Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67693

⸱

28 marca 2025

 ,  , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, 2School of Biological Sciences, University of Southampton

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Streszczenie

Rzęska pierwotna to nieruchliwa, samotna organella złożona przez większość typów komórek. Jest niezbędna do rozwoju i homeostazy szkieletu oraz do koordynowania odpowiedzi komórek na biochemiczne i mechaniczne sygnały z otaczającego środowiska. Ze względu na rozmiar w skali mikrometrowej, rzęska pierwotna jest trudna do zobrazowania in situ w celu scharakteryzowania w tkankach, w sposób wysokoprzepustowy i bez odchyleń optycznych. Zrozumienie jego organizacji w środowisku 3D in vivo będzie kluczem do zrozumienia ról rzęsek w fizjologii i chorobie. Mysia linia ARL13B-CENTRIN-2 ma znacznik mCherry na białku aksonemowym rzęskowym ARL13B i znacznik białka zielonej fluorescencji (GFP) na białku centrioli CENTRIN-2, zlokalizowanym u podstawy rzęski. Ta linia myszy pozwala na obrazowanie rzęski pierwotnej bez konieczności barwienia, co zmniejsza liczbę kroków w zbieraniu obrazów i omija problemy z sygnałem do szumu. W niniejszej publikacji opisano krok po kroku protokół obrazowania rzęsek pierwotnych w tkankach mięśniowo-szkieletowych przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencyjnego. Opisano w nim również uniwersalną metodę analizy obrazu, umożliwiającą bezstronną kwantyfikację cech rzęsek, takich jak długość i orientacja 3D.

Wprowadzenie

Rzęska pierwotna jest niezbędnym organellem w rozwoju i homeostazie wielu tkanek i narządów, w tym szkieletu. Podczas wzrostu pourodzeniowego reguluje mineralizację chrząstki podczas kostnienia śródchrzęstnego1. U ludzi mutacje genetyczne, które wpływają na białka związane z rzęskami, powodują szereg chorób i zaburzeń rozwojowych, znanych jako ciliopaty. Zrozumienie organizacji rzęsek pierwotnych w tkankach jest ważne dla zrozumienia, w jaki sposób regulują one zachowanie komórek na poziomie narządów. Wykazano, że częstość występowania, długość i orientacja rzęsek pierwotnych różnią się w obrębie tkanek i między nimi, co sugeruje rolę organizacji tkanek w ich funkcji2,3,4. Płytka wzrostowa, warstwa chrząstki na końcu kości długich, w której większość pourodzeniowego wzrostu kości następuje od wczesnego okresu życia i okresu dojrzewania, jest wysoce zorganizowaną tkanką z komórkami chondrocytów ułożonymi w kolumnach. Na płytce wzrostowej chondrocyty przechodzą przez etapy różnicowania, od spoczynku, przez proliferację, po przerost.

Ta organizacja komórkowa jest tracona w niektórych ciliopatiach, co sugeruje, że pierwotne rzęski mogą odgrywać rolę w koordynowaniu tej organizacji komórkowej i/lub przynajmniej być związane z polaryzacją komórkową. Ponadto pierwotna orientacja rzęsek wydaje się odgrywać rolę w ich funkcji mechanosensorycznej, z różnicami obserwowanymi między obszarami nośnymi i nienośnymi w chrząstce stawowej4. Nasze ostatnie badania sugerują zróżnicowane role w różnych obszarach chrząstki stawowej i płytki wzrostu5,6. Poprzednie badania, w których obrazowano rzęski pierwotne na płytce wzrostu, były ograniczone do 2D, które gubią informacje związane z organizacją rzęsek w tkance lub są ograniczone do niewielkiej liczby komórek w 3D, co zmniejsza skalę i moc analizy7,8.

Wśród wyzwań związanych z obrazowaniem rzęski pierwotnej są jej rozmiar w skali mikrometrowej oraz nieswoistość przeciwciał immunohistochemicznych. Użycie natywnego sygnału fluorescencyjnego zapewnia silną lokalizację i specyficzność. Natywne sygnały fluorescencyjne mogą być jednak trudne do zobrazowania w zmineralizowanych tkankach, ponieważ długi proces odwapniania w celu zatopienia tkanek w parafinie może spowodować utratę sygnału. Kriosekcja próbek zamrożonych w stanie natywnym zapobiega tej utracie poprzez przyspieszenie procesu zatapiania i cięcia.

