Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.

Streszczenie

Konsekwentne dostarczanie płynów, w tym potencjalnych terapii, do płuc ma kluczowe znaczenie dla modelowania choroby płuc i przedklinicznego rozwoju terapeutycznego. Jednak obecne metody stosowane u myszy - takie jak aspiracja ustno-gardłowa metodą ciągnięcia języka - mogą powodować zmienny poród. W tym miejscu opisujemy użycie niedrogiego, podłączonego do telefonu komórkowego, oświetlonego otoskopu do wizualizacji głośni i umożliwienia bezpośredniego zaszczepienia do dróg oddechowych. Szczegółowo opisujemy zoptymalizowaną technikę inscenizacji z odpowiednim oświetleniem i pomocami do pozycjonowania. Opisano również, w jaki sposób można niezawodnie przeprowadzić intubację przy użyciu elastycznego cewnika o sile 20 G ze światłem światłowodowym lub bez niego. Technika ta znacznie zmniejsza zmienność dostarczania do płuc i zwiększa objętość dostarczanego płynu, który dociera do płuc. Ze względu na zmniejszoną wariancję, przy stosowaniu tej metody można stosować mniejsze kohorty zwierząt zamiast wkraplania ustno-gardłowego metodą ciągnięcia języka. Poniżej przedstawiono metodę skutecznej, szybkiej i konsekwentnej intubacji myszy i dostarczania jej do płuc, w tym solidne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej. Dzięki tej ulepszonej metodologii konsekwentna, bezpieczna intubacja oraz powtarzalne, skuteczne dostarczanie do płuc są w zasięgu ręki.

Wprowadzenie

Globalnie, choroby układu oddechowego są główną przyczyną zabójców dzieci poniżej 5 roku życia i są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u dorosłych¹. W 2021 roku zakażenie SARS-CoV2 było trzecią najczęstszą przyczyną zgonów w US². Modele mysie są często wykorzystywane do badania chorób płuc, w tym astmy, zapalenia płuc, przewlekłej natrętnej choroby płuc i zwłóknienia płuc. Prawie wszystkie te modele wymagają dostarczania płynnych środków do płuc. Można to osiągnąć poprzez bezpośrednią kanaulację tchawicy (zwykle pod bezpośrednią wizualizacją przy użyciu techniki chirurgicznego cięcia), podanie donosowe lub aspirację ustno-gardłową za pomocą dobrze znanej metody ciągnięcia języka^3,4,5. Jednak wszystkie te techniki mają wady. Tworzenie się tkanki bliznowatej po technice chirurgicznego cięcia sprawia, że nie nadaje się ona do badań, które wymagają wielokrotnego podawania środków do płuc, a dwie ostatnie techniki mogą prowadzić do zmiennego dostarczania do płuc. Co więcej, przy użyciu metody ciągnięcia języka, uraz tkankowy języka może być wyraźny, a skuteczność dostarczania zależy od badacza wykonującego procedurę, patrz Rysunek 1.

Rysunek 1: Intubacja sterowana i indukcja IT skutkują lepszym dostarczaniem do płuc i mniejszą zmiennością w porównaniu do ciągnięcia języka. (A) Trzech różnych badaczy dostarczyło 50 μL rozcieńczonego tuszu indyjskiego przez pociągnięcie języka, ustaloną metodę podawania ustno-gardłowego (OP). Dwóch badaczy dostarczyło również atrament do płuc za pomocą intubacji, jak opisano. (B) Płuca zostały usunięte w 1-4 godziny po porodzie i sfotografowane w 2-krotnym powiększeniu. Fotografie oceniano pod kątem zabarwionego obszaru za pomocą ImageJ. (n=6 (intubacja) lub 9 (podanie op), wyniki z 2 lub 3 niezależnych powtórzeń przeprowadzonych przez 2-3 różnych badaczy, p<0,0001 Test T Welcha) (C) Zmienność w podawaniu płuc została również obliczona jako procentowe odchylenie od średniej. Administracja PO była znacznie bardziej zróżnicowana. (p = 0,0317, test Welsha T, GraphPad Prism 10.2.3 wszystkie statystyki i wykresy) (Użyto myszy płci męskiej i żeńskiej C57BL/6J, były one w wieku ~10 tygodni). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mysia anatomia sprawia, że intubacja jest trudna i czasochłonna. Otwór gębowy jest mały, a tkanka policzkowa może zasłaniać badaczowi widok na rima glottidis⁶. Co więcej, fałdy głosowe są bardzo małe i może być trudno je zobaczyć, ponieważ leżą blisko podstawy języka. Wreszcie, potwierdzenie prawidłowego umieszczenia rurki dotchawiczej jest trudne, ponieważ mała objętość oddechowa często nie zaparowuje lustra⁷. Trudności te zachęciły do opracowania szeregu innowacyjnych technik intubacji myszy. Te ulepszone metody obejmują użycie laryngoskopu noworodkowego i drutu do wprowadzenia cewnika do tchawicy^8,9, użycie światłowodowego źródła światła do prowadzenia i usztywnienia cewnika^10,11, oraz korzystanie z transmisji wideo na żywo⁶. Ostatnio zastosowanie otoskopu klinicznego pomogło w intubacji jamy ustnej i tchawicy¹². Inni zastosowali transillumination do wizualizacji głośni i intubacji myszy^7,13,14. Metody te mają jednak wiele wad. Stosowanie środków do depilacji na szyi myszy i bliskość gorącego źródła światła sprawiają, że transiluminacja jest dalekim od idealnego podejścia. Użycie igły w cewniku lub wprowadzenie ostrych narzędzi do jamy ustnej oznacza, że niektóre metody usztywnienia cewnika narażają zwierzęta na nadmierne ryzyko. Wreszcie, wykonanie nacięcia nad tchawicą w celu potwierdzenia umieszczenia ma znaczące wady, w tym potrzebę sterylności i nagromadzenie tkanki bliznowatej. Do tej pory wkraplanie dotchawicze przez intubację okazało się zbyt trudne, aby można je było powszechnie przyjąć¹⁵, a postępy w rozwoju metodologicznym pozostawały odizolowane i nieużywane przez wiele laboratoriów¹⁵. Dalsze badania koncentrowały się na wyborze środka znieczulającego podczas porodu, stwierdzając, że ketamina może mieć przewagę nad izofluranem⁵. Jednak izofluran, który nie jest substancją kontrolowaną i szybko ulega zużyciu po zakończeniu zabiegu, przyniósł atrakcyjne korzyści, dlatego zastosowaliśmy tę formę znieczulenia, optymalizując inne aspekty tej metodologii^16,17.

