Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Przewód pokarmowy odgrywa kluczową rolę w trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych i wydalaniu odpadów z kałem¹. Dodatkowo działa jako bariera przed patogenami, rola wspierana przez zróżnicowany skład komórkowy, w tym komórki macierzyste, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki enteroendokrynne i enterocyty absorpcyjne². Homeostaza jelit może zostać zakłócona przez różne czynniki, takie jak infekcje bakteryjne³ lub procesy zapalne⁴, co prowadzi do poważnych konsekwencji dla organizmu, takich jak złe wchłanianie, biegunka, a nawet śmierć⁵. Badanie takich patofizjologicznych scenariuszy jest zwykle wykonywane przy użyciu zwierząt laboratoryjnych lub, zgodnie z zasadą 3R⁶, kultur komórkowych pochodzących od różnych gatunków. Dokładne przewidywanie i możliwość przenoszenia wyników mają kluczowe znaczenie w przypadku korzystania z modeli specyficznych dla gatunku⁷. Pomimo tej potrzeby zauważalny jest brak kultur komórkowych pochodzących od świń, które odpowiednio odwzorowują złożoność i funkcjonalność przewodu pokarmowego.

Aby sprostać temu wyzwaniu, które dotyczy również innych gatunków, opracowano trójwymiarowe (3D) organoidy w próbie odtworzenia fizjologicznej złożoności klasy GIT8. Początkowo organoidy tworzono z jelit ludzkich i myszy; Do tej pory z powodzeniem opracowano i wyhodowano również organoidy świń pochodzące od młodych i dorosłych świń^9,10. Od momentu powstania te organoidy świńskie zostały wykorzystane w kilku badaniach, koncentrujących się głównie na infekcjach jelitowych^11,12,13,14. Badania mające na celu scharakteryzowanie właściwości fizjologicznych, takich jak transport składników odżywczych czy procesy wydzielnicze, pozostają ograniczone¹⁵. Może to być spowodowane orientacją organoidów jelitowych, z powierzchnią wierzchołkową skierowaną do wewnątrz, a stroną podstawno-boczną na zewnątrz, co ogranicza dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Ograniczenie to zostało rozwiązane poprzez udaną hodowlę organoidów świń w formacie dwuwymiarowym¹⁶, metoda, która została jeszcze bardziej rozwinięta dzięki wykorzystaniu zamrożonej tkanki do ich generowania¹⁷.

Hodowla organoidów świń w 2D zapewnia dostęp do obu stron nabłonka, umożliwiając zastosowanie sprawdzonych metod do badania procesów transportu przez warstwę nabłonkową. Jedną z takich metod jest Ussing chamber¹⁸, która umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym elektrogenicznych procesów absorpcyjnych i wydzielniczych w całym nabłonku. Szerokie zastosowanie tego systemu umożliwiło kompleksowe zrozumienie funkcji jelit świń in vivo, obejmującej całą oś jelitową. Obejmuje to badania nad transportem monosacharydów lub transportem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub reakcjami na wtórne metabolity roślinne, takie jak resweratrol, które wpływają na charakterystykę transportu jelitowego^{19,20,21,22,23,24}. Znaczna część danych z tych badań ułatwia bezpośrednie porównania między dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo a środowiskiem in vitro organoidów świń, pogłębiając naszą wiedzę na temat ich fizjologicznego znaczenia.

W tym badaniu prezentujemy protokół do generowania i hodowli monowarstw 2D z organoidów 3D świń. Dodatkowo szczegółowo opisujemy podejście metodologiczne do ilościowego określania procesów transportu jelitowego przy użyciu techniki komory usinga. Protokół oferuje narzędzia do badania cech absorpcyjnych i wydzielniczych in vitro w organoidach jelita czczego i jelita grubego, co pozwala na bezpośrednie porównanie z dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo. Przyszłe zastosowania tego protokołu mogą obejmować badanie skutków substancji farmakologicznych lub toksykologicznych, a także badanie interakcji między nabłonkiem a patogenami.