Aby zobrazować pierwotne rzęski in situ, Bangs et al. wygenerowali podwójną transgeniczną linię myszy, która wyraża białko podobne do czynnika ADP-rybozylacji (ARL13B) połączone z mCherry i CENTRIN-2 połączone z GFP9. ARL13B to mała GTPaza zlokalizowana w pierwotnej błonie rzęskowej, a CENTRIN-2 to białko dośrodkowe zlokalizowane w dwóch centrosomach u podstawy rzęski < sup class="xref">10,11. Ta linia myszy pozwala zatem na obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych rzęsek pierwotnych bez konieczności stosowania immunohistochemii.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje tę transgeniczną linię do obrazowania pierwotnych rzęsek w 3D na mysich pourodzeniowych płytkach wzrostu za pomocą mikroskopii konfokalnej, wymagając jedynie dodatkowego barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Setki rzęsek pierwotnych w setkach komórek można obrazować i analizować zbiorczo w kontekście tkankowym. Potok analizy obrazu mierzy następnie częstość występowania, długość i orientację rzęsek pierwotnych w różnych obszarach płytki wzrostu. Rurociąg jest również w stanie określić ilościowo te cechy dla centrioli. Zarys kroków w protokole jest przedstawiony w Rysunek 1.

Protokół

Hodowla zwierząt i eksperymenty były prowadzone zgodnie z ramami etycznymi Uniwersytetu Oksfordzkiego i na podstawie licencji projektu udzielonej przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Protokół ten został przeprowadzony na myszach w wieku od 2 do 10 tygodni, ale działał w chrząstce myszy w wieku powyżej tego wieku.

1. Pobieranie tkanek

  1. Poddaj myszy eutanazji, wypełniając pudełko zawierające myszy dwutlenkiem węgla do 80% objętości i utrzymując jego stężenie przez 5 minut. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Wypreparuj tkankę, która Cię interesuje.
    UWAGA: Poniżej znajduje się protokół preparowania kolan tylnych nóg, w tym płytek wzrostowych piszczelowych i udowych oraz chrząstki stawowej.
    1. Naciąć skórę u stopy i przeciąć do górnej części uda. Usuń skórę z linii nacięcia za pomocą kleszczy.
    2. Przytnij tkankę mięśniową i tłuszczową z nóg.
    3. Aby odłączyć nogę od ciała, przetnij czysto kość udową w górnej części biodra. Wytnij stopę u dołu kości piszczelowej.
    4. Usuń nadmiar tkanki mięśniowej i tłuszczowej pozostawionej na nodze.

2. Utrwalanie i osadzanie tkanek

UWAGA: Przez cały czas trwania protokołu należy dbać o to, aby tkanka była w ciemności, aby uniknąć utraty sygnału fluorescencyjnego.

  1. Utrwal tkankę w 10% formalinie w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
  2. Przenieść tkanki do 2,5% formaliny w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Przenieść tkanki do 30% sacharozy w wodzie destylowanej (dH2O) i delikatnie obracać w temperaturze pokojowej przez noc lub przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Napełnić probówki do góry, aby zapewnić całkowite zanurzenie tkanki podczas obracania. Po tej inkubacji tkanka opadnie na dno probówki.
  4. Umieść niewielką ilość suchego lodu w osobnym pudełku i umieść kriomold na wierzchu. Narysuj linię podłoża do krioemburgowania (SCEM) i umieść kończynę wzdłuż niej, z rzepką skierowaną w dół i rozsuwając kość piszczelową i udową, aby noga była jak najbardziej płaska. Trzymaj w miejscu za pomocą kleszczy, aż SCEM zacznie krzepnąć, a kończyna nie będzie się już poruszać, gdy nie jest przytrzymywana.
  5. Przykryj całkowicie SCEM, wypełniając formę do góry. Umieść próbkę w pojemniku na suchy lód, trzymając próbkę płasko, aby uniknąć przemieszczania się tkanki, aż do całkowitego zestalenia się SCEM.
  6. Przenieść do -20 °C.

