Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wrażliwości na leki i interakcji z lekami w Mycobacterium tuberculosis za pomocą mikromiareczkowania resazuryny i testu szachownicy

923 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67672

⸱

24 października 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji i standaryzacji testu mikromiareczkowania rezazuryny (REMA) oraz jego wariantu szachownicy do oceny wrażliwości na leki i profili interakcji Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta dostarcza informacji in vitro w celu optymalizacji kombinacji leków, które mają być stosowane w schematach leczenia i zwalczania gruźlicy wielolekoopornej.

Streszczenie

Pojawienie się gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB) wymaga szybkich i dokładnych metod badania lekowrażliwości (DST) w celu ukierunkowania skutecznego leczenia. W badaniu tym przedstawiono metodologię łączącą test mikromianowania resazuryny (REMA) i test szachownicy w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) i oceny interakcji lek-lek leków przeciwgruźliczych przeciwko Mycobacterium tuberculosis. REMA, dostosowana do formatu 96-dołkowego, wykorzystuje redukcję barwnika resazuryny przez metabolicznie aktywną M. tuberculosis jako wizualny wskaźnik wrażliwości na leki. Różne stężenia leków przeciw gruźlicy są testowane przeciwko izolatom M. tuberculosis i obserwuje się zmiany koloru w celu określenia MIC. Następnie stosuje się test szachownicy w celu oceny potencjalnych efektów synergicznych, addytywnych lub antagonistycznych między kombinacjami leków. Ta prosta i niedroga metoda daje wyniki w ciągu siedmiu dni, oferując znaczną przewagę nad tradycyjnymi metodami czasu letniego. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat czasu letniego izolatów M. tuberculosis i ułatwia identyfikację obiecujących kombinacji leków w celu poprawy wyników leczenia MDR-TB.

Wprowadzenie

Gruźlica (TB), wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis, pozostaje ogromnym globalnym wyzwaniem zdrowotnym, które nasila się w wyniku pojawienia się szczepów opornych na leki. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2023 r. odnotowano około 10,6 mln nowych przypadków gruźlicy i 1,3 mln zgonów, co podkreśla pilną potrzebę opracowania skuteczniejszych strategii diagnostycznych i terapeutycznych1. Gruźlica wielolekooporna (MDR-TB) i gruźlica w znacznym stopniu lekooporna (XDR-TB) stanowią poważne wyzwanie w kontroli choroby ze względu na złożoność, toksyczność i wydłużony czas trwania obecnych schematów leczenia 2,3.

Niedawne wprowadzenie nowych leków przeciwgruźliczych, takich jak bedakilina i delamanid, ukierunkowanych na unikalne szlaki biochemiczne u M. tuberculosis, stanowi przełom w leczeniu gruźlicy 4,5. Leki te zostały zatwierdzone przede wszystkim do stosowania w przypadkach gruźlicy opornych na fluorochinolony i ryfampicynę w ramach zatwierdzonych przez WHO dłuższych i krótszych schematów MDR-TB 6,7. Jednak określenie optymalnych kombinacji leków i schematów dawkowania, zwłaszcza gdy środki te są stosowane w połączeniu z uznanymi terapiami, pozostaje krytycznym obszarem badań 8,9. Obecne metody badania wrażliwości na leki (DST), choć niezawodne, są często czasochłonne, zasobożerne i niepraktyczne w ocenie złożonych kombinacji leków w warunkach klinicznych lub badawczych10. Podkreśla to potrzebę prostych, skalowalnych testów fenotypowych, które mogą ocenić zarówno skuteczność leku, jak i profile interakcji z M. tuberculosis.

