Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena czynności płuc w mysim modelu ex vivo

537 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67668

⸱

16 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology and Immunology, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje stopniową metodę analizy mechaniki oddechowej mysiego modelu ex vivo przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (FOT).

Streszczenie

Mechanika oddechowa jest kluczowym obszarem badań w definiowaniu i leczeniu patologii płuc poprzez ocenę funkcjonalnej pojemności płuc. Mechanikę płuc można ocenić za pomocą różnych manewrów płucnych, które obejmują różne przebiegi oscylacyjne. Po zastosowaniu do płuc manewry te mierzą wiele zmiennych, takich jak ciśnienie, objętość i przepływ, w oparciu o reakcję na przebiegi. Sygnały te są następnie obliczane i analizowane w celu określenia parametrów, takich jak histeryzacja, odporność, podatność, tłumienie tkanek i elastyczność tkanek, zapewniając szczegółową ocenę ogólnej czynności płuc. Analiza mechaniki układu oddechowego jest szczególnie ważna w ocenie płuc dawcy do przeszczepu płuc. Obecny protokół jest pierwszym tego rodzaju, oferującym kompleksową i powtarzalną metodę krokową oceny mechaniki oddechowej przy użyciu mysiego modelu ex vivo. Zawiera szczegółowe informacje na temat wybranego modelu zwierzęcego, odzyskiwania, przechowywania i konserwacji płuc oraz eksperymentów przy użyciu systemu opartego na technice wymuszonej oscylacji. Ponadto przedstawiono analizę danych, znaczenie kliniczne i zastosowania techniki wymuszonej oscylacji w badaniu modelu ex vivo.

Wprowadzenie

Przeszczep płuc stanowi jedyną trwałą metodę leczenia schyłkowej choroby płuc. Każdego roku na całym świecie około 4600 osób otrzymuje przeszczep płuc, ale prawie 600 pacjentów umiera na liście oczekujących z powodu braku odpowiednich płuc dawcy1,2. W celu zwiększenia puli dostępnych płuc, systemy alokacji dawców są stale dostosowywane, co doprowadziło do tego, że chirurdzy podróżują na większe odległości, aby zabezpieczyć narządy dawców3. Zwiększone odległości niezmiennie wydłużają czas niedokrwienia zimna, co stwarza potrzebę dodatkowych metod konserwacji narządów.

Obecnym standardem konserwacji organów dawcy po przeszczepieniu płuc jest zimna statyczna konserwacja w temperaturze 4 °C, ograniczająca czas przechowywania do 6-8 godzin - małe okno żywotności dla transplantacji4. Jednak przy dłuższych odległościach podróży i wynikającym z tego wydłużonym czasie niedokrwienia, ocena czynności płuc przed przeszczepem jest niezwykle ważna4. Wraz z ewolucją polityki przeszczepiania płuc przeprowadzono nowatorskie badania, aby zaspokoić tę potrzebę. Ostatnie badania sugerują, że utrzymywanie ładunków elektrostatycznych w niskiej temperaturze 10 °C jest bardziej optymalną temperaturą przechowywania płuc, co skutkuje poprawą funkcji płuc, odpornością na urazy i porównywalnymi wskaźnikami pierwotnej dysfunkcji przeszczepu po wszczepieniu4,5,6,7,8. Co więcej, badania skoncentrowane na perfuzji płuc ex vivo (EVLP) wykazały znaczną poprawę w zakresie wykorzystania płuc dawców i przeszczepów bez szkody dla biorców9. Podczas gdy wykorzystanie EVLP do rozszerzania puli dawców do przeszczepu płuc i wydłużania czasu przechowywania jest dobrze udokumentowane, technologia ta jest kosztowna, czasochłonna i wymaga specjalistycznego szkolenia do wykonania10. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania dodatkowych metod badania ex vivo czynności płuc, które są kompleksowe, niedrogie i powtarzalne.

Tradycyjne miary mechaniki płuc, np. podatność, opór, elastywność i krzywe ciśnienie-objętość, mogą być niezawodnie określone za pomocą pletyzmografii ciała lub technik respiratorowych przy użyciu modelu jednokomorowego. Bardziej szczegółową mechanikę można uzyskać za pomocą modelu wymuszonej oscylacji, aby dopasować go do modelu stałej fazy, który może podzielić mechanikę dróg oddechowych na przedziały centralne i obwodowe (opór Newtona, tłumienie/elastyczność tkanek, histeryczność)11. Chociaż zastosowanie tych technik jest powtarzalne i wszechstronne, do tej pory ograniczeniem był wymóg wykonywania takich pomiarów w modelu in vivo, przypuszczalnie w sytuacji, gdy wykrwawione płuco traci strukturę w pierścieniu wejściowym pęcherzyków płucnych12. W badaniu tym wykorzystano dostępny na rynku respirator dla małych gryzoni oparty na technice wymuszonej oscylacji w celu opracowania modelu ex vivo, aby lepiej scharakteryzować mechanikę płuc w zastosowaniach związanych z przeszczepami płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano myszy typu dzikiego C57Bl/6 w wieku 6-8 tygodni i wadze od 18 do 28 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i wyposażenia znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie

  1. Do wszystkich zabiegów chirurgicznych należy używać mikroskopu operacyjnego o powiększeniu do 20x.
  2. Przed rozpoczęciem zabiegu należy oczyścić i wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne. Używaj narzędzi w autoklawie lub użyj odpowiedniego roztworu sterylizującego, aby utrzymać warunki aseptyki.