3. Podział na sekcje

  1. Wyjmij blok z formy i przytnij do rozmiaru, który pasuje do uchwytu kriostatu. Przymocuj blok do uchwytu, nakładając SCEM na uchwyt i umieszczając blok na górze.
  2. Pozostawić do zestalenia się w kriostacie przez co najmniej 5 minut w temperaturze -20 °C.
  3. Przymocuj uchwyt do uchwytu na próbkę, a ostrze do uchwytu ostrza.
  4. Przycinaj blok, aż dojdziesz do płytki wzrostowej piszczelowej. Najlepiej przekrój z piszczelą skierowaną do góry.
  5. Przytnij taśmę kriofilmową do rozmiaru, który pasuje do próbki, z wystarczającą ilością miejsca wokół niej. Zamontuj kriofilm do powierzchni cięcia, zapewniając ścisłe przyleganie kriofilmu za pomocą narzędzia montażowego. Wytnij odcinki o grubości 40-60 μm, aby uzyskać sekcje o grubości dwukomórkowej. Zbierz taśmę za pomocą kleszczy i umieść na szkiełku, próbką do góry, a płytka wzrostu piszczeli w jednej linii z krótkim slajdem szkiełka.
  6. Przechowywać szkiełka podstawowe w temperaturze -20 °C.

4. Przygotowanie i montaż prowadnicy

  1. Rozmrozić szkiełko poziomo w temperaturze pokojowej.
  2. Myć szkiełko kroplą PBS przez 3 x 5 minut, aby usunąć SCEM.
  3. Barwienie za pomocą 10 μM DAPI przez 1 min.
  4. Myć szkiełko kroplą PBS przez 2 x 5 min.
  5. Zamontuj, przykryj szkiełkiem nakrywkowym i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego uszczelniaczem do szkiełek nakrywkowych.
  6. Zdjęcie następnego dnia.

5. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Rozdzielczość obiektywu 40x/1,4 w używanym mikroskopie konfokalnym wynosi 240 nm.

