pipety.
- Przenieś 50 $\mu$L mikrogeli do nowej mikroprobówki, aby służyły jako kontrola negatywna dla obróbki etanolem.
UWAGA: Barwnik PI wnika wyłącznie do komórek z uszkodzonymi błonami, takich jak komórki poddane działaniu etanolu. - Do pozostałych mikrogeli należy dodać taką samą objętość 70% etanolu i krótko wymieszać za pomocą wibratora (vortex). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min w celu permeabilizacji błon bakteryjnych dla barwienia PI. Powtórzyć krok 4.1.1.
- Dodaj do mikrożeli taką samą objętość 0,9% (m/v) NaCl i krótko wymieszaj na wortexie. Powtórz krok 4.1.1.
- Dodaj 2 µL PI (1 mg/mL) do obu próbek w mikroprobówkach. Wymieszać dokładnie i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 min.
UWAGA: Jeśli w kontroli negatywnej pojawi się jakikolwiek czerwony sygnał fluorescencyjny poprzez podczas mikroskopii fluorescencyjnej integralność kolonii mogła zostać naruszona podczas ich ekspozycji na inne roztwory w poprzednich krokach.
- Mikroskopia
UWAGA: Obrazy kropli i mikrogeli są rejestrowane przy użyciu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego w celu wyznaczenia rozkładu wielkości kropli oraz fluorescencji kolonii bakteryjnych w mikrogelach (Rysunek 2). W tym przypadku wykorzystano otwartoźródłową platformę mikroskopii odwróconej (https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform)17 stosuje się z obiektywem 10x 0,3 NA, białą matrycą LED do oświetlenia w polu jasnym oraz diodą LED 470 nm do wzbudzenia. Do obrazowania kropli i mikrogeli można użyć komercyjnych mikroskopów epifluorescencyjnych. Wymagana jest kalibracja, ponieważ oświetlenie i filtry różnią się w zależności od modelu, marki oraz zastosowanych białek fluorescencyjnych.- Transfer 2 μL mikrokropel żelu do szkiełka komory obrazującej i dodaj 5 μL oleju fluorowanego, aby pomóc w utworzeniu monowarstwy kropel w celu optymalizacji obrazowania.
UWAGA: Komory do liczenia komórek lub proste komory mikrofluidyczne mogą pomóc w cienkim rozprowadzeniu emulsji i spowolnić proces schnięcia. - W mikroskopie uruchom białe oświetlenie macierzowe LED z góry dla obrazowania w polu jasnym. Zamontuj przygotowany preparat, ustaw ostrość na próbce i zlokalizuj monowarstwę kropli. Wykonaj zdjęcie w polu jasnym.
- Bez przesuwania próbki należy wykonać obraz fluorescencyjny kolonii, przełączając się na diodę LED o długości fali 470 nm w celu wzbudzenia. Należy ustawić koło filtrowe tak, aby dopasować je do filtra dla zielonej długości fali do obrazowania sfGFP. Należy przeskanować wszystkie obszary zawierające monowarstwy kropel i powtórzyć kroki 4.2.2–4.2.3, aby zapewnić istotność statystyczną analizy kropel.
- Transfer 2 µL barwionych mikrogeli do chipa z komorą obrazującą i 5 µL 0,9% (w/v) NaCl, aby pomóc w utworzeniu monowarstwy mikrogeli. Uszczelnij wlot i wylot chipa, aby zapobiec odparowaniu podczas obrazowania.
UWAGA: Parowanie może wpływać na kolokalizację znaczników fluorescencyjnych. Do długotrwałego obrazowania zaleca się stosowanie komór mikroprzepływowych. - Powtórz kroki 4.2.2–4.2.3. Dostosuj filtr przedziału długości fali czerwonej do obrazowania PI i wykonaj odpowiednie zdjęcia.
- Po zakończeniu obrazowania w jednym obszarze należy odnaleźć na preparasie kolejny odpowiedni obszar z monowarstwą mikrogeli i powtórzyć proces obrazowania, aby zapewnić istotność statystyczną oraz kompleksową analizę próbki.
