Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.
Artykuł metodologiczny
Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konsekwentne dostarczanie płynów, w tym potencjalnych terapii, do płuc ma kluczowe znaczenie dla modelowania choroby płuc i przedklinicznego rozwoju terapeutycznego. Jednak obecne metody stosowane u myszy - takie jak aspiracja ustno-gardłowa metodą ciągnięcia języka - mogą powodować zmienny poród. W tym miejscu opisujemy użycie niedrogiego, podłączonego do telefonu komórkowego, oświetlonego otoskopu do wizualizacji głośni i umożliwienia bezpośredniego zaszczepienia do dróg oddechowych. Szczegółowo opisujemy zoptymalizowaną technikę inscenizacji z odpowiednim oświetleniem i pomocami do pozycjonowania. Opisano również, w jaki sposób można niezawodnie przeprowadzić intubację przy użyciu elastycznego cewnika o sile 20 G ze światłem światłowodowym lub bez niego. Technika ta znacznie zmniejsza zmienność dostarczania do płuc i zwiększa objętość dostarczanego płynu, który dociera do płuc. Ze względu na zmniejszoną wariancję, przy stosowaniu tej metody można stosować mniejsze kohorty zwierząt zamiast wkraplania ustno-gardłowego metodą ciągnięcia języka. Poniżej przedstawiono metodę skutecznej, szybkiej i konsekwentnej intubacji myszy i dostarczania jej do płuc, w tym solidne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej. Dzięki tej ulepszonej metodologii konsekwentna, bezpieczna intubacja oraz powtarzalne, skuteczne dostarczanie do płuc są w zasięgu ręki.
Wprowadzenie
W skali globalnej choroby układu oddechowego są główną przyczyną zgonów dzieci poniżej 5 roku życia oraz stanowią istotny czynnik zachorowalności i śmiertelności u dorosłych1. W 2021 roku zakażenie SARS-CoV2 było trzecią najczęstszą przyczyną zgonów w USA2. Modele mysie są często wykorzystywane do badania chorób płuc, w tym astmy, zapalenia płuc, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc oraz włóknienia płuc. Niemal wszystkie te modele wymagają podania substancji w formie płynnej do płuc. Można to osiągnąć poprzez bezpośrednią kanulację tchawicy (zazwyczaj pod bezpośrednią kontrolą wizualną z zastosowaniem techniki chirurgicznego dojścia), podanie donosowe lub aspirację orofaringealną za pomocą uznanej metody pociągania za język3,4,5. Jednak wszystkie te techniki mają swoje wady. Powstawanie tkanki bliznowatej po chirurgicznym dojściu sprawia, że metoda ta jest nieodpowiednia do badań wymagających wielokrotnego podawania substancji do płuc, natomiast dwie pozostałe techniki mogą prowadzić do zmiennej ilości dostarczonego preparatu do płuc. Ponadto, przy zastosowaniu metody pociągania za język, urazy tkankowe języka mogą być znaczne, a efektywność podania zależy od badacza wykonującego procedurę, patrz Rysunek 1.
Rysunek 1: Intubacja sterowana i instylacja przez tchawicę (IT) skutkują lepszym dostarczeniem preparatu do płuc i mniejszą zmiennością w porównaniu do metody z odciągnięciem języka. (A) Troje różnych badaczy podało 50 µL rozcieńczonego tuszu indyjskiego metodą odciągnięcia języka, będącą standardową metodą podania do gardła (OP). Dwóch badaczy podało również tusz do płuc za pomocą intubacji zgodnie z opisem. (B) Płuca usunięto 1-4 h po podaniu i sfotografowano przy 2-krotnym powiększeniu. Zdjęcia oceniano pod kątem powierzchni zabarwienia przy użyciu programu ImageJ. (n=6 (intubacja) lub 9 (podanie OP), wyniki z 2 lub 3 niezależnych powtórzeń wykonanych przez 2-3 różnych badaczy, p<0.0001 test T Welcha) (C) Zmienność podania do płuc obliczono również jako procentowe odchylenie od średniej. Podanie OP charakteryzowało się znacznie większą zmiennością. (p = 0.0317, test T Welcha, GraphPad Prism 10.2.3 do wszystkich obliczeń statystycznych i wykresów) (Użyto samców i samic myszy C57BL/6J w wieku ok. 10 tygodni.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Anatomia myszy sprawia, że intubacja jest trudna i czasochłonna. Jama ustna jest mała, a tkanka policzków może ograniczać badaczowi widoczność rima glottidis6. Ponadto fałdy głosowe są bardzo małe i ich wizualizacja może być utrudniona, ponieważ znajdują się one blisko nasady języka. Wreszcie, potwierdzenie prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej jest trudne, ponieważ mała objętość oddechowa często nie powoduje zaparowania lusterka7. Trudności te skłoniły do opracowania szeregu innowacyjnych technik intubacji myszy. Udoskonalone metody obejmują zastosowanie laryngoskopu noworodkowego i drutu do wprowadzenia cewnika do tchawicy8,9, wykorzystanie światłowodowego źródła światła do prowadzenia i usztywniania cewnika10,11 oraz zastosowanie transmisji wideo na żywo6. W ostatnim czasie pomocne w intubacji orotrachealnej okazało się zastosowanie klinicznego otoskopu12. Inni stosowali transiluminację w celu wizualizacji głośni i intubacji myszy7,13,14. Metody te mają jednak wiele wad. Stosowanie środków depilacyjnych na szyi myszy oraz bliskość zwierzęcia względem gorącego źródła światła sprawiają, że transiluminacja nie jest rozwiązaniem idealnym. Wykorzystanie igły wewnątrz cewnika lub wprowadzanie ostrych narzędzi do pyska oznacza, że niektóre metody usztywniania cewnika narażają zwierzęta na nieuzasadnione ryzyko. Wreszcie, wykonanie nacięcia nad tchawicą w celu potwierdzenia położenia rurki wiąże się ze znacznymi wadami, w tym z koniecznością zachowania sterylności i powstawaniem tkanki bliznowatej. Do tej pory instylacja dotchawicza poprzez intubację okazała się zbyt trudna, by mogła zostać powszechnie przyjęta15, a postępy w rozwoju metodologicznym pozostały odizolowane i nie są wykorzystywane przez wiele laboratoriów15. Dalsze badania skupiły się na wyborze środka anestetycznego podczas zabiegu, wykazując, że ketamina może mieć przewagę nad izofluranem5. Jednak izofluran, nie będąc substancją kontrolowaną i szybko przestając działać po zakończeniu procedury, oferował atrakcyjne korzyści, dlatego stosowaliśmy tę formę znieczulenia, optymalizując inne aspekty tej metodologii16,17.