  1. Ustaw mikroskop.
    1. Włącz mikroskop i otwórz oprogramowanie. Kliknij przycisk System.
    2. Na karcie Pozyskiwanie kliknij Smart Setup, aby skonfigurować kanały. Wybierz i dodaj kanały GFP, mCherry i DAPI. Wybierz opcję Airyscan i funkcję SR8Y w trójkącie Airyscan (między rozdzielczością a prędkością multipleksu 8Y). Kliknij Najlepszy sygnał | OK (rysunek uzupełniający S1A).
    3. Na karcie Locate (Lokalizacja), w obszarze Microscope Control (Sterowanie mikroskopem), wybierz obiektyw 40x/1,4 z zanurzeniem w olejku.
  2. Zlokalizuj interesujący Cię region.
    1. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i podnieś obiektyw do góry, aż olej dotknie szkiełka nakrywkowego.
    2. Umieść płytkę wzrostową lub inny obszar zainteresowania pod ścieżką światła.
    3. W zakładce Locate kliknij Fluorescencja, wybierz DAPI i za pomocą okularu przesuń uchwyt szkiełka za pomocą joysticka, aby ustawić płytkę wzrostu lub obszar zainteresowania pod polem view.
    4. W zakładce Acquisition (Akwizycja) zacznij od wybrania tylko kanału DAPI.
    5. Kliknij Ciągły, aby wyświetlić obraz tego kanału na ekranie i upewnić się, że płytka wzrostu jest widoczna.
    6. Otwórz przeglądarkę kafelków, klikając Pokaż przeglądarkę w zakładce Kafelki. Dodaj wymaganą liczbę kafelków (zwykle 1 kafelek w kierunku x i 3-5 w kierunku y) i kliknij Podgląd i start (rysunek uzupełniający S1B).
    7. Sprawdź, czy płytki pokrywają trzy strefy spoczynku płytki wzrostu, proliferacji i przerostu. Dostosuj położenie i numer kafelka zgodnie z wymaganiami.
  3. Skonfiguruj parametry obrazowania.
    1. Kliknij Ciągłe w zakładce Akwizycja. Na karcie Kanały dostosuj Wzmocnienie (Master) i Moc lasera, aby wyraźnie zobaczyć jądra na ekranie. Poczekaj, aż detektor Airyscan Detector się wyrówna. Otwórz okno Airyscan Detector Adjustment, klikając kafelkowy symbol rozety u dołu okna; po wyrównaniu wszystkie płytki zmienią kolor na zielony (rysunek uzupełniający S1C).
    2. Wybierz indywidualnie kanały GFP i mCherry i powtórz te kroki - ustawiając wzmocnienie (Master), moc lasera i wyrównaj detektor Airyscan.
    3. Wybierz wszystkie trzy kanały i kliknij Ciągły. Poczekaj, aż detektor Airyscan Detector się wyrówna.
    4. Na karcie Tryb akwizycji zdefiniuj wartości Rozmiar obrazu, Piksel, Rozmiar, Rozmiar klatki, Szybkość i Uśrednianie. Patrz rysunek uzupełniający S1D,E, aby zapoznać się z wartościami ustawień trybu akwizycji, wzmocnienia (Master) i mocy lasera dla używanych kanałów.
  4. Pobieranie obrazów.
    1. Na karcie Pozyskiwanie kliknij pole wyboru Z-Stack
      2. .
    2. Po wybraniu tylko kanału DAPI kliknij Ciągły, aby wyświetlić obraz na ekranie. Przesuń obiektyw w dół do najbliższej płaszczyzny, która ma zostać zobrazowana. Na karcie Z-Stack kliknij Ustaw pierwszą płaszczyznę, ustaw ostrość na ostatniej płaszczyźnie, która ma być wyświetlana, a następnie kliknij Ustaw ostatnią płaszczyznę. Obraz 30-40 μm z-stacks.
    3. Ustaw interwał na 0,15 μm.
    4. Przejdź do środka stosu z. Na karcie Kafelki, w obszarze Regiony kafelków, kliknij Weryfikuj, a następnie kliknij Ustaw Z i przejdź do następnego.
    5. Na karcie Strategia koncentracji uwagi sprawdź, czy strategia koncentracji uwagi jest ustawiona na Użyj wartości Z/Powierzchnia ostrości zdefiniowana w ustawieniach kafelków.
    6. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
  5. Przetwarzanie obrazu
    1. Na karcie Przetwarzanie wybierz tryb pojedynczy lub wsadowy. Wybierz opcję Przetwarzanie Airyscan. Zaznacz opcję Przetwarzanie 3D i wybierz opcję Autofiltr standardowy. Wybierz uzyskany obraz RAW i rozpocznij przetwarzanie (rysunek uzupełniający S2A).
    2. Po zakończeniu przetwarzania Airyscan wybierz opcję Stitching (Łączenie) w metodach przetwarzania. Wybierz pozycję Nowe wyjście, Kafelki fuzji, Poprawne cieniowanie i Wszystko przez odwołanie, z odwołaniem jako DAPI. Wybierz przetworzony obraz Airyscan i rozpocznij przetwarzanie (rysunek uzupełniający S2B).
    3. Zapisz obrazy RAW i podwójnie przetworzone. Ten ostatni jest zapisywany automatycznie w trybie wsadowym.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Użyty tutaj potok analizy został dostosowany do celów tego badania. Szczegóły dotyczące operacji rurociągu przedstawiono na rysunku uzupełniającym S3.