Dla tego protokołu, dwie zdrowe świnie (Bentheim Blacked Pied pig; 1 samiec, 1 samica; 4,5 miesiąca; około 65 kg) zostały poświęcone przez postrzelenie bełtem i wykrwawienie. Zgodnie z ustawą o ochronie zwierząt takie postępowanie (ubój i usunięcie tkanek) nie jest klasyfikowane jako doświadczenie na zwierzętach, ale musi zostać zgłoszone urzędnikowi ds. dobrostanu zwierząt (nr rejestracyjny). TiHo-T-2023-15) Fundacji Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze.

1. Powlekanie wkładek

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnych materiałów pod szafą bezpieczeństwa. Wszystkie etapy protokołu są wykonywane na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Rozmrażać zamrożoną błonę podstawną na lodzie przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. Wymieszać błonę podstawną w stosunku 1:40 (v/v) z lodowato zimną sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w stożkowej probówce.
2. Wyjmij sterylne płytki z wkładkami z opakowania. Dodać 200 μl mieszanki membrany podstawnej do komory wierzchołkowej każdej wkładki.
3. Założyć pokrywę płytki studzienki i inkubować przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w inkubatorze.
4. Ostrożnie zassać roztwór przed wysianiem komórek. Upewnij się, że końcówka nie dotyka membrany podczas zasysania.

2. Generacja jednowarstwowych organoidów 2D

UWAGA: Organoidy jelita grubego świni są generowane i hodowane zgodnie z opisem dla organoidów jelita czczego u świń²⁵. Po wytworzeniu organoidów 3D należy je uprawiać przez co najmniej 3-4 tygodnie, podczas cotygodniowego pasażu, aby zapewnić stały wzrost. Liczba komórek w każdej kopule zawierającej organoidy 3D, które rozpuszczają się w kolejnych etapach, jest wystarczająca do pokrycia pojedynczego filtra transbłonowego. Przed generacją jednowarstwową, organoidy 3D zostały poddane optycznej kontroli jakości w celu sprawdzenia poprzedniego wzrostu i możliwego zanieczyszczenia (Rysunek 1).

Rysunek 1: Reprezentatywne organoidy 3D. Trójwymiarowe organoidy (A) jelita czczego i (B) jelita grubego są dokładnie badane pod mikroskopem przed wygenerowaniem monowarstw. Szczególną uwagę zwraca się na ocenę poprzednich wzorców wzrostu, integralności strukturalnej oraz obecności wszelkich zanieczyszczeń lub zanieczyszczeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Usunąć podłoże organoidowe (Tabela 1) ze studzienek z organoidami kryptowymi 3D. Dodać 1 ml lodowatego PBS do studzienki i delikatnie rozpuść błonę podstawną, pipetując w górę iw dół końcówką p1000.
2. Zebrać wszystkie rozpuszczone organoidy w probówce o pojemności 15 ml wstępnie napełnionej 10 ml lodowatego PBS. Odwirować probówkę przy 250 x g, 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
3. Zawiesić osad w 1 ml ciepłej (37 °C) 0,05 % (v/v) trypsyny/EDTA (na tym etapie można połączyć 2 probówki). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie umieścić bezpośrednio na lodzie, aby zatrzymać reakcję.
4. Ponownie zawieszaj na lodzie 20x z końcówką p1000 i kolejne 15x z końcówką p1000 + końcówką p200 na górze. Dodaj 10 ml lodowatego DMEM uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS).
5. Probówka wirówkowa o sile 1 000 x g, 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki jednowarstwowej (tabela 1).
6. Określić liczbę żywych komórek na ml za pomocą komory Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta.
7. W tym miejscu usunąć roztwór powlekający z komory wierzchołkowej i zastąpić go 500 μl ciepłego (37 °C) podłoża jednowarstwowego. Dodać 3 ml pożywki jednowarstwowej do komory podstawno-bocznej.
8. Określ rezystancję ślepej próby (TEER) każdej pustej wkładki transwell, zgodnie ze szczegółowym opisem w kroku 3. Czas, w którym w komorze wierzchołkowej nie ma pożywki, powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wysychaniu komórek.
9. Usunąć wierzchołkową pożywkę jednowarstwową i dodać do hodowli 2D jelita czczego 2 x 10⁵ komórek nabłonkowych, a do hodowli 2D okrężnicy 1,5 x 10⁵ komórek nabłonkowych w 500 μl pożywki jednowarstwowej w komorze wierzchołkowej każdego transwella.
10. Zmieniaj podłoże i mierz TEER co 2-3 dni. Zmierz TEER przed zmianą podłoża. Ostrożnie odessać pożywkę z komory wierzchołkowej i podstawowej i zastąpić ją 500 μl lub 3 ml świeżej, ciepłej (37 °C) pożywki.
    1. W przypadku organoidów jelita czczego: w 16 dniu, po wysianiu, zmienić pożywkę z jednowarstwowej na pożywkę różnicującą (tabela 1). W przypadku organoidów jelita grubego: zmienić pożywkę w dniu 7 na pożywkę różnicującą.
11. Zmieniaj pożywkę różnicującą każdego dnia i wykonuj pomiar TEER podczas każdej zmiany pożywki. W dniu 18 (w przypadku organoidów jelita czczego) lub w dniu 9 (w przypadku organoidów okrężnicy), po wysianiu, przystąp do eksperymentów funkcjonalnych.

3. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER)

UWAGA: Wszystkie pomiary są wykonywane pod szafą bezpieczeństwa, aby uniknąć zanieczyszczenia. Przed wysiewem komórek mierzy się każdą pustą powlekaną osłonę, aby uzyskać indywidualne wartości ślepej próby. Woltomierz przechowuje wartości na wprowadzonym urządzeniu USB.

1. Oczyść elektrodę pałeczki 70% (v/v) etanolem i pozostaw elektrodę do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją pod szafką.
2. Wprowadzić krótkie ramię elektrody pałeczki do komory wierzchołkowej wkładek, a długie ramię do komory podstawno-bocznej wkładki. Unikaj kontaktu krótkiego ramienia z warstwą komórek.
3. Zmierz przeznabłonkową rezystancję elektryczną każdego transwella. Pozwól, aby woltomierz osiągnął równowagę, aby zapewnić stabilny pomiar. Zmierz wartości TEER, klikając przycisk Sklep.
4. Kontynuuj kroki 3.2 i 3.3 z pozostałymi studzienkami. Po dotarciu do ostatniej studzienki woltomierz otwiera żądanie zapisania danych na urządzeniu USB. Kliknij Zapisz.
5. Wyczyść elektrodę po każdej płytce i na końcu pomiaru i pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem.
6. Odejmij puste wartości określone przed wysiewem komórek od zmierzonych wartości komórkowych.

4. Badania transportu elektrofizjologicznego z wykorzystaniem techniki komory Ussinga

UWAGA: Określanie badań transportu elektrofizjologicznego odbywa się za pomocą komory Ussing składającej się z dwóch komór, które są przedzielone nabłonkiem. Komora ta jest podłączona do cęgów napięciowych za pomocą elektrod Ag / AgCl. Technika ta pozwala na śledzenie aktywnych procesów transportu elektrogenicznego nabłonka poprzez zmiany prądu zwarciowego (I_sc) indukowanego przez zacisk napięciowy, a także rezystancję tkankową (R_t) obliczoną za pomocą prawa Ohma. I_sc i R_t są rejestrowane co 6 s podczas całego eksperymentu. W trakcie eksperymentu badana tkanka jest napowietrzana karbogenem i inkubowana w zmodyfikowanych roztworach Krebsa-Henseleita w celu zapewnienia warunków do życia. Indometacyna (10 μM) jest dodawana do roztworów buforowych w celu zahamowania syntezy prostaglandyn²⁶.

