Artykuł metodologiczny

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

DOI:

10.3791/67695

⸱

14 lutego 2025

 ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Inserm, Institut Cochin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki swojej niezwykłej zdolności do generowania zarówno ektodermalnych, jak i mezenchymalnych pochodnych, czaszkowe komórki grzebienia nerwowego (CNCC) wzbudziły duże zainteresowanie badaniem mechanizmów regulujących decyzje dotyczące losu komórek i plastyczności. Ta populacja komórek, pochodząca z nabłonka nerwowego grzbietowego, jest przejściowa i stosunkowo rzadka w rozwijającym się zarodku, co sprawia, że testy funkcjonalne, badania przesiewowe genomu i testy biochemiczne są trudne do wykonania in vivo. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano kilka metod modelowania rozwoju CNCC in vitro. Metody hodowli oparte na neurosferze (NS) zapewniają złożone mikrośrodowisko, które podsumowuje rozwijający się przedni nabłonek nerwowy w 3D. Systemy te pozwalają na wzrost wielu NS na tej samej płytce w celu wygenerowania dużej ilości CNCC, ale wyprodukowane NS wykazują dużą zmienność kształtu, rozmiaru i liczby uformowanych CNCC, co utrudnia przeprowadzanie testów ilościowych. Protokół ten przedstawia powtarzalną metodę wytwarzania NS z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) w formacie 96-dołkowym. NS generowane w 96-dołkowych płytkach wytwarzają komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC), które można dalej hodować. Kontrolując liczbę komórek wyjściowych, podejście to zmniejsza zmienność rozmiaru i kształtu między NS i zwiększa odtwarzalność między eksperymentami. Wreszcie, ten system hodowli można dostosować do kilku zastosowań i oferuje wyższy stopień elastyczności, dzięki czemu jest wysoce konfigurowalny i nadaje się do multipleksowania warunków eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) to populacja komórek macierzystych, która powstaje w najbardziej przedniej części rozwijającego się zarodka, na granicy między płytką nerwową a powierzchnią ektodermy1. Następnie CNCC przechodzą przejście od nabłonka do mezenchymalnego (EMT), rozwarstwiają się od nabłonka nerwowego i migrują grzbietowo-brzusznie w kierunku różnych miejsc w zarodku, gdzie różnicują się w wiele różnych typów komórek2. Badanie tej populacji komórek jest bardzo interesujące, ponieważ posiada ona niezwykłą plastyczność3 oraz unikalną zdolność różnicowania się zarówno na pochodne ektodermalne, jak i mezenchymalne, takie jak kości twarzoczaszki i chrząstki4. Chociaż CNCC są stosunkowo dostępne w zarodku, są populacją przejściową z małą liczbą komórek, co utrudnia przeprowadzenie ogólnoustrojowych badań mechanistycznych in vivo. Linie komórkowe CNCC zostały wyizolowane i scharakteryzowane w ciągu ostatnich kilku lat, aby przezwyciężyć te ograniczenia. W szczególności linia komórkowa CNCC O9-1 jest doskonałym narzędziem do badania migracyjnego i pomigracyjnego rozwoju grzebienia nerwowego5,6; Jednak ta linia komórkowa nie pozwala na badanie wczesnych zdarzeń przed migracją prowadzącą do indukcji i specyfikacji grzebienia nerwowego. W związku z tym poczyniono znaczące postępy w opracowywaniu protokołów różnicowania in vitro w celu różnicowania CNCC w naczyniu poprzez zastosowanie struktur 3D przypominających rozwijający się nabłonek nerwowy zwanych neurosferami (NS)7,8- uzyskana po różnicowaniu kolonii embrionalnych komórek macierzystych (ESC). Te protokoły 3D solidnie generują dużą liczbę CNCC, umożliwiając prowadzenie biochemicznych i genomicznych badań mechanistycznych9,10. NS są hodowane na płytkach o niskim przyczepie w pożywce uzupełnionej N2B27, razem z czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF) i naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF)10,11 w celu stymulowania proliferacji komórek. Protokoły te są przeprowadzane na szalkach Petriego, hodując wiele NS na tej samej płytce. W rosnącym NS komórki agregują się i kontynuują podział - osiągając średnicę 100-200 μm po osiągnięciu dojrzałości. W okresie dojrzałości (około 5 dnia) NS przyczepiają się do podłoża i różnicują się w CNCC przypominające ich odpowiedniki in vivo9,12. Te CNCC są następnie poddawane EMT i rozwarstwiają się na powierzchni płyty. Różnice morfologiczne można zaobserwować w zależności od wielkości NS, ponieważ większe kule będą wydawać się ciemniejsze w jądrze ze względu na mniejszą dostępność składników odżywczych i tlenu, co prowadzi do apoptozy komórek 13. Chociaż ten rodzaj procedury generuje dużą liczbę CNCC w punkcie końcowym różnicowania, ma kilka ograniczeń, co sprawia, że badanie różnych dynamik molekularnych zachodzących podczas procesu różnicowania jest prawie niemożliwe. Po pierwsze, użycie kolonii ESC - które różnią się wielkością - utrudnia kontrolowanie początkowej liczby komórek w każdym eksperymencie. Powoduje to generowanie NS o różnych kształtach i średnicach, które rozwijają się w różny sposób poprzez aktywację określonych szlaków sygnałowych, co prowadzi do zmiany różnicowania komórek, a tym samym nie tworzy jednolitej próbki w danym punkcie czasowym. Po drugie, hodowla wielu NS na tej samej płytce często prowadzi do ich łączenia się ze sobą14 i potencjalnego uwalniania cząsteczek sygnałowych, które wpływają na mikrośrodowisko ich sąsiadów, a tym samym na ich rozwój. Ogólnie rzecz biorąc, procedury te generują dużą zmienność między próbkami i eksperymentami.

