Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

880 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Streszczenie

Wydzielane białka Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) odgrywają kluczową rolę w patogenezie gruźlicy, modulacji immunologicznej i postępie choroby. Zrozumienie ich składu i funkcji jest niezbędne do identyfikacji nowych biomarkerów, które mogą pomóc w diagnozowaniu gruźlicy, opracowywaniu szczepionek i interwencjach terapeutycznych. Badanie to koncentruje się na systematycznej izolacji, frakcjonowaniu i charakterystyce białek filtratu kulturowego (CFP), aby umożliwić kompleksowe analizy immunologiczne i proteomiczne. CFP uzyskano z kultur M. tuberculosis H37Rv hodowanych w warunkach określonych chemicznie, aby zapewnić kontrolowaną ekspresję białek. Supernatant hodowli oczyszczono przez filtrację i zagęszczono przy użyciu systemu pustych włókien w celu zatrzymania białek powyżej 10 kDa. Frakcjonowanie osiągnięto poprzez ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej, rozdzielając białka na podstawie ich punktów izoelektrycznych na 20 odrębnych frakcji. Dalszą rozdzielczość przeprowadzono za pomocą preparatywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie elektroelucji, otrzymując 30 frakcji białkowych. Frakcjonowane białka uzyskane w ten sposób stanowią cenne źródło do profilowania immunologicznego i analiz proteomicznych opartych na spektrometrii mas. Poprzez systematyczne izolowanie i charakteryzowanie wydzielanych białek, badanie to przyczynia się do identyfikacji biomarkerów białkowych specyficznych dla gruźlicy, co może poprawić dokładność diagnostyczną i pogłębić naszą wiedzę na temat patogenezy M. tuberculosis .

Wprowadzenie

Szeroko zakrojone badania wykazały istotną rolę wydzielanych białek we wzroście i interakcjach immunologicznych Mycobacterium tuberculosis1. Filtrat hodowlany M. tuberculosis zawiera złożony zestaw składników białkowych i niebiałkowych, co czyni go cennym źródłem dla zrozumienia jego biologii i właściwości immunogennych. Wczesne badania proteomiczne zidentyfikowały prawie 450 białek w filtraciehodowlanym 2, z których wiele odgrywa kluczową rolę w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwko gruźlicy. Identyfikacja tych immunologicznie istotnych antygenów ma zasadnicze znaczenie dla opracowania innowacyjnej diagnostyki i szczepionek przeciwko gruźlicy. Postęp w tej dziedzinie jest jednak kwestionowany ze względu na złożoność odpowiedzi immunologicznej na zakażenie M. tuberculosis oraz ograniczenia techniczne metod oczyszczania biochemicznego stosowanych do izolowania białek prątków.

Zastosowano różne techniki separacji w celu rozdzielenia białek M. tuberculosis, ułatwiając wykrywanie mniejszych, ale funkcjonalnie istotnych białek i rozszerzając zakres badań proteomicznych. Idealna metoda separacji skutecznie rozkłada złożone mieszaniny białek na ograniczoną liczbę odrębnych frakcji. Dwa szeroko stosowane podejścia do rozdzielania białek prątkowych to metody oparte na chromatografii i elektroforezie 1,2.

Techniki chromatograficzne, w tym powinowactwo, wymiana jonowa i chromatografia z odwróconymi fazami, są podstawą frakcjonowania białek od ponad dekady. Metody te są szeroko stosowane do rozdzielania białek M. tuberculosis 3. Są one jednak ograniczone przez takie czynniki, jak niska wydajność białka i zakłócenia ze strony składników niebiałkowych, co może komplikować późniejsze analizy immunologiczne. Te wady ograniczają użyteczność chromatografii do identyfikacji antygenów istotnych immunologicznie.

Aby zaradzić tym ograniczeniom, zastosowano dwuwymiarową metodę separacji opartą na elektroforezie. W pierwszym wymiarze białka są rozdzielane na podstawie ich ogniskowania izoelektrycznego (IEF) za pomocą preparatywnego systemu IEF, który segreguje białka według ich punktów izoelektrycznych. W drugim wymiarze białka są dalej rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej za pomocą preparatywnego SDS-PAGE, a następnie elucja za pomocą narzędzia eluterującego z całego żelu.