Wśród takich podejść fenotypowych test mikromianowania resazuryny (REMA) stał się powszechnie akceptowaną i konwencjonalną metodą oceny wrażliwości leku. Test opiera się na redukcji niebieskiego barwnika resazuryny do różowej rezorufiny przez metabolicznie aktywne bakterie, służąc jako wizualny wskaźnik żywotności komórek. Chociaż spopularyzowana przez Palomino i wsp. w 2002 r.11, zasada stosowania resazuryny do oceny wzrostu bakterii sięga prac Pitala i wsp.12. W ciągu ostatnich dwóch dekad metoda REMA została szeroko zwalidowana i włączona do standardowych procedur operacyjnych w badaniach nad prątkami i testach diagnostycznych 13,14,15.

Uzupełniając REMA, test szachownicy, wprowadzony przez Caleffi-Ferracioli i wsp., rozszerza użyteczność REMA, umożliwiając badania interakcji dwóch leków w formacie mikrorozcieńczenia przy użyciu tego samego odczytu opartego na rezazurynie16. Metoda ta, choć zasadniczo obiecująca, pozostaje przede wszystkim narzędziem badawczym przydatnym do badań przesiewowych potencjalnych synergicznych lub antagonistycznych kombinacji leków podczas wczesnej oceny przedklinicznej, a nie rutynowym testem diagnostycznym.

Niniejszy manuskrypt nie przedstawia REMA ani jej wariantu szachownicy jako nowatorskich metod. Celem tego badania jest raczej zapewnienie wizualnej reprezentacji użytecznej i zwalidowanej metodologii określania MIC i testowania interakcji z lekami, która została opisana i z powodzeniem zastosowana we wcześniejszych badaniach. Udostępniamy protokół krok po kroku ze szczegółowymi wskazówkami dotyczącymi przygotowania inokulum, miareczkowania leku, układu płytki, interpretacji MIC i analizy interakcji przy szachownicy. Niniejszy manuskrypt ma na celu wsparcie szerszego, bardziej spójnego stosowania testów REMA i szachownicy w opracowywaniu leków na gruźlicę i farmakologii eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Chemikalia i materiały użyte w przykładowych eksperymentach są dostępne w pliku Tabela materiałów.

1. Przygotowanie pożywek 7H9-S

  1. Na 100 ml pożywki 7H9-S odważyć 0,47 g proszku 7H9 i 0,1 g kazytonu, a następnie rozpuścić w 90 ml wody destylowanej; Mieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Sterylizować bulion w kolbie o pojemności 250 ml w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
  3. Po autoklawizowaniu i schłodzeniu dodaj 10 ml suplementu katalazy albuminy kwasu oleinowego i dekstrozy (OADC) i 0,5 ml glicerolu.
  4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu sprawdzenia sterylności.
    UWAGA: Sterylność przygotowanej pożywki 7H9-S sprawdza się poprzez inkubację przez noc w temperaturze 37 °C. Pożywka powinna pozostać klarowna następnego dnia, bez zaobserwowania zmętnienia.
  5. Przechowywać pożywkę 7H9-S w temperaturze 4 °C, z dala od bezpośredniego światła.