Metoda, którą opisujemy, pokonuje wyzwania związane z wizualizacją, które inni próbowali rozwiązać, zmniejsza ryzyko dla zwierząt doświadczalnych, skraca czas potrzebny na wkroplenie małych objętości dotchawiczo przez rurkę dotchawiczą, zwiększa objętość płynu docierającego do płuc i oferuje ulepszoną metodę potwierdzania umieszczenia rurki dotchawiczej. Korzystanie z podwieszanej podstawy, magnetycznych pomocnych dłoni (zaciski aligatora na elastycznych ramionach przymocowanych do podstawy) i jaśniejszego oświetlenia pozwala indywidualnemu badaczowi na skuteczne wykonanie porodu dotchawiczego. Wizualizacja jest łatwiejsza dzięki "domowemu" otoskopowi z łącznością WIFI. To urządzenie jest tańsze niż komercyjne instrumenty do intubacji. Co więcej, łączność WIFI pozwala na jednoczesny przekaz wideo na urządzeniu przenośnym (takim jak telefon komórkowy), dzięki czemu nadaje się do treningu. Intubacja może wykorzystywać światłowodowe źródło światła przewleczone przez elastyczny cewnik (PTFE) o wymiarach 20 g x 1" (usunięta igła) lub cewnik bez światła. Głębokość jest kontrolowana za pomocą dwóch metod - dodania klina bezpieczeństwa do intubacji (stożkowa osłona na cewniku) oraz obserwacji głębokości w strumieniu wideo. Umieszczenie rurki dotchawiczej potwierdza się za pomocą "metody pęcherzykowej" w celu wyraźniejszej wizualizacji objętości oddechowej niż tradycyjna metoda lustrzanej mgły¹⁸. Jest to mniej stresujące dla zwierzęcia niż poleganie na niedrożności tchawicy w celu modyfikacji parcia na oddech¹⁰ w celu potwierdzenia umieszczenia. Połączone użycie rurki przedłużającej sprzężonej z cewnikiem w celu potwierdzenia udanej intubacji (zwanej dalej metodą pęcherzykową), uproszczone z Watanabe et. al⁷, a konsumencki wideootoskop w jednej procedurze sprawia, że intubacja jest praktyczną metodą terapeutycznego dostarczania do płuc i wyraźną poprawą metody ciągnięcia języka (zobacz Rysunek 1). Jeśli szukasz niezawodnej, spójnej i niedrogiej metody niechirurgicznego podawania płynów do płuc myszy, zwłaszcza bez użycia substancji kontrolowanych (takich jak ketamina) lub drogiego sprzętu, następująca metoda może być idealna.

Protokół

Konieczne jest, aby te procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (IACUC), wymienione w protokole, a personel weterynaryjny był konsultowany przed podjęciem dalszych działań. IACUC w naszej instytucji zatwierdziło protokół przed rozpoczęciem eksperymentu i przejrzało zawartość filmu przed przesłaniem. Otrzymaliśmy wsparcie i szkolenia za pośrednictwem Zakładu Medycyny Porównawczej Tulane, aby zapewnić najwyższy standard opieki nad wszystkimi naszymi zwierzętami laboratoryjnymi.

1. Ustawić

UWAGA: Zobacz Rysunek 2 dla konfiguracji.

Rysunek 2: Stacja używana do intubacji sterowanej jest przygotowana tak, jak pokazano. Od lewej: pipety do podawania, rurka bąbelkowa do potwierdzenia prawidłowego umieszczenia rurki dotchawiczej, kleszcze, szpatułka, wziernik nosowy dla dzieci (omówiony, ale nie potrzebny do tego zabiegu), pomocne dłonie, światło powiększające, statyw pod mysz ze stożkiem nosowym, sonda światłowodowa, komora indukcyjna znieczulenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wyczyść klin zabezpieczający dostarczony z zestawem do intubacji za pomocą podkładki do przygotowania izopropanolu. Wsuń czysty klin zabezpieczający (zielony na filmie) na elastyczną kaniulę 20 G i bezpiecznie wyrzuć dołączoną igłę.
   UWAGA: Zastosowany zestaw do intubacji gryzoni (tabela materiałów) zawiera kliny zabezpieczające do intubacji. Są to małe, stożkowe rękawy, które mieszczą się na elastycznym cewniku o wymiarach 20 G x 1 cal. Zapobiegają one uszkodzeniu cariny przez cewnik.
2. Zbierz inne potrzebne narzędzia, w tym telefon komórkowy, komercyjny otoskop, stojak na mysz ze stożkiem nosowym, drobno ząbkowane zgięte kleszcze, przygotowaną rurkę dotchawiczą (od 1.1) i światło światłowodowe, jeśli go używasz. Przed użyciem wyczyść to wszystko za pomocą wkładek przygotowawczych z izopropanolem.
3. Weź około 20 cm elastycznej rurki. Zegnij go w kształcie litery U, dodaj połączenie Luer lock na jednym końcu i zabezpiecz go opaską zaciskową. Do probówki dodaj 200-300 μl sterylnej, przefiltrowanej wody lub atramentu indyjskiego. W dalszej części tego zespołu nazywa się go "rurką bąbelkową".
4. Wykonaj pętlę do szwów, zawiązując ~13 cm plecionego jedwabnego szwu w rozmiarze 0 w kółko. Umieść tę pętlę w górnej części stojaka i upewnij się, że obie strony szwu są zabezpieczone, a stojak jest czysty. Umieść podstawkę pod mysz na metalowej podstawie światła powiększającego. Umieść pomocne dłonie wokół miejsca, w którym będzie znajdować się pysk myszy.
   UWAGA: Wielu sprzedawców produkuje wymienne podstawki (patrz Tabela materiałów), a jeden z nich można tanio wykonać w laboratorium^4,7,14. Do podwieszenia zwierzęcia użyto plecionego jedwabnego szwu w rozmiarze 0. Opisano jednak użycie innych materiałów w tym samym celu^4,13.
5. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia. Stosować stałe natężenie przepływu_O2 przy 0,8 l/min i 2% izofluranu. Znieczulij zwierzę na tyle (patrz uwaga), aby nie obudziło się podczas zakładania stożka nosowego. Nie należy znacząco hamować częstości oddechów myszy. Regularne oddechy pomagają docenić fałdy głosowe.
   UWAGA: Częstość oddechów myszy powinna być normalna. Kryterium to służy do ustalenia odpowiedniej głębokości znieczulenia. Może się to różnić w zależności od zwierzęcia i może przekraczać 200 oddechów/min. W związku z tym nie jest praktyczne ani konieczne liczenie oddechów ani szczypanie palców u nóg.
   UWAGA: W razie potrzeby tę procedurę można przerwać. Zwierzęta nie powinny jednak pozostawać w komorze indukcyjnej dłużej, niż jest to absolutnie konieczne.
6. Podłącz otoskop do telefonu komórkowego i upewnij się, że obraz wideo jest stabilny.
   UWAGA: Aby zminimalizować narażenie badaczy na izofluran podczas tej procedury, należy użyć chemicznego respiratora podczas wykonywania wielu intubacji lub szkolenia w tej metodzie. Alternatywnie wykonaj procedurę w dygestorium.