2. Pobieranie płuc dawcy

  1. Wszystkie operacje należy wykonywać w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Ten etap jest wykonywany w dedykowanej przestrzeni operacyjnej i w sterylnych warunkach.
  2. Umieść mysz w anestezjologicznej komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie 5% izofluranem w tlenie i utrzymuj znieczulenie 3,5% izofluranem w tlenie przez cały zabieg (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  3. Zapisz wagę myszy przed pierwszym nacięciem.
  4. Przymocuj mysz do stołu operacyjnego i zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, wywierając nacisk na palec u nogi. Jeśli mysz wycofuje się z bólu, w razie potrzeby zwiększ znieczulenie.
  5. Usuń płuca od dawcy zgodnie ze standardową procedurą13.
    UWAGA: Płuca i serce zostały usunięte en block w celu perfuzji płuc ex vivo, a część tchawicy została usunięta w celu późniejszej intubacji.

3. Przechowywanie i konserwacja płuc

  1. Po usunięciu płuc od dawcy należy zaintubować tchawicę za pomocą dożylnego cewnika naczynio-cewnika 18 G, ostrożnie przesuwając cewnik, upewniając się, że nie przebije tchawicy.
  2. Zabezpiecz tchawicę nad kaniulą za pomocą jedwabnego szwu 3-0, zapewniając szczelne uszczelnienie. Przesunąć dożylny angiocewnik 18 G, aż znajdzie się w prawej komorze drogi odpływu (RVOT), tuż za zastawką płucną.
  3. Zapisz czas, w którym płuca zostały usunięte z organizmu.
  4. Przechowywać płuca w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej dostępny w handlu roztwór konserwujący w temperaturze 4 °C lub 10 °C przez noc.

4. Konfiguracja i kalibracja

  1. Zacznij od włączenia systemu i/lub oprogramowania.
  2. Uruchom program, kliknij przycisk Utwórz nowe badanie i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zdefiniować protokół i przypisać tematy.
  3. Kliknij Sesja eksperymentowania i zaloguj się przy użyciu inicjałów imienia i nazwiska użytkownika.
  4. Rozpocznij oznaczanie tematów według spójnej konwencji nazewnictwa.
  5. Wprowadź informacje o płci, dacie urodzenia i wadze każdego tematu.
  6. Wybierz i przypisz obiekty do miejsca pomiaru i potwierdź masy.
  7. Kontynuuj konfigurację i kalibrację oprogramowania, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.
    UWAGA: Podczas kalibracji rurki ten sam typ kaniuli, który jest używany do intubacji płuc dawcy, został podłączony do rurki Y systemu, aby zapewnić spójność.
  8. Powtórz kalibrację, jeśli wartości kalibracji wykraczają poza akceptowane zakresy.
  9. Anuluj monity, aby rozpocząć wentylację, aż będzie gotowy. Sesje eksperymentalne z wentylacją i rejestracją danych można rozpocząć później.