  1. Zaimportuj plik obrazu czi do oprogramowania. Otwórz panel analizy; Z listy rozwijanej wybierz pozycję Nowy potok...
  2. Aby utworzyć potok wykrywania komórek, zaimportuj Cellpose Python Segmenter do pipeline12. Ustaw Model_Name na cyto2, Input_channel na 2, Second_channel na 3, Diameter_in_μm na 10, Flow_threshold na 0,4, a Cellprob_threshold na 0. Dodaj obiekt Importuj obiekty dokumentu (nazwa zmieniona na Importuj etykiety ręczne) przed i operatora filtru funkcji obiektu (o nazwie zmienionej na Filtr rozmiaru) po potoku, klikając pozycję + Dodaj operację. Patrz rysunek uzupełniający S3A, aby zapoznać się z wartościami ustawień rurociągu.
    1. Przenieś widza na pierwszą płaszczyznę zainteresowania
    2. Kliknij ikonę narzędzia Rysuj obiekty
    3. Kliknij ikonę trybu wielokąta
    4. Rysuj obszar do analizy
    5. Przenoszenie przeglądarki do ostatniej płaszczyzny zainteresowania
    6. Rysuj obszar do analizy
    7. Kliknij zielony haczyk Zastosuj zmiany
    8. Kliknij ikonę Pokaż tabelę obiektów
    9. Kliknij prawym przyciskiem myszy utworzony obiekt i wybierz polecenie Zmień nazwę obiektu, aby zmienić nazwę obiektu na odpowiednią nazwę. Kliknij prawym przyciskiem myszy utworzony obiekt i kliknij Dodaj tag. Dodaj tag o nazwie Analysis Region (Region analizy).
  3. Uruchom ten potok, klikając niebieską strzałkę do przodu w górnej części panelu Analiza.
  4. Aby utworzyć pierwotny rurociąg wykrywania rzęsek i centrioli, otwórz panel analizy, z listy rozwijanej wybierz Nowy rurociąg.... Dodaj następujące operatory do potoku: Importuj obiekty dokumentu (nazwa została zmieniona na Importuj etykiety ręczne), dwa operatory segmentera progu intensywności (nazwa została zmieniona na Próg rzęsek i Próg centrioli), Dzielenie (nazwa została zmieniona na Podział centrioli), Filtr cech obiektu (nazwa została zmieniona na Filtr rozmiaru podziału centrioli) i Przedział (zmieniono nazwę na Przedział - Komórka). Zobacz rysunek uzupełniający S3B, aby zapoznać się z wartościami ustawień rurociągu.
  5. Uruchom ten potok, klikając niebieską strzałkę do przodu w górnej części panelu Analiza.
  6. Otwórz okno Obiekty. Kliknij Im/Export..., wybierz Eksport Excela.... Wybierz następujące funkcje, aby zapisać: # Dzieci, Nazwa, Nazwy nadrzędne, Granice zorientowane na 3D Krótki bok, Środkowy bok, Długi bok, Kąt XY, Kąt XZ, Kąt YZ, Granica X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, RozmiarX, RozmiarY, RozmiarZ, Środek geometrii X, Y, Z, Pierwsza płaszczyzna, Ostatnia, Liczba, Kulistość (siatka), Objętość (Siatka), Pole powierzchni (Siatka).

Wyniki

Płytkę wzrostu 6-tygodniowej myszy obrazowano zgodnie z opisanym protokołem, a następnie zmapowano organizację rzęsek pierwotnych w tkance. Przechwycono obraz wszystkich trzech regionów płytki wzrostu – spoczynkowego, proliferacyjnego i hypertroficznego – i poddano go analizie w ramach opracowanego schematu (Rysunek 2A). Poszczególne komórki można zidentyfikować dzięki barwieniu DAPI, przy czym aksonema rzęsek jest zaznaczona na czerwono, a centriole na zielono. Rozdzielczość uzyskana tą metodą jest wystarczająco wysoka, aby odróżnić poszczególne centriole (Rysunek 2B). Przy tej rozdzielczości rzęski można wizualizować w ich trójwymiarowym środowisku, skierowane w różnych kierunkach (Wideo 1).

Można również rejestrować obrazy o niższej rozdzielczości, stosując obiektywy o większym powiększeniu, aby zwizualizować rzęski pierwotne w szerszym obszarze tkanki; nie nadają się one jednak do analizy orientacji rzęsek w 3D. Na przykład rzęski pierwotne w chrząstce stawowej obrazowano za pomocą obiektywu 20x, co wykazało, że metoda ta działa również w przypadku innych tkanek (Rysunek 2C). Przy tej rozdzielczości można zidentyfikować aksonemy rzęsek w kolorze czerwonym, natomiast centriola są trudniejsze do rozróżnienia. Kość podchrzestna wykazuje tendencję do silnego tła sygnału GFP, co utrudnia identyfikację centrioli w tej tkance.

Potok przetwarzania pozwala na wykrywanie poszczególnych komórek, rzęsek pierwotnych oraz centrioli i sprawdza się zarówno w przypadku wysoko zorganizowanych młodych chrząstek wzrostu, jak i starszych chrząstek wzrostu, w których kolumny są mniej wyraźnie zdefiniowane, na przykład u 10-tygodniowych myszy (Rycina 3). Komórki i rzęski są wykrywane w 3D, co można zaobserwować w całym stosie obrazów w osi z.