Opisana przez nas metoda pozwala pokonać problemy z wizualizacją, z którymi mierzyli się inni badacze, ogranicza ryzyko dla zwierząt doświadczalnych, skraca czas potrzebny na wlewanie małych objętości w sposób wewnątrzoskrzelny za pomocą rurki endotrachealnej, zwiększa objętość cieczy docierającej do płuc oraz oferuje ulepszoną metodę potwierdzania prawidłowego umieszczenia rurki endotrachealnej. Zastosowanie statywu zawiesowego, magnetycznych „trzecich rączek” (klipsów aligatorowych na elastycznych ramionach przymocowanych do podstawy) oraz jaśniejszego oświetlenia umożliwia pojedynczemu badaczowi sprawne przeprowadzenie podania wewnątrzoskrzelnego. Wizualizację ułatwia domowy otoskop z łącznością WIFI. Urządzenie to jest bardziej przystępne cenowo niż komercyjne instrumenty do intubacji. Ponadto łączność WIFI pozwala na jednoczesne przesyłanie obrazu wideo na urządzenie przenośne (np. telefon komórkowy), co czyni tę metodę przydatną w celach szkoleniowych. Do intubacji można wykorzystać albo światłowodowe źródło światła wprowadzone przez elastyczny cewnik (PTFE) o rozmiarze 20 g x 1" (po usunięciu igły), albo sam cewnik bez źródła światła. Głębokość wprowadzenia jest kontrolowana dwiema metodami – poprzez dodanie klinowego bezpiecznika do intubacji (stożkowej osłony na cewniku) oraz poprzez obserwację głębokości na obrazie wideo. Umieszczenie rurki endotrachealnej potwierdza się za pomocą „metody pęcherzyków”, która pozwala wyraźniej zwizualizować objętość oddechową niż tradycyjna metoda zaparowania lusterka18. Jest to mniej stresujące dla zwierzęcia niż poleganie na obturacji tchawicy w celu wywołania duszności10 dla potwierdzenia prawidłowego umieszczenia rurki. Połączenie zastosowania rurki przedłużającej sprzężonej z cewnikiem w celu potwierdzenia udanej intubacji (dalej nazywanej metodą pęcherzyków), uproszczonej na podstawie pracy Watanabe i wsp.7, oraz konsumenckiego wideootoskopu w ramach jednej procedury sprawia, że intubacja staje się praktyczną metodą terapeutycznego podawania substancji do płuc i stanowi wyraźną poprawę względem metody odciągania języka (patrz Rycina 1). Jeśli poszukiwana jest niezawodna, powtarzalna i niedroga metoda niechirurgicznego podawania cieczy do płuc myszy, zwłaszcza bez użycia substancji kontrolowanych (takich jak ketamina) lub kosztownego sprzętu, poniższa metoda może okazać się idealna.
Protokół
Niezbędne jest, aby procedury te zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC), wymieniony w protokole, a przed przystąpieniem do prac skonsultowano się z personelem weterynaryjnym. IACUC w naszej instytucji zatwierdził protokół przed rozpoczęciem eksperymentu i przeanalizował zawartość wideo przed przesłaniem. Wsparcie i szkolenie zapewnił Wydział Medycyny Porównawczej Uniwersytetu Tulane, aby zagwarantować najwyższy standard opieki nad wszystkimi naszymi zwierzętami laboratoryjnymi.
1. Przygotowanie
UWAGA: Schemat ustawienia przedstawiono na Rysunku 2.
Rycina 2: Przygotowane stanowisko do intubacji prowadzonej przedstawiono na rysunku. Od lewej: Pipety do podawania, probówka z pęcherzykami do potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej, pęseta, szpatułka, pediatryczne rozwieraki do nosa (omówione, ale niepotrzebne w tej procedurze), uchwyty pomocnicze, lampa powiększająca, statyw dla myszy z lejkiem nosowym, sonda światłowodowa, komora do indukcji anestezji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Oczyść klin zabezpieczający dołączony do zestawu do intubacji za pomocą gazika nasączonego izopropanolem. Nasuń czysty klin zabezpieczający (kolor zielony na filmie) na elastyczną kaniulę 20 G i w bezpieczny sposób wyrzuć dołączoną igłę.
UWAGA: Użyty zestaw do intubacji gryzoni (Tabela materiałów) zawiera kliny zabezpieczające. Są to małe, stożkowe tulejki, które pasują do elastycznego cewnika 20 G x 1 cal. Zapobiegają one uszkodzeniu carina przez cewnik. - Przygotuj pozostałe niezbędne narzędzia, w tym telefon komórkowy, komercyjny otoskop, statyw dla myszy z lejkiem nosowym, pęsetę ząbkowaną wygiętą, przygotowaną rurkę endotrachealną (z punktu 1.1) oraz światłowód, jeśli jest on wykorzystywany. Przed użyciem oczyść wszystkie te elementy gazikami nasączonymi izopropanolem.
- Odetnij około 20 cm elastycznego wężyka. Zegnij go w kształt litery U, załóż złączkę Luer lock na jednym końcu i zabezpiecz ją wiązaniem skrętnym. Do wężyka wlej 200-300 µL sterylnej wody filtrowanej lub tuszu indyjskiego. Od tego momentu zestaw ten nazywany będzie „rurką z pęcherzykiem”.
- Wykonaj pętlę szewną, wiążąc ok. 13 cm plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 0 w okrąg. Umieść pętlę na górze statywu i upewnij się, że obie strony nici są zabezpieczone, a statyw jest czysty. Umieść statyw dla myszy na metalowej podstawie lampy powiększającej. Ustaw uchwyty pomocnicze („helping hands”) wokół miejsca, w którym znajdować się będzie pysk myszy.
UWAGA: Wielu dostawców oferuje wymienne statywy (patrz Tabela materiałów), a taki można tanio wykonać w laboratorium4,7,14. Do zawieszenia zwierzęcia użyto plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 0. Opisano jednak zastosowanie innych materiałów w tym samym celu4,13. - Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia. Stosuj stały przepływ O2 z prędkością 0,8 L/min i 2% izofluranu. Znieczul zwierzę w stopniu wystarczającym (patrz uwaga), aby nie obudziło się podczas zakładania lejka nosowego. Nie tłum znacząco częstotliwości oddychania myszy. Regularne oddechy ułatwiają wizualizację fałdów głosowych.
UWAGA: Częstotliwość oddychania myszy powinna być normalna. Kryterium to służy do ustalenia odpowiedniej głębokości znieczulenia. Może być ono zmienne między zwierzętami i może przekraczać 200 oddechów/min. W związku z tym liczenie oddechów lub stosowanie testu ucisku palca u stopy nie jest praktyczne ani konieczne.