2. Preparat inokulum M. tuberculosis

  1. Przygotowanie inokulum z kultury M. tuberculosis wyhodowanej w podłożu stałym Lowenstein Jensen (LJ)
    1. Używając sterylnej pętli do zaszczepiania, zbierz pełną pętlę kultury M. tuberculosis ze świeżo wyhodowanej (21-28 dniowej) pożywki LJ.
      UWAGA: Ostrożnie unikaj zbyt głębokiego skrobania w pożywce, co może przeszkadzać starszym koloniom.
    2. Zebrane bakterie umieść w sterylnej butelce bijou zawierającej sterylne szklane kulki i 2,5 ml bulionu 7H9-S. Upewnij się, że szklane koraliki pomagają w mechanicznym rozbijaniu grudek podczas wirowania.
      UWAGA: Świeże kultury w okresie od 21 do 28 dni są niezbędne, aby zapewnić wiarygodne wyniki testu wrażliwości. Unikaj używania starszych kultur, ponieważ mogą one prowadzić do niespójnych wyników.
    3. Zabezpiecz butelkę bijou i energicznie wiruj przez co najmniej 1 minutę. Zapewnij ciągłe mieszanie, aby rozbić grudki bakteryjne, co skutkuje stosunkowo mętną zawiesiną. Celem jest jednorodne rozmieszczenie bakterii w pożywce.
    4. Przenieś zawiesinę hodowlaną do świeżej butelki bijou i pozostaw na 15 minut, aby stała w spokoju. Ten krok pozwala większym grudkom bakterii osiąść na dnie.
    5. Używając wzorca McFarland 1.0 jako odniesienia, sprawdź zmętnienie zawiesiny hodowlanej i dostosuj bulionem 7H9-S, aż do osiągnięcia pożądanego zmętnienia.
      UWAGA: Wzorzec McFarlanda, zwykle 1,0, jest używany jako odniesienie dla zmętnienia równoważnego około 1,97 × 106 CFU/ml17. Wzorzec przygotowuje się przez zmieszanie 0,1 ml 1% chlorku baru i 9,9 1 ml 1% kwasu siarkowego, w wyniku czego powstaje drobny osad siarczanu baru, który zapewnia zmętnienie. Zawiesina bakteryjna jest wizualnie porównywana ze standardem McFarland, przytrzymując obie rurki na białym tle z czarnymi liniami. Zmętnienie zawiesiny bakteryjnej jest dostosowywane do normy.
  2. Przygotowanie inokulum z kultury M.tuberculosis wyhodowanej w płynnym podłożu 7H9
    1. Za pomocą sterylnej pipety przenieś 2,5 ml kultury M. tuberculosis (w wieku 2-3 tygodni) do świeżej butelki z kulkami szklanymi.
    2. Mieszaj mieszaninę przez co najmniej 1 minutę, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Działanie wirowe pomaga rozbijać wszelkie grudki.
    3. Przenieś 2,5 ml zawiesiny hodowlanej do świeżej butelki bijou i pozostaw na 15 minut, aby grudki osiadły na dnie.
    4. Porównaj zmętnienie ze wzorcem McFarland 1.0 i dostosuj za pomocą bulionu 7H9-S, aby osiągnąć wymagane stężenie.
  3. Rozcieńczenie inokulum
    1. Przygotuj rozcieńczenie 1:10: Aby rozcieńczyć inokulum, dodaj 1 ml zawiesiny bakteryjnej do 9 ml bulionu 7H9-S w sterylnym pojemniku (da to około 1,97 × 105 jtk/ml).

3. Przygotowanie antybiotyków i przechowywanie

  1. Przygotowanie roztworów podstawowych i roboczych: Przygotuj leki użyte w przykładowym eksperymencie, wraz z ich metodami przygotowania roztworu podstawowego i roboczego, jak podsumowano w Tabeli 1.
    1. Izoniazyd (INH lub I): Aby przygotować roztwór podstawowy izoniazydu o stężeniu 1 mg/ml, rozpuścić 2 mg izoniazydu w proszku w 2,0 ml wody destylowanej. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    2. Moksyfloksacyna (MOX lub M): Aby przygotować roztwór podstawowy moksyfloksacyny o stężeniu 1 mg/ml, rozpuścić 2 mg moksyfloksacyny w proszku w 2,0 ml wody destylowanej. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    3. Bedakilina (BDQ lub J): Bedakilina jest słabo rozpuszczalna w wodzie. Aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml, należy rozpuścić 2 mg proszku bedakiliny w 2,0 ml DMSO. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    4. Delamanid (DEL lub D): Podobnie jak bedakilina, delamanid ma słabą rozpuszczalność w wodzie. Aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml, należy rozpuścić 2 mg delamanidu w proszku w 2,0 ml DMSO. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
  2. Przechowywanie: Podać 100 μl każdego roztworu podstawowego leku do sterylnych kriowialiów i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy. Po rozmrożeniu wyrzuć pozostały roztwór. Nie zamrażaj ponownie.