- Transfer 2 μL mikrokropel żelu do szkiełka komory obrazującej i dodaj 5 μL oleju fluorowanego, aby pomóc w utworzeniu monowarstwy kropel w celu optymalizacji obrazowania.
Rycina 2: Obrazy mikroskopowe i ich analiza. Obrazowanie fluorescencyjne i analiza kolonii w mikrogelach. (A–C) Kanały obrazowania pozyskane za pomocą mikroskopii jasnopolowej i fluorescencyjnej przy użyciu mikroskopu odwróconego. Obraz kompozytowy (D) pokazuje obecność kolonii negatywnej (tylko fluorescencja czerwona) wewnątrz mikrogeli. (E–H) Wyniki przepływu analizy obrazu. Poprzez generowanie ROI (regionów zainteresowania), kolonie mogą zostać zidentyfikowane w kanałach czerwonym i zielonym, a sygnały mogą zostać ilościowo określone w celu zdefiniowania obecności kolonii negatywnych. Paski skali: 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Analiza obrazu
UWAGA: Aby przeanalizować sygnały fluorescencyjne z enkapsulowanych kolonii i zidentyfikować rzadkie zdarzenia, obrazy z obrazowania w polu jasnym i fluorescencyjnego można przetwarzać za pomocą oprogramowania Fiji/ImageJ (Rycina 3). Kroki te można zaimplementować w skrypcie makra, a wartości parametrów mogą się różnić w zależności od konfiguracji optycznej.- Otwórz obrazy z kanałów zielonego i czerwonego. Zdefiniuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) zaczynający się w współrzędnych (500, 500) o szerokości i wysokości 2000 pikseli każdy.
UWAGA: Parametry te odnoszą się do obrazów o rozmiarze 3000 x 3000 pikseli, a ROI definiuje obszar o lepszym oświetleniu. - Przytnij obraz do zdefiniowanego prostokątnego ROI. Odejmij stałą wartość 10 od intensywności każdego piksela i zastosuj filtr wygładzający do obrazu, aby zredukować szum tła i sprawić, by obiekty zainteresowania były bardziej wyraźne.
UWAGA: Tylko ten obszar zostanie wykorzystany do dalszej analizy. - Stwórz kopię obrazu z kanału czerwonego i przekonwertuj go na maskę binarną, aby zidentyfikować rzadkie zdarzenia związane z plazmidem. Ustaw wartości progu między 10 a 255. Piksele w tym zakresie zostaną uznane za pierwszy plan (obiekty zainteresowania), a pozostałe za tło.
- Wykonaj operacje morfologiczne, aby zamknąć małe przerwy i wypełnić wszelkie otwory wewnątrz obiektów zainteresowania. Zastosuj algorytm watershed w celu oddzielenia nakładających się obiektów w masce binarnej.
- Przeanalizuj cząstki w masce binarnej. Uwzględnij tylko cząstki o rozmiarze większym niż 30 pikseli i kolistości od 0,50 do 1,00. Wyniki zostaną podsumowane i dodane do tabeli wyników. Zapisz zestaw ROI wykrytych podczas analizy cząstek do dalszej wizualizacji.
- Wyświetl zapisane ROI na obrazach z kanałów zielonego i czerwonego. Zmierz intensywność lub inne właściwości ROI w tych obrazach. Zapisz pomiary w tabeli wyników i wyeksportuj je do oddzielnych plików CSV w celu dalszej analizy statystycznej.
- Otwórz obrazy z kanałów zielonego i czerwonego. Zdefiniuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) zaczynający się w współrzędnych (500, 500) o szerokości i wysokości 2000 pikseli każdy.