OSTRZEŻENIE: Procedurę tę można przerwać w razie potrzeby. Zwierzęta nie powinny jednak pozostawać w komorze indukcyjnej dłużej, niż jest to ściśle konieczne. - Podłącz otoskop do telefonu komórkowego i upewnij się, że przekaz wideo jest stabilny.
OSTRZEŻENIE: Aby zminimalizować ekspozycję badaczy na izofluran podczas tej procedury, należy używać maski z filtrem chemicznym w przypadku wykonywania wielu intubacji lub szkolenia z tej metody. Alternatywnie procedurę można przeprowadzić w dygestorium.
2. Określanie stadium rozwoju zwierząt
- Gdy tylko pierwsze zwierzę zaśnie, wyjmij je z komory indukcyjnej, złap za kark i oprzyj jego górne zęby o długość szwy. Delikatnie napnij zwierzę, aby utrzymać pozycję szwów, kładąc mysz plecami na statywie.
UWAGA: Średnio zwierzęta pozostają pod narkozą przez łącznie 2 min, wliczając indukcję. Znacznie zmniejsza to ryzyko dla zwierzęcia, eliminuje potrzebę stosowania lubrykacji okulistycznej i zapobiega gromadzeniu się śliny. Należy dążyć do tego, aby zwierzęta pozostawały w stanie sedacji jak najkrócej. - Niewielko odchyl kąt szyi do tyłu (wprowadzając szyję w lekkie wyprostu, 5°-15°). Delikatnie nasuń stożek nosowy na nozdrza. Nie dociskaj stożka zbyt mocno, ponieważ może to zakłócić ułożenie szwów, zawieszając mysz.
- Mocno chwyć język jak najbliżej dolnej wargi, używając dużych, drobno ząbkowanych pęsety wygiętej. Odciągnij go w dół i na bok od górnych zębów w stronę dolnych zębów.
OSTRZEŻENIE: Przedłużona trakcja, nadmierne napięcie lub zmiażdżenie języka mogą pogorszyć stan zdrowotny zwierzęcia. Należy monitorować język pod kątem objawów urazu (siniaków, krwawienia, obrzęku lub wysychania); w przypadku ich wystąpienia należy przerwać procedurę i powiadomić personel weterynaryjny. - W przypadku korzystania z uchwytów pomocniczych („helping hands”), utrwal pęsetę w tej pozycji. W zależności od doświadczenia i ostrości wzroku badacza, podświetlana lupa może pomóc w prawidłowym ułożeniu zwierzęcia.
- Wprowadź światłowód (jeśli jest używany) przez elastyczny cewnik z zamontowanym klinem zabezpieczającym intubację (kolor zielony na wideo).
UWAGA: Nie mocuj kabla światłowodowego zbyt ciasno do źródła światła. Zbyt mocne dociśnięcie utrudnia usunięcie światłowodu przy pozostawieniu rurki endotrachealnej na miejscu.
3. Ocena wizualna strun głosowych i intubacja
- Trzymając otoskop w niedominującej ręce, lekko dociśnij go do języka. Następnie ustaw kąt kamery i źródła światła tak, aby zwizualizować struny głosowe w pobliżu nasady języka.
UWAGA: Niewielkie różnice w anatomii i kolorze tkanek mogą utrudniać orientację. Wykorzystaj ruchy związane z oddychaniem, aby potwierdzić identyfikację struktur. - Przy włączonym świetle światłowodowym (jeśli jest używane), wprowadź kaniulę wzdłuż górnej części otoskopu, lekko stykając ją z nasadą języka lub krawędzią otoskopu w celu odniesienia. Przesuń ją do jamy ustnej myszy pomiędzy podniebieniem miękkim a krawędzią otoskopu.
UWAGA: Jeśli światłowód nie jest używany, „rurkę z pęcherzykiem” (bubble tube) opisaną w kroku 4 można przymocować do cewnika na tym etapie. Jasne, skupione oświetlenie jamy ustnej myszy jest niezbędne przy tej modyfikacji procedury. - Dostosuj kąt podejścia tak, aby cewnik był wprowadzony bardzo płytko. Natychmiast po wprowadzeniu cewnika (mniej niż 1 mm za strunami głosowymi), podnieś jego końcówkę, tak aby była prawie równoległa do blatu stołu. Zapobiega to wypychaniu cewnika przez nagłośnię w kierunku grzbietowym do przełyku. Szczególnie podczas szkolenia, w przypadku trudności lub na początku zdobywania doświadczenia, podgląd wideo jest nieoceniony przy umieszczaniu rurki endotrachealnej pomiędzy strunami głosowymi.
UWAGA: Produkcja śliny nie utrudnia widoczności strun głosowych podczas wykonywania tej procedury. Jednak w poprzednich publikacjach dotyczących intubacji szczurów19 opisano użycie aplikatora bawełnianego z ostrym końcem do usuwania przeszkadzającej śliny. Metoda ta może okazać się przydatna, jeśli ślina stanie się problemem.- W przypadku napotkania oporu natychmiast wyjmij cewnik i pozwól, aby oddychanie wróciło do normy. W przypadku wystąpienia krwawienia skonsultuj się z personelem weterynaryjnym.
UWAGA: Podczas wprowadzania cewnika opór powinien być niemal nieodczuwalny.
- W przypadku napotkania oporu natychmiast wyjmij cewnik i pozwól, aby oddychanie wróciło do normy. W przypadku wystąpienia krwawienia skonsultuj się z personelem weterynaryjnym.
4. Potwierdzenie prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej
- Potwierdź wizualnie prawidłowe położenie rurki endotrachealne za pomocą otoskopu. Ponadto upewnij się co do poprawnego umieszczenia rurki, biorąc pod uwagę, że tchawica stawia mniejszy opór podczas wprowadzania niż przełyk. Zauważ, że w odpowiedniej pozycji rurka endotrachealna znajduje się ok. 5 mm poza fałdami głosowymi. Poszukaj światła z włókna optycznego prześwitującego przez skórę szyi, aby ponownie potwierdzić prawidłowość umiejscowienia.
UWAGA: Klin bezpieczeństwa intubacyjnego powinien zapobiegać zbyt głębokiemu wprowadzeniu rurki endotrachealnej. Klin bezpieczeństwa chroni przed urazem kątastki; nie musi on jednak całkowicie blokować posuwania rurki. Należy go traktować jako funkcję zabezpieczającą, a optymalna głębokość jest często mniejsza niż ta dopuszczona przez klin. - Następnie, trzymając rurkę endotrachealną w miejscu, wyjmij światłowód. Potwierdź odpowiednie umiejscowienie cewnika, stosując „metodę pęcherzykową” (opisana poniżej), zamiast zaparowywania lustra.
