Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67666

⸱

31 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Physiology and Cell Biology, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Center for Systems Neuroscience (ZSN)

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Streszczenie

Przewód pokarmowy (GIT) służy zarówno do trawienia pokarmu i pobierania składników odżywczych, ale także jako bariera ochronna przed patogenami. Tradycyjnie badania w tej dziedzinie opierały się na eksperymentach na zwierzętach, ale rośnie zapotrzebowanie na alternatywne metody, które są zgodne z zasadami 3R - zastępuj, redukuj i udoskonalaj. Organoidy świń okazały się obiecującym narzędziem, oferującym dokładniejszą replikację warunków in vivo in vitro niż tradycyjne modele komórkowe. Jednym z głównych wyzwań związanych z organoidami jelitowymi jest ich powierzchnia wierzchołkowa skierowana do wewnątrz i powierzchnia podstawno-boczna skierowana na zewnątrz. To ograniczenie można przezwyciężyć, tworząc dwuwymiarowe (2D) warstwy organoidów na wkładkach transwell (zwanych dalej wkładkami), zapewniając dostęp do obu powierzchni. W tym badaniu z powodzeniem opracowaliśmy dwuwymiarowe hodowle organoidów jelita czczego i jelita grubego świń. Proces hodowli obejmuje dwie kluczowe fazy: najpierw tworzenie monowarstwy komórkowej, a następnie różnicowanie komórek za pomocą dostosowanych pożywek. Wzrost komórek jest śledzony poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego, który stabilizuje się do 8 dnia w przypadku organoidów okrężnicy i 16 dnia w przypadku organoidów jelita czczego. Po 2-dniowej fazie różnicowania nabłonek jest gotowy do analizy. Aby określić ilościowo i śledzić aktywne procesy transportu elektrogenicznego, takie jak wydzielanie chlorków, stosujemy technikę komory usselga. Metoda ta pozwala na pomiar w czasie rzeczywistym i szczegółową charakterystykę procesów transportu nabłonkowego. Ten innowacyjny model in vitro, w połączeniu ze sprawdzonymi technikami, takimi jak komora usselga, zapewnia solidną platformę do fizjologicznej charakterystyki przewodu pokarmowego świń w ramach 3R. Otwiera również możliwości badania mechanizmów patofizjologicznych i opracowywania potencjalnych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Przewód pokarmowy odgrywa kluczową rolę w trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych i wydalaniu odpadów z kałem1. Dodatkowo działa jako bariera przed patogenami, rola wspierana przez zróżnicowany skład komórkowy, w tym komórki macierzyste, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki enteroendokrynne i enterocyty absorpcyjne2. Homeostaza jelit może zostać zakłócona przez różne czynniki, takie jak infekcje bakteryjne3 lub procesy zapalne4, co prowadzi do poważnych konsekwencji dla organizmu, takich jak złe wchłanianie, biegunka, a nawet śmierć5. Badanie takich patofizjologicznych scenariuszy jest zwykle wykonywane przy użyciu zwierząt laboratoryjnych lub, zgodnie z zasadą 3R6, kultur komórkowych pochodzących od różnych gatunków. Dokładne przewidywanie i możliwość przenoszenia wyników mają kluczowe znaczenie w przypadku korzystania z modeli specyficznych dla gatunku7. Pomimo tej potrzeby zauważalny jest brak kultur komórkowych pochodzących od świń, które odpowiednio odwzorowują złożoność i funkcjonalność przewodu pokarmowego.

Aby sprostać temu wyzwaniu, które dotyczy również innych gatunków, opracowano trójwymiarowe (3D) organoidy w próbie odtworzenia fizjologicznej złożoności klasy GIT8. Początkowo organoidy tworzono z jelit ludzkich i myszy; Do tej pory z powodzeniem opracowano i wyhodowano również organoidy świń pochodzące od młodych i dorosłych świń9,10. Od momentu powstania te organoidy świńskie zostały wykorzystane w kilku badaniach, koncentrujących się głównie na infekcjach jelitowych11,12,13,14. Badania mające na celu scharakteryzowanie właściwości fizjologicznych, takich jak transport składników odżywczych czy procesy wydzielnicze, pozostają ograniczone15. Może to być spowodowane orientacją organoidów jelitowych, z powierzchnią wierzchołkową skierowaną do wewnątrz, a stroną podstawno-boczną na zewnątrz, co ogranicza dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Ograniczenie to zostało rozwiązane poprzez udaną hodowlę organoidów świń w formacie dwuwymiarowym16, metoda, która została jeszcze bardziej rozwinięta dzięki wykorzystaniu zamrożonej tkanki do ich generowania17.