2. Inscenizacja zwierząt

1. Gdy tylko pierwsze zwierzę zaśnie, wyjmij je z komory indukcyjnej, posmaruj i umieść jego górne zęby na długości szwu. Lekko napnij zwierzę, aby utrzymać pozycję szwu podczas odkładania myszy z powrotem na stojak.
   UWAGA: Zwierzęta są znieczulane średnio przez 2 minuty, łącznie z indukcją. To znacznie zmniejsza ryzyko dla zwierzęcia, eliminuje potrzebę smarowania okulistycznego i zapobiega gromadzeniu się śliny. Pracuj nad tym, aby zwierzęta były uspokojone tak krótko, jak to możliwe.
2. Wyreguluj kąt szyi lekko do tyłu (umieszczając szyję w niewielkim wyprostu, 5°-15°). Delikatnie popchnij stożek nosowy nad nozdrzy. Nie dociskaj mocno stożka w dół, ponieważ może to kolidować ze szwem, zawieszając mysz.
3. Mocno chwyć język jak najbliżej dolnej wargi, używając dużych, drobno ząbkowanych zgiętych kleszczyków. Pociągnij go w dół i odsuń od górnych zębów na jedną stronę dolnych zębów.
   UWAGA: Przedłużona przyczepność, nadmierne napięcie lub zmiażdżenie języka może zagrozić zdrowiu zwierząt. Należy monitorować język pod kątem oznak urazu (siniaki, krwawienie, obrzęk lub wysuszenie), a jeśli zostaną zaobserwowane, przerwać zabieg i powiadomić personel weterynaryjny.
4. Jeśli używasz pomocnych rąk, podeprzyj kleszcze w tej pozycji. W zależności od doświadczenia i ostrości wzroku badacza, podświetlane szkło powiększające może pomóc w odpowiednim ułożeniu zwierzęcia.
5. Przeprowadź światło światłowodowe (jeśli używasz) przez elastyczny cewnik z założonym klinem zabezpieczającym do intubacji (zielony na filmie).
   UWAGA: Nie mocuj światłowodowego zbyt mocno do źródła światła. Zbyt mocne naciskanie utrudnia usunięcie światła przy jednoczesnym pozostawieniu rurki dotchawiczej na miejscu.

3. Wizualne docenienie strun głosowych i intubacja

1. Trzymając otoskop w ręce niedominującej, delikatnie przyciśnij go do języka. Następnie ustaw kamerę pod kątem i jej źródło światła, aby uwidocznić struny głosowe w pobliżu podstawy języka.
   UWAGA: Niewielkie różnice w anatomii i kolorze tkanek mogą utrudniać orientację. Użyj ruchu związanego z oddychaniem, aby potwierdzić identyfikację strukturalną.
2. Przy włączonym świetle światłowodowym (jeśli używasz), poprowadź kaniulę wzdłuż górnej części otoskopu, nawiązując lekki kontakt z podstawą języka lub wargową częścią otoskopu w celach informacyjnych. Wsuń go do ust myszy między miękką paletą a krawędzią otoskopu.
   UWAGA: Jeśli światło światłowodowe nie jest używane, na tym etapie można podłączyć do cewnika "rurkę bąbelkową" opisaną w kroku 4. Jasne, skupione oświetlenie w pysku myszy jest niezbędne do tej modyfikacji zabiegu.
3. Dostosuj kąt podejścia tak, aby cewnik był bardzo płytki. Natychmiast po wprowadzeniu cewnika (mniej niż 1 mm poza fałdy głosowe) należy podnieść końcówkę cewnika, tak aby była prawie równoległa do blatu. Zapobiega to wpychaniu się cewnika przez nagłośnię grzbietowo do przełyku. Szczególnie podczas treningu, gdy masz trudności lub na wczesnym etapie doświadczenia, korzystanie z przekazu wideo jest nieocenione w umieszczaniu rurki dotchawiczej między fałdami głosowymi.
   UWAGA: Wydzielanie śliny nie utrudnia oglądania fałdów głosowych podczas wykonywania tej procedury. Jednak użycie bawełnianego aplikatora z końcówką włóczni do usuwania zatykającej śliny zostało opisane w poprzednich publikacjach podczas intubacji szczurów¹⁹. Ta metoda może okazać się przydatna, jeśli ślina stanie się problemem.
   1. W przypadku napotkania oporu należy natychmiast usunąć cewnik i pozwolić, aby oddechy powróciły do normy. W przypadku zaobserwowania krwawienia należy skonsultować się z personelem weterynaryjnym.
      UWAGA: Podczas przesuwania cewnika nie powinno być prawie żadnego oporu.

4. Potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej

1. Potwierdź wzrokowo, że rurka dotchawicza znajduje się we właściwym miejscu za pomocą otoskopu. Ponadto upewnij się, że rurka jest prawidłowo umieszczona, biorąc pod uwagę, że tchawica zapewnia mniejszy opór podczas umieszczania niż przełyk. Zwróć uwagę, że w odpowiedniej pozycji rurka dotchawicza znajduje się ~5 mm poza fałdami głosowymi. Poszukaj światła ze źródła światłowodowego prześwitującego przez skórę szyi, aby ponownie sprawdzić, czy umieszczenie jest prawidłowe.
   UWAGA: Klin zabezpieczający do intubacji powinien zapobiegać zbyt głębokiemu włożeniu rurki dotchawiczej. Klin zabezpieczający zapobiega urazom cariny; Nie musi to jednak powstrzymywać awansu. Powinien być używany jako zabezpieczenie, a optymalna głębokość jest często płytsza niż pozwala na to klin.
2. Następnie, przytrzymując rurkę dotchawiczą na miejscu, usuń światło światłowodowe. Upewnij się, że cewnik jest prawidłowo umieszczony przy użyciu "metody pęcherzykowej" (opisanej poniżej), a nie zaparowania lustra.
3. Odzyskać rurkę bąbelkową przygotowaną w kroku 1.3. Przygotuj go przed zabiegiem i ponownie wykorzystaj dla wszystkich zwierząt.
   UWAGA: Nigdy nie należy zasysać 200-300 μl wody lub atramentu w probówce bąbelkowej. Aby tego uniknąć, upewnij się, że płyn znajduje się daleko od zamka Luer.
4. Po założeniu rurki dotchawiczej zabezpiecz rurkę bąbelkową na miejscu za pomocą zamka Luer. Objętość oddechowa powinna być natychmiast widoczna. Jeśli nie, rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona. Usuń go szybko i pozwól, aby mysz powróciła do normalnego tempa oddychania.
   UWAGA: Niewłaściwe umieszczenie cewnika w przełyku spowoduje ucisk tchawicy, uniemożliwiając wystarczające oddychanie. Nieprawidłowemu przemieszczeniu często towarzyszy utrudniony oddech (w tym znaczny udział mięśni międzyżebrowych) i/lub dramatycznie zmniejszona częstość oddechów. Ponadto kaniulacja przełyku może prowadzić do skurczu mięśni, co utrudnia późniejszą intubację; Z tego powodu zalecamy korzystanie z wielu zwierząt podczas treningu.

5. Dostawa dotchawicza

UWAGA: Podobnie jak w przypadku metody ciągnięcia języka przy porodzie ustno-gardłowym, poród przez intubację grozi utopieniem zwierzęcia. U dorastających i dorosłych myszy 50 μl jest ogólnie bezpieczną objętością płynu do dostarczenia i jest wystarczające do rozprowadzenia po płucach.

1. W przypadku używania strzykawki do podawania: Odłączyć rurkę bąbelkową i Luer lock od cewnika, podłączyć załadowaną strzykawkę Luer Slip i wcisnąć tłok, aby dostarczyć żądaną objętość (maksymalnie 50 μL).
2. W przypadku używania pipety do podawania: Odpipetować żądaną objętość (maksymalnie 50 μl) bezpośrednio do cewnika i pozwolić myszy na wdychanie roztworu.
   UWAGA: Jeśli trenujesz, rozważ użycie wskaźnika, takiego jak rozcieńczony, przefiltrowany atrament indyjski lub błękit metylenowy.
3. Aby zapewnić rozproszone dostarczanie do płuc, należy przepłukać dostarczony płyn do płuc za pomocą do 500 μl powietrza²⁰. Można to zrobić za pomocą fabrycznie załadowanej strzykawki Luer lock o pojemności 0,5 ml lub pipety P1000 wyposażonej w końcówkę filtrującą, które okazały się niezawodne. W razie potrzeby można przeprowadzić wielokrotne wgłębienia pipetora bez ryzyka negatywnego zasysania dostarczonej cieczy.
   UWAGA: W przypadku zaszczepiania zwierzęcia tą metodą należy rozważyć zmniejszenie stężenia inokulum ze względu na zwiększoną skuteczność podawania w stosunku do aspiracji ustno-gardłowej lub donosowej.
   UWAGA: Podczas przepłukiwania inokulum powietrzem może być konieczne użycie większej ilości niż objętość oddechowa (~200 μL). Jednak użycie 500 μL nie wiąże się z ryzykiem barotraumy, ponieważ jest to tylko około połowa pojemności życiowej²¹. Dorosłe myszy mają pojemność rezerwy wdechowej około ~800 μl, więc nawet jeśli mysz miała wdech bezpośrednio przed płukaniem, barotrauma nie występuje²¹. Rozważ, czy mniejsze objętości spłukiwanego powietrza mogą odpowiadać Twoim potrzebom w zakresie dystrybucji inokulum (sugerowano 100-200 μL).

6. Ocena dostawy

UWAGA: To jest wykonywane tylko wtedy, gdy ktoś trenuje lub ćwiczy tę procedurę.