- Pobierz rurkę pęcherzykową przygotowaną w kroku 1.3. Przygotuj ją przed procedurą i używaj wielokrotnie dla wszystkich zwierząt.
OSTROŻNIE: 200-300 µL wody lub tuszu w rurce pęcherzykowej nigdy nie powinny zostać odessane. Aby tego uniknąć, upewnij się, że ciecz znajduje się daleko od złącza Luer lock. - Przy wprowadzonej rurce endotrachealnej zamocuj rurkę pęcherzykową za pomocą złącza Luer lock. Objętość oddechowa powinna być natychmiast widoczna. Jeśli tak nie jest, rurka endotrachealna jest źle umiejscowiona. Szybko ją usuń i poczekaj, aż do myszy powróci normalna częstość oddychania.
OSTROŻNIE: Błędne umieszczenie cewnika w przełyku spowoduje ucisk tchawicy, uniemożliwiając prawidłowe oddychanie. Błędnemu umiejscowieniu często towarzyszy duszność (w tym wyraźny udział mięśni międzyżebrowych) i/lub gwałtowny spadek częstości oddychania. Ponadto kaniulacja przełyku może doprowadzić do skurczu mięśni, co utrudni kolejną próbę intubacji; z tego powodu zalecamy wykorzystanie wielu zwierząt podczas treningu.
5. Podanie dotchawicze
UWAGA: Podobnie jak w metodzie odciągania języka przy podawaniu do gardła, podawanie poprzez intubację wiąże się z ryzykiem utonięcia zwierzęcia. U myszy młodzieńczych i dorosłych 50 µL jest zazwyczaj bezpieczną objętością płynu do podania i jest wystarczająca, aby rozprzestrzenić się w całych płucach.
- W przypadku podawania za pomocą strzykawki: odłączyć rurkę z pęcherzykiem i złącze Luer lock od cewnika, podłączyć napełnioną strzykawkę z Luer slip i nacisnąć tłok, aby podać pożądaną objętość (maksymalnie 50 µL).
- W przypadku podawania za pomocą pipety: pobrać pożądaną objętość (maksymalnie 50 µL) i nanieść ją bezpośrednio do cewnika, umożliwiając myszy wdech roztworu.
UWAGA: W celach szkoleniowych należy rozważyć użycie wskaźnika, takiego jak rozcieńczony, przefiltrowany tusz indyjski lub błękit metylenowy. - Aby zapewnić rozproszone dostarczenie do płuc, należy przepłukać podaną ciecz do płuc za pomocą do 500 µL powietrza20. Można to zrobić, używając albo wstępnie napełnionej strzykawki Luer lock o objętości 0,5 mL, albo pipety P1000 z końcówką z filtrem; obie te metody okazały się niezawodne. W razie potrzeby można kilkakrotnie nacisnąć pipetę bez ryzyka zasysania podanej cieczy.
OSTRZEŻENIE: Podczas inokulacji zwierzęcia tą metodą należy rozważyć zmniejszenie stężenia inokulum ze względu na zwiększoną wydajność podania w porównaniu z aspiracją orofaringealną lub podaniem donosowym.
UWAGA: Podczas przepłukiwania inokulum powietrzem może być konieczne użycie objętości większej niż objętość oddechowa (~200 µL). Jednak zastosowanie 500 µL nie stwarza ryzyka urazu ciśnieniowego (barotraumy), ponieważ stanowi to jedynie około połowę pojemności życiowej21. Dorosłe myszy mają rezerwową pojemność wdechową wynoszącą około ~800 µL, zatem barotrauma nie występuje, nawet jeśli mysz wykonała wdech bezpośrednio przed przepłukiwaniem21. Należy rozważyć, czy mniejsze objętości przepłukiwania powietrzem (sugerowane 100-200 µL) będą bardziej odpowiednie dla potrzeb rozprzestrzeniania inokulum.
6. Ocena dostarczania
UWAGA: Czynność tę wykonuje się wyłącznie podczas szkolenia lub ćwiczenia procedury.
- Uśmieć zwierzę w sposób humanitarny, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. W niniejszej procedurze zastosowano uduszenie CO2 jako podstawową metodę eutanazji oraz zwichnięcie stawów szyjnych jako metodę potwierdzającą.
- Otwórz klatkę piersiową i wyjmij płuca. Zrób to poprzez otwarcie otrzewnej, dostęp do przepony od strony ogonowej i nakłucie jej małymi nożyczkami w miejscu, w którym widoczne jest serce. Spowoduje to zapadnięcie się płuc i stworzy więcej miejsca do otwarcia klatki piersiowej poprzez przecięcie żeber.
UWAGA: Jeśli wymagana jest perfuzja w celu zmniejszenia ilości krwi w płucach, przeprowadź tę procedurę przez prawą komorę serca na tym etapie. - Po wyjęciu płuca krótko opłucz 1 mL sterylnego PBS. Rozłóż je płasko na białej powierzchni (np. na gąbce chirurgicznej), aby odsłonić maksymalną powierzchnię, zachowując jednocześnie względne położenie płatów.
- Wykonaj fotografię płuc ex vivo (użyto telefonu komórkowego), otwórz obrazy w programie ImageJ i zmierz obszary zabarwione oraz niezabarwione, obrysowując linię frontu barwnika. Pomiaru powierzchni zabarwionej powinien dokonać niezależny, oślepiony badacz, aby uniknąć błędów systematycznych.
UWAGA: W przypadku zastosowania luminescencji i systemu IVIS, jak pokazano na Rysunku 3, zamiast Kroku 6 należy przeprowadzić obrazowanie żywych tkanek in vivo.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 3, inokulacja wewnątrzopłucnowa z wykorzystaniem tradycyjnej metody wyciągania języka (podanie przez gardło) spowodowała niejednorodne, plamiste rozmieszczenie tuszu oraz większą zmienność wyników między badaczami. W przeciwieństwie do tego, instylacja dotchawicza (IT) po intubacji doprowadziła do bardziej spójnego dostarczenia substancji do obu płuc (prawego i lewego) i charakteryzowała się mniejszą zmiennością (Rysunek 1C i Rysunek 3D). W płucach zwierząt, którym tusz podano poprzez aspirację przez gardło z wyciąganiem języka, barwienie jest subtelne i występuje jedynie w pobliżu dużych dróg oddechowych (Rysunek 1A). Natomiast w przypadku zastosowania intubacji prowadzonej w celu podania tuszu, rozprzestrzenił się on znacznie głębiej w tkankę, obejmując znacznie większy obszar płuc. Po porównaniu powierzchni płuc zabarwionej tuszem pomiędzy obiema metodami, metoda intubacji okazała się znacznie skuteczniejsza od metody wyciągania języka (Rysunek 1B). Zmienność ilości dostarczonego tuszu była również drastycznie niższa w warunkach intubacji (Rysunek 1C). Zwiększony obszar zabarwienia płuc oraz mniejsza zmienność ilości cieczy docierającej do płuc silnie sugerują, że podanie IT jest lepszą metodą niż wyciąganie języka.