4. Przygotowanie roztworu resazuryny i przechowywanie

  1. Rozpuścić rezazurynę do końcowego stężenia 0,01% lub 0,02% w wodzie destylowanej. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm do sterylizacji.
  2. Wysterylizowany roztwór rezazuryny należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1-2 tygodni, chroniąc przed światłem, aby zapobiec degradacji.

5. Przygotowanie płyty REMA

UWAGA: Patrz Rysunek 1 , aby zapoznać się z ilustracyjnym przewodnikiem dotyczącym konfiguracji płytki do mikromiareczkowania REMA 96-dołkowej. Płytka 96-dołkowa zapewnia wystarczająco dużo miejsca do przeprowadzenia testów leków w dwóch egzemplarzach dla każdego leku w sześciu dwukrotnych rozcieńczeniach.

  1. Dodać bulion 7H9-S: Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl bulionu 7H9-S do kolumn 2-11, rzędy B-G. Upewnij się, że dystrybucja jest równomierna we wszystkich studzienkach.
  2. Dodać roztwory leków: Dodać 100 μl roboczego roztworu INH do studzienek B2 i B6. Podobnie, dodaj roztwory robocze MOX, DEL i BDQ do ich odpowiednich dołków (B3 i B7, B4 i B8, B5 i B9).
  3. Rozcieńczyć stężenia leku: Za pomocą pipety wielokanałowej wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia od rzędów B do G (kolumny 2-9), upewniając się, że ostatnie 100 μl zostało odrzucone po wymieszaniu w rzędzie G.
  4. Studzienki kontrolujące wzrost: Dodać 100 μl bulionu 7H9-S do studzienek B10 i C10 w celu kontroli wzrostu.
  5. Kontrole ujemne i sterylność: Dodaj 200 μl bulionu 7H9-S do studzienek B11 i C11, aby służyły jako kontrole ujemne i sterylność.
  6. Zapobiegaj parowaniu: Dodaj 200 μl sterylnej wody destylowanej do wszystkich zewnętrznych studzienek, aby zminimalizować parowanie podczas inkubacji.
  7. Zaszczepić płytki: Zaszczepić każdą studzienkę 100 μl rozcieńczonej zawiesiny hodowli w stosunku 1:10, z wyjątkiem studzienki kontroli ujemnej. Zapewnić równomierne zaszczepienie we wszystkich studzienkach.
  8. Uszczelnić i inkubować: Przechowywać płytki w plastikowych torebkach w celu zachowania sterylności i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni.

6. Test miareczkowania REMA w szachownicę

UWAGA: Patrz rysunek 2A, B , aby zapoznać się z wizualnym przewodnikiem po szablonie testu miareczkowania REMA w szachownicę dla kombinacji leków (np. BDQ i DEL).

  1. Rozcieńczanie leków w pionie i poziomie: Rozcieńczanie pierwszego leku (BDQ) w pionie (rzędy B-H) i drugiego leku (DEL) w poziomie (kolumny 2-8), aby uzyskać różne kombinacje dwóch leków.
    UWAGA: Przygotować seryjnie rozcieńczony roztwór roboczy w sterylnej fiolce (od 4 μg/ml do 0,06 μg/ml) dla leku, który jest rozcieńczany poziomo.
  2. Dodać roztwór roboczy BDQ do rozcieńczenia pionowego: Dodać 100 μl roboczego roztworu BDQ do studzienki B2 i B8.
  3. Dodać bulion 7H9-S: Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl bulionu 7H9-S do kolumn C2-H8. Upewnij się, że dystrybucja jest równomierna we wszystkich studzienkach.
  4. Rozcieńczyć stężenia leku: Za pomocą pipety wielokanałowej wykonać dwukrotne rozcieńczenia z rzędów B-H (kolumny 2-8), upewniając się, że ostatnie 50 μl zostało odrzucone po wymieszaniu w rzędzie H.
  5. Dodać roztwór roboczy DEL do rozcieńczenia poziomego: Dodać seryjnie rozcieńczone roztwory robocze leków od 4 μg/ml do 0,06 μg/ml do odpowiednich studzienek.
  6. Studzienki kontrolujące wzrost: Dodać 100 μl bulionu 7H9-S do studzienek B9 i C9 w celu kontroli wzrostu.
  7. Kontrola ujemna i sterylność: Dodaj 200 μl bulionu 7H9-S do studzienek B10 i C10, aby służyły jako kontrole ujemne i sterylność.
  8. Zaszczepić płytki: Zaszczepić każdą studzienkę 100 μl rozcieńczonej zawiesiny hodowli w stosunku 1:10, z wyjątkiem studzienki kontroli ujemnej. Zapewnić równomierne zaszczepienie we wszystkich studzienkach.
  9. Uszczelnić i inkubować: Przechowywać płytki w plastikowych torebkach w celu zachowania sterylności i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni.