To dwuwymiarowe podejście ma kilka zalet. Znacznie zmniejsza złożoność białek filtratu hodowlanego (CFP) poprzez frakcjonowanie ich na 600 odrębnych frakcji. Dodatkowo frakcje nadają się do bezpośredniej analizy immunologicznej, ponieważ w procesie elucji nie wprowadzane są składniki, które zakłócają komórkowe testy immunologiczne 4,5,6.

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie i separację białek filtratu hodowlanego do analizy immunologicznej6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wzrost Mycobacterium tuberculosis i przygotowanie białek filtratu kulturowego (CFP)

  1. Przygotowanie płynnego podłoża Saautona
    1. Połącz następujące składniki w 950 ml wody destylowanej: Glicerol, 30,0 ml; Diwodorofosforan potasu (KH2PO4), 0,5 g; Siarczan magnezu, 0,5 g; Kwas cytrynowy, 2,0 g; Hydrolizat kazeiny, 0,5 g; Siarczan żelazowo-amonowy, 0,05 g; Glutaminian sodu, 4,0 g.
    2. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą 40% wodorotlenku potasu (około 5 ml/l).
    3. Uzupełnić objętość do 1 l i sterylizować w autoklawie pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut.
  2. Przygotowanie zawiesiny prątków
    1. Przenieść kolonie Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) wyhodowane na zboczach Lowensteina-Jensena (LJ) do 2 ml płynnej pożywki Saautona.
    2. Rozbij grudki prątków przez energiczne potrząsanie szklanymi kulkami w sterylnych warunkach.
  3. Inicjowanie wzrostu prątków
    1. Przenieś zawiesinę bakteryjną do butelki McCartneya zawierającej 10 ml płynnego podłoża Sauton.
    2. Inkubować butelkę w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie.
  4. Zwiększanie skali kultury
    1. Przenieś wyhodowaną kulturę do 200 ml pożywki Saauton w butelce o pojemności 1 l.
    2. Inkubować na wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 4 tygodnie.
    3. Przenieść kulturę w fazie logarytmicznej do 4-litrowej kolby zawierającej 2 litry pożywki Saautona.
    4. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C w warunkach stacjonarnych przez dodatkowe 4 tygodnie, aż utworzy się błonka powierzchniowa.
  5. Zbiór białek filtratu kulturowego (CFP)
    1. Zbierz kulturę przez odwirowanie przy 1,000-1,500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przefiltrować supernatant przez system filtracji próżniowej 0,45 μm.
    3. Zagęścić filtrat zawierający CFP, stosując system filtracji o przepływie stycznym z punktem odcięcia 10 kDa.
  6. Przechowywanie zebranego CFP
    1. Oszacuj zawartość białka przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania BCA.
    2. Podzielić białka na porcje, dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,2% i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (IEF)

  1. Przygotowanie próbki białka
    1. Rozpuścić Mycobacterium tuberculosis CFP w 60 ml buforu separacyjnego IEF zawierającego 8 M mocznika, 1 mM ditiotreitolu (DTT), 5% glicerolu, 2% digitoniny, 2% amfolitów (pH 3,0-10,0 i pH 4,0-6,0 w stosunku 1:4).
  2. Konfiguracja systemu IEF
    1. Napełnij komorę anodową 0,1 M kwasem fosforowym, a komorę katodową 0,1 M wodorotlenkiem sodu.
    2. Preparatywną komórkę IEF należy zmontować zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  3. Wykonywanie IEF
    1. Załaduj do 350 mg białka do systemu IEF.
    2. Skupić białka w temperaturze 4 °C za pomocą chłodzącego systemu wody krążącej.
    3. Zastosuj stałą moc 12 W, aż napięcie ustabilizuje się na poziomie około 1400 V, a następnie kontynuuj przez dodatkowe 30 minut.
  4. Zbieranie i analizowanie ułamków
    1. Zbierz frakcje IEF i określ ich pH.
    2. Przeanalizuj każdą podwielokrotność za pomocą SDS-PAGE i wizualizuj białka za pomocą barwienia srebrem.