Hodowla organoidów świń w 2D zapewnia dostęp do obu stron nabłonka, umożliwiając zastosowanie sprawdzonych metod do badania procesów transportu przez warstwę nabłonkową. Jedną z takich metod jest Ussing chamber18, która umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym elektrogenicznych procesów absorpcyjnych i wydzielniczych w całym nabłonku. Szerokie zastosowanie tego systemu umożliwiło kompleksowe zrozumienie funkcji jelit świń in vivo, obejmującej całą oś jelitową. Obejmuje to badania nad transportem monosacharydów lub transportem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub reakcjami na wtórne metabolity roślinne, takie jak resweratrol, które wpływają na charakterystykę transportu jelitowego19,20,21,22,23,24. Znaczna część danych z tych badań ułatwia bezpośrednie porównania między dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo a środowiskiem in vitro organoidów świń, pogłębiając naszą wiedzę na temat ich fizjologicznego znaczenia.

W tym badaniu prezentujemy protokół do generowania i hodowli monowarstw 2D z organoidów 3D świń. Dodatkowo szczegółowo opisujemy podejście metodologiczne do ilościowego określania procesów transportu jelitowego przy użyciu techniki komory usinga. Protokół oferuje narzędzia do badania cech absorpcyjnych i wydzielniczych in vitro w organoidach jelita czczego i jelita grubego, co pozwala na bezpośrednie porównanie z dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo. Przyszłe zastosowania tego protokołu mogą obejmować badanie skutków substancji farmakologicznych lub toksykologicznych, a także badanie interakcji między nabłonkiem a patogenami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Do niniejszego protokołu wykorzystano dwie zdrowe świnie (rasa Bentheim Blacked Pied; 1 samiec, 1 samica; w wieku 4,5 miesiąca; o masie około 65 kg), które zostały uśmiercone za pomocą pistoletucaptive bolt oraz upuszczania krwi. Zgodnie z ustawą o ochronie zwierząt, czynność ta (ubój i pobranie tkanek) nie jest klasyfikowana jako eksperyment na zwierzętach, jednak musiała zostać zgłoszona do urzędnika ds. dobrostanu zwierząt (nr rejestracyjny TiHo-T-2023-15) Fundacji Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze.

1. Powlekanie wkładów

UWAGA: Wszystkie etapy są przeprowadzane z użyciem sterylnych materiałów w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie kroki protokołu są wykonywane na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

  1. rozmrozić zamrożoną błonę podstawną na lodzie przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. W probówce stożkowej wymieszać błonę podstawną w stosunku 1:40 (v/v) z lodowatym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).
  2. Wyjąć sterylne płytki z wkładkami z opakowania. Do komory apikalnej każdego wkładu dodać 200 µL mieszaniny błony podstawnej.
  3. Założyć pokrywkę płytki wielodołkowej i inkubować przez co najmniej 1,5 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  4. Przed wysianiem komórek ostrożnie odessać roztwór. Należy upewnić się, że końcówka nie dotyka membrany podczas odsysania.

2. Generowanie 2D monowarstw organoidów

UWAGA: Organoidy jelita grubego świni są generowane i hodowane zgodnie z opisem dla organoidów jelita cienkiego (wyrostka) świni25. Po wygenerowaniu organoidów 3D należy je hodować przez co najmniej 3-4 tygodnie, wykonując cotygodniowe pasażowanie w celu zapewnienia spójnego wzrostu. Liczba komórek w każdej kopule zawierającej organoidy 3D, które są rozpuszczane w kolejnych krokach, jest wystarczająca do pokrycia pojedynczego filtra transmembranowego. Przed generowaniem monowarstwy organoidy 3D poddano optycznej kontroli jakości w celu sprawdzenia poprzedniego wzrostu oraz ewentualnego zanieczyszczenia (Rysunek 1).