7. Inkubacja i interpretacja wyników

  1. Barwienie rezazuryną: Po 7 dniach inkubacji dodaj 30 μl rezazuryny (0,01%-0,02%) do każdej studzienki. Zapieczętuj i inkubuj płytkę przez noc, aby uzyskać kolor.
  2. Interpretacja zmiany koloru.
    1. Zbadaj wizualnie studnie w stałym białym świetle lub oświetleniu zrównoważonym światłem dziennym.
      UWAGA: Kontrola wzrostu (bez leku) powinna zmienić kolor na niebieski na różowy, wskazując na aktywny metabolizm bakteryjny. Niebieski kolor wskazuje na całkowite zahamowanie wzrostu. Różowy oznacza aktywny wzrost, podczas gdy fioletowy (odcień mieszany) reprezentuje częściowe zahamowanie.
    2. Porównaj intensywność koloru zarówno z kontrolą negatywną (tylko pożywka), jak i kontrolą pozytywną (wzrost bakterii bez leku), aby uzyskać dokładną interpretację. Aby zminimalizować stronniczość obserwatora, użyj podwójnych niezależnych odczytów lub fotografii płytowej.
      UWAGA: Ocena wizualna może się różnić w zależności od warunków oświetlenia otoczenia, dlatego niezbędne jest stałe oświetlenie.
  3. Minimalne stężenie hamujące (MIC)
    1. Zdefiniuj MIC jako najniższe stężenie leku, przy którym studzienka pozostaje całkowicie niebieska, co wskazuje na ≥99% zahamowanie aktywności metabolicznej. Rozważ studzienki o fioletowym lub różowym kolorze, wskazujące na częściowy lub całkowity wzrost.
      UWAGA: Oznaczenie MIC za pomocą REMA jest zbliżone do zasad klasycznej metody proporcji, w której MIC jest uważany za najniższe stężenie, które hamuje ≥99% inokulum w stosunku do kontroli wolnej od leku. Chociaż REMA nie wykorzystuje zliczeń CFU, wizualny punkt końcowy stanowi fenotypowy korelat tego progu opartego na proporcjach. Interpretacja ta jest zgodna z wcześniej ustalonymi protokołami kolorymetrycznymi11,14.

8. Obliczanie wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FIC)

UWAGA: Wskaźnik frakcyjnego stężenia hamującego (FIC) pomaga określić interakcję między dwoma lekami (synergia, antagonizm lub obojętność). Oblicza się go na podstawie wartości MIC uzyskanych z testu szachownicy.