5. Wentylacja płuc i akwizycja danych

  1. Usunąć płuca z rurki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłukać drogę odpływu prawej komory (RVOT) za pomocą wcześniej umieszczonego dożylnego cewnika naczynio-cewnika 18 G z dodatkowym roztworem konserwującym w dawce 60 ml/kg w celu przepłukania naczyń włosowatych płuc.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć odwodnienia płuc dawcy, ponieważ jest to znany czynnik zakłócający w badaniu mechaniki płuc.
  2. Przymocuj płuca dawcy do respiratora i rozpocznij eksperyment.
  3. Kliknij Rozpocznij wentylację, a gdy będziesz gotowy, naciśnij Rozpocznij nagrywanie, aby rozpocząć sesję eksperymentalną.
    UWAGA: Respirator użyty w tym badaniu został ustawiony na częstość oddechów 150 oddechów/min, objętość oddechową 10 ml / kg i PEEP 3.
  4. Uruchom każde zadanie, klikając dwukrotnie zadanie do oceny mechaniki płuc na liście zadań po prawej stronie.
  5. Uruchom zadanie Głęboka inflacja znajdujące się na liście zadań, aby dodatkowo upewnić się, że regiony niedodmy są rekrutowane, a objętość płuc została ustandaryzowana. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Wyniki.
  6. Kontynuuj sekwencję zadań.
    UWAGA: Czynność płuc można ocenić za pomocą wielu zadań oceniających właściwości mechaniczne. Głęboka inflacja standaryzuje objętość płuc, podczas gdy Prime-8 stabilizuje mechanikę płuc. PV-P i PV-V mierzą podatność statyczną i dynamiczną, rezystancję dróg oddechowych i przewodność. Snapshot 150 zapewnia szybką ocenę odporności, podatności i elastyczności, podczas gdy QuickPrime ocenia opór dróg oddechowych i tkanek wraz z lepkosprężystością płuc. Zadania te łącznie zapewniają kompleksową analizę czynności płuc. W tym artykule dane dotyczące zadań wykonanych w Deep Inflation, Snapshot 150 i QuickPrime (przy użyciu komercyjnie dostępnego sprzętu) są przedstawione jako wyniki reprezentatywne. Objętość płuc została ustandaryzowana między perturbacjami za pomocą zadania głębokiej inflacji w celu zminimalizowania zmiennych zakłócających podczas interpretacji danych.
  7. Uruchom wybraną sekwencję zadań w trzech egzemplarzach.
  8. Kliknij Zatrzymaj nagrywanie, a następnie Zatrzymaj wentylację.
  9. Eksportuj dane pojedynczo lub przejdź do następnego tematu i powtórz kroki 5.1-5.9.
    UWAGA: W przypadku danych pochodzących z perturbacji Snapshot 150 i QuickPrime do wiarygodnej analizy wymagany jest ChZT >0,95.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Graficzne przedstawienie schematu doświadczalnego dla modelu mysiego przedstawiono na Rysunku 1. Płuca napowietrzono przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu wentylacji dla małych gryzoni opartego na technice wymuszonych oscylacji, aby ocenić mechanikę oddechową tkanki dawcy w różnych warunkach (Rysunek 2). Podczas porównywania wyników między grupami zakonserwowanych płuc dawców stwierdzono, że grupy płuc przechowywanych w temperaturze 10 °C wykazywały lepsze ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczenie i potencjalne zastosowania
Mechanika oddechowa jest rutynowo wykorzystywana w różnych zastosowaniach do badania patologii płuc i uszkodzeń płuc. Badania nad mechaniką oddechową były wielokrotnie opisywane w odniesieniu do progresji chorób takich jak ARDS oraz w przypadkach wspomaganej wentylacji, ale w literaturze znacznie rzadziej dotyczyły transplantacji narządów 15,16,17,18,19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez żadnych powiązań komercyjnych lub finansowych, które mogłyby zostać błędnie zinterpretowane jako konflikt interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Sophie Paczensy za korzystanie z systemu respiratora oraz Colinowi Welshowi za pomoc. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu biorender.com. Badania te były wspierane przez grant z South Carolina Clinical and Translational Institute (NIH/National Center for Advancing Translational Sciences) pod numerem nagrody UL1-TR001450.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik naczynio-cewnik 18 GB. Braun4251687-02Piasta prosta
24 G Cewnik naczynio-cewnikB. Braun4251601-02Prosta piasta
3 mL strzykawkaFisher Scientific14-823-41
3-0 szew jedwabnyMedexETH-A304H
50 mL rurki stożkoweThermo Fisher339652
70% EtOHFisher ScientificBP82031GAL
Komora indukcyjna anestezjologiiAparat Harvard75-2030Hermetyczna komora indukcyjna dla szczurów
Maszyna anestezjologiczna AparatHarvard75-0238Mobilny system anestezjologiczny z pasywnym oczyszczaniem Maska
anestezjologicznaAparat Harvarda59-8255Maska anestezjologiczna dla szczurów
mikrokleszczeŚwiat Instrumenty precyzyjne501217Kleszcze opatrunkowe, 12,5 cm, proste, ząbkowane
Myszy C57Bl/6Charles RiverKod szczepu 027 Typ dziki, 6-8 tygodni, 18-28g
Cyfrowa wagaFisher ScientificS72422
System FlexiVentScireqNC2926059wentylator dla małych gryzoni oparty na technice wymuszonej oscylacji 
Strzykawka insulinowa, 1 mlFisher Scientific14-841-33
Isoflurane, USPPiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Mikroskop operacyjny lub lupy chirurgiczneAmScopeSM-3BZ-80S3.5x - 90x Mikroskop stereoskopowy
Roztwór PerfadexXvivo19811, 19850
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875714
Sterylne waciki bawełnianePuritan25-806 1WC
Sterylne gąbki z gazyFisher Scientific22-037-902
Nożyczki chirurgiczneWorld Precision Instruments1962CNożyczki Metzenbaum

Bibliografia

  1. Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
  2. Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
  3. Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
  4. Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
  5. Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
  6. Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
  7. Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
  8. Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
  9. Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
  10. Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
  11. Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
  12. Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
  13. Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
  14. Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
  15. Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
  16. Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
  17. Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
  18. Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
  19. Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model ex vivomechanika oddychaniaprzeszczep p ucwymuszone oscylacjepodatno p ucelastancja tkanekop r p uckonserwacja p uc
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.