Artykuł metodologiczny

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

DOI:

10.3791/67683

⸱

16 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Dartmouth Hitchcock Medical Center, 2Dartmouth Cancer Center, 3Dartmouth College, Geisel School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki transkryptomicznej przestrzennej są zaawansowanym narzędziem w badaniach biomedycznych do wizualizacji przestrzennie zarejestrowanych wzorców ekspresji genów. Obrazowanie i analiza wielu próbek za pomocą platform obrazowania przestrzennego może być kosztowna. Przeprowadzanie tych testów w wielu warunkach eksperymentalnych, jak to widać w badaniach rozwojowych, dodatkowo zwiększa koszty. Aby obniżyć koszty, badanie to miało na celu optymalizację technik i strategii przestrzennego rozmieszczenia próbek transkryptomicznych do badań rozwojowych. W tym przypadku w badaniu wykorzystano danio pręgowanego, który jest dobrze ugruntowanym modelem kręgowców rozwojowych, który jest przezroczysty podczas rozwoju, ma ~70% genetycznej homologii do ludzi i wysoce opisany genom idealny do analizy transkryptomicznej. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, rozwój danio pręgowanego pozwala również na kompaktowe umieszczanie odcinków szeregowych w kilku powtórzeniach biologicznych. W niniejszym dokumencie informujemy o zoptymalizowanym utrwalaniu, kriosekcji i niezawodnym wyrównaniu wielu próbek ryb w obszarze obrazowania platformy obrazowania przestrzennego do hybrydyzacji in situ. Dzięki tej metodzie danio pręgowany w wieku zaledwie 15 dni po zapłodnieniu (dpf) z co najmniej 4 różnych form i do 174 skrawków może być z powodzeniem kriosekcyjny, zbierany w obszarze obrazowania 22 mm 10,5 mm (dla przestrzennego szkiełka transkryptomicznego in situ) i przetwarzany jednocześnie. Opierając się na jakości przekroju, wyrównaniu próbki i wielkości próbki na szkiełku, metoda ta u danio pręgowanego optymalizuje wydajność i koszt na próbkę technik transkryptomicznych przestrzennych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena przestrzennie odrębnych wzorców ekspresji w tkance pozostaje kluczowa dla naszego zrozumienia wpływów genomowych na rozwój, raka i choroby1,2,3. Transkryptomika przestrzenna łączy techniki ekspresji multipleksowej z przestrzenną rejestracją ekspresji w tkankach. "Transkryptomika przestrzenna" została po raz pierwszy ukuta przez Ståhla i współpracowników4, w której zamontowane próbki raka były badane przy użyciu sekwencjonowania in situ nowej generacji. Od tego czasu "transkryptomika przestrzenna" jest stosowana jako uniwersalne rozwiązanie do wysokoprzepustowych badań ekspresji w połączeniu z rejestracją przestrzenną. Chociaż są to potężne narzędzia, są to również kosztowne przedsięwzięcia, które często wymagają dużych inwestycji instytucjonalnych i kosztów laboratoryjnych, zanim będzie można wygenerować dane5. Strategie mające na celu minimalizację kosztów przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości danych cieszą się dużym zainteresowaniem.

Danio rerio, Danio rerio, stały się ważnym systemem modelowym do badania biologii rozwojowej i oferują sposób na zwielokrotnienie analiz całych organów (i organizmów) kręgowców na ograniczonej przestrzeni. Danio pręgowany jest mały (4-6 mm jako larwy i 2-3 cm jako dorosłe) i może składać setki przezroczystych jaj na raz6. Zarodki danio pręgowanego są zapładniane zewnętrznie i szybko się rozwijają, co pozwala naukowcom na wprowadzenie transgenów we wczesnych stadiach rozwoju, aby łatwo generować allele przyrostu i utraty funkcji7. Dopasowanie wielu próbek do jednego szkiełka to atrakcyjna strategia obniżania kosztów. Ich wysoka płodność i niewielkie rozmiary sprawiają, że danio pręgowany jest idealnym kandydatem do multipleksowania przestrzennych testów transkryptomicznych, które mają ograniczoną przestrzeń dla okazów8.