Schemat procesu przetwarzania tkanek: pobieranie, fiksacja, krojenie, obrazowanie mikroskopowe, analiza; diagram.
Rycina 1: Schemat eksperymentalny. Schemat blokowy poszczególnych etapów protokołu, od pobrania tkanki do analizy obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające rozmieszczenie jąder komórkowych i analizę ekspresji białek.
Rysunek 2: Cilia pierwotne w tkankach mysich myszy ARL13B-CENTRIN-2. (A) Płytka wzrostu 6-tygodniowej myszy; DAPI w kolorze białym, CENTRIN-2 w kolorze zielonym, a ARL13B w kolorze czerwonym, obrazowanie przy użyciu obiektywu 40x. (B) Powiększenie pojedynczej cilii pierwotnej i dwóch centrismów. (C) Chrząstka stawowa i kość podchrzestna 4-tygodniowej myszy, obrazowanie przy użyciu obiektywu 20x. (D) Nerka 6-tygodniowej myszy, obrazowana z wykorzystaniem tej samej procedury co w przypadku tkanki mięśniowo-szkieletowej. (E) Powiększenie białej ramki z rysunku D, przedstawiające pojedyncze cilia pierwotne i ich centrismy w nerce. Paski skali = 20 µm (A,D), 4 µm (B), 60 µm (C), 6 µm (E). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat detekcji komórek i rzęsek; wyniki mikroskopowe segmentacji komórek i analizy orientacji rzęsek.
Rysunek 3: Procedura detekcji komórek i rzęsek. Przykład zastosowania procedury analizy obrazu na płytce wzrostowej 10-tygodniowego osobnika. (A) Obraz otwarty w oprogramowaniu. (B) Wynik procedury detekcji komórek. (C) Wynik procedury detekcji rzęsek i centrioli. Rzęski są zaznaczone na różowo, a centriole na zielono. Widok z boku pokazuje, że rozdzielczość jest wystarczająco wysoka, aby odróżnić rzęski zorientowane w różnych kierunkach w 3D. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wideo 1: Trójwymiarowa rekonstrukcja płytki wzrostu 6-tygodniowej myszy ARL13B-CENTRIN-2. Rekonstrukcja trójwymiarowa została wykonana w oprogramowaniu Imaris i zapisana w formie filmu animowanego. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Rycina dodatkowa S1: Ustawienia akwizycji obrazu w systemie mikroskopowym. (A) Okno Smart Setup służące do dodawania kanałów i wyboru trybu Airyscan. (B) Przeglądarka kafelków (Tile viewer) do wyboru i podglądu obszarów do obrazowania. (C) Okno Airyscan Detector Adjustment, w którym potwierdzane jest wyrównanie detektorów Airyscan po zmianie koloru wszystkich kafelków na zielony. (D) Ustawienia laserów dla trzech kanałów. (E) Tryb akwizycji (Acquisition Mode) i ustawienia stosu Z (Z-Stack). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa S2: Ustawienia przetwarzania obrazu w systemie mikroskopowym. (A) Ustawienia przetwarzania Airyscan. (B) Ustawienia szycia obrazów (stitching). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S3: Niestandardowe potoki analizy obrazu. (A) Potok detekcji komórek z wykorzystaniem kanałów GFP i DAPI. (B) Potok detekcji rzęsek pierwotnych i centrioli z wykorzystaniem odpowiednio kanałów mCherry i GFP. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym protokole konieczne jest przystąpienie do etapów przetwarzania i osadzania tkanek natychmiast po pobraniu. Bloki i szkiełka tkanki mogą być jednak przechowywane przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze -20 °C. Kilka kroków w tym protokole można zmodyfikować w celu dopasowania do różnych zastosowań, w szczególności grubości przekroju, powiększenia i parametrów stosu z. Będzie to miało wpływ na głębię obrazowania i uzyskaną rozdzielczość. Zmiany w trybie przysłony numerycznej i rozdzielczości można było wykorzystać do uzyskania jeszcze wyższej rozdzielczości i zmniejszenia rozmiaru interwału z-stacks. Wydłużyłoby to jednak czas obrazowania lub zmniejszyłoby rozmiar pola widzenia, które można zobrazować. Opisane parametry obrazowania są minimalnymi wymaganiami określonymi dla analizy 3D pierwotnej orientacji rzęsek.