1. Poddać zwierzę eutanazji w sposób humanitarny zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. Zastosowano tu uduszenie CO₂ jako podstawową metodę eutanazji oraz zwichnięcie szyjki macicy jako metodę potwierdzającą eutanazję.
2. Otwórz ścianę klatki piersiowej i usuń płuca. Zrób to, otwierając otrzewną, uzyskując dostęp do przepony od strony ogonowej i nakłuwając ją małymi nożyczkami w miejscu, w którym widać serce. Spowoduje to cofnięcie się płuc i da więcej miejsca na otwarcie jamy klatki piersiowej poprzez przecięcie żeber.
   UWAGA: Jeśli wymagana jest perfuzja w celu zmniejszenia ilości krwi w płucach, na tym etapie należy wykonać zabieg przez prawą komorę serca.
3. Po wyjęciu należy krótko przepłukać płuca 1 ml sterylnego PBS. Połóż je płasko na białej powierzchni (jak gąbka chirurgiczna), aby odsłonić maksymalny obszar, zachowując względne ułożenie płata.
4. Sfotografuj płuca ex vivo (użyliśmy telefonu komórkowego), otwórz obrazy w ImageJ i określ ilościowo poplamione i niezabarwione obszary, śledząc kontur czoła barwnika. Określ ilościowo obszar zabarwiony za pomocą niezależnego, zaślepionego badacza, aby uniknąć stronniczości.
   UWAGA: W przypadku korzystania z luminescencji i IVIS, jak pokazano na rysunku Rysunek 3, obrazowanie na żywo in vivo powinno być przeprowadzone zamiast kroku 6.

Wyniki

Jak widać w Rysunek 1 i Rysunek 3, inokulacja dopłucna przy użyciu tradycyjnej metody ciągnięcia języka (dostawa ustno-gardłowa) skutkowała niejednolitym, niespójnym rozkładem tuszu i większą zmiennością między badaczami. W przeciwieństwie do tego, wkroplenie IT po intubacji prowadziło do bardziej spójnego dostarczania zarówno do prawego, jak i lewego płuca i było mniej zmienne (Ryciny 1C i Ryc. 3D). W płucach zwierząt, którym podano tusz przez aspirację ustno-gardłową za pomocą pociągnięcia języka, tusz jest subtelny i obecny tylko w pobliżu dużych dróg oddechowych zwierząt (Ryc. 1A). W przeciwieństwie do tego, gdy intubacja sterowana została użyta do dostarczenia atramentu, rozprzestrzenił się on znacznie głębiej w tkance, oznaczając znacznie większy obszar płuc. Kiedy porównano powierzchnię płuc zabarwioną tuszem między metodami, metoda intubacji okazała się znacznie lepsza od ciągnięcia języka (Ryc. 1B)". Zmienność ilości podawanego atramentu była również drastycznie niższa w warunkach intubacji (Rysunek 1C). Zwiększona powierzchnia płuc zabarwiona i mniejsza zmienność ilości płynu docierającego do płuc silnie sugerowały, że dostarczanie IT jest lepsze niż ciągnięcie języka.

Jak widać na Filmie 1, tradycyjne endoskopy (jak wcześniej opublikowane) mają zbyt długą ogniskową, aby docenić fałdy głosowe i kierować umiejscowieniem rurki dotchawiczej^6,19. W przeciwieństwie do tego, obrazy wideo wykonane za pomocą otoskopu konsumenckiego (ryc. S1 i znaczniki czasu: 6:34 i 7:05 na filmie) miały znacznie lepszą rozdzielczość, co prowadziło do lepszej wizualizacji głośni.

Ta metoda intubacji obejmuje wielokrotne weryfikacje umieszczenia rurki w tchawicy. Objętość oddechowa myszy była łatwo widoczna podczas stosowania metody bąbelkowej (ryc. S2 i znacznik czasu: 8:25) i działa jako ostateczna pewność, że każdy dostarczony płyn dostanie się do płuc.

Aby dokładniej ocenić wariancję dwóch metod dostarczania, oceniliśmy ekspresję transgenu w tkance płucnej po tym, jak myszom zaszczepiono 1 x^{10 11} vg AAV6.2-Lucyferazy przy użyciu dwóch różnych metod (wkraplanie ustno-gardłowe metodą ciągnięcia języka lub dostarczanie dotchawicze po intubacji sterowanej). Siedem dni po podaniu wektora pomiary luminescencji wykonano za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS) (Ryc. 3A). Następnie obliczyliśmy średnie promieniowanie w obu płucach. 10 minut przed obrazowaniem (30 s ekspozycji) wstrzyknięto im (podskórnie) 200 μl lucyferyny (15 mg/ml). Jak pokazano w Rysunek 3B, zwierzęta, którym podano wektor przez wkroplenie jamy ustnej i gardła, miały sygnał luminescencyjny, który był szeroko rozpowszechniony zarówno w okolicy klatki piersiowej, jak i nosa. Natomiast zwierzęta, którym podano wektor przez dostarczenie dotchawicze za pomocą intubacji sterowanej, wykazywały skoncentrowaną luminescencję w płucach. Średnie promieniowanie u zaintubowanych zwierząt było znacznie większe w porównaniu z dostarczaniem ustno-gardłowym, co wskazuje na poprawę skuteczności dostarczania wektora do płuc i zmniejszoną zmienność podawania, obliczoną na podstawie różnicy w stosunku do średniej (Rysunek 3C i Rysunek 3D).

Pozytywne wyniki metody intubacji to powtarzalne wkroplenie do 50 μL do płuc myszy (przeprowadzone w Rysunek 1 i Rysunek 3), z rozproszonym rozkładem w płucach (jak pokazano w Rysunek 1), a nie w innych obszarach (takich jak górne drogi oddechowe/nos, jak widać na Rysunek 3).

Jakakolwiek krzywda wyrządzona zwierzęciu, nadmierny stres, zmniejszona objętość płynu docierającego do płuc, słaba dystrybucja inokulum w płucach lub przedłużające się potrzeby treningowe stanowiłyby negatywny wynik, ale nie wystąpiłyby.