1. Rozgrzej roztwory buforowe błony śluzowej i surowicy do temperatury 37 °C i napowietrz karbogenem. Zmontuj pojedyncze komory za pomocą pustej wkładki dla każdej pojedynczej komory. Upewnij się, że wierzchołkowe boki transwelli są skierowane w tym samym kierunku.
2. Napełnij wszystkie komory 5 ml wstępnie podgrzanego roztworu buforowego błony śluzowej (Tabela 2). Podłącz wszystkie elektrody od voltage clamp do poszczególnych komór zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że żadne pęcherzyki gazu nie zakłócają pracy elektrod, aby zapewnić prawidłowy pomiar.
3. Skalibruj oprogramowanie komory Ussing w tych warunkach, klikając przycisk Rf/dpI w oprogramowaniu do cęgowania napięcia. Rezystancja wszystkich zastosowanych pustych wkładek powinna być równa (~ 70 Ohm), a prąd powinien wynosić około 0 mV (± 5 mV). Jeśli tak nie jest w przypadku niektórych komór, sprawdź, czy elektrody lub pęcherzyki są prawidłowo umieszczone w układzie.
4. Usuń wszystkie elektrody i wyrzuć zużyty roztwór buforowy. Otwórz wszystkie pojedyncze komory i wyjmij puste wkładki. Upewnij się, że kolejność poszczególnych komór jest zachowana.
5. Przenieś płytkę studzienkową z wkładkami z inkubatora do szafy bezpieczeństwa. Ostrożnie odessać podłoże podstawno-boczne i wierzchołkowe.
6. Przemyć komórki, dodając 500 μl ciepłego (37 °C) buforu błony śluzowej do komory wierzchołkowej i 3 ml buforu surowiczego do komory podstawno-bocznej. Zassać i powtórzyć 2x.
7. Wyjmij wkładki z płyty. Delikatnie zdejmij wsporniki wkładek. Umieść wkładki w komorach Ussing i upewnij się, że orientacja wkładek jest taka sama, jak podczas fazy kalibracji. Zmontuj poszczególne komory, jak pokazano w Rysunek 2.
8. Komory skierowane w stronę podstawno-bocznej strony komórek należy wypełnić 5 ml buforu surowiczego (Tabela 2), a komorę skierowaną w stronę komory wierzchołkowej 5 ml buforu błony śluzowej.
9. Podłącz elektrody i rurki napowietrzające do każdej komory z osobna. Rozpocznij pomiar w oprogramowaniu Ussing. Pozostaw na 15 minut.
10. Zmień warunki z obwodu otwartego na warunki zwarcia. Równowaga przez 5 min do 10 min. Dodać 10 μM forskoliny do komory surowiczej.
    UWAGA: Dodatek forskoliny może być zastąpiony innymi środkami/substancjami w zależności od poszczególnych odcinków jelit i pytań badawczych.
11. Po 15 minutach dodaj więcej środków w taki sam sposób jak forskolina lub zatrzymaj pomiar. Wyjmij rurki napowietrzające i elektrody z poszczególnych komór. Wlej roztwory buforowe z obu komór do miski.
12. Zdemontuj komory i albo wyrzuć wkładki, albo użyj ich do dalszej analizy (np. immunohistochemii lub analizy ekspresji)

Rysunek 2: Schematyczna struktura komory Ussing. Pokazane są obie komory przedzielone membraną z wyhodowaną monowarstwą 2D. Obie komory są napowietrzane karbogenem; Napięcie i prąd są monitorowane przez dwie elektrody na komorę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Analiza danych generowanych przez konfigurację komory Ussing

1. Zaimportuj dane wygenerowane przez oprogramowanie cęgów napięciowych do odpowiedniego edytora arkuszy kalkulacyjnych.
2. Aby wyznaczyć podstawowe wartości I_sc i R_t, należy obliczyć średnią z 10 kolejnych punktów danych pobranych 10 minut po zainicjowaniu warunków zwarcia. Każda pojedyncza komora służy jako techniczna replika, podczas gdy każde przejście organoidów służy jako biologiczny powtórzenie.
3. Aby ocenić efekty zastosowanych środków, należy obliczyć średnią z 10 kolejnych punktów danych bezpośrednio przed dodaniem środka. Porównaj tę średnią z maksymalną (lub minimalną) wartością obserwowaną po zastosowaniu środka. Uzyskane dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD).

Ten protokół ułatwia niezawodne generowanie monowarstw 2D świń poprzez dezagregację organoidów 3D pochodzących z jelita czczego i jelita grubego świń. W okresie uprawy wynoszącym 16 dni w przypadku organoidów jelita czczego i 9 dni w przypadku organoidów jelita grubego powstają nienaruszone monowarstwy. Te monowarstwy mogą być następnie wykorzystane do oceny właściwości transportu elektrogenicznego i fizjologicznego przy użyciu techniki komory Usselga.