Kriosekcja larw danio pręgowanego to wymagająca technika. Wiele przestrzennych platform transkryptomicznych nie zostało zoptymalizowanych pod kątem skrawków parafiny danio pręgowanego i wymaga kriosekcji podczas pracy z danio pręgowanym jako organizmem modelowym w celu zachowania struktury tkanki i zachowania transkryptów RNA. Ponadto niewielki rozmiar danio pręgowanego utrudnia uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji i skuteczną analizę wielu próbek. Zadanie to staje się trudniejsze podczas pracy z larwami danio pręgowanego, które są mniejsze i bardziej kruche niż ich dorosłe odpowiedniki. Aby sprostać tym wyzwaniom, opisujemy metodę, która niezawodnie wyrównuje wiele próbek i efektywnie wykorzystuje obszar obrazowania platform obrazowania przestrzennego w celu uzyskania wielu wysokiej jakości sekcji na jednym slajdzie, które mogą być następnie obrazowane i analizowane przez platformy obrazowania przestrzennego (Rysunek 1). W tym przypadku metoda ta jest stosowana do platformy przestrzennego obrazowania transkryptomicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami w Dartmouth College.

1. Przygotowanie kriostatu

  1. Schłodzić kriostat do temperatury -22 °C i oczyścić wewnętrzne powierzchnie kriostatu, wcierając zanieczyszczenia do pojemnika. Umieść wszystkie niezbędne szczotki i narzędzia w komorze.

2. Przygotowanie jednorazowej formy bazowej

  1. Przygotuj formę bazową (jednorazowa forma z tworzywa sztucznego 37 mm 24 mm 5 mm) do wyrównania próbki, rysując linię prostą w poprzek wnętrza formy bazowej za pomocą trwałego markera, który będzie służył jako punkt odniesienia do wyrównania próbki. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej po wewnętrznej stronie formy bazowej, w miejscu, w którym powinna znajdować się linia prosta, zanim narysujesz linię, aby uzyskać najlepsze wyniki (Rysunek 2A).
  2. Narysuj kropkę po wewnętrznej stronie formy bazowej w pobliżu lewej lub prawej ściany, aby zapewnić prawidłową orientację próbki podczas kriosekcji (Rysunek 2B).
  3. Zmierz żądany kąt cięcia za pomocą kątomierza i zaznacz go po wewnętrznej stronie formy bazowej dla każdej próbki ( Rysunek 2C).
  4. Na przygotowaną formę bazową nałożyć płytką warstwę podłoża zamrażającego (optyczna tomografia koherentna [OCT]). Upewnij się, że jest wystarczająco dużo podłoża do zamrażania, aby przykryć próbki.
    1. Unikaj pęcherzyków powietrza podczas nakładania medium zamrażającego, zalewając dyszę butelki z pożywką i dodając niezbędną ilość pożywki do jednego rogu formy bazowej przed przesunięciem płaszczyzny poziomej formy podstawowej, tak aby podłoże było równomiernie rozprowadzone na całej powierzchni.
    2. Powoli ściskaj butelkę podczas dozowania środka zamrażającego.
  5. Dodaj lód do zlewki o pojemności 1 l, umieść formę bazową z zamrażarką w łaźni lodowej i inkubuj przez co najmniej 10 minut, aby schłodzić podłoże.

3. Przygotowanie suchego lodu: kąpiel 100% etanolowa

  1. Przygotuj kąpiel z suchym lodem i 100% etanolem w dygestorium, dodając jedną część 100% etanolu do jednej części suchego lodu w wiaderku na lód.
  2. Użyj jednorazowego naczynia aluminiowego lub złóż folię aluminiową w łódkę wystarczająco dużą, aby zmieściła się jednorazowa forma podstawowa. Upewnij się, że naczynie lub łódka jest wystarczająco duża, aby forma podstawy leżała całkowicie płasko.
  3. Umieść naczynie lub łódkę w wannie i przykryj wiadro. Odczekaj 5-10 minut, aż wiadro ostygnie przed zamrożeniem próbek.

