Artykuł metodologiczny

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

DOI:

10.3791/67680

⸱

26 września 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściany komórkowej i białka błonowe prątków, które odgrywają kluczową rolę w patogenezie gruźlicy, udało się oddzielić za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) i preparatywnej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Następnie następuje elucja żelu, pokonując ograniczenia w konwencjonalnych metodach separacji białek hydrofobowych. W tej procedurze kolonie M. tuberculosis przeniesiono ze skosów Lowensteina-Jensena do 2 ml bulionu 7H9, zdyspergowano szklanymi kulkami i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie. Następnie kulturę przeskalowano do 200 ml i hodowano w shakerze przez 4 tygodnie. Został on następnie przeskalowany do 1 litra z 500 ml bulionu 7H9 i uprawiany przez dodatkowe 4 tygodnie. Wyhodowane prątki granulowano przez odwirowanie w ilości 1741 × g przez 30 minut. Na każde 2 g pastylki dodano 1 ml buforu łamliwego, a próbkę poddano sonikacji. Lizat odwirowywano przy 3436 × g przez 15 minut w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek, a supernatant zagęszczono. Ten supernatant (lizat całokomórkowy) odwirowywano w stężeniu 13751 × g przez 30 minut w celu osadzenia białek ściany komórkowej. Pozostały supernatant był ultra odwirowywany w stężeniu 100 000 × g przez 4 godziny w celu oddzielenia błony komórkowej i cytozolu. Wyizolowane białka ściany komórkowej i błony zostały załadowane do płynnego preparatywnego układu IEF w temperaturze 4 °C i rozdzielone w temperaturze 12 W, aż napięcie ustabilizowało się na poziomie 1400 V, co oddziela 20 frakcji. Te frakcje IEF zostały następnie oddzielone za pomocą preparatywnego SDS-PAGE, a białka eluowano przy użyciu całego eluteru żelowego o natężeniu 250 mA, w wyniku czego uzyskano 30 frakcji. Dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie zidentyfikować nowe ściany komórkowe M. tuberculosis i biomarkery specyficzne dla błony, a także wykazuje potencjał do charakteryzowania podobnych białek w innych patogenach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania immunologiczne wykazały, że oprócz rozpuszczalnych białek, które są łatwe do oczyszczenia, ludzka odpowiedź immunologiczna na patogeny, takie jak M. tuberculosis, jest również ukierunkowana hydrofobowa białko obecne w ścianie komórkowej1 i białkach błony komórkowej2 Mycobacterium tuberculosis. Te białka ściany komórkowej i błony odgrywają kluczową rolę w kontroli immunologicznej przeciwko wielu patogenom, w tym gruźlicy. Niektóre z tych białek są zgłaszane jako antygeny immunodominujące, które wywołują odpowiedź komórek T i B. W przeciwieństwie do tego, inne białka są identyfikowane jako sygnatury molekularne patogenów, które są rozpoznawane jako inicjujące wrodzoną odpowiedź immunologiczną, takie jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) przez komórki odpornościowe, inicjując w ten sposób odpowiedź immunologiczną. Na przykład lipoproteiny prątków, takie jak LprG, LpqH, LprA i PhoS1, są rozpoznawane przez receptor Toll-podobny 23.

Hydrofobowy charakter białek ściany komórkowej i błony stanowi poważne wyzwanie techniczne w zakresie ich rozpuszczania i separacji. Badania wykazały, że białka błonowe stanowią około 20% do 30% regionów kodujących wszystkie organizmy, w tym prątki 4,5. Ze względu na ich wewnętrzną naturę i wyzwania techniczne, białka ściany komórkowej i błony są trudniejsze do rozpuszczenia i wyizolowania w porównaniu z białkami rozpuszczalnymi. W rezultacie opisano tylko 2% struktur białek błonowych6. Do trudności w wyizolowaniu tych białek przyczynia się kilka czynników. Podstawowym wyzwaniem jest ich niska liczebność w komórce, co komplikuje izolację poszczególnych białek w celu dalszej charakterystyki7. Dodatkowo białka te mają tendencję do agregacji, co dodatkowo komplikuje ich rozpuszczalność. Ten problem można rozwiązać, dodając detergenty, które wspomagają rozpuszczanie. Jednak niektóre białka mogą nadal tworzyć agregaty nawet w obecności detergentów, w którym to przypadku można zastosować środki chaotropowe i redukujące w celu poprawy rozpuszczalności.