  1. Zidentyfikuj wartość MIC dla każdego leku z osobna: Na podstawie testu REMA określ wartość MIC dla każdego leku, gdy jest stosowany indywidualnie.
  2. Zidentyfikuj wartość MIC dla każdego leku w skojarzeniu: Na podstawie testu miareczkowania w szachownicę zidentyfikuj wartość MIC każdego leku w przypadku stosowania w połączeniu z drugim lekiem.
  3. Oblicz FIC dla każdego leku.
    UWAGA: W tabeli 2 znajdują się wzory używane do obliczania FIC i wskaźnika. Tabela 3 przedstawia skonsolidowany kod MIC na podstawie testu REMA. Reprezentatywne wartości MIC i indeksu FIC przedstawiono w tabeli 4.
    1. Zinterpretuj indeks FIC w następujący sposób:
      FIC ≤ 0,5: Wskaż synergię - leki współpracują ze sobą, aby hamować wzrost skuteczniej niż każdy z leków osobno.
      FIC > od 0,5 do < 4,0: Wskaż addytywność - łączny efekt jest równy sumie poszczególnych efektów.
      FIC ≥ 4.0: Wskazują na antagonizm - leki zakłócają nawzajem swoją aktywność.
  4. Przykład: Oblicz indeks FIC dla BDQ i DEL w H37Rv
    1. Określić wartość MIC BDQ dla H37Rv (np. 0,125 μg/ml). W połączeniu z DEL zapisać wartość MIC BDQ jako 0,03 μg/ml.
    2. Określić wartość MIC DEL dla H37Rv (np. 0,063 μg/ml). W połączeniu z BDQ zapisać wartość MIC DEL jako 0,125 μg/ml.
    3. Obliczać FIC dla BDQ:
      FIC(BDQ) = MIC BDQ w połączeniu/MIC samego BDQ = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Obliczać FIC dla DEL:FIC(DEL) = MIC DEL w połączeniu / MIC samego DEL = 0,125 / 0,063 = 1,98
    5. Dodaj oba FIC, aby uzyskać indeks FIC:Indeks FIC = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Zinterpretuj wynik.
      UWAGA: Indeks FIC wynoszący 2,26 mieści się w zakresie interakcji addytywnych (od >0,5 do <4,0), co wskazuje, że połączenie BDQ i DEL ma addytywny wpływ na zahamowanie wzrostu M. tuberculosis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oznaczanie MIC leków przeciwgruźliczych za pomocą testu REMA
Aktywność bedakiliny, delamanidu, moksyfloksacyny i izoniazydu oceniano za pomocą REMA przeciwko lekowrażliwemu H37RV i lekoopornemu izolatowi klinicznemu M. tuberculosis. Bedakilinę, delamanid i izoniazyd stosowano w zakresie stężeń (od 1 μg/ml do 0,03 μg/ml), a moksyfloksacyna mieściła się w zakresie (2 μg/ml do 0,06 μg/ml). Zawiesiny bakteryjne lekoopornych izolatów klinicznych M. tuberculosis i H37Rv zaszczepiono następ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Globalne zagrożenie, jakie stwarza gruźlica lekooporna (DR-TB), stało się palącym problemem 1,19. Stworzyło to pilną potrzebę opracowania ulepszonych, szybkich metod testowania lekowrażliwości (DST), szczególnie w przypadku leków drugiego rzutu i nowszych leków przeciwgruźliczych. Takie metody są niezbędne do ulepszenia strategii leczenia, skutecznego zarządzania lekami przeciwgruźliczymi oraz zmniejszenia ryzyka postępu choroby i dalszej oporności