Morfologia komórkowa podczas krioterapii; obraz mikroskopowy porównujący integralność strukturalną, skala 100 µm.
Rysunek 1: Reprezentatywne organoidy 3D. Trójwymiarowe (A) organoidy jelita czczego oraz (B) organoidy okrężnicy są dokładnie badane pod mikroskopem przed wytworzeniem monowarstw. Szczególną uwagę poświęca się ocenie wcześniejszych wzorców wzrostu, integralności strukturalnej oraz obecności wszelkich zanieczyszczeń lub kontaminacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Usunąć pożywkę do organoidów (Tabela 1) z dołków zawierających 3D organoidy krypt. Dodać 1 mL schłodzonego PBS do każdego dołka i delikatnie rozpuścić błonę podstawną, pipetując w górę i w dół końcówką p1000.
  2. Zebrać wszystkie rozpuszczone organoidy do probówki 15 mL wypełnionej uprzednio 10 mL schłodzonego PBS. Odwirować probówkę przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odessać nadsącz.
  3. Resuspendować osad w 1 mL ciepłej (37 °C) 0,05 % (v/v) trypsyny/EDTA (na tym etapie można połączyć zawartość dwóch probówek). Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej, a następnie natychmiast przenieść na lód, aby zatrzymać reakcję.
  4. Resuspendować na lodzie 20 razy końcówką p1000, a następnie kolejne 15 razy końcówką p1000 i p200. Dodać 10 mL schłodzonego DMEM uzupełnionego o 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  5. Odwirować probówkę przy 1 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 1 mL pożywki dla monowarstwy (Tabela 1).
  6. Określić liczbę żywych komórek na mL przy użyciu komory Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Usunąć w tym momencie roztwór powlekający z komory apikalnej i zastąpić go 500 µL ciepłej (37 °C) pożywki dla monowarstwy. Dodać 3 mL pożywki dla monowarstwy do komory basolateralnej.
  8. Wyznaczyć oporność pustą (TEER) dla każdego pustego wkładu transwell, zgodnie z opisem w kroku 3. Czas, w którym w komorze apikalnej nie ma pożywki, powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wysychaniu komórek.
  9. Usunąć apikalną pożywkę dla monowarstwy i dodać do komory apikalnej każdego transwellu 2 x 105 komórek nabłonkowych w 500 µL pożywki dla monowarstwy w przypadku hodowli 2D jelita cienkiego (jejunum) oraz 1,5 x 105 komórek nabłonkowych w 500 µL pożywki dla monowarstwy w przypadku hodowli 2D jelita grubego.
  10. Wymieniać pożywkę i mierzyć TEER co 2-3 dni. Pomiar TEER należy przeprowadzić przed wymianą pożywki. Ostrożnie odessać pożywkę z komory apikalnej i basalnej i zastąpić ją 500 µL lub 3 mL świeżej, ciepłej (37 °C) pożywki.
    1. W przypadku organoidów jejunum: w 16. dniu po wysianiu zmienić pożywkę dla monowarstwy na pożywkę różnicującą (Tabela 1). W przypadku organoidów jelita grubego: zmienić pożywkę w 7. dniu na pożywkę różnicującą.
  11. Wymieniać pożywkę różnicującą codziennie i przeprowadzać pomiar TEER przy każdej wymianie pożywki. W 18. dniu (dla organoidów jejunum) lub 9. dniu (dla organoidów jelita grubego) po wysianiu przystąpić do eksperymentów funkcjonalnych.

3. Pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER)

UWAGA: Wszystkie pomiary są wykonywane w komorze bezpieczeństwa, aby uniknąć kontaminacji. Przed wysiewaniem komórek każdy pusty, powlekany transwell jest mierzony w celu uzyskania indywidualnych wartości tła. Woltomierz zapisuje wartości na podłączonym urządzeniu USB.