4. Eutanazja próbek

  1. Losowo wybierz danio pręgowanego do podziału. Jeśli próbki różnią się wielkością, podziel je na grupy według względnej wielkości, aby ułatwić dokładne wyrównanie (zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje). Umieść większe ryby i mniejsze ryby w osobnych naczyniach.
  2. Napełnij zlewkę wodą z systemu rybnego i umieść zlewkę w pojemniku na lód. Otocz zlewkę lodem.
  3. Monitoruj temperaturę wody za pomocą termometru. Pozwól, aby temperatura ustabilizowała się w zakresie 2-4 °C.
  4. Za pomocą siatki lub sitka umieścić jedną grupę ryb w wodzie o temperaturze 4 °C. Ryby powinny być całkowicie zanurzone w wodzie i nie mieć kontaktu z lodem. Po ustaniu ruchu operkularnego dodaj lód do wody, aby upewnić się, że temperatura nie spadnie poniżej 4 °C. Pozostaw ryby w wodzie o temperaturze 4 °C na 10 minut
    UWAGA: Kontynuuj osadzanie, wyrównywanie i błyskawiczne zamrażanie każdej grupy uśpionych próbek przed eutanazją następnej grupy. Za każdym razem wymieniaj wodę.

5. Osadzanie i wyrównywanie

  1. Rybę poddaną eutanazji należy zebrać po zanurzeniu w wodzie o temperaturze 4 °C na 10 minut. Wyjmij rybę z wody za pomocą kleszczy z cienką końcówką, chwytając ją za płetwę ogonową i osusz, delikatnie dociskając ją do chłonnej, niestrzępiącej się chusteczki.
    UWAGA: W przypadku sekcji o wysokiej jakości bardzo ważne jest ograniczenie czasu między wyjęciem ryb z wody o temperaturze 4 °C a błyskawicznym zamrożeniem
  2. Pracując z przygotowaną formą bazową w kąpieli lodowej pod mikroskopem stereoskopowym (10-krotne powiększenie), umieść każdą próbkę w formie bazowej wzdłuż punktów odniesienia we właściwej orientacji i delikatnie przykryj próbki kolejną cienką warstwą pożywki zamrażającej.
    UWAGA: Nie napełniaj całej formy środkiem zamrażającym. Zamiast tego używaj tylko cienkiej warstwy, tylko tyle, aby pokryć wszystkie próbki.
  3. Użyj anatomicznego punktu odniesienia, aby precyzyjnie wyrównać rybę z liniami zaznaczonymi po wewnętrznej stronie formy podstawowej. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby dostosować orientację każdej ryby, tak aby były wyrównane i w tej samej orientacji. Unikaj tworzenia się pęcherzyków w podłożu zamrażającym, poruszając się powoli.
  4. Nałóż kawałek suchego lodu na dno formy bazowej pod próbki, aż zostaną miejscowo zamrożone na miejscu. Utrzymuj poziomą płaszczyznę formy podstawowej, aby uniknąć przesuwania próbek poza ich punkty odniesienia przed zamrożeniem na miejsce z suchym lodem.
  5. Umieść formę bazową z próbkami na aluminiowej łodzi lub naczyniu w kąpieli z suchym lodem: 100% etanolem. Upewnij się, że łódź unosi się na powierzchni wanny, a forma podstawy pozostaje sucha. Przykryj kąpiel i pozwól próbkom unosić się na wodzie przez 10 minut.
  6. Zawiń zamrożoną formę bazową w folię i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do cięcia. Powtórz kroki 4.2-5.6 dla pozostałych grup.