Stosowanie detergentów do solubilizacji może zakłócać późniejsze metody separacji. Na przykład naładowane detergenty nie mogą być używane z chromatografią jonowymienną, a wszystkie detergenty mogą zakłócać chromatografię oddziaływań hydrofobowych8. Dlatego wybór detergentu kompatybilnego z wybraną metodą separacji ma kluczowe znaczenie. Kolejnym ważnym krokiem w izolacji białek ściany komórkowej i błony jest usunięcie detergentów używanych do solubilizacji, ponieważ mogą one zakłócać późniejsze analizy funkcjonalne białek.

Opracowaliśmy solidną metodologię, która pozwala przezwyciężyć wiele wyzwań związanych z analizą białek błonowych, w szczególności białek hydrofobowych ze ściany komórkowej i błony komórkowej. Kluczowym wyzwaniem w badaniu tych białek jest ich rozpuszczalność, ponieważ ich hydrofobowy charakter sprawia, że są trudne do ekstrakcji i analizy. Opisana tutaj metodologia wykorzystuje specjalnie opracowany bufor ogniskowania izoelektrycznego (IEF), który skutecznie rozpuszcza białka ściany komórkowej i błony komórkowej. Ten etap rozpuszczania ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia późniejszą analizę tych hydrofobowych białek.

Dodatkową zaletą tej metody jest jej zdolność do zmniejszania złożoności mieszanki białkowej. Dzięki zastosowaniu dwóch uzupełniających się technik separacji - opartych na punkcie izoelektrycznym (pI) i masie cząsteczkowej białek - metodologia ta skutecznie rozdziela białka ściany komórkowej i błony komórkowej na uproszczone frakcje. Każda frakcja zazwyczaj zawiera tylko jedno do trzech białek, co znacznie zwiększa rozdzielczość i ułatwia dalszą charakterystykę.

Metodologia ta, opracowana przy użyciu białek ściany komórkowej i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis jako systemu modelowego, skutecznie rozwiązuje problemy związane z izolacją i analizą białek hydrofobowych. Zapewnia niezawodne podejście do izolacji, separacji i charakterystyki tych złożonych frakcji białkowych, zwiększając możliwości ich szczegółowego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to było zgodne z odpowiednimi wytycznymi rządowymi i zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Naukowy Komitet Doradczy i Komitet Etyczny. Świadomą zgodę uzyskano od badanej populacji przed pobraniem próbek.

1. Hodowla M. tuberculosis

  1. Przenieś około 10 M. kolonii gruźlicy ze skosów Lowensteina-Jensena do 2 ml pożywki bulionowej 7H9 (zawiesić 2,35 g Middlebrook 7H9 Bulion Base w 400 ml wody destylowanej, 50 ml suplementu katalazy albuminy kwasu oleinowego i dekstrozy [OADC], 0,5 g Tween 80 i uzupełnić do 500 ml)
    UWAGA: M. tuberculosis jest patogenem grupy ryzyka 3; należy obchodzić się z nim w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w obiekcie BSL3. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
  2. Rozprowadzić komórki za pomocą szklanych kulek w sterylnych warunkach w wytrząsarce do butelek z prędkością 15 obr./min przez 1 min.
  3. Przenieść zawiesinę bakteryjną do 10 ml pożywki bulionowej 7H9 w butelce McCartneya i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie w inkubatorze z wytrząsarką przy 30 obr./min.
  4. Zwiększ hodowlę w fazie logarytmicznej do 200 ml pożywki bulionowej 7H9 i hoduj w kulturze wytrząsającej przez 4 tygodnie przy 30 obr./min.
  5. Następnie zwiększyć skalę kultury w 1-litrowej kolbie zawierającej 500 ml pożywki bulionowej 7H9 i hodować jako kulturę wytrząsającą przy 30 obr./min przez 4 tygodnie w temperaturze 37 °C.
  6. Zebrać prątki przez odwirowanie z prędkością 1741 g przez 30 minut.