Tutaj przedstawiamy strategię przezwyciężenia tych trudności, które generują pojedynczy NS - zdolny do produkcji CNCC - poprzez agregację mysich ESC (mESC) na 96-dołkowych płytkach bez TC z dnem U. Rozpoczęcie od mESC pozwala na zbadanie procesu specyfikacji i wczesnych etapów rozwoju CNCC w porównaniu z rozpoczęciem od już ustalonych linii komórkowych grzebienia nerwowego. Protokół ten rozpoczyna się od dezagregacji kolonii mESC w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie wysiewu określonej liczby mESC w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem U, która nie została poddana działaniu TC. Komórki pozostawia się do agregacji na dwa dni, a następnie przenosi się na 96-dołkową płytkę płaskodenną bez TC, w której NS będzie mógł przymocować się do dna płytki. Kontrolując początkową liczbę komórek i mikrośrodowisko każdego NS podczas procesu różnicowania, protokół ten zmniejsza zmienność próbki, co zwiększa odtwarzalność eksperymentalną. Wierzymy, że będzie to wygodna platforma do projektowania eksperymentów multipleksowych, takich jak testowanie wpływu różnych warunków hodowli lub wykonywanie badań przesiewowych zaburzeń genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie zawiesiny pojedynczej komórki z mysich kolonii ESC

UWAGA: Ten protokół jest przystosowany do stosowania CK35 mESC (linia mESC kompetentna do transmisji linii zarodkowej, aby mieć możliwość rozwijania modeli in vivo15) hodowanych na inaktywowanych karmnikach na pokrytej żelatyną płytce 6-dołkowej poddanej działaniu TC. Jedna studzienka z 6-dołkowej płytki poddanej działaniu TC powinna dać około 1,5 × 106 mESC, co jest wystarczające dla pozostałej części protokołu. W razie potrzeby można to zwiększyć. Dostosuj początkowe kroki zgodnie z wybranym szczepem ESC i metodą hodowli podtrzymującej, a także odpowiednią pożywką hodowlaną. Protokół ten ma być wykonywany w sterylnych warunkach. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