  1. Oczyścić elektrodę w kształcie pałeczek 70% (v/v) etanolem i pozostawić do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją pod komorą laminarną.
  2. Wprowadzić krótkie ramię elektrody do przedziału apikalnego insertów, a długie ramię do przedziału basolateralnego insertu. Należy unikać kontaktu krótkiego ramienia z warstwą komórek.
  3. Zmierzyć transepithelial electrical resistance (TEER) dla każdego transwellu. Pozostawić woltomierzem do ustabilizowania się odczytu w celu zapewnienia dokładności pomiaru. Wartości TEER zmierzyć, klikając przycisk Store.
  4. Powtórzyć kroki 3.2 i 3.3 dla pozostałych studni. Po dotarciu do ostatniej studni woltomierz wyświetli prośbę o zapisanie danych na urządzeniu USB. Kliknąć Save.
  5. Oczyścić elektrodę po każdej płytce oraz po zakończeniu pomiarów i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed schowaniem.
  6. Od zmierzonych wartości komórkowych odjąć wartości tła określone przed wysianiem komórek.

4. Badania transportu elektrofizjologicznego z wykorzystaniem komory Ussinga

UWAGA: Badania elektrofizjologiczne transportu przeprowadza się przy użyciu komory Ussinga, składającej się z dwóch przedziałów oddzielonych nabłonkiem. Komora ta jest połączona z układem voltage clamp za pomocą elektrod Ag/AgCl. Technika ta umożliwia śledzenie aktywnych procesów transportu elektrogennego nabłonka poprzez zmiany prądu zwarcia (Isc) indukowanego przez układ voltage clamp, a także oporu tkanki (Rt) obliczanego na podstawie prawa Ohma. Wartości Isc i Rt są rejestrowane co 6 s przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas eksperymentu badana tkanka jest napowietrzana karbogenem i inkubowana w zmodyfikowanych roztworach Krebsa-Henseleita w celu zapewnienia warunków żywotności. Do roztworów buforowych dodaje się indometacynę (10 µM), aby zahamować syntezę prostaglandyn26.

  1. Podgrzać roztwory buforu śluzówkowego i surowiczego do 37 °C i napowietrzyć karbogenem. Złożyć pojedyncze komory, używając pustego wkładu dla każdej z nich. Upewnić się, że strony apikalne transwelli są skierowane w tym samym kierunku.
  2. Wypełnić wszystkie komory 5 mL uprzednio podgrzanego roztworu buforu śluzówkowego (Tabela 2). Podłączyć wszystkie elektrody z clampora napięcia do poszczególnych komór zgodnie z instrukcją producenta. Upewnić się, że pęcherzyki gazu nie zakłócają pracy elektrod, aby zapewnić poprawność pomiaru.
  3. Skalibrować oprogramowanie komory Ussinga dla tych warunków, klikając przycisk Rf/dpI w oprogramowaniu clampora napięcia. Rezystancja wszystkich użytych pustych wkładów powinna być taka sama (~ 70 Ohm), a prąd powinien wynosić około 0 mV (± 5 mV). Jeśli tak nie jest w przypadku niektórych komór, należy sprawdzić prawidłowe rozmieszczenie elektrod lub obecność pęcherzyków powietrza w systemie.
  4. Wyjąć wszystkie elektrody i wylać zużyty roztwór buforu. Otworzyć wszystkie poszczególne komory i wyjąć puste wkłady. Upewnić się, że zachowano kolejność poszczególnych komór.
  5. Przenieść płytkę z wkładami z inkubatora do komory bezpieczeństwa. Ostrożnie odessać medium bazolateralne i apikalne.
  6. Przemyć komórki, dodając 500 µL ciepłego (37 °C) buforu śluzówkowego do komory apikalnej oraz 3 mL buforu surowiczego do komory bazolateralnej. Odessać bufory i powtórzyć czynność 2x.
  7. Wyjąć wkłady z płytki. Delikatnie usunąć podpory wkładów. Umieścić wkłady w komorach Ussinga, upewniając się, że orientacja wkładów jest taka sama jak podczas fazy kalibracji. Złożyć poszczególne komory zgodnie z Rysunkiem 2.
  8. Wypełnić komory od strony bazolateralnej komórek 5 mL buforu surowiczego (Tabela 2), a komorę od strony apikalnej 5 mL buforu śluzówkowego.
  9. Podłączyć elektrody i rurki do napowietrzania do każdej pojedynczej komory. Rozpocząć pomiar w oprogramowaniu Ussinga. Pozostawić na 15 min w celu wyrównania stanu równowagi.
  10. Zmienić warunki z obwodu otwartego na warunki zwarcia. Równoważyć od 5 min do 10 min. Dodać 10 µM forskoliny do komory surowiczej.
    UWAGA: Dodanie forskoliny można zastąpić innymi odczynnikami/substancjami, w zależności od badanych odcinków jelita i pytań badawczych.
  11. Po 15 min dodać kolejne odczynniki w ten sam sposób co forskolinę lub zakończyć pomiar. Usunąć rurki do napowietrzania i elektrody z poszczególnych komór. Wlać roztwory buforowe z obu komór do naczynia.
  12. Rozmontować komory i utylizować wkłady lub wykorzystać je do dalszych analiz (np. immunohistochemii lub analizy ekspresji).