Wideo 1: Tradycyjny endoskopowy widok części ustnej gardła myszy i fałdów głosowych jest nieostry i trudny do efektywnego wykorzystania. Ogniskowa 3 cm tego endoskopu oznacza, że fałdy głosowe i orientacja są trudne do docenienia. Język w lewym dolnym rogu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Rysunek 3: Intubacja daje większe dostarczenie do płuc przy mniejszej zmienności w stosunku do aspiracji O.P. (A) 6-10 tygodniowym samicom myszy BALB/c podano 1x10¹¹ vg AAV6.2-Lucyferazy, (Penn Vector Core), a następnie oceniono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (IVIS) 7 dni później. 10 minut przed obrazowaniem (30 s ekspozycji) wstrzyknięto im (podskórnie) 200 μl lucyferyny (GoldBio, 15 mg/ml). (Utworzone za pomocą biorender.com) (B) Reprezentatywne obrazy IVIS myszy otrzymujących AAV6.2-Lucyferazy przez aspirację OP (pociągnięcie języka, po lewej) lub podanie IT (intubacja, po prawej). Obszary zainteresowania mają ten sam rozmiar, a średnie promieniowanie w tym obszarze jest pokazane na obrazie. (C) Kwantyfikacja sygnału lucyferazy u myszy aspiracyjnych OP (n = 7) w porównaniu z intubacją (n = 5). p<0,0001 przez niesparowany test t Welsha z transformacją logarytmiczną surowych danych lucyferazy. (D) Odchylenie od średniej wyrażone jako procent średniego promieniowania. (p=0,0381, test T Welsha) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek S1: Pokazane są przykładowe obrazy z otoskopu konsumenckiego użytego w opisanym protokole do intubacji sterowanej (po lewej) oraz endoskopu o podobnej cenie i dostępności (po prawej). Zwróć uwagę na wyraźne różnice w ostrości między obrazami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S2: Przykładowy obraz przedstawiający rurkę bąbelkową w użyciu. Objętość oddechowa szybko przesuwa kroplę w rurce bąbelkowej o kilka centymetrów. Kropelka porusza się bardzo nieznacznie, jeśli rurka znajduje się w przełyku. Za pomocą tej metody można oszacować częstość oddechów i objętość oddechową. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek S3: Podstawowy zestaw oświetleniowy, który eliminuje potrzebę zakupu kosztownego zestawu oświetlenia światłowodowego. Igła o wadze 20 G została przepchnięta przez stożkowy światłowodowy o pojemności 50 ml o średnicy 0,75 mm, który zakupiono tanio (i hurtowo) i przycięto na długość (~1m) żyletką i przyklejono taśmą. Mocowanie cewnika na miejscu nie było konieczne ze względu na dokładne dopasowanie do światłowodowego. Zabezpieczenie stożkowej pokrywy nad latarką do telefonu komórkowego powoduje wystarczającą transdukcję światła do przeprowadzenia intubacji w zaciemnionym pomieszczeniu. Taki montaż dodatkowo obniża koszty ponoszone przez laboratorium stosujące tę technikę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Intubacja i wkraplanie dotchawicze są najlepszymi metodami dostarczania płynu do płuc, ale liczne wyzwania związane z anatomią myszy uniemożliwiły powszechne zastosowanie w laboratoriach płucnych¹⁵. Chociaż zapewnia skuteczne dostarczanie inokulum do płuc, potencjalną wadą dostarczania IT za pomocą tej i innych technik intubacji jest ominięcie górnych dróg oddechowych. Poród donosowy to sprawdzona metoda, która nie omija górnych dróg oddechowych. Chociaż podawanie donosowe jest często stosowane w laboratoriach wirusologii płucnej i może być bardziej skuteczne w niektórych przypadkach²², nie odzwierciedla naturalnej drogi ekspozycji²³ dla niektórych zasysanych środków, powoduje bardziej zmienne ilości inokulum w płucach²⁴ i jest mniej skuteczne w przypadku stosowania izofluranu jako środka znieczulającego⁵. W związku z tym przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad aparatami aerozolowymi i porównaniem ich z innymi technikami dostarczania do płuc²⁵, ale metody te stwarzają zagrożenia związane z aerozolami i są zwykle drogie. Wszystkie te trudności doprowadziły do wkraplania jamy ustnej i gardła za pomocą pociągnięcia języka²⁶, co jest preferowaną metodą dostarczania płynu płucnego w wielu laboratoriach. Jak wykazaliśmy, metoda ta jest znacznie bardziej zmienna niż wkraplanie dotchawicze po intubacji. Co więcej, nie można ocenić porodu metodą ciągnięcia języka podczas podawania, a język myszy może spowodować nadmierny uraz z powodu napięcia potrzebnego do zapobieżenia połknięciu. Język jest również utrzymywany w technice intubacji kierowanej i wkraplania IT. Ponieważ jednak obraz wideo pokazuje zapalenie głośni, badacz korzystający z naszej metody nie musi wymuszać ułożenia krtani poprzez wywieranie znacznego nacisku na język. Ta zmniejszona przyczepność powoduje mniej urazów tkanek. Jednak pomimo znacznych korzyści płynących z intubacji i wkraplania informatycznego, na drodze do jej zastosowania w niektórych laboratoriach stanęły wyzwania. Na przykład: ucisk tchawicy z powodu błędnej kaniulacji przełyku może utrudniać oddychanie i zwiększać śmiertelność; Zbyt głębokie wprowadzenie rurki dotchawiczej może prowadzić do uszkodzenia kariny lub oskrzeli głównych; I wreszcie, mysia intubacja tradycyjnymi metodami zajmuje dużo czasu, co czyni ją niepraktyczną dla większości badaczy poszukujących niezawodnego porodu dopłucnego. Nasza metoda rozwiązuje trudności związane z intubacją myszy, pokonując nawet anatomiczne bariery uniemożliwiające intubację myszy.