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka kwadratowa 250 ml z nakrętkąSchott Duran218203655Przygotowanie podłoża
Rosół 7H9Becton Dickinson271310Pożywka wzrostowa dla M. tuberculosis (temperatura pomieszczenia)
Płytka 96-dołkowa z pokrywkąCorning359696-dołkowe, przezroczyste, płaskie płytki polistyrenowe poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne (temperatura pomieszczenia)
ART-Tips (1000 μ L)TARSONOWIE528106Hydrofobowe filtry polietylenowe z  Sterylna końcówka filtra z polipropylenu (temperatura pokojowa)
ART-Porady (200 μ L)TARSONOWIE528104Hydrofobowe filtry polietylenowe z  Sterylna końcówka filtra z polipropylenu (temperatura pokojowa)
Chlorek baru dwuwodnyMerck217565McFarland Przygotowanie standardowe (temperatura pomieszczenia)
Bedakilina (BDQ)Jansen i JansenPrezent od Jansena i JansenaLek przeciwgruźliczy (4 ° C)
CasitoneBecton Dickinson225930Suplement do hodowli bakterii (temperatura pomieszczenia)
Delamanid (DEL)Otsuka FarmaceutykiPrezent od Otsuka PharmaceuticalsLek przeciwgruźliczy (4 ° C)
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich67-68-5Przygotowanie wywaru leku (temperatura pomieszczenia)
Filtr 0,2 μ mMiliporySLGVR33RS0,22  μ m PVDF, jednorazowy, sterylny filtr strzykawkowy (temperatura pokojowa)
GlicerolMerck356350Dodano do pożywki hodowlanej (temperatura pomieszczenia)
Pętla zaszczepiającaSigma-AldrichI8263 powiedział:Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia)
Izoniazyd (INH)Sigma-AldrichI3377-5GLek przeciwgruźliczy (4 ° C)
LJ średni skosBD Mycobactosel221414Pożywki wzrostowe dla M. tuberculosis (4 ° C)
Butelka McCartney Bijou z wąskimi ustami, 14 mlTechnologia Supertek12.124.0014Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia)
Butelka McCartney Bijou z wąskimi ustami, 7 mlTechnologia Supertek12.124.0007Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia)
Mikropipety (1000 μ L)GilsonF144059MDo precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa)
Mikropipety (200 μ L)GilsonFA10005MDo precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa)
Moksyfloksacyna (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50MGLek przeciwgruźliczy (4 ° C)
Pipeta wielokanałowa (20– 200 μ L)Firma VWR849070024Do jednoczesnego pipetowania przez studzienki
Organizacja OADC (Organizacja Zarządzania TBecton Dickinson211886Suplement do hodowli bakterii (4 ° C)
Napełniacze do pipetMerckZ333980Do precyzyjnego obchodzenia się z cieczami (temperatura pokojowa)
Sól sodowa rezazurynySigma-Aldrich62758-13-8Wskaźnik redoks do testów REMA (temperatura pomieszczenia)
Pipety serologiczne, 10 mlCorningCLS4100Użyto sterylnych, polistyrenowych pipet jednorazowych (Temperatura pokojowa)
Koraliki szklane lite, średnica 6 mmSigma-AldrichZ265950Do przygotowania zawiesiny hodowlanej (temperatura pomieszczenia)
Kwas siarkowy 95– 97%Merck100731McFarland Przygotowanie standardowe (temperatura pomieszczenia)
Strzykawki do filtraFurgonetka Dispo100032Do stosowania z filtrami strzykawkowymi
Mieszalnik wirowyREMICM-101 PLUSDo przygotowania zawiesiny hodowlanej
Torebka foliowa zapinana na zamek błyskawicznySigma-AldrichZ162949