  1. Zacznij od mESC przy zbiegu 70%-80% wyhodowanym na pożywce hodowlanej mESC. W Tabeli 1 przedstawiono skład pożywki hodowlanej mESC użytej w tym badaniu.
    UWAGA: Nie pozwól, aby mESC rosły powyżej 80% konfluencji, ponieważ zaczną się różnicować, a to wpłynie na proces agregacji. Kolonie muszą być zwarte i wykazywać zdrową morfologię (brak pęknięć i fal, wyraźny kontrast jądrowo-cytoplazmowy).
  2. Przygotować pożywkę różnicującą CNCC. Patrz Tabela 1 dla składu pożywki różnicującej CNCC.
    UWAGA: Po dodaniu czynników wzrostu pożywkę można przechowywać do 3 tygodni w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że podłoże jest chronione przed światłem.
  3. Przygotować świeży roztwór kolagenazy o stężeniu 2 mg/ml w pożywce DMEM-Knockout.
    UWAGA: Użycie kolagenazy zapewnia, że odłączone zostaną tylko kolonie, a nie karmniki, ponieważ ich obecność w kolejnych krokach będzie zakłócać agregację NS. Przed użyciem przefiltrować roztwór kolagenazy za pomocą filtra 0,22 μm.
  4. Odessać pożywkę ESC z mESC.
  5. Delikatnie dodaj 1 ml PBS na bok studzienki. Delikatnie kołysz talerzem, aby zapewnić równomierne mycie.
  6. Usuń PBS i zastąp 2 ml roztworu kolagenazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-45 min.
    1. Sprawdź płytkę pod mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu po pierwszych 20 minutach, a następnie co 5 minut.
    2. Kiedy kolonie mają zwinięte krawędzie, mocno postukaj w bok talerza, a kolonie się oderwą.
  7. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml zbierz kolonie i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Sprawdź płytkę pod mikroskopem świetlnym pod kątem resztek kolonii. Można je zbierać za pomocą prania PBS.
  8. Odwirować kolonie w stężeniu 16 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Odessać jak najwięcej pożywki ze stożkowej rurki, uważając, aby nie naruszyć kolonii na dnie probówki.
  10. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  11. Oddziel kolonie w probówce, energicznie pipetując w górę i w dół, najpierw za pomocą mikropipety p1000, a następnie mikropipety p200.
    UWAGA: Zapewnia to uzyskanie zawiesiny jednokomórkowej.
  12. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej mESC w celu zablokowania trypsyny i odwirować przy 160 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki różnicującej CNCC.
  13. Policz komórki za pomocą automatycznego urządzenia do liczenia komórek lub znormalizowanego systemu pod mikroskopem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. Po zliczeniu rozcieńczyć odpowiednią ilością pożywki różnicującej CNCC, aby uzyskać stężenie 3000 żywych komórek na 50 μl.
  15. Za pomocą mikropipety p200 rozsiać 50 μl zawiesiny komórek w każdym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, która nie została poddana działaniu TC, a następnie uzupełnić dołek do 200 μl pożywką różnicującą CNCC.
    UWAGA: Podczas napełniania płytki należy od czasu do czasu ponownie zawiesić zawiesinę jednokomórkową za pomocą mikropipety p1000 w celu uzyskania jednorodnego stężenia.
  16. Inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Przenoszenie do płaskiej płytki 96-dołkowej w celu rozróżnienia CNCC

  1. Następnego dnia (dzień 1) obserwuj płytkę pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że na dnie każdej studzienki widoczny jest jeden mały klaster komórek z wyraźnymi obwódkami. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na noc.
    UWAGA: Wokół głównego agregatu mogą znajdować się komórki, niektóre martwe. Nie będzie to kolidować z agregacją NS.
  2. W dniu 2 powoli usuń 100 μl pożywki z każdej studzienki.
    1. Podczas zasysania pożywki należy uważać, aby nie wyjąć NS. Aby tego uniknąć, umieść końcówkę pipety blisko powierzchni i daleko od dna.
  3. Odetnij końcówkę mikropipety p200 w odległości około 3-4 mm od końcówki. Użyj tego, aby zassać NS z pozostałym podłożem.
    UWAGA: Aby ułatwić nabieranie NS, przed zasysaniem delikatnie pipetuj w górę i w dół kilka razy.
  4. Przenieść NS i pozostałą pożywkę na 96-dołkową płytkę płaskodenną bez TC i sprawdzić transfer pod mikroskopem świetlnym, a następnie przykryć każdą nową studzienkę 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego CNCC. Pozostawić NS w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do 4 dnia.
  5. W 4 dniu usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić ją 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej CNCC.
    UWAGA: Aby uniknąć zakłócania mocowania NS na spodzie płytki, powoli zasysaj i wymieniaj pożywkę.
  6. W dniach 5 i 6 sprawdź nasadkę NS pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że jaśniejsze komórki - rozwarstwiające się od NS - zaczynają otaczać główny korpus NS.
  7. W dniu 7 należy zmienić podłoże zgodnie z opisem w punkcie 2.5. Zmieniaj pożywkę, stosując tę samą procedurę co 2 dni, aż do punktu końcowego badania.