Rysunek 3: Schemat analizy obrazu w celu identyfikacji kolonii negatywnych. Rysunek przedstawia krok po kroku proces automatycznego przetwarzania i oceny obrazów fluorescencyjnych. Proces opiera się na kolokalizacji znaczników fluorescencyjnych oraz analizie cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
5. Analiza porównawcza na płytkach agarowych
UWAGA: Aby porównać metodę kropelkową z tradycyjnym testem na płytkach, w kroku 2.1.8. przeprowadzono kwantyfikację fluorescencyjnych kolonii tego samego szczepu E. coli przy użyciu szalek Petriego. Służyło to jako analogiczna metoda kontrolna do pomiaru stabilności plazmidu sfGFP. Zobacz także ilustrację metody na Rysunku 1.
- Przygotować agar LB (bez antybiotyku) zgodnie z opisem w kroku 2.1.1 z sekcji Pozyskiwanie komórek. Schłodzić agar poniżej 60 °C i go zhomogenizować.
- W warunkach sterylnych wlać 15 mL pożywki agarowej do każdej szalki Petriego. Pozostawić płytki do zestalenia z częściowo otwartymi pokrywkami, aż będą gotowe do użycia.
- Zaszczepić trzy płytki, nakładając na każdą po 10 µL kultury E. coli w medium LB o wartości OD600 wynoszącej 0,007 ± 0,002. Rozprowadzić równomiernie za pomocą rozprzestrzeniacza w kształcie litery L. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, zamknięte i odwrócone dnem do góry. Przygotować w tych samych warunkach płytkę kontrolną bez bakterii.
- Po 24 h wykonać obrazy fluorescencyjne płytek, używając FluoPi, otwartoźródłowego systemu obrazowania fluorescencyjnego (https://github.com/RudgeLab/FluoPi)15.
UWAGA: FluoPi składa się z kamery Raspberry Pi z niebieskim światłem wzbudzenia o długości fali scentrowanej na 470 nm oraz akrylowych filtrów wzbudzenia i emisji. - Ręcznie przeliczyć kolonie fluorescencyjne i niefluorescencyjne na każdej płytce, korzystając z uzyskanych obrazów.
Wyniki
Walidacja enkapsulacji komórek i tworzenia mikrokolonii
Enkapsulację komórek można potwierdzić wizualnie, wykonując mikroskopię w polu jasnym mikro kropli żelu przed rozbiciem emulsji i przemyciem mikrogeli. Reprezentatywny wynik emulsji na tym etapie przedstawiono na Rysunku 4.
Rysunek 4: Fragment nałożonego obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej. Po inkubacji przez noc reprezentatywne mikrokolonie E. coli wykazujące ekspresję sfGFP wewnątrz żelowych mikrokropli. Użyto obiektywu mikroskopowego o powiększeniu 10x i NA 0,30. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wyniki analizy obrazu
Po zabarwieniu mikrogeli oraz pozyskaniu obrazów w świetle przechodzącym oraz w kanałach fluorescencyjnych w kilku pozycjach, możliwe jest zwizualizowanie kolonii zidentyfikowanych jako negatywne na obrazach pierwotnych (patrz Rysunek 5A). Dane wyekstrahowane ze wszystkich obrazów jednego eksperymentu można przedstawić na wykresie w celu ukazania stosunku fluorescencji różnych kolonii, co pozwala wyróżnić te, które utraciły fluorescencję kodowaną przez plazmid (patrz Rysunek 5B). Wyniki wskazują, że 100 kolonii utraciło plazmid lub funkcjonalność plazmidu z całkowitej liczby 2785 analizowanych mikrokolonii, co odpowiada 3,6%.