Bibliografia

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
  2. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
  3. Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S. Highly transmitted M. tuberculosis strains are more likely to evolve MDR/XDR and cause outbreaks, but what makes them highly transmitted. Tuberculosis. 129, 102092(2021).
  4. Koul, A., et al. Delayed bactericidal response of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline involves remodelling of bacterial metabolism. Nat Commun. 5, 3369(2014).
  5. Matsumoto, M., et al. OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS Med. 3 (11), e466(2006).
  6. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 4. treatment drug-resistant tuberculosis treatment. , World Health Organization. At https://www.who.int/publications/i/item/9789240063129 (2020).
  7. Conradie, F., et al. Treatment of highly drug-resistant pulmonary tuberculosis. N Engl J Med. 382 (10), 893-902 (2020).
  8. Lechartier, B., Hartkoorn, R. C., Cole, S. T. In vitro combination studies of benzothiazinone lead compound BTZ043 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 56 (11), 5790-5793 (2012).
  9. Mallikaarjun, S., et al. Delamanid coadministered with antiretroviral drugs or anti-tuberculosis drugs shows no clinically relevant drug-drug interactions in healthy subjects. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5976-5985 (2016).
  10. Pai, M., Nicol, M. P., Boehme, C. C. Tuberculosis diagnostics: State of the art and future directions. Microbiol Spectr. 4 (5), (2016).
  11. Palomino, J. -C., et al. Resazurin microtiter assay plate: Simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  12. Pital, A., Pital, R. C., Leise, J. M. A rapid method for determining the drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am Rev Tuberc. 78 (1), 111-116 (1958).
  13. Präbst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., Hübner, H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 1601, 1-17 (2017).
  14. Schön, T., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex isolates - the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination. Clin. Microbiol. Infect. 26 (11), 1488-1492 (2020).
  15. Singh, S., et al. Rapid identification and drug susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis: Standard operating procedure for non-commercial assays: Part 3: Colorimetric Redox Indicator Assay v1.3.12. J Lab Physicians. 4 (2), 120-126 (2012).
  16. Caleffi-Ferracioli, K. R., Maltempe, F. G., Siqueira, V. L. D., Cardoso, R. F. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis. 93 (6), 660-663 (2013).
  17. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis growth: a correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-290 (2013).
  18. Chandramohan, Y., et al. In vitro interaction profiles of the new antitubercular drugs bedaquiline and delamanid with Moxifloxacin against clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Glob Antimicrob Resist. 19, 348-353 (2019).
  19. Hameed, H. A., et al. Characterization of genetic variants associated with rifampicin resistance level in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Guangzhou Chest Hospital, China. Infect Drug Resist. 15, 5655-5666 (2022).
  20. Lienhardt, C., et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: Needs, challenges, promise, and prospects for the future. J Infect Dis. 205, S241-S249 (2012).
  21. Anoopkumar-Dukie, S., et al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells. Br J Radiol. 78 (934), 945-947 (2005).
  22. Baker, C. N., Thornsberry, C., Hawkinson, R. W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J Clin Microbiol. 17 (3), 450-457 (1983).
  23. McFarland, J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. XLIX (14), 1176(1907).
  24. Bellio, P., Fagnani, L., Nazzicone, L., Celenza, G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX. 8, 101543(2021).
  25. Martin, A., Camacho, M., Portaels, F., Palomino, J. C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: Rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother. 47 (11), 3616-3619 (2003).
  26. Zhao, L., et al. Evaluation of BACTEC MGIT 960 system for the second-line drugs susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in China. J Microbiol Methods. 91, 212-214 (2012).
  27. Said, H. M., et al. Comparison between the BACTEC MGIT 960 system and the agar proportion method for susceptibility testing of multidrug resistant tuberculosis strains in a high burden setting of South Africa. BMC Infect Dis. 12, 369(2012).
  28. Caviedes, L., Delgado, J., Gilman, R. H. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40 (5), 1873-1874 (2002).
  29. Mouton, J. W., Vinks, A. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling of antibacterials in vitro and in vivo using bacterial growth and kill kinetics. Clin Pharmacokinet. 44 (2), 201-210 (2005).
  30. Sychev, A. V., Lavrova, A. I., Dogonadze, M. Z., Postnikov, E. B. Establishing compliance between spectral, colourimetric and photometric indicators in resazurin reduction test. Bioengineering. 10 (8), 962(2023).
  31. Postnikov, E. B., Sychev, A. V., Lavrova, A. I. Dose-response curve in REMA test: Determination from smartphone-based pictures. Analytica. 5 (4), 619-631 (2024).
  32. Mehlawat, N., Chakkumpulakkal Puthan Veettil, T., Sharpin, R., Wood, B. R., Alan, T. Ultrafast and ultrasensitive bacterial detection in biofluids: Leveraging resazurin as a visible and fluorescent spectroscopic marker. Anal Chem. 96 (45), 18002-18010 (2024).
  33. Grosset, J., Truffot-Pernot, C., Lacroix, C., Ji, B. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 36 (3), 548-551 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

minimalne st enie hamuj cegru lica wielolekoopornabadanie wra liwo ci na lekileki przeciwgru liczesynergistyczne dzia anie lek w
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.