3. Przekazywanie i konserwacja CNCC

UWAGA: Przejście CNCC można przeprowadzić, gdy tylko wokół NS widoczna jest wystarczająca ilość komórek. Może to nastąpić już w 7 dniu, ponieważ wcześniejsze punkty czasowe nie zapewniają wystarczającej ilości CNCC.

  1. Przygotuj pożywkę konserwacyjną CNCC. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem pożywki konserwacyjnej CNCC.
    1. Przed dodaniem go do pożywki przefiltruj BSA po rozludnieniu przez filtr 0,22 μm. Po dodaniu czynników wzrostu należy przechowywać podłoże do 3 tygodni w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że podłoże jest chronione przed światłem.
  2. Przygotować fibronektynę w stężeniu 7,5 μg/ml w PBS. Mieszaj energicznie.
  3. Pokryj dołki 96-dołkowej płytki niepoddanej działaniu TC, dodając 100 μl roztworu fibronektyny na studzienkę. Pozostaw płaszcz pod maską na 30 minut w RT.
    UWAGA: Jeśli CNCC są przeznaczone do barwienia immunofluorescencyjnego, przed powlekaniem umieść sterylne szklane szkiełko nakrywkowe na dnie studzienki. Upewnij się, że szkiełko pozostaje na dnie studni i nie unosi się na wodzie, aby uniknąć pokrycia przeciwnej strony niż ta, która będzie używana. Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcji 5 dotyczącymi mocowania i montażu CNCC.
  4. W międzyczasie, na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem, która nie została poddana działaniu TC, należy odessać jak najwięcej pożywki różnicującej CNCC z dołków i zastąpić ją akutazą o stężeniu 50 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  5. Po inkubacji dodać 100 μl pożywki konserwacyjnej CNCC na studzienkę, aby ugasić akutazę. Usuń fibronektynę z dołków 96-dołkowej płytki przyjmującej, która nie została poddana działaniu TC z płaskim dnem. Przefiltrować odłączony CNCC po migracji, przepuszczając go przez filtr 40 μm na górze studzienki 96-dołkowej płytki odbiorczej z płaskim dnem niepoddanej działaniu TC.
    UWAGA: Spowoduje to odfiltrowanie grudek komórek lub pozostałych NS, które nie zostały wcześniej usunięte. CNCC wyhodowane w tych samych warunkach można zebrać w jednej probówce o pojemności 50 ml, a następnie wysiać w tym samym dołku na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu TC. W takim przypadku pokryj studzienkę 1 ml fibronektyny i użyj 1 ml pożywki konserwacyjnej CNCC do ugaszenia akutazy.
  6. Pozostawić pomigracyjny CNCC na 15-30 minut w temperaturze 37 °C. Wyrzucić pożywkę i zastąpić 100 μl pożywki konserwacyjnej CNCC. Zmieniaj podłoże co 2 dni.
    UWAGA: Delikatnie dodaj pożywkę, ponieważ szybki przepływ indukuje różnicowanie CNCC w pochodne neuronalne. Jeśli pracujesz w formacie 6-dołkowym, użyj 1 ml pożywki konserwacyjnej CNCC.