6. Kriosekcja

  1. Przynieś zamrożone formy bazowe do wstępnie schłodzonego kriostatu w celu kriosekcji i umieść je w komorze kriostatu. Transportuj zamrożone bloki w pudełku z suchym lodem, aby zapobiec rozmrożeniu.
  2. Wyjmij szkiełko do obrazowania przestrzennego in situ z magazynu i umieść je we wstępnie schłodzonym uchwycie na szkiełka. Przechowuj uchwyt szkiełek ze szkiełkiem do obrazowania przestrzennego w komorze kriostatu o temperaturze -22 °C do czasu, gdy będzie gotowy do pobrania skrawków z obszaru zainteresowania.
  3. Wyjmij zamrożone próbki z formy podstawowej, a następnie zamroź je w uchwycie ze świeżym medium do zamrażania. Zamroź je na uchwycie tak, aby powierzchnia cięcia była skierowana w stronę ostrza.
  4. Umieść świeże, drobne ostrze mikrotomu w kriostacie.
  5. Dopasuj formę do ostrza i przytnij obszar zainteresowania (zalecana grubość wykończenia 20-50 μm). Upewnij się, że oznaczenia wykonane wewnątrz formy są przenoszone na zamrożony blok próbki, aby pomóc zidentyfikować lokalizację w próbkach.
  6. Wyreguluj formę podczas fazy przycinania tak, aby powierzchnia cięcia była równoległa do oznaczeń referencyjnych w medium zamrażającym.
  7. Zbierz skrawki na standardowym dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym i sprawdź je w jasnym polu, aby potwierdzić, kiedy przycinanie nie jest już konieczne.
  8. Wyjąć szkiełko do obrazowania przestrzennego z komory kriostatu i umieścić je w łaźni lodowej o temperaturze 4 °C. Trzymaj suwak w uchwycie na suwak. Upewnij się, że zjeżdżalnia nie ulega zamoczeniu.
  9. Rozpocznij kriosekcję (zalecane 10-14 μm; Rysunek 3) i zbierać skrawki na dodatnio naładowane szkiełka, aż do osiągnięcia obszaru zainteresowania w próbkach. Sprawdź sekcje za pomocą jasnego pola, aby potwierdzić, że obszar zainteresowania będzie następną sekcją z formy.
  10. Przynieś szkiełko do obrazowania przestrzennego pojedynczej komórki z powrotem do komory kriostatu. Wyjmij szkiełko z uchwytu szkiełka i zbierz sekcje z dokładnego obszaru zainteresowania na szkiełko do obrazowania przestrzennego rząd po rzędzie za pomocą pędzla z cienką końcówką, aby zapobiec zwijaniu się sekcji.
    1. Wciśnij róg pustej, zamrażającej pożywki do stolika noża tylną stroną pędzla, tak aby sekcja pozostała płaska podczas chwytania szkiełka do zbierania.
    2. Użyj górnej części prowadnicy jako punktu obrotu, powoli opuść suwak na sekcję i pozwól, aby sekcje przylegały do suwaka przez 3 sekundy przed podniesieniem suwaka ze stolika noża.
    3. Pracuj od lewej do prawej podczas zbierania skrawków w obszarze obrazowania szkiełka i jeśli to możliwe, nakładaj na siebie warstwy pustej, zamrażającej pożywki.
    4. Użyj kolorowych obramowań papieru jako odniesienia, aby umieścić sekcje w obszarze obrazowania szkiełka, jeśli tkanka jest słabo widoczna
      5. .
  11. Po zebraniu odcinków z obszaru zainteresowania umieść szkiełko z powrotem w uchwycie szkiełka. Jeśli na szkiełku do obrazowania przestrzennego nie ma już próbek do pobrania, należy przechowywać szkiełko w temperaturze -80 °C przez okres do 2 tygodni, aż będzie gotowe do analizy instrumentu za pomocą platformy obrazowania przestrzennego in situ. Jeśli konieczne jest pobranie skrawków z wielu form, umieść szkiełko do obrazowania przestrzennego z powrotem w łaźni lodowej o temperaturze 4 °C i powtórz kroki 6.3-6.11 z następną formą.
  12. Zbierz skrawki przed i po sekcjach obszaru zainteresowania z każdej formy na standardowym dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym do barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), aby sprawdzić, czy wyrównanie próbki i jakość przekroju są wystarczające przed przystąpieniem do analizy.

7. Naprawianie próbki

  1. Wyjmij szkiełka referencyjne z kriostatu i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby przykleić sekcje do szkiełka.
  2. Utrwalić skrawki, umieszczając je w pojemniku na szkiełka z 4% paraformaldehydem (Tabela 1) na 20 minut.
  3. Umyj sekcje, umieszczając je w pojemniku na szkiełko z wodą destylowaną na 3 minuty.
  4. Kontynuuj barwienie HE lub wysusz i przechowuj szkiełka w temperaturze -80 °C do przyszłego barwienia.