Po rozdrobnieniu organoidów 3D, pojedyncze komórki są umieszczane na powlekanych wkładkach. Wzrost komórek jest monitorowany poprzez pomiar wartości przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER) podczas każdej zmiany pożywki. Takie podejście umożliwia śledzenie zarówno proliferacji komórek, jak i tworzenia nienaruszonej monowarstwy, która jest niezbędna do ustanowienia funkcjonalnego nabłonka. Początkowo wartości TEER są zbliżone do wartości wyjściowej, ale stopniowo rosną w okresie uprawy, osiągając plateau na poziomie około 150 Ω*cm2 dla organoidów jelita czczego (Rysunek 3A) po 18 dniach i około 200 Ω * cm2 dla organoidów okrężnicy (Rysunek 3B) po 9 dniach uprawy.

Rysunek 3: Pomiar TEER podczas uprawy. Wartości reprezentatywne dla trzech pojedynczych płytek zawierających sześć studzienek każda w okresie hodowli wynoszącym (A) 18 dni w przypadku organoidów jelita czczego lub (B) 9 dni w przypadku organoidów okrężnicy. Przedstawione dane są średnimi ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po 2-dniowym okresie różnicowania, organoidy 2D są montowane w komorach Ussing w celu monitorowania parametrów elektrofizjologicznych, takich jak Isc, który odzwierciedla transport jonów, i Rt, który wskazuje na integralność tkanki. Oba parametry są rejestrowane co 6 sekund przez cały czas trwania eksperymentu. Po początkowym okresie równowagi w warunkach obiegu otwartego, system przełącza się w warunki zwarciowe, co pozwala na pomiar aktywnych procesów transportu elektrogenicznego w nabłonku. Po tym przejściu następuje kolejny okres równowagi, podczas którego ustalane są podstawowe wartości nabłonka. Warto zauważyć, że podstawowa Isc (Figura 4A) organoidów jelita czczego jest znacznie niższa (0,67 ± 0,36 μA/cm2) w porównaniu z organoidami okrężnicy (7,12 ± 3,74 μA/cm2). W przeciwieństwie do tego, podstawowe wartości Rt ( Rysunek 4B) nie wykazują znaczącej różnicy między dwoma typami organoidów, z wartościami około 175 Ω * cm2 dla organoidów jelita czczego i około 135 Ω * cm2 dla organoidów okrężnicy.

Rysunek 4: Podstawowe wartości elektrofizjologiczne organoidów okrężnicy i jelita czczego. Reprezentatywne wartości Isc (A) i Rt (B) dwuwymiarowych organoidów jelita czczego i okrężnicy określone techniką komory Usinga. Wartości uzyskano 10 minut po zmianie warunków z obwodu otwartego na zwarcie poprzez obliczenie średniej z 10 kolejnych wartości. Przedstawione dane są średnimi ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. Niesparowany test t; = p<0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Technika komory Ussinga jest podstawowym narzędziem do monitorowania aktywnych procesów transportu elektrogenicznego w tkankach nabłonkowych, które są kluczowe dla walidacji i oceny funkcjonalności modeli nabłonkowych in vitro. W tym badaniu, zarówno organoidy jelita czczego, jak i okrężnicy były leczone forskoliną po stronie surowiczej. Ekspozycja ta doprowadziła do znacznego wzrostu Isc w organoidach jelita czczego, wzrastając z 0,86 ± 4,59 μA/cm2 do 27,78 ± 2,27 μA/cm2 (Figura 5A). Podobnie, Isc w organoidach okrężnicy wzrósł z 3,83 ± 2,25 μA/cm2 do 28,78 ± 1,06 μA/cm2 po zastosowaniu forskoliny (Figura 5B).

Rysunek 5: Reakcja nabłonkowa na symulację forskoliny. Reprezentatywne wyniki Isc organoidów (A) jelita czczego i (B) okrężnicy przed i po zastosowaniu forskoliny do kompartmentu surowiczego. Wartości podstawowe uzyskano poprzez obliczenie średniej z ostatnich 10 wartości przed dodaniem forskoliny, natomiast wartości po zastosowaniu stanowiły maksymalną odpowiedź na środek stymulujący. Przedstawione dane są średnimi ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. Niesparowany test t; * = p<0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Kompozycje podłoża używane do hodowli organoidów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Skład używanych Usping. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy zadeklarować.