4. Utrwalanie i montowanie NS dla immunofluorescencji

  1. W żądanym momencie przenieś NS z 96-dołkowej płytki z płaskim dnem bez TC do probówki o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 2 ml, przecinając końcówkę mikropipety p200 i delikatnie pipetując w górę iw dół, aby pobrać NS.
    UWAGA: W późniejszych punktach czasowych (od 7 dnia) NS będzie wystarczająco duży, aby był widoczny gołym okiem, ale także będzie trudniejszy do oderwania.
  2. Pozwól NS osiąść w probówce przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usuń jak najwięcej pożywki i spłucz 1 ml zimnego PBS.
    UWAGA: W przypadku przenoszenia małych NS z wczesnych punktów czasowych (przed 3-4 dniem), wiruj z prędkością 16 × g przez 3 minuty, aby upewnić się, że NS osiądzie na dnie.
  3. Usuń PBS i w kapturze chemicznym zastąp 2 ml 4% PFA w PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Po dodaniu 4% roztworu PFA powoli odwróć probówkę i pozwól jej odpocząć podczas utrwalania z boku. Celem jest lekkie rozłożenie NS, aby nie sklejały się ze sobą na tym etapie.
  4. Usuń 4% roztwór PFA (z okapu chemicznego) i przemyj NS 1 ml zimnego PBS/0,5% Tween20. Pozwól mu osiąść w RT przez 3 minuty. Powtórz to w sumie 3 razy.
    UWAGA: NS osiądzie na dole.
  5. Usuń PBS/0,5% Tween20 i dodaj 2 ml PBS/0,1% Triton X-100. Odwróć rurkę i pozwól jej opocząć na boku. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj NS 3 razy w zimnym PBS/0,5% Tween20, jak wskazano w kroku 4.4.
  7. Usunąć PBS/0,5% Tween20 i zablokować 2% BSA w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę, najlepiej przez noc.
    UWAGA: Próbki można przechowywać w 2% BSA/PBS przez okres do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.
  8. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, dodając odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego do 2% masy ciała/PBS w końcowej objętości 500 μl. Aby zapoznać się z pierwszorzędową mieszanką przeciwciał użytą w tym badaniu, patrz Tabela 2.
  9. Usuń jak najwięcej roztworu blokującego i przenieś NS do probówki o pojemności 0,5 ml, przecinając końcówkę mikropipety p200.
  10. Dodać roztwór przeciwciała pierwotnego i powoli pipetować w górę iw dół, aby ponownie zawiesić NS. Inkubować przez noc na rotatorze w temperaturze 4 °C.
  11. Umyj NS 3 razy w zimnym PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając wybrane przeciwciała drugorzędowe w 2% BSA/PBS i dodając 1/1000 DAPI. Aby zapoznać się z drugorzędową mieszanką przeciwciał użytą w tym badaniu, patrz Tabela 2.
    UWAGA: Utrzymuj rurki przed światłem.
  13. Zastąp PBS 500 μl wtórnego roztworu przeciwciał i owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Inkubować przez 1 godzinę na rotatorze w temperaturze pokojowej.
  14. Umyj NS 3 razy w zimnym PBS, jak wskazano w kroku 4.11.
  15. Usuń jak najwięcej PBS bez zasysania NS, zastąp 50 μl środka czyszczącego i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  16. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  17. Przygotuj komory montażowe.
    1. Na szkiełku mikroskopowym umieść trzy warstwy taśmy dwustronnej. Użyj przezroczystej, bezwłóknistej taśmy, aby uniknąć pozostałości w komorze montażowej.
    2. Za pomocą brzytwy wytnij okienko 3 mm × 8 mm w podwójnej taśmie.
      UWAGA: Wymiary komory zależą od punktu czasowego próbki. Ten przykład nadaje się do przechowywania 50 μl podłoża montażowego, co jest optymalne dla 10-20 pojedynczych NS w późniejszych punktach czasowych (dni 7-9).
  18. Pod stereoskopem ostrożnie przenieś NS w środku czyszczącym do komory montażowej, przecinając końcówkę mikropipety p200 o niskiej przyczepności. Użyj powiększenia od 2x do 4x, aby zapewnić pole widzenia całej komory i wystarczające powiększenie do zidentyfikowania NS. Jeśli stereoskop jest przystosowany do obrazowania fluorescencyjnego, praca z niebieskim filtrem fluorescencyjnym ułatwi identyfikację NS, ponieważ barwienie DAPI sprawi, że przezroczysty NS będzie się wyróżniał.
    UWAGA: Sprawdź, czy podłoże tworzy lekko wypukły menisk nad komorą. Zapewni to, że w komorze nie będzie pęcherzyków.
  19. Umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni i lekko dociśnij jego boki, aby przylegało. Wykonaj ten krok pod stereoskopem i sprawdź, czy NS nie są wypchnięte na zewnątrz komory.
  20. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania zdjęcia.