8. Barwienie sekcji HE

  1. Odwodnić i oczyścić sekcje, inkubując szkiełka w 100% etanolu przez 2 minuty, 95% (Tabela 2) etanolu przez 2 minuty, a następnie w wodzie z kranu przez 1 minutę. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.
  2. Wybarwić jądra i rozróżnić je przez inkubację szkiełek w hematoksylinie przez 2 min 45 s, wodzie z kranu przez 1 min, 0,3% zakwaszonym alkoholu (tabela 3) przez 1 min, a następnie pod bieżącą wodą z kranu przez 1 min. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.
  3. Zabarwić składniki cytoplazmatyczne i odwodnić przez inkubację szkiełek w Eozynie Y 1% przez 45 s, 50% etanolu (Tabela 4) przez 1 min, 95% etanolu przez 1 minutę i 100% etanolu przez 1 min. Użyj stojaka do barwienia szkiełek mikroskopowych, aby przenieść szkiełka z kąpieli do kąpieli.
  4. Oczyść sekcje, inkubując szkiełka w ksylenie przez 1 minutę. Zamontuj i przykryj szkiełka, nakładając kroplę podłoża montażowego na górną trzecią część szkiełka za pomocą pipety transferowej i powoli opuszczając szkiełko nakrywkowe na wierzch podłoża montażowego za pomocą kleszczy.