Jak pokazano w Filmie 1, tradycyjne endoskopy (opisywane w poprzednich publikacjach) mają zbyt długą ogniskową, aby umożliwić dokładną ocenę fałdów głosowych i poprowadzić rurkę endotrachealną6,19. W przeciwieństwie do nich, obrazy wideo uzyskane za pomocą konsumenckiego otoskopu (Rycina S1 oraz znaczniki czasu: 6:34 i 7:05 w filmie) charakteryzowały się znacznie lepszą rozdzielczością, co pozwoliło na lepszą wizualizację głośni.
Ta metoda intubacji obejmuje wielokrotną weryfikację umieszczenia rurki w tchawicy. Objętość oddechowa myszy była wyraźnie widoczna przy zastosowaniu metody pęcherzykowej (Rycina S2 oraz znacznik czasu: 8:25) i służy jako końcowe potwierdzenie, że każda podana ciecz trafi do płuc.
Aby dalej ocenić zmienność dwóch metod dostarczania, zbadano ekspresję transgenu w tkance płuc po inokulacji myszy 1 x 1011 vg AAV6.2-Luciferase za pomocą dwóch różnych metod (instylacji orofaringealnej metodą wyciągania języka lub podania wewnątrzoskrzelnego po intubacji z prowadzeniem). Siedem dni po podaniu wektora dokonano pomiarów luminescencji przy użyciu systemu obrazowania in vivo (IVIS) (Rysunek 3A). Następnie obliczono średnią radiancję dla obu płuc. Na 10 min przed obrazowaniem (ekspozycja 30 s) zwierzęta otrzymały w zastrzyku (podskórnie) 200 µL lucyferyny (15 mg/mL). Jak pokazano na Rysunku 3B, zwierzęta, którym podano wektor poprzez instylację orofaringealną, wykazywały sygnał luminescencyjny szeroko rozproszony zarówno w klatce piersiowej, jak i w obszarze nosa. W przeciwieństwie do nich, zwierzęta, którym wektor podano wewnątrzoskrzelnie za pomocą intubacji z prowadzeniem, wykazały skoncentrowaną luminescencję w płucach. Średnia radiancja u zwierząt intubowanych była znacznie większa w porównaniu z podaniem orofaringealnym, co wskazuje na poprawę wydajności dostarczania wektora do płuc oraz zmniejszoną zmienność dostarczania, obliczoną na podstawie odchylenia od średniej (Rysunek 3C i Rysunek 3D).
Pozytywne rezultaty metody intubacji obejmowały powtarzalne podanie do 50µL substancji do płuc myszy (przeprowadzone w Rysunku 1 i Rysunku 3), z rozproszonym rozmieszczeniem w całym płucu (co wykazano w Rysunku 1) i brakiem obecności w innych obszarach (takich jak górne drogi oddechowe/nos, co widać w Rysunku 3).
Negatywnym wynikiem byłaby jakakolwiek szkoda wyrządzona zwierzęciu, nadmierny stres, zmniejszona objętość płynu docierającego do płuc, niewłaściwa dystrybucja inokulum w płucach lub potrzeba przedłużonego szkolenia, jednak żadna z tych sytuacji nie wystąpiła.
Film 1: Tradycyjny widok endoskopowy gardła i fałdów głosowych myszy jest nieostry i trudny do efektywnego wykorzystania. Ogniskowa wynosząca 3 cm w tym endoskopie sprawia, że fałdy głosowe i orientacja przestrzenna są trudne do oceny. Język znajduje się w lewym dolnym rogu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.
Rysunek 3: Intubacja zapewnia większe dostarczanie do płuc przy mniejszej zmienności w porównaniu z aspiracją O.P. (A) Samice myszy BALB/c w wieku 6-10 tyg. otrzymały dawkę 1x1011 vg AAV6.2-Luciferase (Penn Vector Core), a następnie poddano je ocenie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (IVIS) 7 dni później. Na 10 min przed obrazowaniem (czas ekspozycji 30 s) wstrzyknięto im (podskórnie) 200 µL lucyferyny (GoldBio, 15mg/mL). (Stworzone w biorender.com) (B) Reprezentatywne obrazy IVIS myszy, którym AAV6.2-Luciferase podano poprzez aspirację OP (wyciągnięcie języka, lewo) lub dostarczanie IT (intubacja, prawo). Obszary zainteresowania (ROI) mają taką samą wielkość, a na obrazie przedstawiono średnią radiancję w obrębie obszaru. (C) Ilościowe oznaczenie sygnału lucyferazy u myszy po aspiracji OP (n=7) w porównaniu z intubacją (n=5). p<0.0001 w nieparzystym teście t Welcha po transformacji logarytmicznej surowych danych lucyferazy. (D) Odchylenie od średniej jako procent średniej radiancji. (p=0.0381, test t Welcha) Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina S1: Przedstawiono przykładowe obrazy z konsumenckiego otoskopu użytego w opisanym protokole do intubacji prowadzonej (lewo) oraz z endoskopu o podobnym koszcie i dostępności (prawo). Zwróć uwagę na wyraźne różnice w ostrości między obrazami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina S2: Przykładowy obraz przedstawiający rurkę pęcherzykową w użyciu. Objętość oddechowa szybko przesuwa kropelkę w rurce pęcherzykowej o kilka centymetrów. Kropelka przesuwa się w niewielkim stopniu, jeśli rurka znajduje się w przełyku. Częstość oddechów oraz objętość oddechowa mogą być szacowane za pomocą tej metody. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek S3: Podstawowy zestaw oświetleniowy, który eliminuje konieczność zakupu kosztownego zestawu do oświetlenia światłowodowego. Igła 20 G została przeprowadzona przez stożkową probówkę 50 mL, tanio (i w ilościach hurtowych) zakupiono kabel światłowodowy o średnicy 0,75 mm, który przycięto żyletką do odpowiedniej długości (~1m) i przymocowano taśmą. Unieruchomienie cewnika nie było konieczne ze względu na ciasne dopasowanie do kabla światłowodowego. Zamocowanie pokrywy stożkowej nad latarką telefonu komórkowego zapewnia wystarczającą transmisję światła do przeprowadzenia intubacji w zaciemnionym pomieszczeniu. Taka konstrukcja dodatkowo obniża koszty ponoszone przez laboratorium wdrażające tę technikę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Intubacja i wkraplanie dotchawicze są najlepszymi metodami dostarczania płynu do płuc, ale liczne wyzwania związane z anatomią myszy uniemożliwiły powszechne zastosowanie w laboratoriach płucnych15. Chociaż zapewnia skuteczne dostarczanie inokulum do płuc, potencjalną wadą dostarczania IT za pomocą tej i innych technik intubacji jest ominięcie górnych dróg oddechowych. Poród donosowy to sprawdzona metoda, która nie omija górnych dróg oddechowych. Chociaż podawanie donosowe jest często stosowane w laboratoriach wirusologii płucnej i może być bardziej skuteczne w niektórych przypadkach22, nie odzwierciedla naturalnej drogi ekspozycji23 dla niektórych zasysanych środków, powoduje bardziej zmienne ilości inokulum w płucach24 i jest mniej skuteczne w przypadku stosowania izofluranu jako środka znieczulającego5. W związku z tym przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad aparatami aerozolowymi i porównaniem ich z innymi technikami dostarczania do płuc25, ale metody te stwarzają zagrożenia związane z aerozolami i są zwykle drogie. Wszystkie te trudności doprowadziły do wkraplania jamy ustnej i gardła za pomocą pociągnięcia języka26, co jest preferowaną metodą dostarczania płynu płucnego w wielu laboratoriach. Jak wykazaliśmy, metoda ta jest znacznie bardziej zmienna niż wkraplanie dotchawicze po intubacji. Co więcej, nie można ocenić porodu metodą ciągnięcia języka podczas podawania, a język myszy może spowodować nadmierny uraz z powodu napięcia potrzebnego do zapobieżenia połknięciu. Język jest również utrzymywany w technice intubacji kierowanej i wkraplania IT. Ponieważ jednak obraz wideo pokazuje zapalenie głośni, badacz korzystający z naszej metody nie musi wymuszać ułożenia krtani poprzez wywieranie znacznego nacisku na język. Ta zmniejszona przyczepność powoduje mniej urazów tkanek. Jednak pomimo znacznych korzyści płynących z intubacji i wkraplania informatycznego, na drodze do jej zastosowania w niektórych laboratoriach stanęły wyzwania. Na przykład: ucisk tchawicy z powodu błędnej kaniulacji przełyku może utrudniać oddychanie i zwiększać śmiertelność; Zbyt głębokie wprowadzenie rurki dotchawiczej może prowadzić do uszkodzenia kariny lub oskrzeli głównych; I wreszcie, mysia intubacja tradycyjnymi metodami zajmuje dużo czasu, co czyni ją niepraktyczną dla większości badaczy poszukujących niezawodnego porodu dopłucnego. Nasza metoda rozwiązuje trudności związane z intubacją myszy, pokonując nawet anatomiczne bariery uniemożliwiające intubację myszy.
Zaproponowano kilka metod przezwyciężenia anatomicznych wyzwań związanych z intubacją myszy poprzez wdrożenie pomocy wizualnych. Na przykład zaproponowano zastosowanie tradycyjnego endoskopu6. Jednak długa ogniskowa instrumentu nie nadaje się do stosowania do intubacji u myszy (ryc. S1). Jest to również łatwo widoczne w filmie 1, gdzie fałdy głosowe są widoczne, ale są rozmyte. Otoskopy kliniczne były również stosowane w laryngoskopii bezpośredniej12. Jednak koszt otoskopów klinicznych i brak przekazu wideo sprawiają, że są one niedostępne dla większości laboratoriów i nie nadają się do szkolenia. Zastosowanie powszechnie dostępnego otoskopu konsumenckiego znacznie poprawiło praktyczność intubacji sterowanej. Krótsza ogniskowa, mniejszy korpus i przedłużona warga depresyjna pozwalają na wyraźniejszy przekaz wideo, lepszą manewrowość i pozycjonowanie, a warga otoskopowa może być używana do wywierania nacisku na podstawę języka, co poprawia dostęp do obręczy głośniowej. Poza tymi pomocami wizualnymi, transiluminacja została również wykorzystana do skutecznej wizualizacji głośni i intubacji myszy 7,13,14. Jednak podejścia oparte na transilluminacji mogą wymagać środków do depilacji na obszarze nakładającym się na szyję myszy, bliskiej odległości od gorącego źródła światła, użycia igły w cewniku, wprowadzenia ostrych narzędzi do ust myszy i/lub małego nacięcia, które należy wykonać nad tchawicą w celu potwierdzenia umieszczenia. Opisana tutaj metoda pozwala uniknąć tych zagrożeń i opiera się na najlepszych aspektach tych opublikowanych metod. Oprócz pokonania anatomicznych barier utrudniających intubację, w naszej metodzie wzięto pod uwagę względy kosztowe.
Razem użycie pomocnych dłoni, stojaka na mysz, otoskopu i światła światłowodowego sprawia, że intubacja jest łatwiejsza do nauczenia się i znacznie szybsza do wykonania, przy zmniejszonych kosztach dla laboratoriów. Kosztów dostępnego na rynku stanowiska do intubacji można uniknąć, korzystając z ręcznie robionegostanowiska 27. Koszt montażu światłowodu można pokryć, kupując kabel światłowodowy osobno (po znacznie niższych kosztach, ~ 9 USD vs 218 USD - kent scientific- w momencie pisania tego tekstu). Aby uzupełnić światłowodowe źródło światła, stożkowa pokrywka o pojemności 50 ml z otworkiem w środku i taśmą może być użyta do zbierania światła z latarki telefonu komórkowego (patrz rysunek S3 i tabela materiałów). Das et. Na pewno nie opiszemy podobnego urządzenia11. Dla niektórych laboratoriów obniżony koszt tego rozwiązania może sprawić, że nasza metoda stanie się znacznie bardziej dostępną procedurą. Poza kosztami, trudności z potwierdzeniem umieszczenia rurki dotchawiczej sprawiły, że intubacja myszy była zniechęcająca.