2. Przygotowanie białek lizatu całych komórek

  1. Poddać wyizolowany osad bakteryjny sonikacji zgodnie ze standardowym protokołem.
  2. Przygotować bufor rozbijający o następującym składzie: 20 mM Tris z 8,5% (8,5 g na 100 ml) NaCl.
  3. Dostosuj końcowe pH do 7,4 za pomocą stężonego HCl.
  4. Dodać świeżo przygotowane inhibitory proteazy do buforu niszczącego o następujących stężeniach (szczegółowe informacje na temat inhibitorów proteazy, które należy dodać, są wymienione w tabeli uzupełniającej 1)
  5. Traktować pałeczki M. tuberculosis (100 ml objętości po upakowaniu i zważyć) na każde 2 g osadu komórek bakteryjnych, dodać 1 ml buforu łamiącego lizozymem (1 mg/5 ml zawiesiny komórkowej) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając.
  6. Zawiesić pałeczki w podwójnej objętości buforu łamającego.
  7. Do buforu dodać 0,04% (wag./obj.) azydek sodu i 0,05% Tween 80.
  8. Rozbić komórki bakteryjne w buforze rozbijającym za pomocą sonikatora z cyklem 9 s włączonym i 9 s wyłączonym przez 30 minut przy 40% amplitudzie, utrzymując zawiesinę na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek.
  9. Odwirować przygotowany lizat przy 3438 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek.
  10. Zagęścić supernatant za pomocą koncentratorów odśrodkowych (odcięcie 3 kDa – 5 ml).
  11. Oznaczyć stężenie białka w supernatancie za pomocą testu ilościowego białka kwasu bicinchoninowego (BCA) przy użyciu białka BSA jako standardu.
    UWAGA: W analizie SDS-PAGE załaduj 50 μg białka do analizy.

3. Izolacja białek ściany komórkowej i błony komórkowej przez ultrawirowanie

  1. Wyizoluj ścianę komórkową, błonę komórkową i białka cytozolowe z lizatu całej komórki zgodnie z protokołem Raja i wsp.9. zgodnie z poniższym opisem.
  2. Odwirować lizat całego układu komórkowego w temperaturze 13751 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut, rozdzielając białka ściany komórkowej w postaci osadu.
  3. Poddać supernatant ultrawirowaniu w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C przez 4 godziny za pomocą ultrawirówki, oddzielając białka błony komórkowej w postaci osadu i pozostawiając białka cytozolowe w supernatancie.
  4. Oszacuj stężenia białek w ścianie komórkowej i frakcjach błony komórkowej za pomocą testu białka BCA.
    UWAGA: W analizie SDS-PAGE załaduj 50 μg białka do analizy. Oddzielona ściana komórkowa i błona komórkowa są przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

4. Preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (Rotofor [aparatura IEF])

  1. Rozpuścić solubilizację ścian komórkowych i białek błony komórkowej wyizolowanych przez ultrawirowanie w buforze IEF zawierającym 8 M mocznika, 1 mM DTT, 5% glicerolu, 2% digitoniny.
  2. Dodać 2% amfolitów (pH 3,0 do 10,0 i pH 4,0 do 6,0 w stosunku 1:4)
  3. Frakcjonować rozpuszczone białka za pomocą ciekłego systemu IEF utrzymywanego w temperaturze 4 °C z chłodzącą łaźnią wodną.
  4. Przeprowadzić separację IEF zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stałą moc 12 W, aż do ustabilizowania się napięcia (między 1300 V a 1600 V).
  5. Kontynuuj przebieg IEF przez dodatkowe 30 minut po ustabilizowaniu napięcia, z całkowitym czasem pracy około 5-6 godzin.
  6. Zebrać poszczególne frakcje IEF za pomocą pompy próżniowej i określić ich wartości pH.
  7. Poddaj oddzielone frakcje (50 μg) SDS-PAGE i zwizualizuj białka za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue (CBB) lub srebra. Oddzielone frakcje IEF należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