Schemat eksperymentu z zaciskaniem napięcia; dwuwymiarowa monowarstwa błony; pomiar μA/mV; układ śluzówkowy/surowiczy.
Rycina 2: Schematyczna budowa komory Ussinga. Przedstawiono obie komory przedzielone błoną z wyhodowaną 2D monowarstwą. Obie komory są napowietrzane karbogenem; napięcie i prąd są monitorowane przez dwie elektrody w każdej komorze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

5. Analiza danych generowanych przez układ komory Ussinga

  1. Zaimportuj dane wygenerowane przez oprogramowanie do clampingu napięciowego do odpowiedniego edytora arkuszy kalkulacyjnych.
  2. Aby wyznaczyć wartości podstawowe Isc i Rt, oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych pobranych 10 min po zainicjowaniu warunków zwarcia. Każda pojedyncza komora służy jako powtórzenie techniczne, natomiast każde przejście organoidów służy jako powtórzenie biologiczne.
  3. Aby ocenić wpływ zastosowanych czynników, oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych bezpośrednio przed dodaniem czynnika. Porównaj tę średnią z maksymalną (lub minimalną) wartością zaobserwowaną po zastosowaniu czynnika. Uzyskane dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół umożliwia niezawodne generowanie dwuwymiarowych (2D) monowarstw świńskich poprzez dysagregację trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z jelita czczo i okrężnicy świń. W ciągu okresu hodowli trwającego 16 dni dla organoidów jelita czczego oraz 9 dni dla organoidów okrężnicy powstają nienaruszone monowarstwy. Monowarstwy te mogą być następnie wykorzystane do oceny elektrogennych i fizjologicznych właściwości transportowych z użyciem komory Ussinga.

Po rozbiciu organoidów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę przekształcania ustalonych organoidów 3D świń w pojedyncze komórki, które są następnie wysiewane na błonach transwell w celu utworzenia nienaruszonej monowarstwy. Taka konfiguracja zapewnia dostęp do wierzchołkowej strony komórek, ułatwiając korzystanie z komór Ussing do monitorowania procesów absorpcyjnych i wydzielniczych.

Pierwszym i kluczowym krokiem w tym wieloetapowym procesie jest precyzyjna dezintegracja organoidów 3D. Osiągnięcie równomiernego wysiewu pojed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy zadeklarować.