3. Preparatywna SDS-PAGE i elucja w całym żelu

  1. Przygotowanie próbek do SDS-PAGE
    1. Wymieszaj frakcje IEF z dostępnym na rynku buforem próbki 6x SDS-PAGE.
    2. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  2. Uruchamianie preparatywnej SDS-PAGE
    1. Załaduj do 10 mg białka do żelu poliakrylamidowego o długości 16 cm × 20 cm z 4% żelem do układania w stosy i 12,5% żelem rozdzielczym.
    2. Uruchom elektroforezę przy stałym prądzie 50 mA, aż czoło barwnika znajdzie się 2 cm od dołu.
  3. Elucja białek z żelu
    1. Równoważyć żel w buforze elucyjnym (60 mM Tris, 40 mM CAPS, pH 9,4) przez 10 minut.
    2. Przenieś żel do instrumentu eluter z całego żelu.
    3. Eluować białka, przykładając stały prąd 250 mA przez 1 godzinę.
  4. Zbieranie i analizowanie ułamków
    1. Oddzielone białka należy rozdzielić na 30 pojedynczych frakcji, każda o objętości 2,5 ml.
    2. Oznaczyć stężenie białka za pomocą metody szacowania białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Przeanalizuj 10 μg białka z każdej frakcji za pomocą SDS-PAGE i wizualizuj za pomocą barwienia srebrem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 ilustruje złożoność przygotowanych białek z filtratu hodowli (CFP). Początkowo 100 µg CFP poddano analizie 2D-SDS PAGE w celu oceny stopnia złożoności. Analiza ta wykazała obecność prawie 100 odrębnych plamek białkowych w CFP (Rysunek 1).

20 frakcji zebranych z każdego przebiegu przeanalizowano metodą SDS-PAGE. Z nich trzy reprezentatywne frakcje z trzech różnych przebiegów przedstawiono na Ryc. 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Białka filtratu kulturowego (CFP) Mycobacterium tuberculosis stanowią złożoną mieszaninę różnych składników białkowych obecnych w różnych stężeniach. Badania proteomiczne zidentyfikowały do 1314 białek w CFP 4,5. Liczne badania podkreśliły kluczową rolę CFP w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. W szczególności CFP odgrywają niezastąpioną rolę zarówno w odporności komórkowej, charakteryzującej się odpowiedziami limfocytów T

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ä System filtracji strumienia stycznego KTA CYTIVA (CYTIWA)29038437
Amfoliity (pH od 3,0 do 10,0 )BIO-RAD1632094
Amfoliity (pH 4,0 do 6,0 )BIO-RAD1631143
Test białka BCA MERCK71285-M
CZAPKIMERCKZobacz materiał C2632
Hydrolizat kazeinyMERCK65072-00-6
Kwas cytrynowyMERCKZobacz materiał C0759 powiedział:
DigitoninaMERCK300410
Naziemna telewizja cyfrowaMERCKZobacz materiał D9779
Siarczan żelazowo-amonowyHIMEDIAGRM10944
GlicerolMERCKZobacz materiał G5516
Glicerol MERCK252859
Skosy Lowensteina-Jensena HIMEDIASL001 powiedział:
Siarczan magnezuMERCKZobacz materiał M7506
System filtracji próżniowej Millipore Stericup Quick ReleaseMERCKS2HVU11RE
Kwas fosforowy MERCK695017
Diwodorortofosforan potasuMERCKZobacz materiał P0662
Wodorotlenek potasu MERCK484016
Preparatywna komórka IEF (Rotofor) BIO-RAD170-2986 
Azydek sodu MERCKS2002
Glutaminian soduMERCK49621
Wodorotlenek soduHIMEDIAMB095 powiedział:
TrisMERCK252859
MocznikMERCKU5128 powiedział:
Cała aparatura Gel Eluter BIO-RAD1651250

Bibliografia

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

frakcjonowanie białekogniskowanie izoelektryczneSDS-PAGEbiomarkery białkoweprofilowanie immunologicznefiltracja przepływu stycznegoanaliza proteomicznaantygeny limfocytów T
Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.