Zaproponowano kilka metod przezwyciężenia anatomicznych wyzwań związanych z intubacją myszy poprzez wdrożenie pomocy wizualnych. Na przykład zaproponowano zastosowanie tradycyjnego endoskopu⁶. Jednak długa ogniskowa instrumentu nie nadaje się do stosowania do intubacji u myszy (ryc. S1). Jest to również łatwo widoczne w filmie 1, gdzie fałdy głosowe są widoczne, ale są rozmyte. Otoskopy kliniczne były również stosowane w laryngoskopii bezpośredniej¹². Jednak koszt otoskopów klinicznych i brak przekazu wideo sprawiają, że są one niedostępne dla większości laboratoriów i nie nadają się do szkolenia. Zastosowanie powszechnie dostępnego otoskopu konsumenckiego znacznie poprawiło praktyczność intubacji sterowanej. Krótsza ogniskowa, mniejszy korpus i przedłużona warga depresyjna pozwalają na wyraźniejszy przekaz wideo, lepszą manewrowość i pozycjonowanie, a warga otoskopowa może być używana do wywierania nacisku na podstawę języka, co poprawia dostęp do obręczy głośniowej. Poza tymi pomocami wizualnymi, transiluminacja została również wykorzystana do skutecznej wizualizacji głośni i intubacji myszy ^7,13,14. Jednak podejścia oparte na transilluminacji mogą wymagać środków do depilacji na obszarze nakładającym się na szyję myszy, bliskiej odległości od gorącego źródła światła, użycia igły w cewniku, wprowadzenia ostrych narzędzi do ust myszy i/lub małego nacięcia, które należy wykonać nad tchawicą w celu potwierdzenia umieszczenia. Opisana tutaj metoda pozwala uniknąć tych zagrożeń i opiera się na najlepszych aspektach tych opublikowanych metod. Oprócz pokonania anatomicznych barier utrudniających intubację, w naszej metodzie wzięto pod uwagę względy kosztowe.

Razem użycie pomocnych dłoni, stojaka na mysz, otoskopu i światła światłowodowego sprawia, że intubacja jest łatwiejsza do nauczenia się i znacznie szybsza do wykonania, przy zmniejszonych kosztach dla laboratoriów. Kosztów dostępnego na rynku stanowiska do intubacji można uniknąć, korzystając z ręcznie robionego^{stanowiska 27}. Koszt montażu światłowodu można pokryć, kupując kabel światłowodowy osobno (po znacznie niższych kosztach, ~ 9 USD vs 218 USD - kent scientific- w momencie pisania tego tekstu). Aby uzupełnić światłowodowe źródło światła, stożkowa pokrywka o pojemności 50 ml z otworkiem w środku i taśmą może być użyta do zbierania światła z latarki telefonu komórkowego (patrz rysunek S3 i tabela materiałów). Das et. Na pewno nie opiszemy podobnego urządzenia¹¹. Dla niektórych laboratoriów obniżony koszt tego rozwiązania może sprawić, że nasza metoda stanie się znacznie bardziej dostępną procedurą. Poza kosztami, trudności z potwierdzeniem umieszczenia rurki dotchawiczej sprawiły, że intubacja myszy była zniechęcająca.

W przeszłości, aby potwierdzić, że rurka dotchawicza jest odpowiednio umieszczona, naukowcy polegali na zamgławianiu lusterek, trzymając lusterko dentystyczne nad rurką dotchawiczą¹⁸. Jednak mała objętość oddechowa i wahania temperatury w pomieszczeniu często zapobiegają parowaniu lusterek i prowadzą do błędów w ocenie. W przypadku intubacji u myszy stwarza to poważne ryzyko obrażeń. Inni uciekali się do wywoływania niewydolności oddechowej poprzez zatkanie rurki dotchawiczej¹⁰. Powoduje to znaczny stres u zwierzęcia i dostarcza mniej informacji niż "metoda bąbelkowa". Co więcej, wprowadzenie leków płucnych i powietrza do żołądka z powodu nieodpowiedniego potwierdzenia umieszczenia rurki dotchawiczej może powodować niepokój, a także utrudniać skuteczność podawanego środka. Zastosowanie "metody pęcherzykowej" zapewnia szybsze, bardziej wiarygodne wizualne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej i stanowi nieznaczne ulepszenie w stosunku do podobnej metody opisanej wcześniej²⁸. "Metoda pęcherzykowa" umożliwia również badaczowi przybliżone oszacowanie częstości oddechów i objętości oddechowej zwierzęcia.

Ułożenie zwierząt i wizualizacja fałdów głosowych są kluczem do tej techniki. Odkryliśmy, że wzierniki nosowe u dzieci były zbyt duże i nieporęczne, aby utrzymać otwarte usta i policzki poza przeszkodą podczas intubacji, ale były bardzo pomocne podczas treningu, ponieważ pozwoliły badaczowi zademonstrować umieszczenie otoskopu. Nakłonienie uczestnika szkolenia do rozpoznania odpowiedniej anatomii jest trudne, a poprawa widoczności w pysku myszy była kluczowa, w czym znacznie pomogło zastosowanie komercyjnego otoskopu. Ustawianie pozycji przy użyciu oświetlonego szkła powiększającego i pomocnych dłoni jest integralną częścią pomocy niedoświadczonym operatorom w intubacji, chociaż może nie być tak krytyczne dla doświadczonych operatorów.

Podczas szkolenia w tej metodzie może być konieczne rozwiązywanie problemów. Jeśli rurka dotchawicza wielokrotnie wchodzi do przełyku, głośnia mogła mieć skurcze, podniebienie miękkie może być w stanie zapalnym, a prawidłowe umieszczenie może być trudniejsze. W takim przypadku należy pozwolić zwierzęciu dojść do siebie przez kilka minut przed ponowną próbą intubacji. Liczba ponownych prób powinna być określona w protokole IACUC i zawsze przestrzegana. Jeśli masz problemy z widzeniem fałdów głosowych, częstość oddechów może być stłumiona z powodu zbyt dużego znieczulenia lub ułożenie myszy może być nieodpowiednie (najczęściej głowa odchylona do tyłu zbyt daleko). W takim przypadku zmień pozycję zwierzęcia i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu przed ponowną próbą. Rurka bąbelkowa powinna wyraźnie pokazywać objętość oddechową zwierzęcia. Jeśli pęcherzyk porusza się tylko nieznacznie, przyczyną tego ruchu może być sapanie spowodowane naciskiem wywieranym na tchawicę przez nieprawidłowo umieszczoną rurkę dotchawiczą. W tym przypadku zapoznaj się ze znacznikiem czasu: 8:25 i rysunkiem S3 , aby zobaczyć, jak łatwo widoczna jest objętość oddechowa podczas używania "rurki bąbelkowej" na prawidłowo umieszczonej rurce dotchawiczej. Jeśli rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona, wyjmij ją natychmiast i pozwól zwierzęciu dojść do siebie przed ponownym przystąpieniem do zabiegu.