9. Przestrzenne obrazowanie transkryptomiczne i analiza przekrojów

  1. Wyjmij szkiełka obrazowe z pamięci w temperaturze -80 °C i zobrazuj za pomocą platformy obrazowania przestrzennego in situ do przestrzennej analizy transkryptomicznej.
    UWAGA: Dokładne kroki związane z obrazowaniem zostaną określone przez platformę obrazowania przestrzennego.
  2. Przegląd wskaźników kontroli jakości platformy transkryptomicznej przestrzennej. Ważne wskaźniki, które należy sprawdzić, to liczba wykrytych komórek, mediana transkryptów na komórkę, transkrypcje jądrowe na 100μm2 oraz całkowita liczba zdekodowanych transkryptów wysokiej jakości każdego genu w zestawie sondy.
    UWAGA: Te wskaźniki kontroli jakości nie mają uniwersalnych progów, a oczekiwania dotyczące tych progów będą się różnić w zależności od użytej próbki i panelu genów.
  3. Odczytywanie danych wyjściowych wykrywalnych transkryptów RNA, określanie, które transkrypty są niskiej jakości na podstawie wskaźników kontroli jakości eksperymentu, i odfiltrowywanie transkryptów niskiej jakości. Przeanalizuj pozostałe transkrypcje wysokiej jakości pod kątem ich rozmieszczenia przestrzennego w obrębie sekcji.
  4. Wyświetlanie segmentacji komórkowej sekcji i komórek klastrowych w oparciu o zainteresowania eksperymentalne. Porównaj transkrypty RNA w klastrach komórkowych regionu zainteresowania w grupach danio pręgowanego w różnym wieku na tym samym slajdzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie (Rysunek 1), danio pręgowany jest używany jako model zwierzęcy do badania przestrzennie rozdzielczych wzorców ekspresji genów. Skuteczna kriosekcja larw danio pręgowanego w celu obrazowania przestrzennego jest wyzwaniem. Skrawki muszą być wysokiej jakości, aby zachować strukturę tkanki i wykrywalne geny (Ryc. 4). Sekcje zawierające wiele próbek w celu uzyskania efektywnego obrazowania przestrzennego muszą być precyzyjnie wyrównane, aby przeanalizować obszary zaintere...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport zawiera szczegółowe rozwiązania wielu wyzwań technicznych związanych z danio pręgowanym jako organizmem modelowym w przestrzennej analizie transkryptomicznej podczas opracowywania. Aby sprostać tym wyzwaniom, nasz kompaktowy układ próbek optymalizuje koszty na powstających przestrzennych platformach transkryptomicznych1. Kriosekcja larw danio pręgowanego w celu obrazowania przestrzennego jest wyzwaniem. Skrawki powinny zachowywać wystarczającą strukturę tkankową i jakość transkryp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji ani nie występują w konflikcie interesów w związku z tym raportem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekcja i obrazowanie zostały wykonane za pomocą narzędzi dostarczonych przez wspólne zasoby w Dartmouth Cancer Center, finansowane przez NCI Cancer Center Support Grant 5P30CA023108, oraz Center for Quantitative Biology at Dartmouth College (NIGMS COBRE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 L ZlewkaPyrex1003
200 proof czysty etanolKoptecV1001
Kwas octowy, lodowatyVWR0714zakwaszony alkohol
Folia
aluminiowa Szkiełka nakrywkoweEpredia24X50-1,5-001G
Jednorazowa forma bazowaFisher HealthCare22-363-556
Topnik DPX do wody
ŁącznikSigma-Aldrich06522do histologii
Granulki
Dumont #5SF KleszczeFine Science Tools11252-00
Eozyna-Y AlkoholowaEpredia71204Eozyna Y 1%
Gill 1 HematoksylinaEpredia72411Hematoksyliną
KimwipeKimberly-Clark Professional34120chłonna, niestrzępiąca się chusteczka
Taśma do etykietowania laboratoryjnegoVWR89097-934
Ostrze mikrotomowe MX35 UltraEpredia3053835
Microtome CryostatThermo ScientificMicrome HM 525
O.C.T. CompoundFisher HealthCare23-730-571medium zamrażające
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127permanentny PFA
VWR52877-886
Kątomierz
SafeClear Substytut ksylenuFisherbrand68551-16-6Substytut ksylenu
Ostrza jednokrawędzioweAmerican Line66-0407
SteriomikroskopZeiss4350639000Stemi 305 z podwójną diodą LED (4355259020) i stanowiskiem K lab (4354259010)
Prowadnice Superfrost Plus VWR48311-703
Pipeta transferowa
Xenium V1 Szkiełkoprzestrzennego obrazowania transkryptomicznego10X/Xenium3000941
destylowanejsuchego lodu Marker do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22, 627-644 (2021).
  3. Duhan, L., et al. Single-cell transcriptomics: background, technologies, applications, and challenges. Mol Biol Rep. 51, 600(2024).
  4. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  5. Colman, R. E., et al. Whole-genome and targeted sequencing of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis on the iSeq100 and MiSeq: A performance, ease-of-use, and cost evaluation. PLOS Med. 16 (4), e1002194(2019).
  6. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: zebrafish. Development. 146 (18), dev167692(2019).
  7. Mohideen, M. P. K., et al. Histology-based screen for zebrafish mutants with abnormal cell differentiation. Dev Dyn. 228 (3), 414-423 (2003).
  8. Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 38-46 (2018).
  9. Stock, R. J., Labudovich, M., Ducatman, B. Asymptomatic first-trimester liver cell adenoma: diagnosis by fine-needle aspiration cytology with cytochemical and ultrastructural study. Obstet Gynecol. 66 (2), 287-290 (1985).
  10. Petukhov, V., et al. Cell segmentation in imaging-based spatial transcriptomics. Nat Biotechnol. 40 (3), 345-354 (2022).
  11. Meyer, T., Tiburcy, M., Zimmermann, W. H. Cardiac macrotissues-on-a-plate models for phenotypic drug screens. Adv Drug Deliv Rev. 140, 93-100 (2019).
  12. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  13. Yu, K., Xing, J., Zhang, J., Zhao, R., Zhang, Y., Zhao, L. Effect of multiple cycles of freeze-thawing on the RNA quality of lung cancer tissues. Cell Tissue Bank. 18 (3), 433-440 (2017).
  14. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (1), 57(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spatial TranscriptomicsCryosectioning TechniqueSample AlignmentIn Situ HybridizationSpatial Imaging PlatformDevelopmental StudiesSerial SectioningPositively Charged SlidesHematoxylin Eosin Staining

Powiązane artykuły