Rycina 5: Ilościowe oznaczenie negatywnych mikrokolonii. (A) Fragment nałożonego obrazu z mikroskopii fluorescencyjnej. Po usunięciu oleju i barwieniu, reprezentatywne kolonie w mikrogelach wykazujące ekspresję sfGFP oraz dwie kolonie negatywne wykazały czerwoną fluorescencję barwnika DNA (obwiedzione czarną linią). Pasek skali: 100 µm. (B) Wykres rozrzutu wartości fluorescencji poszczególnych mikrokolonii wyekstrahowanych z 16 wielokanałowych obrazów mikroskopowych. Kolonie bez fluorescencji zielonej uznano za negatywne, co zaznaczono kolorem czerwonym na wykresie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Ilościowe oznaczenie płytek agarowych
Zdjęcia trzech powtórnych szalek przedstawiono na Rysunku 6, gdzie białe strzałki wskazują kolonie niefluorescencyjne. Na pierwszej szalce (Rysunek 6A) widocznych było łącznie 213 kolonii, z czego 1 nie była fluorescencyjna. Na drugiej szalce (Rysunek 6B) znajdowało się łącznie 49 kolonii i nie stwierdzono kolonii niefluorescencyjnych. Na trzeciej szalce (Rysunek 6C) widocznych było łącznie 252 kolonie, z których 6 nie było fluorescencyjnych. Wyniki te odpowiadają średniej częstości utraty plazmidu przez kolonie na poziomie 2,3%, przy dużym odchyleniu standardowym wynoszącym 3,2.
Rycina 6: Identyfikacja kolonii negatywnych na płytkach. (A–C) Fluorescencyjne i niefluorescencyjne kolonie E. coli na płytkach z agarem LB (średnica: 90 mm, wysokość: 15 mm). Inokulum, pochodzące z zapasu E. coli z sfGFP przechowywanego w -80 °C, zostało wysiałe w 1. dniu, hodowane z antybiotykiem w 2. dniu, a następnie codziennie rozcieńczane 1:100 od 3. do 6. dnia, aby umożliwić utratę plazmidu. Kolonie inkubowano w 37 °C przez 24 h i obrazowano w komorze FluoPi. Kolonie niefluorescencyjne zostały uwydatnione w programie GIMP i wskazane białymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Wykazano, że metoda oparta na mikrokropelkach w żelu skutecznie identyfikuje i określa ilościowo kolonie z ekspresją genetyczną białek fluorescencyjnych kodowaną plazmidem i bez niej. Kolonie, które nie wykazują wystarczającej ekspresji produktu plazmidowego, są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika DNA (tutaj jodku propidyny), który barwi wszystkie kolonie i ma inną długość fali emisyjnej. Ta integracja mikrofluidyki kropelkowej, żelowania i mikroskopii fluorescencyjnej, wykorzystująca technologię open source, umożliwia realizację zaawansowanego przepływu pracy w wielu warunkach badawczych11,13. Pomyślne wygenerowanie mikrokropelek żelu umożliwia zaawansowane procesy pracy pojedynczej komórki w biologii molekularnej, w tym lizę komórek, amplifikację pojedynczego genomu, badania przesiewowe interakcji metabolicznych komórek, wymianę pożywek i wiele innych 8,9. Te zalety są wykorzystywane w tym protokole do hodowli, barwienia i analizowania mikrokolonii w bardziej skalowalny sposób niż w tradycyjnych testach opartych na płytkach.
Kroki krytyczne
Proces enkapsulacji jest krytyczną i delikatną częścią protokołu. Precyzyjna kontrola stężeń składników, natężeń przepływu i ciśnień jest wymagana do wytworzenia jednolitych mikrożeli w określonym zakresie wielkości i kontrolowania średniej liczby komórek na kroplę. Ponadto utrzymanie stężenia i temperatury mieszanki komórkowo-agarozowej zapobiega zbrylaniu się lub przedwczesnemu żelowaniu. Kontrola temperatury ciekłej zawiesiny agarozowo-komórkowej w końcówce pipety jest szczególnie korzystną implementacją naszej sprzętowej stacji roboczej mikrofluidyki typu open source, która zapewnia znacznie łatwiejsze i bardziej niezawodne wytwarzanie mikrożelu w porównaniu z wysiłkami zmierzającymi do kontrolowania temperatury pomp strzykawkowych i przewodów. Ponieważ komórki są mieszane z pożywką wzrostową agarozy przed enkapsulacją i hodowlą, mikrożele agarozy muszą być wytwarzane szybko, aby uniknąć poważnych zmian stężenia komórek. W tym celu zoptymalizowano konstrukcję mikroprzepływowego chipa rozdzielającego kropelki, zainspirowaną przez Abate i wsp.18.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów
Konieczne było kilka kalibracji i modyfikacji, aby udoskonalić oryginalny protokół. Kapsułkowanie agarozy jest znacznie trudniejsze niż zwykłe kropelki wody w oleju, co wymaga zaprojektowania systemu utrzymującego agarozę w stanie ciekłym przy jednoczesnym zapewnieniu, że przepływ fazy wodnej osiąga jednorodny zakres wielkości cząstek. Zmiany lepkości agarozy spowodowane żelowaniem wpływają na szybkość przepływu, prowadząc do większych rozmiarów cząstek. Mikroskopia wymaga starannego doboru filtrów i źródeł światła, aby zapewnić nienakładające się na siebie sygnały wzbudzenia i emisji w celu wyraźnego rozróżnienia. Początkowo DAPI został wybrany do barwienia bakterii, ale jego sygnał emisyjny pokrywał się z sfGFP, co spowodowało, że sfGFP został wykryty w niebieskim kanale detekcji. Przeszliśmy na PI, ponieważ jego emisja jest dobrze oddzielona od sfGFP na długich falach (czerwone światło).