Chociaż intubacja i wkraplanie dotchawicze są znacznie lepsze od innych metod, są zbyt trudne technicznie, aby można je było powszechnie przyjąć. Opisane tutaj metody sprawiają, że wkraplanie dotchawicze i intubacja mysia są dostępne i praktyczne. Chociaż przyszłe zastosowania tej techniki są w dużym stopniu zależne od tego, co jest dostarczane do płuc i w jakim kontekście są one podawane, łatwa i niezawodna metoda toruje drogę do wielu postępów w biologii płuc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Światłowód LightiZestaw oświetlenia światłowodowego, Mysz	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Element zespołu światłowodowego, kompatybilny z innymi lampami i zamiennym światłowodowym poniżej
Alternatywny montaż światłowodu	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego miałaby nie działać)
Alternatywny montaż światłowodów	Aparat Harvard	72-9075	alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego nie miałaby działać)
Alternatywny montaż światłowodu	Ręcznie robiony przez laboratorium	N/A	Instrukcje można znaleźć tutaj za pomocą gumowego korka: DOI 10.3791/50318
Alternatywny montaż światłowodowy	Ręcznie wykonany przez laboratorium	N/A (materiały wymienione poniżej)	Wykonany ze stożkowej pokrywki 50 ml, taśmy i
światłowodowego stojaka do intubacji	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Regulowany stojak do intubacji, dostępnych jest wiele wersji do samodzielnego wykonania, używane stojaki na końcówki i drewniane platformy, niektóre alternatywy wymieniają wiele dostępnych odpowiednich alternatyw.
Alternatywne stanowiska do intubacji	Braintree Scientifuc	RIS 100	alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)
Alternatywne stanowiska do intubacji	Natsume Seisakusho	KN-1014	alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)
Alternatywne stanowiska do intubacji	Vetland	000A3467	alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)
Alternatywne stanowiska do intubacji	Ręcznie robione przez laboratorium	N/A	Wykonane z 3-pierścieniowego segregatora tutaj: DOI 10.3791/60844 (opublikowano kilka alternatywnych metod)
Niewchłanialny pleciony jedwabny szew, rozmiar 0	Fine Science Tools	18020-00	każdy dłuższy niż 1 cal uszkodzi Carina
Cewnik dożylny Safelet 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Lub podobne
mikrokleszcze preparacyjne RS-5358	Fisher	RS-5358	Lub podobne, zawiera pomocne dłonie
Szkło powiększające ze światłem i podstawką, elastyczna magnetyczna pomocna dłoń EOOKU, 5X& 10X 12V 108szt Koraliki LED Lampa powiększająca, 3 tryby Regulowane obrotowe ramiona na gęsiej szyi i Wytrzymała płyta podstawy	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Elastyczny-regulowany-Gęsia szyja /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9.. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& słowa kluczowe=powiększające+szkło+z +światło+EOOKU+3+w+1& qid=1709661 709& sprefix=powiększające+szkło+z+ światłem+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	Lub podobnie, wszelkie wygięte drobno ząbkowane kleszcze będą działać
Usuwanie woskowiny - Narzędzie do usuwania woskowiny z 8-częściowym zestawem do uszu - Środek do czyszczenia uszu z kamerą - Zestaw do usuwania woskowiny ze światłem - Kamera do uszu z 6 łyżkami do uszu - Środek do czyszczenia uszu dla iOS i Android ()	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removal-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& identyfikator zawartości=amzn1.sym.1ad20 66f-97D2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1	lub podobne, dostępnych jest kilka marek
AZIMOM PMMA Plastikowy koniec świecącego światłowodowego 0,75 mm (0,02 cala) 100 m (328 stóp) / rolka do sufitu Star Sky All Kind Led Light Engine Sterownik Źródło	Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastikowy sufit do cięcia-1szt0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.br/ AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& słowa kluczowe=światłowód%2Boptyczny%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1	Lub podobnie, włókno jest używane do budowy urządzenia w linii 7
50 ml stożkowa rurka	Cell Treat	229421	powinna działać dowolna nieprzezroczysta plastikowa stożkowa pokrywka z zakrętką o pojemności 50 ml. Nie wchodzi w kontakt ani nie zbliża się do zwierzęcia, więc nie ma potrzeby stosowania sterylności
Isoflurane	VetOne	Skonsultuj się z personelem
Innoculum	Nie dotyczy	Specyficzne dla Twojego eksperymentu
Końcówki do pipet (filtr)	Nie dotyczy	Sterylny filtr Używane końcówki p100 i p1000	Marka/dostawca nie dotyczy
Komora indukcyjna	N/A	Dostępne w Twojej instytucji	Marka/Dostawca nie dotyczy
Podkładki przygotowawcze z izopropanolem	Nie dotyczy Marka		/Dostawca nie dotyczy
Przewody	N / A	elastyczna rurka o małej średnicy będzie działać	Do budowy "rurki bąbelkowej"  (nasz ma średnicę ~3 mm i został pobrany z linii dożylnej)
Luer lock	N/A	pasujący do rurki powyżej	Do budowy "rurki bąbelkowej"
Półmaska oddechowa 3M 3M		17-986-9B	w celu ograniczenia ekspozycji na gaz
Twist Tie	N/A	N/A	, aby zachować kształt U rurki bąbelkowej