Podziękowania

Dziękujemy Federalnemu Ministerstwu Żywności i Rolnictwa (BLE# 28N-2-071-00) za dofinansowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowaSARSTEDT AG & Co. KG8,33,922
A83-01MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10432Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby
accujet SBrand GmbH + Co KG, Wertheim, Niemcy26351
Advanced DMEM/F12 MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, USA12634010Przechowywać pod adresem 4 ° C
B27 suplementThermo Fisher Scientific, Waltham, USA17504044Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
CaCl2.2 H2OMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyC3306Przechowywać w temperaturze pokojowej
D(+)-Glukoza (wasserfrei)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.08337Przechowywać w temperaturze pokojowej
DAPTMedChemExpress, New Jersey, USAHY-13027 Przechowywaćw temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
D-MannitolMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyM4125Przechowywać w temperaturze pokojowej
DMSOSigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy154938Przechowywać w temperaturze pokojowej
Zestaw elektrod (AgCl/PtIr/Std.)Scientific Instruments, Simmerath, Niemcy#1316
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000063
Eppendorf Research plus Eppendorf SE, Hamburg, Gemany3123000047
EVOM3 Ręczny nabłonkowy miernik woltomierzy Ohm Światoweinstrumenty precyzyjne, Sarasota, USAEVM-MT-03-01
FBSSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyF7524Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby
ForskolinSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyF6886Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby
gasprofi 1 SCS microWLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Niemcy60,04,000
Gastrin 1MedChemExpress, New Jersey, USAHY-P1097Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
GlutamaxThermo Fisher Scientific, Waltham, USA35050061Przechowywać w temperaturze 4 stopni. 
HClSigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy1090571000Przechowywać w temperaturze pokojowej
HEPESSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyH0887Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C
Herasafe 2025 Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IIThermo Fisher Scientific, Waltham, USA51033316
Inkubator ICO105Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Niemcy62,20,143
IndometacynaMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyI7378Przechowywać w temperaturze pokojowej
KClMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.04936Przechowywać w temperaturze pokojowej
L-GlutaminSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyG7513Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
LWRN Supernatantwłasnej roboty Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. W razie potrzeby rozmrozić. Suplement LWRN jest produkowany zgodnie z Miyoshi et al. (2012)
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mLCorning Incorporated - Life Sciences354234Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. W razie potrzeby ostrożnie rozmrozić na lodzie
Megafuge 1.ORHeraeus Instruments, Osterode, Niemcy75003060
MgCl2.6 H2OMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.05833Przechowywać w temperaturze pokojowej
Na2HPO4.2H2OMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.06580Przechowywać w temperaturze pokojowej
N-acetylo-L-cysteinaSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyA7250Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
NaClMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.06404Przechowywać w temperaturze pokojowej
NaH2PO4. H2OMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.06346Przechowywać w temperaturze pokojowej
NaHCO3Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy1.06329Przechowywać w temperaturze pokojowej
Neubauer improved chamberGlaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhö n, Niemcy40442712
Olympus IX70 odwrócony mikroskopOlympus Corporation, Hamburg, Niemcy
Pen/StrepThermo Fisher Scientific, Waltham, USA15140122Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
PolymyxinBSigma-Aldrich, Schnelldorf, NiemcyP4932-1MUPrzechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
Statyw mikroskopu Primovert z lornetkąZeiss415510-1101-000
rm EGFPrepotech, New Jersey, USA315-09Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
SB202190MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10295Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby
Snapwell 3801Corning Incorporated - Nauki Biologiczne3801
Trypsyna/EDTAThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone25300054
Ussing Base SystemScientific Instruments, Simmerath, Niemcy#1317
Ussing DiffusionChamber Scientific Instruments, Simmerath, NiemcySKU 1307
Cęgi napięciowe/prądowe VCC6Scientific Instruments, Simmerath, NiemcySKU 1310
Y27632MedChemExpress, New Jersey, USAHY-10583Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby

Bibliografia

  1. Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. , Academic Press. 367-406 (1997).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  3. Pham, T. A., Lawley, T. D. Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections. Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).
  4. Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140 (6), 859-870 (2010).
  5. Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections. Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).
  6. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen & Co. Limited. London. (1959).
  7. Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids. Pharmaceutics. 13 (8), 1280(2021).
  8. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  9. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  10. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).
  11. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).
  12. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).
  13. Min, S., Kim, S., Cho, S. W. Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches. Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).
  14. Yin, L., et al. Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus. J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).
  15. van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Front Cell Dev Biol. 8, 375(2020).
  16. van der Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).
  17. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  18. Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).
  19. Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level. Nutrients. 13 (2), 305(2021).
  20. Guschlbauer, M., et al. Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).
  21. Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).
  22. Klinger, S., Breves, G. Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes. Nutrients. 10 (3), 302(2018).
  23. Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning. J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).
  24. Schroeder, B., et al. Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection. Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).
  25. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), e0256143(2021).
  26. Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen. Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).
  27. Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces. J Vis Exp. (208), e67010(2024).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS One. 16 (10), e0257824(2021).
  30. Beduneau, A., et al. A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure. Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).
  31. Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine. J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).
  32. Pearce, S., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  33. Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies. Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).
  34. Moeser, A. J., et al. Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).
  35. Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).
  36. Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).
  37. Herrmann, J., et al. Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).
  38. Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. Intestinal absorption in health and disease--sugars. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).
  39. Crane, R. K. Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues. Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).
  40. Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon. Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwuwymiarowe organoidytransepithelialna oporno elektrycznakomora Ussingatransport nab onkowyr nicowanie organoid whodowla monowarstwowaorganoidy jelita cienkiego jejunuorganoidy jelita grubegoin vitro model jelita
Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.