Podczas gdy utratę plazmidu określono ilościowo przy użyciu proponowanej metody, zastosowany plazmid sfGFP był nieoczekiwanie stabilny, nie wykazując prawie żadnych przypadków utraty plazmidu w pierwszym pokoleniu komórek hodowanych bez antybiotyków, nawet w warunkach stresowych, takich jak pożywka pH9 i inkubacja w temperaturze 40 °C. Obserwacja ta jest zgodna z ustaleniami innych grup badawczych 1,19. Stabilność plazmidu ograniczyła demonstrację pełnych możliwości kwantyfikacji metody dla początkowych generacji kultur komórkowych, ale wykazała, że metoda jest wystarczająco czuła, aby wykryć nawet niewielkie różnice w retencji plazmidu. Obserwacja stabilności wysokoplazmidowej u wczesnych generacji ma ważne implikacje dla kropelkowych badań przesiewowych mikroprzepływowych przy użyciu testu selekcji negatywnej, takiego jak hamowanie bakterii docelowych. Oznacza to, że utrata plazmidu celów selekcyjnych jest niskim źródłem fałszywie dodatnich wyników selekcji. Ze względu na to, że kropelkowe przesiewacze mikroprzepływowe zazwyczaj przewyższają inne sita o wysokiej przepustowości, takie jak przepływy pracy robotów pipetujących, o rzędy wielkości pod względem przepustowości, te rzadkie zdarzenia muszą być oceniane i brane pod uwagę.
Ograniczenia
Pomimo swoich zalet, prezentowana metoda ma swoje ograniczenia. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych wymaga specjalistycznej wiedzy i skrupulatnej dbałości o szczegóły, a także ścisłej eksperymentalnej kontroli natężenia przepływu w celu zapewnienia deterministycznej wydajności enkapsulacji. Te aspekty mogą wymagać optymalizacji dla różnych konfiguracji eksperymentalnych. Chociaż metoda ta opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania sygnałów, co wymaga dostępu do odpowiedniego sprzętu do obrazowania, sprzęt ten można wytwarzać przy użyciu sprzętu typu open source, co czyni go bardziej dostępnym. Co więcej, mikrożele mogą być przetwarzane w komercyjnej cytometrii przepływowej za pomocą dużych dysz, co jeszcze bardziej poprawia dostępność i przepustowość eksperymentalną. Do tej analizy cytometrycznej można również użyć sortowników kropelkowych.
