W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji i standaryzacji testu mikromiareczkowania rezazuryny (REMA) oraz jego wariantu szachownicy do oceny wrażliwości na leki i profili interakcji Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta dostarcza informacji in vitro w celu optymalizacji kombinacji leków, które mają być stosowane w schematach leczenia i zwalczania gruźlicy wielolekoopornej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie wrażliwości na leki i interakcji z lekami w Mycobacterium tuberculosis za pomocą mikromiareczkowania resazuryny i testu szachownicy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pojawienie się gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB) wymaga szybkich i dokładnych metod badania lekowrażliwości (DST) w celu ukierunkowania skutecznego leczenia. W badaniu tym przedstawiono metodologię łączącą test mikromianowania resazuryny (REMA) i test szachownicy w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) i oceny interakcji lek-lek leków przeciwgruźliczych przeciwko Mycobacterium tuberculosis. REMA, dostosowana do formatu 96-dołkowego, wykorzystuje redukcję barwnika resazuryny przez metabolicznie aktywną M. tuberculosis jako wizualny wskaźnik wrażliwości na leki. Różne stężenia leków przeciw gruźlicy są testowane przeciwko izolatom M. tuberculosis i obserwuje się zmiany koloru w celu określenia MIC. Następnie stosuje się test szachownicy w celu oceny potencjalnych efektów synergicznych, addytywnych lub antagonistycznych między kombinacjami leków. Ta prosta i niedroga metoda daje wyniki w ciągu siedmiu dni, oferując znaczną przewagę nad tradycyjnymi metodami czasu letniego. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat czasu letniego izolatów M. tuberculosis i ułatwia identyfikację obiecujących kombinacji leków w celu poprawy wyników leczenia MDR-TB.
Wprowadzenie
Gruźlica (TB), wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis, pozostaje ogromnym globalnym wyzwaniem zdrowotnym, które nasila się w wyniku pojawienia się szczepów opornych na leki. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2023 r. odnotowano około 10,6 mln nowych przypadków gruźlicy i 1,3 mln zgonów, co podkreśla pilną potrzebę opracowania skuteczniejszych strategii diagnostycznych i terapeutycznych1. Gruźlica wielolekooporna (MDR-TB) i gruźlica w znacznym stopniu lekooporna (XDR-TB) stanowią poważne wyzwanie w kontroli choroby ze względu na złożoność, toksyczność i wydłużony czas trwania obecnych schematów leczenia<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Chemikalia i materiały użyte w przykładowych eksperymentach są dostępne w pliku Tabela materiałów.
1. Przygotowanie pożywek 7H9-S
- Na 100 ml pożywki 7H9-S odważyć 0,47 g proszku 7H9 i 0,1 g kazytonu, a następnie rozpuścić w 90 ml wody destylowanej; Mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Sterylizować bulion w kolbie o pojemności 250 ml w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
- Po autoklawizowaniu i schłodzeniu dodaj 10 ml suplementu katalazy albuminy kwasu oleinowego i dekstrozy (OADC) i 0,5 ml glicerolu.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Oznaczanie MIC leków przeciwgruźliczych za pomocą testu REMA
Aktywność bedakiliny, delamanidu, moksyfloksacyny i izoniazydu oceniano za pomocą REMA przeciwko lekowrażliwemu H37RV i lekoopornemu izolatowi klinicznemu M. tuberculosis. Bedakilinę, delamanid i izoniazyd stosowano w zakresie stężeń (od 1 μg/ml do 0,03 μg/ml), a moksyfloksacyna mieściła się w zakresie (2 μg/ml do 0,06 μg/ml). Zawiesiny bakteryjne lekoopornych izolatów klinicznych M. tuberculosis i H37Rv zaszczepiono następ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Globalne zagrożenie, jakie stwarza gruźlica lekooporna (DR-TB), stało się palącym problemem 1,19. Stworzyło to pilną potrzebę opracowania ulepszonych, szybkich metod testowania lekowrażliwości (DST), szczególnie w przypadku leków drugiego rzutu i nowszych leków przeciwgruźliczych. Takie metody są niezbędne do ulepszenia strategii leczenia, skutecznego zarządzania lekami przeciwgruźliczymi oraz zmniejszenia ryzyka postępu choroby i dalszej oporności