Wybór medium montażowego jest ważny dla uzyskania wysokiej rozdzielczości. Współczynnik załamania światła medium montażowego musi być podobny do współczynnika zanurzeniowego, aby zminimalizować degradację obrazu w kominacie z. Współczynnik załamania światła mocowanego i zastosowanego tutaj olejku immersyjnego ma współczynniki załamania światła wynoszące odpowiednio 1,52 i 1,518. Zastosowana tutaj funkcja Airyscan w mikroskopie konfokalnym zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości. Można użyć innych mikroskopów o wysokiej rozdzielczości; Okazało się jednak, że sam tryb konfokalny nie był wystarczający do uzyskania rozdzielczości wymaganej dla rozmiaru obrazowanych obszarów. Maksymalna rozdzielczość trybu Multiplex SR-8Y Airyscan wynosi 120/160 nm w x/y i 450 nm w z, a maksymalna liczba klatek/s 47,5. Stwierdziliśmy, że tryb Multiplex SR-4Y Airyscan, który prezentuje maksymalną rozdzielczość 140 nm w x/y i 450 nm w z, ale obrazy o połowę szybciej z maksymalną liczbą klatek na sekundę wynoszącą 25, nie przedstawia znaczącej różnicy w obrazowaniu rzęsek pierwotnych w 3D. Podobnie tryb super-resolution (SR) Airyscan, który oferuje najwyższą rozdzielczość w tym mikroskopie - 120 nm w x/y i 350 nm w z - zajmie więcej czasu, ponieważ jego maksymalna liczba klatek/s wynosi 4,713.

Sygnał tła GFP można zaobserwować w innych tkankach, takich jak mięśnie. Aby to zminimalizować, zakres laserów można zawęzić, aby zmniejszyć nakładanie się na inne długości fal. Linia ta była wcześniej używana do obrazowania rzęsek pierwotnych w zarodku, pierwotnych kultur komórkowych, włókien mięśniowych i nabłonka barwnikowego siatkówki 9,14,15. Udało nam się zobrazować rzęski pierwotne w nerkach, chrząstkach i tkance kostnej. Prawdopodobnie konieczna będzie pewna optymalizacja ustawień obrazowania dla różnych tkanek; Jednak ten protokół kriosekcji powinien zapewnić zachowanie sygnału.

Dwukomórkowe grube skrawki (40-60 μm) są wystarczające do uzyskania informacji o orientacji 3D na płytce wzrostowej, ponieważ umożliwia to obrazowanie całych komórek i ich rzęsek pierwotnych. W przypadku innych tkanek, w których komórki są większe niż chondrocyty, takich jak adipocyty, do zebrania danych dotyczących populacji komórek mogą być wymagane grubsze sekcje. W zależności od rozdzielczości głębi użytego mikroskopu, obrazowanie głęboko w grubszych sekcjach może nie być możliwe. Techniki oczyszczania tkanek prawdopodobnie doprowadziłyby do utraty endogennego sygnału mCherry i GFP ze względu na wymagany czas. Zbadano to, ponieważ metody oczyszczania były stosowane do innych metod obrazowania kończyny, ale w tym kontekście nie uznano tego za konieczne. Nasze doświadczenie z endogennym CD31-RFP sugerowało, że techniki oczyszczania wymagałyby starannej, dostosowanej do próbki optymalizacji.

Ta linia ARL13B-CENTRIN-2 może być krzyżowana z innymi liniami myszy w celu dalszego badania organizacji rzęsek pierwotnych w tkankach. Na przykład skrzyżowano je z agrekanem-Cre IFT88fl/fl, aby warunkowo wyeliminować IFT88, pierwotne białko rzęsek, którego delecja zapobiega rzęskom, w komórkach wykazujących ekspresję agrekanów (chondrocyty poporodowe)5,6. Te sygnały fluorescencyjne ARL13B i CENTRIN-2 mogą być następnie wykorzystane do pomiaru skuteczności zaburzeń genetycznych na poziomie struktury rzęskowej w tkankach i wszelkich związanych z nimi zmian w organizacji rzęsek. Obecnie trwają prace, które właśnie to robią. Naszym pierwszym celem będzie ilościowe określenie, za pomocą tej bardziej solidnej metodologii, wpływu delecji IFT88 na częstość występowania rzęsek. Wcześniej mierzyliśmy to za pomocą immunofluorescencji i oszacowaliśmy, że jest to redukcja o 20%6. Metodę tę można również połączyć z immunohistochemią w celu zobrazowania rzęsek pierwotnych w połączeniu z innymi białkami, na przykład białkiem błony komórkowej.