5. Preparatywna SDS-PAGE i cała elucja żelu

  1. Wymieszać oddzielone IEF frakcje ściany komórkowej i błony komórkowej z 6-krotnym buforem próbki SDS-PAGE i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut przed analizą SDS-PAGE.
  2. Oddziel frakcje białkowe w drugim wymiarze za pomocą żeli poliakrylamidowych o długości 16 cm i długości 20 cm, składających się z 12,5% żelu rozdzielczego i 4% żelu do układania w stosy.
  3. Do załadowania próbki należy użyć pojedynczego dołka na próbkę o długości 13 cm.
  4. Przeprowadzaj elektroforezę przy stałym prądzie 50 mA/żel, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.
  5. Równoważyć żel w buforze elucyjnym (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM kwas 3-(cykloheksyloamino)-1-propanosulfonowy [CAPS]) przez 10 minut po zakończeniu elektroforezy.
  6. Przenieść żel do całego aparatu do eluteracji żelu zgodnie z opisem producenta urządzenia.
  7. Eluować białka z żelu, uruchamiając eluter przy stałym prądzie 250 mA przez 1 godzinę.
  8. Zebrać około 30 frakcji białkowych, każda o objętości 3 ml, z każdego żelu za pomocą pompy próżniowej.
  9. Określić ilościowo stężenie białka w eluowanych frakcjach za pomocą testu białka BCA.
  10. Poddaj 10 μg eluowanych frakcji analizie SDS-PAGE i uwidocznij za pomocą barwienia błękitem brylantowym Coomassie (CBB).
    UWAGA: Oddzielone całe eluowane frakcje żelowe przechowywano w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja białek ściany komórkowej i błony komórkowej za pomocą ultrawirowania z dużą prędkością
Białka ściany komórkowej i błony wyizolowano z całych lizatów komórkowych za pomocą ultrawirowania, jak opisano w protokole. Analiza SDS-PAGE oddzielonych frakcji subkomórkowych - ściany komórkowej, błony komórkowej i profili białkowych cytozolu M. tuberculosis pokazano na rycinie 1.

Rozdzielanie białek ściany komórkowej za pomocą pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrofobowy charakter białek ściany komórkowej i błony stanowi poważne wyzwanie eksperymentalne w zakresie ich rozpuszczania i separacji. We wspomnianym protokole opisaliśmy nowatorską dwuwymiarową metodę separacji opartą na elektroforezie, aby skutecznie wyizolować te hydrofobowe białka. W tym protokole początkowo oddzieliliśmy białka błony i ściany komórkowej na podstawie ich punktów izoelektrycznych za pomocą ciekłego systemu IEF. Aby rozwiązać problem solubilizacji, zastosowaliśmy wysokie stężenie środka chaotropoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta jest w pełni wspierana przez grant DST SERB dr K. R. Uma Devi. Dr B. Ramalingam był finansowany przez stypendium DBT-Ramalingaswamy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół 7H9 Himedia Zobacz materiał M198
40% Bio-Lyte 3/10 Amfolite BIO-RAD1631113
Test białka BCA MERCKZobacz materiał BCA1
Bio-Lyte 5/7 Amfolite BIO-RAD1631152
koncentratory odśrodkowe 3 kDaMERCKZ629456
Digitonina.MERCKZobacz materiał D141
Dnase (Wirus Dnase)MERCK11284932001
Naziemna telewizja cyfrowaMERCKZobacz materiał D9779
EDTAMERCKNumer katalogowy E9884
EGTA (EGTA)MERCKE3889 powiedział:
GlicerolMERCKZobacz materiał G5516
LeupeptynaMERCKE18
Pepstatyna AMERCKZobacz materiał P5318
PMSF (Kanał PMSF)MERCK78830
RnazaMERCK10109134001
Rotofor BIO-RAD170-2986  aparatura do ogniskowania izoelektrycznego (IEF)
SonifikacjiVibra-Cell, DźwiękiVC 750
TLCK (Troska)MERCKZobacz materiał T7254 TGL
TPCK (Protokół TPCK)MERCK4376
mocznikMERCKU5378 powiedział:
Cała aparatura Gel Eluter BIO-RAD1651250

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
  10. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).
  11. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
  13. Deenadayalan, A., et al. An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Med Res Arch. 11 (11), (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka ciany kom rkowejfrakcjonowanie bia ekogniskowanie izoelektryczneSDS PAGEseparacja bia ek hydrofobowychfrakcjonowanie subkom rkowebiomarkery bia koweelucja z elu

Powiązane artykuły