W przeszłości, aby potwierdzić, że rurka dotchawicza jest odpowiednio umieszczona, naukowcy polegali na zamgławianiu lusterek, trzymając lusterko dentystyczne nad rurką dotchawiczą18. Jednak mała objętość oddechowa i wahania temperatury w pomieszczeniu często zapobiegają parowaniu lusterek i prowadzą do błędów w ocenie. W przypadku intubacji u myszy stwarza to poważne ryzyko obrażeń. Inni uciekali się do wywoływania niewydolności oddechowej poprzez zatkanie rurki dotchawiczej10. Powoduje to znaczny stres u zwierzęcia i dostarcza mniej informacji niż "metoda bąbelkowa". Co więcej, wprowadzenie leków płucnych i powietrza do żołądka z powodu nieodpowiedniego potwierdzenia umieszczenia rurki dotchawiczej może powodować niepokój, a także utrudniać skuteczność podawanego środka. Zastosowanie "metody pęcherzykowej" zapewnia szybsze, bardziej wiarygodne wizualne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej i stanowi nieznaczne ulepszenie w stosunku do podobnej metody opisanej wcześniej28. "Metoda pęcherzykowa" umożliwia również badaczowi przybliżone oszacowanie częstości oddechów i objętości oddechowej zwierzęcia.
Ułożenie zwierząt i wizualizacja fałdów głosowych są kluczem do tej techniki. Odkryliśmy, że wzierniki nosowe u dzieci były zbyt duże i nieporęczne, aby utrzymać otwarte usta i policzki poza przeszkodą podczas intubacji, ale były bardzo pomocne podczas treningu, ponieważ pozwoliły badaczowi zademonstrować umieszczenie otoskopu. Nakłonienie uczestnika szkolenia do rozpoznania odpowiedniej anatomii jest trudne, a poprawa widoczności w pysku myszy była kluczowa, w czym znacznie pomogło zastosowanie komercyjnego otoskopu. Ustawianie pozycji przy użyciu oświetlonego szkła powiększającego i pomocnych dłoni jest integralną częścią pomocy niedoświadczonym operatorom w intubacji, chociaż może nie być tak krytyczne dla doświadczonych operatorów.
Podczas szkolenia w tej metodzie może być konieczne rozwiązywanie problemów. Jeśli rurka dotchawicza wielokrotnie wchodzi do przełyku, głośnia mogła mieć skurcze, podniebienie miękkie może być w stanie zapalnym, a prawidłowe umieszczenie może być trudniejsze. W takim przypadku należy pozwolić zwierzęciu dojść do siebie przez kilka minut przed ponowną próbą intubacji. Liczba ponownych prób powinna być określona w protokole IACUC i zawsze przestrzegana. Jeśli masz problemy z widzeniem fałdów głosowych, częstość oddechów może być stłumiona z powodu zbyt dużego znieczulenia lub ułożenie myszy może być nieodpowiednie (najczęściej głowa odchylona do tyłu zbyt daleko). W takim przypadku zmień pozycję zwierzęcia i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu przed ponowną próbą. Rurka bąbelkowa powinna wyraźnie pokazywać objętość oddechową zwierzęcia. Jeśli pęcherzyk porusza się tylko nieznacznie, przyczyną tego ruchu może być sapanie spowodowane naciskiem wywieranym na tchawicę przez nieprawidłowo umieszczoną rurkę dotchawiczą. W tym przypadku zapoznaj się ze znacznikiem czasu: 8:25 i rysunkiem S3 , aby zobaczyć, jak łatwo widoczna jest objętość oddechowa podczas używania "rurki bąbelkowej" na prawidłowo umieszczonej rurce dotchawiczej. Jeśli rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona, wyjmij ją natychmiast i pozwól zwierzęciu dojść do siebie przed ponownym przystąpieniem do zabiegu.
Chociaż intubacja i wkraplanie dotchawicze są znacznie lepsze od innych metod, są zbyt trudne technicznie, aby można je było powszechnie przyjąć. Opisane tutaj metody sprawiają, że wkraplanie dotchawicze i intubacja mysia są dostępne i praktyczne. Chociaż przyszłe zastosowania tej techniki są w dużym stopniu zależne od tego, co jest dostarczane do płuc i w jakim kontekście są one podawane, łatwa i niezawodna metoda toruje drogę do wielu postępów w biologii płuc.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych ujawnień.
Podziękowania
Abagail Boyd (University of South Alabama) dostarczyła kluczowych wskazówek dotyczących dostosowania naszego protokołu intubacji w oparciu o swoje doświadczenia. Larkin Kolls zapoznał pisarzy z technologią otoskopów domowych. Firma Penn Vector-Core stworzyła wektor wirusowy użyty w eksperymencie. Candice Fisher jest kierownikiem naszego laboratorium; Jest integralną częścią pracy, którą wykonujemy. Madison Robin utrzymywała porządek pracy, sterylność i organizację naszego wiwarium przez cały czas trwania tych eksperymentów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Światłowód LightiZestaw oświetlenia światłowodowego, Mysz | Kent Scientific | ETI-12ETI-MSE-02 | Element zespołu światłowodowego, kompatybilny z innymi lampami i zamiennym światłowodowym poniżej |
| Alternatywny montaż światłowodu | Braintree Scientifuc | RW-A37 47 | alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego miałaby nie działać) |
| Alternatywny montaż światłowodów | Aparat Harvard | 72-9075 | alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego nie miałaby działać) |
| Alternatywny montaż światłowodu | Ręcznie robiony przez laboratorium | N/A | Instrukcje można znaleźć tutaj za pomocą gumowego korka: DOI 10.3791/50318 |
| Alternatywny montaż światłowodowy | Ręcznie wykonany przez laboratorium | N/A (materiały wymienione poniżej) | Wykonany ze stożkowej pokrywki 50 ml, taśmy i |
| światłowodowego stojaka do intubacji | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | Regulowany stojak do intubacji, dostępnych jest wiele wersji do samodzielnego wykonania, używane stojaki na końcówki i drewniane platformy, niektóre alternatywy wymieniają wiele dostępnych odpowiednich alternatyw. |
| Alternatywne stanowiska do intubacji | Braintree Scientifuc | RIS 100 | alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać) |
| Alternatywne stanowiska do intubacji | Natsume Seisakusho | KN-1014 | alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać) |
| Alternatywne stanowiska do intubacji | Vetland | 000A3467 | alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać) |
| Alternatywne stanowiska do intubacji | Ręcznie robione przez laboratorium | N/A | Wykonane z 3-pierścieniowego segregatora tutaj: DOI 10.3791/60844 (opublikowano kilka alternatywnych metod) |
| Niewchłanialny pleciony jedwabny szew, rozmiar 0 | Fine Science Tools | 18020-00 | każdy dłuższy niż 1 cal uszkodzi Carina |
| Cewnik dożylny Safelet 20G x 1" | Nipro | NPRCI+2025 | Lub podobne |
| mikrokleszcze preparacyjne RS-5358 | Fisher | RS-5358 | Lub podobne, zawiera pomocne dłonie |