5. Utrwalanie i montaż CNCC do immunofluorescencji

  1. Usuń pożywkę konserwacyjną CNCC ze studzienek i umyj je PBS. Delikatnie dodać PBS, pipetując z boku studzienki.
  2. Kontynuuj utrwalanie, przepuszczalność i barwienie zgodnie z opisem w krokach 4.3-4.14.
  3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym, dodając do szkiełka podłoże montażowe, chwytając i obracając szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety tak, aby pomigracyjne CNCC skierowało się w stronę szkiełka podstawowego, a następnie umieszczając je na kropli.
    1. Opcjonalnie: Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci lub innymi powszechnie stosowanymi systemami uszczelniającymi.
  4. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu wykonania zdjęcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, kolonie mESC zostały rozdzielone, a 3000 komórek zostało wysianych na 96-dołkowych płytkach z dnem U, które nie były traktowane metodą TC. W dniu 2 zagregowane NS przeniesiono do 96-dołkowych płytek z płaskim dnem bez TC, aby umożliwić ich przyczepienie. Uproszczona wizualizacja protokołu agregacji NS znajduje się w Rysunek 1A. NS hodowano do 9 dnia, a następnie przetwarzano w celu barwienia immunofluorescencyjnego. Komórki, które migrowały z NS na płytkę, przeniesiono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele różnicowania 3D in vitro umożliwiają analizę złożonych interakcji komórkowych, które mogą być trudne - lub nie mogą - być zaobserwowane w hodowli komórkowej 2D. Opracowano kilka modeli do badania rozwoju CNCC in vitro. Są one na ogół bezpośrednio pochodzące z kolonii ESC 7,21 lub eksplantatów tkankowych22,23. Chociaż systemy te okazały się skuteczne w generowaniu komórek grzebieni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Remi Xavier Coux za porady dotyczące projektowania starterów i ekspertyzy w hodowli komórkowej. Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN Starting Grant 101039995 - REGENECREST) oraz Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m filtry strzykawkoweClearLine146560
15 mL Polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej przejrzystościFalcon352096
200 µ L ClearLine Plus Końcówki filtracyjne o niskim poziomie wiązaniaDutscher713263
40 & micro; m filtryFalcon352340
5 ml Pipeta serologicznaStarstedt86.1253.001
50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej przejrzystościFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 osioł anty królik IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 osioł anty mysie IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 osioł anty kozy IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy Merck-SigmaA5955
B27 PLUS suplementThermofisher Scientific17504044
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Merck-SigmaA9418
ChloroformCarlo Erba438601
Kolagenaza typu IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 dołków przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TCCorning3516
Okulary nakrywkowe, okrągłeVWR  tel. 630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM o wysokiej zawartości glukozyMerck-SigmaD0822
DNA LoBind  Probówki, 2 mlEppendorf30108078
destylowana bez DNaz/RNazThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 0,5 mlEppendorf30121023
probówki Eppendorf Safe-Lock, 2 mlEppendorf30120094
ESGRO mLIF Średni suplementMerck-SigmaESG1107
etanol 70%Carlo Erba528170
płód Surowica bydlęcaMerck-SigmaF7524
FibronektynaMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Roztwór żelatynyMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
Ludzkie FGF-basicPeprotech100-18B
Ludzkie przeciwciało SOX9R& DsystemsAF3075
Insulina z trzustki bydlęcejMerck-SigmaI6634
iScript Zestaw do syntezy cDNA Biorad1708891
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie AP-2 alfa, niesprzężonemysie3B5
niesprzężony
N2Thermofisher Scientific17502048
Podłoże neurobazalneThermofisher Scientific21103049
Płytka poddana hodowli nietkankowej, 96 dołków, płaskodennaFalcon351172
poddana hodowli nietkankowej, 96 dołków, Falcon 351177 z dnem w kształcie litery U
16% roztwór paraformaldehydu, klasa emMikroskopia elektronowa Nauki15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
Oczyszczone przeciwciało antytubulinowe i beta-3 (TUJ1)BiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Scotch Dwustronna 12,7 mm i 22,8 mPrzezroczysta bezwłóknowa taśma dwustronna
Zestaw SensiFAST SYBR No-ROXMeridian BioscienceBIO-98020
Sterylne jednorazowe skalpele chirurgiczneSwann-Morton05XX
Szkiełka mikroskopowe adhezyjne Superfrost PlusEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100ThermofisherScientific A16046.
TRIzolFisherScientific15596026
Trypsina-EDTA (0,05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 MAb królika (IF Formulated)Technologia sygnalizacji komórkowejE7E2G
β-merkaptoetanolThermofisher Scientific
Woda przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie PAX7 DSHB , suplement DSHB PAX7 płytka Odczynnik AP31350010

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776(2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346(2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941(2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235(2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie grzebienia neuronalnegohodowla tr jwymiarowatworzenie neurosferembrionalne kom rki macierzyste myszydecyzje o losie kom rkianaliza immunofluorescencyjnaekspresja marker w EMTp ytka 96 do kowa

Powiązane artykuły