Co więcej, chociaż metoda ta ma na celu wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych z plazmidów, barwników lub innych markerów, ogranicza się do komórek, które można znakować fluorescencyjnie, co może nie mieć zastosowania do wszystkich szczepów bakteryjnych lub warunków eksperymentalnych. Metodę tę można jednak dostosować do innych rodzajów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub mikroskopia jasnego pola, co pozwala na zastosowania fenotypowania wykraczające poza fluorescencję. Dodatkowo można go łączyć z technikami spektroskopowymi, takimi jak FTIR lub spektroskopia Ramana, rozszerzając jego możliwości w zakresie analizy składu chemicznego i informacji strukturalnych zamkniętych komórek. Adaptacje te poszerzają zakres jego zastosowania, czyniąc go wszechstronnym narzędziem dla różnych środowisk badawczych.
Znaczenie i zastosowania
Tradycyjne testy utraty plazmidu19 nie pozwalają na dobre określenie ilościowe stosunku komórek, które utraciły swoją ekspresję, informacje, które mogą być bardzo ważne w projektowaniu metod eksperymentalnych i różnych zastosowaniach biologicznych. Zazwyczaj typy kolonii są wyliczane w testach na płytkach agarowych, w których można uzyskać dobrze zdefiniowane izolowane kolonie, jak pokazano na rysunku 4. Jednak nakładające się na siebie kolonie są trudne do zidentyfikowania z całą pewnością; W naszych rękach nie zawsze uzyskujemy optymalną gęstość kolonii, a wiele płytek jest niezbędnych do uzyskania dobrych statystyk zdarzeń utraty plazmidów o niskiej częstotliwości. Proponowana metoda oferuje bardziej niezawodne podejście do dokładnego ilościowego oznaczania sygnałów fluorescencyjnych pochodzących z izolowanych kolonii o większej liczbie kolonii niż metody analogowe z płytką agarową, ponieważ w mikrokropelkach kolonie rozwijają się oddzielnie, są mniejsze i można je łatwo załadować do komór obrazowania, umożliwiając ilościowe określanie liczby dużych kolonii w oparciu o mikroskopię lub cytometrię przepływową. Może to znacznie poprawić statystyczną reprezentację metody i umożliwić integrację z innymi przepływami pracy z mikrokroplami żelu.
Wykorzystanie sprzętu typu open source11,20 pozwala naukowcom dostosować projekt mikroprzepływowej stacji roboczej i precyzyjnie dostosować szczura przepływu; W związku z tym wielkość cząstek obsługuje różne typy komórek i warunki eksperymentalne. Elastyczność ta rozciąga się na potencjalne włączenie innych typów mikroskopii, takich jak mikroskopia z kontrastem fazowym lub spektroskopia, co rozszerza możliwości zastosowania tej metody. Zdolność metody do oceny stabilności plazmidu w różnych warunkach ma kluczowe znaczenie dla zastosowań wymagających retencji plazmidu bez selekcji antybiotyków, w określonych warunkach stresu lub różnych generacjach kultur. Wszechstronność i zdolność adaptacji prezentowanej metody sprawiają, że jest ona cenna dla różnorodnych zastosowań badawczych w dziedzinach takich jak biologia syntetyczna, monitorowanie środowiska i diagnostyka kliniczna2.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste nie mogły mieć wpływu na pracę opisaną w tym artykule.