| Szkło powiększające ze światłem i podstawką, elastyczna magnetyczna pomocna dłoń EOOKU, 5X& 10X 12V 108szt Koraliki LED Lampa powiększająca, 3 tryby Regulowane obrotowe ramiona na gęsiej szyi i Wytrzymała płyta podstawy | Amazon | https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Elastyczny-regulowany-Gęsia szyja /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9.. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& słowa kluczowe=powiększające+szkło+z +światło+EOOKU+3+w+1& qid=1709661 709& sprefix=powiększające+szkło+z+ światłem+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5 | Lub podobnie, wszelkie wygięte drobno ząbkowane kleszcze będą działać |
| Usuwanie woskowiny - Narzędzie do usuwania woskowiny z 8-częściowym zestawem do uszu - Środek do czyszczenia uszu z kamerą - Zestaw do usuwania woskowiny ze światłem - Kamera do uszu z 6 łyżkami do uszu - Środek do czyszczenia uszu dla iOS i Android () | Amazon | https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removal-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& identyfikator zawartości=amzn1.sym.1ad20 66f-97D2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1 | lub podobne, dostępnych jest kilka marek |
| AZIMOM PMMA Plastikowy koniec świecącego światłowodowego 0,75 mm (0,02 cala) 100 m (328 stóp) / rolka do sufitu Star Sky All Kind Led Light Engine Sterownik Źródło | Amazon | https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastikowy sufit do cięcia-1szt0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.br/ AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& słowa kluczowe=światłowód%2Boptyczny%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1 | Lub podobnie, włókno jest używane do budowy urządzenia w linii 7 |
| 50 ml stożkowa rurka | Cell Treat | 229421 | powinna działać dowolna nieprzezroczysta plastikowa stożkowa pokrywka z zakrętką o pojemności 50 ml. Nie wchodzi w kontakt ani nie zbliża się do zwierzęcia, więc nie ma potrzeby stosowania sterylności |
| Isoflurane | VetOne | Skonsultuj się z personelem | |
| Innoculum | Nie dotyczy | Specyficzne dla Twojego eksperymentu | |
| Końcówki do pipet (filtr) | Nie dotyczy | Sterylny filtr Używane końcówki p100 i p1000 | Marka/dostawca nie dotyczy |
| Komora indukcyjna | N/A | Dostępne w Twojej instytucji | Marka/Dostawca nie dotyczy |
| Podkładki przygotowawcze z izopropanolem | Nie dotyczy Marka | /Dostawca nie dotyczy | |
| Przewody | N / A | elastyczna rurka o małej średnicy będzie działać | Do budowy "rurki bąbelkowej" (nasz ma średnicę ~3 mm i został pobrany z linii dożylnej) |
| Luer lock | N/A | pasujący do rurki powyżej | Do budowy "rurki bąbelkowej" |
| Półmaska oddechowa 3M 3M | 17-986-9B | w celu ograniczenia ekspozycji na gaz | |
| Twist Tie | N/A | N/A | , aby zachować kształt U rurki bąbelkowej |
Bibliografia
- The Pneumonia Etiology Research for Child Health (PERCH) Study Group. Causes of severe pneumonia requiring hospital admission in children without HIV infection from Africa and Asia: the PERCH multi-country case-control study. Lancet. 394 (10200), 757-779 (2019).
- Shiels, M. S., Haque, A. T., Berrington de González, A., Freedman, N. D. Leading causes of death in the US During the COVID-19 pandemic, March 2020 to October 2021. JAMA Intern Med. 182 (8), 883-886 (2022).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PLOS ONE. 8 (5), e63432(2013).
- Nielsen, T. B., Yan, J., Luna, B., Spellberg, B. Murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia. J Vis Exp. (136), e57672(2018).
- Seo, Y., et al. Optimizing anesthesia and delivery approaches for dosing into lungs of mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 325 (2), L262-L269 (2023).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Lab Anim. 37 (3), 204-206 (2003).
- Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Lab Anim. 43 (4), 399-401 (2009).
- Samsamshariat, S. A., Movahed, M. R. Using a 0.035-in. straight-tip wire and a small infant laryngoscope for safe and easy endotracheal intubations in rats for cardiovascular research. Cardiovasc Revasc Med. 6 (4), 160-162 (2005).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Lab Anim. 42 (2), 222-230 (2008).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemp Top Lab Anim Sci. 44 (2), 52-55 (2005).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. J Vis Exp. (86), e50269(2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C., Nelson, A. M. Repeated Orotracheal Intubation in Mice. J Vis Exp. (157), e60844(2020).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106 (3), 984-987 (2009).
- Controlled Substance Schedules. , US Department of Justice Diversion Control Division. https://www.deadiversion.usdoj.gov/schedules/schedules.html (2025).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Anim. 44 (4), 329-336 (2010).
- Balloy, V., Huerre, M., Latgé, J. -P. Differences in patterns of infection and inflammation for corticosteroid treatment and chemotherapy in experimental invasive pulmonary aspergillosis. Infect Immun. 73 (1), 494-503 (2005).
- Clary, E. M., O'Halloran, E. K., de la Fuente, S. G., Eubanks, S. Videoendoscopic endotracheal intubation of the rat. Lab Anim. 38 (2), 158-161 (2004).
- Silva, P. L., Scharffenberg, M., Rocco, P. R. M. Understanding the mechanisms of ventilator-induced lung injury using animal models. Intensive Care Med Exp. 11 (1), 82(2023).
- Schulz, H., et al. Respiratory mechanics in mice: strain and sex specific differences. Acta Physiol Scand. 174 (4), 367-375 (2002).
- Americo, J. L., Cotter, C. A., Earl, P. L., Liu, R., Moss, B. Intranasal inoculation of an MVA-based vaccine induces IgA and protects the respiratory tract of hACE2 mice from SARS-CoV-2 infection. PNAS. 119 (24), e2202069119(2022).
- Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
- Pelgrim, C. E., et al. Intratracheal administration of solutions in mice; development and validation of an optimized method with improved efficacy, reproducibility and accuracy. J Pharmacol Toxicol Methods. 114, 107156(2022).
- Kunda, N. K., Price, D. N., Muttil, P. Respiratory tract deposition and distribution pattern of microparticles in mice using different pulmonary delivery techniques. Vaccines. 6 (3), 41(2018).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55 (1), 24-35 (2000).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J Vis Exp. (51), e2702(2011).
- Hattori, T., et al. Gene expression profiling of IL-17A-treated synovial fibroblasts from the human temporomandibular joint. Mediators Inflamm. 2015, 436067(2015).
Przedruki i uprawnienia