Transgen na ARL13B może mieć wpływ na ekspresję ARL13B i długość rzęsek pierwotnych. Wcześniejsze badania mierzyły różne długości rzęsek pierwszorzędowych za pomocą linii ARL13B-CENTRIN-2 w porównaniu z nietransgenowym ARL13B w niektórych regionach mózgu myszy, bez różnicy w innych16. W innym badaniu zaobserwowano różnice w długości rzęsek pierwotnych w linii myszy ARL13B znakowanej GFP w porównaniu z nieoznakowanym ARL13B w mysich fibroblastach embrionalnych10. Trwające prace mają na celu weryfikację wszelkich zmian w długości rzęsek pierwotnych w płytce wzrostowej i innych tkankach poprzez porównanie wyników przy użyciu mysiej linii ARL13B-CENTRIN-2 z barwieniem przeciwciałami przeciwko nietransgenicznemu ARL13B.

Potok analizy obrazu w tym protokole został zaprojektowany w celu późniejszego pomiaru procentu rzęsek, długości i orientacji 3D rzęsek pierwotnych, a także liczby centrioli i położenia w płytce wzrostowej. Oprogramowanie do analizy obrazu pozwala na tworzenie niestandardowych potoków poprzez zmianę odpowiednich kroków. Danymi wyjściowymi tego potoku jest arkusz kalkulacyjny z pomiarami wybranych cech wykrytych komórek, rzęsek i centrioli. Postanaliza może być następnie przeprowadzona w R lub innym oprogramowaniu zgodnie z celami badania. Podobnie jak w przypadku ustawień obrazowania, kroki potoku i określone ustawienia można zmienić, aby pracować na różnych obrazach i zgodnie z celami badania. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta pozwala na wysokoprzepustową analizę rzęsek pierwotnych niż została wcześniej opublikowana na płytce wzrostowej. Liczba komórek i związanych z nimi rzęsek, które można badać, pozwala na większe i bardziej wiarygodne pomiary.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom personelu BSU w Instytucie Reumatologii im. Kennedy'ego, szczególnie Albertino Bonifacio, za hodowlę zwierząt. Dziękujemy Centrum Doskonałości Obrazowania Biomedycznego Oxford-ZEISS za pomoc w korzystaniu z mikroskopu, a w szczególności dr Jacky (Ka Long) Ko za pomoc w opracowaniu linii analizy obrazu. Prace te były wspierane przez stypendium Kennedy Trust of Rheumatology Research (Johnson) oraz Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC, BB/X007049/1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe 22 x 50 mm fisherscientific 
oprogramowanie arivis Vision4DZeissN/AOprogramowanie do analizy obrazu 
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy ZeissZeiss 980 Airyscan 2
CoverGrip Uszczelniacz do szkiełek nakrywkowych Biot 23005
Kriofilm typ 3C(16UF) (typ arkusza) Szerokość 2,0 cmSection-labC-FUF303Do zakupu bezpośrednio w Section-lab
CryostatLeica CM1900 UV
DAPIinvitrogenD1306
Jednorazowe formy bazowe epredia58952
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbeccogibco14190
FormalinaSigma20260630
Imaris software Instrumenty Oksfordzkie N/AOprogramowanie do analizy obrazu do rekonstrukcji 3D 
Olejek immersyjny 518FZeissISO 8036 
Ostrza MicrotomeFeather02.075.00.006
Szkło SlowFade Antifade Mountant invitrogenS36917
SacharozaSigmaS9378
Super Cryoembedding Medium (SCEM)Section-labC-EM001Do zakupu bezpośrednio w Section-lab
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plusavantor631-0108
Oprogramowanie ZenZeissN/A Darmoweoprogramowanie do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej
12373128

Bibliografia

  1. Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. Expression of primary cilia in mammalian cells. Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).
  2. Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon. J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).
  3. McGlashan, S. R., et al. Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length. Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).
  4. Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space. Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).
  5. Coveney, C. R., et al. The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis. Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).
  6. Coveney, C. R., et al. Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces. J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).
  7. Andrea, C. E. D., et al. Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma. Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).
  8. Ascenzi, M. -G., et al. Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization. J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).
  9. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).
  10. Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins. Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).
  11. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).
  12. arivis. Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D. , 1-20 (2021).
  13. Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes. Nat Methods. , (2019).
  14. Ning, K., et al. Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium. Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).
  15. Palla, A. R., et al. Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging. Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).
  16. Brewer, K. K., et al. Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain. Cells. 13 (3), 259-277 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie rz sek pierwotnychmyszy ARL13B CENTRIN 2mikroskopia konfokalnaanaliza p ytki wzrostutr jwymiarowa analiza obrazuorientacja rz sekznakowanie bia kami fluorescencyjnymiobrazowanie w stosie Z Z stack
Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.