Podziękowania
Ta praca jest częścią finansowanych projektów przyznanych T.W. przez ANID FONDECYT Regular 1241621 oraz projekt Chang Zuckerberg Initiative 'Latin American Hub for Bioimaging Through Open Hardware'. T.W. jest również wdzięczny za finansowanie z CIFAR, jako Azrieli Global Scholar w programie CIFAR MacMillan Multiscale Human.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-oktanol | Sigma-Aldrich | 370533-25G | Do rozbijania emulsji |
| 70% etanolu | Do przenikania komórek | ||
| Agar-Agar | Winkler | 9002-18-0 | |
| Dziurkacz | 0,75 mm i 1,8 mm | ||
| Niebieski transiluminator LED | IO Rodeo | ||
| Probówka do hodowli | |||
| Eksykator | Z pompą próżniową | ||
| Jednorazowy kubek | Do mieszania PDMS | ||
| Jednorazowy widelec | Do mieszania PDMS | ||
| E. coli Szczep | |||
| Mikroskop FluoPi | https://github.com/wenzel-lab/FluoPi | Zielony system obrazowania fluorescencyjnego do analizy płytek | |
| Olej fluorowany | 3M | Novec 7500 | |
| Szklana grzałka ślizgowa | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring | Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & stopni; C z chipem mikroprzepływowym | |
| Szkiełka szklane | |||
| Płyta grzejna | Mechaniczna | Do odparowywania Aquapel | |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | Fiji/ImageJ | 2.14.0/1.54f | |
| Inkubator | Mundo Lab | MLAB Scientific / Do inkubacji płytek i mikrożeli | |
| Izopropanol | Do czyszczenia szkiełek Stężenie | ||
| Kanamycyny | 100 ug/ml | ||
| Rozsiewacz | Do rozprowadzania bakterii na płytkach agarowych | ||
| Forma | Wzór chipa na wafli silikonowej lub szklanej | ||
| Mikroprobówki | 2 ml | ||
| roztworu | Sód chlorek 0,9% w/v | ||
| https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platformStolik | mikroskopii stroboskopowej o otwartym kodzie źródłowym | Do mikroskopii w jasnym polu | |
| Szalka Petriego | Citotest | 2303-1090 | 90 x 15 mm |
| Grzałka końcówki do pipet | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring | Do kontrolowania temperatury na poziomie 40 & deg; C końcówki pipety | |
| Myjka plazmowa | Diener Electronic | 117056 | Do klejenia PDMS za pomocą szkiełka |
| Plazmid pCA_Odd1 | Koduje oporność na sfGFP i kanamycynę | ||
| Rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) | Adtech Polymer Engineering Ltd | ||
| Wstępnie zmieszane medium Luria Bertoni | US Biological Life Science | L1520 | |
| Propidium jodek (PI) | Do barwienia | ||
| System regulatora ciśnienia i przepływu oparty na Raspberry Pi | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller | Do kontrolowania ciśnienia i natężenia przepływu | |
| Podstawa elastomeru silikonowego | Zestaw Sylgard | PDMS - 184 Zestaw elastomerów | |
| silikonowych Utwardzacz z elastomeru silikonowego | Sylgard | PDMS kit - 184 Zestaw elastomerów silikonowych | |
| Spektrofotometr | Do pomiaru absorbancji | ||
| Mikroskop SQUID | https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform | System obrazowania multifluorescencyjnego do analizy barwionych komórek | |
| Sterylna pętla | Do zbierania kolonii i powlekania smugami | ||
| Środek powierzchniowo czynny | Fluidics | Sphere Pico-Surf | |
| Strzykawki | NIPRO | Z filtrami i rurkami | |
| Wytrząsarka z kontrolowaną temperaturą | Pęseta | ||
| Ultra-niska temperatura żelowania agaroza | Sigma-Aldrich | A2576-5G | Do generowania kulek hydrożelowych |
| mikrokanały urządzenia PDMS |
Bibliografia
- Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance. Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).
- Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution. Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).
- Wein, T., Dagan, T. Plasmid evolution. Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).
- Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli. Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).
- Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).
- Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli. Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).
- Wang, R., et al. Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus. PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).
- Moragues, T., et al. Droplet-based microfluidics. Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).
- Vitalis, C., Wenzel, T. Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens. Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).
- Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms. J Vis Exp. (144), e57848(2019).
- Wenzel, T. Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment. PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).
- Murillo, L. F. R., Wenzel, T. Welcome to the journal of open hardware. J Open Hardware. 1 (1), (2017).
- Shin, J. H., Choi, S. Open-source and do-it-yourself microfluidics. Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).
- Pryszlak, A., et al. Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics. Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).
- Pollak, B., et al. Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication. Biology. 5 (1), (2020).
- Volkmer, B., Heinemann, M. Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling. PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).
- Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. bioRxiv. , (2020).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Faster multiple emulsification with drop splitting. Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).
- Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability. Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).
- Oellermann, M., et al. Open hardware in science: The benefits of open electronics. Integr Comp Biol. 62 (4), 1061-1075 (2022).
Przedruki i uprawnienia