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Butelka kwadratowa 250 ml z nakrętką | Schott Duran | 218203655 | Przygotowanie podłoża |
| Rosół 7H9 | Becton Dickinson | 271310 | Pożywka wzrostowa dla M. tuberculosis (temperatura pomieszczenia) |
| Płytka 96-dołkowa z pokrywką | Corning | 3596 | 96-dołkowe, przezroczyste, płaskie płytki polistyrenowe poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne (temperatura pomieszczenia) |
| ART-Tips (1000 μ L) | TARSONOWIE | 528106 | Hydrofobowe filtry polietylenowe z Sterylna końcówka filtra z polipropylenu (temperatura pokojowa) |
| ART-Porady (200 μ L) | TARSONOWIE | 528104 | Hydrofobowe filtry polietylenowe z Sterylna końcówka filtra z polipropylenu (temperatura pokojowa) |
| Chlorek baru dwuwodny | Merck | 217565 | McFarland Przygotowanie standardowe (temperatura pomieszczenia) |
| Bedakilina (BDQ) | Jansen i Jansen | Prezent od Jansena i Jansena | Lek przeciwgruźliczy (4 ° C) |
| Casitone | Becton Dickinson | 225930 | Suplement do hodowli bakterii (temperatura pomieszczenia) |
| Delamanid (DEL) | Otsuka Farmaceutyki | Prezent od Otsuka Pharmaceuticals | Lek przeciwgruźliczy (4 ° C) |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | Przygotowanie wywaru leku (temperatura pomieszczenia) |
| Filtr 0,2 μ m | Milipory | SLGVR33RS | 0,22 μ m PVDF, jednorazowy, sterylny filtr strzykawkowy (temperatura pokojowa) |
| Glicerol | Merck | 356350 | Dodano do pożywki hodowlanej (temperatura pomieszczenia) |
| Pętla zaszczepiająca | Sigma-Aldrich | I8263 powiedział: | Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia) |
| Izoniazyd (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-5G | Lek przeciwgruźliczy (4 ° C) |
| LJ średni skos | BD Mycobactosel | 221414 | Pożywki wzrostowe dla M. tuberculosis (4 ° C) |
| Butelka McCartney Bijou z wąskimi ustami, 14 ml | Technologia Supertek | 12.124.0014 | Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia) |
| Butelka McCartney Bijou z wąskimi ustami, 7 ml | Technologia Supertek | 12.124.0007 | Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia) |
| Mikropipety (1000 μ L) | Gilson | F144059M | Do precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa) |
| Mikropipety (200 μ L) | Gilson | FA10005M | Do precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa) |
| Moksyfloksacyna (MOX) | Sigma-Aldrich | SML1581-50MG | Lek przeciwgruźliczy (4 ° C) |
| Pipeta wielokanałowa (20– 200 μ L) | Firma VWR | 849070024 | Do jednoczesnego pipetowania przez studzienki |
| Organizacja OADC (Organizacja Zarządzania T | Becton Dickinson | 211886 | Suplement do hodowli bakterii (4 ° C) |
| Napełniacze do pipet | Merck | Z333980 | Do precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa) |
| Sól sodowa rezazuryny | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | Wskaźnik redoks do testów REMA (temperatura pomieszczenia) |
| Pipety serologiczne, 10 ml | Corning | CLS4100 | Użyto sterylnych, polistyrenowych pipet jednorazowych (Temperatura pokojowa) |
| Koraliki szklane lite, średnica 6 mm | Sigma-Aldrich | Z265950 | Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia) |
| Kwas siarkowy 95– 97% | Merck | 100731 | McFarland Przygotowanie standardowe (temperatura pomieszczenia) |
| Strzykawki do filtra | Furgonetka Dispo | 100032 | Do stosowania z filtrami strzykawkowymi |
| Mieszalnik wirowy | REMI | CM-101 PLUS | Do przygotowania zawiesiny hodowlanej |
| Torebka foliowa zapinana na zamek błyskawiczny | Sigma-Aldrich | Z162949 |
Bibliografia
- Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
- Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
- Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
